Een werkwijze van gerichte Cell Isolation via Glasoppervlak functionalisering
20 september 2016
Dit protocol beschrijft de aanpasbare oppervlaktefunctionalisering van het desthiobiotine, streptavidine en APTES systeem om specifieke celtypen van belang te isoleren. Daarnaast behandelt dit manuscript de toepassingen, optimalisatie en verificatie van dit proces.
Het algemene doel van dit functionalisatieproces van glasoppervlakken is om het zacht vastleggen en vrijgeven van cellen van belang mogelijk te maken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van tumorangiogenese, waardoor screening van celbiomarkers die duidelijke indicaties geven voor geneesmiddelresistentie mogelijk wordt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het volledig aanpasbaar is, voor vrijwel elk type cel van belang.
Zolang er een antilichaam is dat specifiek is voor het celtype, kan het oppervlak worden aangepast voor het vastleggen ervan. Hoewel deze methode inzicht kan geven in kankerangiogenese, kan deze ook worden toegepast op andere ziekten, aangezien gezuiverde monsters noodzakelijk zijn voor de ontwikkeling van meer gepersonaliseerde behandelingsschema's. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we probeerden een omkeerbaar vrijgavemechanisme te ontwikkelen voor het vastleggen van cellen, door gebruik te maken van de interactie tussen desthiobiotine en de adivin-familie.
Nadat een glasoppervlak gedurende vijf minuten in een zuurstofplasmamachine is gereinigd volgens het tekstprotocol, bereid je 2,5 milliliter van een 2% gereconstitueerde 3-aminopropyltriethoxysilaan, of APTES-oplossing, voor door 50 microliters APTES en 2,45 milliliter ethanol in een conische buis te combineren. Pipet de APTES-oplossing op de glazen oppervlakken, bedek vervolgens de oppervlakken en plaats ze op een platform shaker op kamertemperatuur gedurende 50 minuten om de APTES-laag gelijkmatig te verdelen. Verwarm intussen de oven voor op 55 graden Celsius voor de acht-en 24-well platen, of 90 graden Celsius voor de glaskommen.
Nadat de platen uit de shaker zijn verwijderd, gebruik je ethanol om de glazen oppervlakken te spoelen volgens het tekstprotocol. Droog de oppervlakken met 100% stikstofgas. Plaats vervolgens de acht-en 24-well platen in de oven gedurende twee uur, of de glaskommen in de oven gedurende één uur.
Bereid vervolgens 2,5 milliliter d-Desthiobiotine, of DSB-oplossing, door 1,5 milligram per milliliter van DSB in 37,5 microliters DMSO te mengen, en voeg vijf milligram per milliliter EDC toe aan 2.462,5 microliters van 0,1 Molair MES-buffer, pH 6. Combineer vervolgens de twee oplossingen. Voeg na 15 minuten één microliter BME toe om de reactie tussen DSB en EDC te onderdrukken.
Verwijder de hete APTES-functionele glazen oppervlakken uit de oven en laat ze vijf tot tien minuten afkoelen. Voeg MES-buffer toe aan de glazen oppervlakken om ze te spoelen door de pipettenstandaard op een hoek van 70 graden vast te houden, zodat de punt niet direct op het oppervlak gericht is. Spuit vervolgens de buffer af en trek deze vanuit een vast punt, zoals de hoek van de put, aan.
Gebruik vervolgens de MES-buffer om nogmaals twee keer te spoelen. Breng de DSB-oplossing aan op de glazen oppervlakken. Breng ze over naar een vochtige papieren handdoek in een petrischaal, dek de schaal af en incubeer in de koelkast gedurende 18 tot 24 uur.
Na de incubatie bij vier graden Celsius, gebruik je PBS om elk glasoppervlak drie keer te spoelen, zoals eerder in deze video is gedemonstreerd. Verdun vervolgens Streptavidin, of SAV-voorraadoplossing, tot 0,4 milligram per milliliter en breng het gelijkmatig aan op de glazen oppervlakken zodat een dunne laag zich vormt. Na 18 tot 24 uur incubatie van het glas, gebruik je 150 microliters PBS om elk oppervlak drie keer te spoelen.
Bevochtig vervolgens een papieren handdoek met gedeïoniseerd water en leg het plat in een petrischaal van 14 centimeter rond de platen om vocht in de putjes vast te houden. Dek de petrischaal met de glazen oppervlakken af en plaats deze in een koelkast op vier graden Celsius totdat het nodig is. Om celvastlegging uit te voeren, zuig het medium uit T175 flessjes met cellen.
Gebruik vervolgens PBS om de cellen te spoelen en de buffer af te zuigen. Voeg 10 milliliter niet-enzymatische oplosmiddel, zoals Celdissociatie-oplossing, toe aan de fles. Incubeer vervolgens gedurende zes minuten bij 37 graden Celsius.
Na zes minuten, voeg 10 milliliter koude HBSS toe om het oplosmiddel te verdunnen. Pipet vervolgens 20 microliters van de cellen en gebruik een hemocytometer om ze te tellen. Centrifugeer de celsuspensie bij 500 x g, in vier graden Celsius, gedurende vijf minuten.
En gebruik HBSS om de cellen opnieuw te suspenderen tot één keer 10 tot de zesde cellen per milliliter. Pipet omhoog en omlaag om de cellen in oplossing op te schorsen en cellulaire klompvorming te verminderen die de antilichaambinding kan verminderen. Verdeel vervolgens de cellulaire suspensie in afzonderlijke controle- en experimentele oplossingen.
Voeg de biotinylerde antilichamen toe aan de respectieve celoplossingen en incubeer op een einde-over-einde mixer bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Gebruik 150 microliters HBSS om de functionele glas in acht-well platen drie keer te wassen, zoals eerder in de video is gedemonstreerd. Voeg de celloplossing toe aan de putjes en incubeer op ijs op de shaker gedurende 45 minuten.
Bereid ondertussen een 20 millimolair oplossing van biotin in steriel HBSS. Gebruik vervolgens na de incubatie 150 microliters HBSS om de celloplossing van het glas te spoelen. Na het twee keer herhalen van de spoeling, voeg je 150 microliters van de biotin-oplossing toe aan elke respectieve vrijgaveput en incubeer gedurende 20 minuten om de reactie te laten doorgaan.
Verzamel niet-specifiek gebonden cellen door de cellen met HBSS te wassen. Ga vervolgens door met fluorescentiebeeldvorming en analyse volgens het tekstprotocol. Neem beelden op van levende cellen in een fles als controle.
In dit experiment werden MCF7GFP-cellen blootgesteld aan het functionele oppervlak. 60%van de cellen werden vastgelegd met behulp van het HLA-ABC-antilich
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een aanpasbare oppervlaktefunctionalisatiemethode met behulp van desthiobiotine, streptavidine en APTES om specifieke celtypen te isoleren. Het maakt de zachte opname en afgifte van cellen mogelijk en helpt bij de studie van tumorangiogenese en geneesmiddelresistentie.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Oncologie
- Biotechnologie
Achtergrond
- Het begrijpen van tumorangiogenese is cruciaal voor kankeronderzoek.
- Celbiomarkers kunnen geneesmiddelresistentie aangeven.
- Aanpasbare methoden verbeteren de studie van verschillende celtypen.
- Reversibele afgiftemechanismen zijn belangrijk voor het vastleggen van cellen.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het isoleren van specifieke celtypen.
- Om inzichten te bieden in de kankerbiologie en -behandeling.
- Om de screening van biomarkers voor gepersonaliseerde geneeskunde te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Oppervlaktefunctionalisatie met desthiobiotine en streptavidine.
- Gebruik van antilichamen specifiek voor doelceltypen.
- Optimalisatie van opname- en afgiftecondities.
- Verificatie van de effectiviteit van de methode bij het isoleren van cellen.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt de effectieve opname van verschillende celtypen mogelijk.
- Het biedt een platform voor het bestuderen van geneesmiddelresistentie in tumoren.
- Aanpasbare oppervlakken verhogen de veelzijdigheid van de techniek.
- De verkregen inzichten kunnen persoonlijke behandelstrategieën informeren.
Conclusies
- Dit protocol biedt een nieuwe aanpak voor celisolatie.
- Het heeft potentiële toepassingen buiten het kankeronderzoek.
- De methode kan bijdragen aan vooruitgang in gepersonaliseerde geneeskunde.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method addresses a critical bottleneck in personalized medicine by enabling gentle, reversible isolation of specific cell populations without altering physiological expression. It supports biomarker screening for drug resistance in tumor angiogenesis studies, directly informing target validation and lead identification efforts. The customizable surface functionalization platform enhances reproducibility and scalability for downstream applications in oncology and immunology research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through isolation of specific cell types for biomarker analysis.
- Operational Value: Provides a reversible capture-release system that preserves native cellular expression profiles.
- Predictive Value: Supports functional target validation by isolating cells indicative of drug resistance mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified cell populations suitable for downstream screening assays and receptor expression analysis.
- Operational Value: Achieves up to 80% capture efficiency in single-cell mixtures with biotin-mediated gentle release.
- Platform Value: Enables assay standardization through quantifiable surface verification using plate reader and ImageJ analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical studies by providing disease-relevant isolated cells for xenograft and cancer separation models.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity in target engagement studies through gentle cell recovery.
- Translational Value: Supports biomarker-aligned screening for personalized treatment regimen development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification, enabling isolation of biomarker-positive cell populations for mechanistic and phenotypic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating cells expressing specific surface markers.
- Screening: Delivers assay-ready purified cells with quantifiable capture and release metrics for compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative measurement of cell capture efficiency and release kinetics via fluorescence imaging and hemocytometer counting.
- Translational Research: Connects to preclinical workflows through application in xenograft models and cancer separation studies.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform adaptable to any cell type with available antibody, reducing need for re-optimization across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by minimizing expression artifacts during isolation.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized surface functionalization and biotin-mediated release.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling reliable screening of drug resistance biomarkers.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation in isolated cell populations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry, antibody conjugation, and cell handling techniques.
- Depends on access to oxygen plasma equipment, ovens for silanization, and fluorescence imaging systems.
- Necessitates standardization of antibody titration and cell concentration ranges for optimal capture.
- Involves adaptation considerations for different cell types and surface geometries (well plates vs. glass dishes).
- Includes practical limitations such as background signal at low cell concentrations and antibody optimization requirements.
