Name: Driedimensionale Culture Assay te ontdekken Cancer Cell Invasiviteit en Satellite tumorvorming (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Leer een driedimensionale kweekmethode om kankercellen in te bedden in collageen en te omhullen met fibrinegel. Dit systeem maakt het mogelijk om satelliettumorvorming en invasiviteit te monitoren voor kankeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Werk gedeeltelijk gefinancierd door Prostate Cancer Canada (subsidie # D2014-4 aan SG en CJD) en de Canadian Institutes of Health Research (subsidie # MOP-111069 aan SG). We willen Dr. Richard Poulin bedanken voor redactionele bijstand en mevrouw Chanel Dupont voor technische bijstand.

LET OP: Geen ethiek overweging sinds dierlijke en menselijke kankercellen werden gekocht of welwillend ter beschikking gesteld aan ons. 1. Het maken van Collageen pluggen (Pseudo-primaire tumor) <ol><li> Bereid een collageen dispersie. Type I collageen uit rattenstaart pezen (RTT) kan zowel worden gewonnen en gesteriliseerd zoals eerder gemeld 17, of direct te bestellen. Verspreiden gevriesdroogde RTT collageen (3,25-3,50 mg / ml in 0,02 N azijnzuur) met behulp van een blender (high speed-instelling; vijf runs 2 min) voor een uniforme menging. </li><li> Harvest (trypsine-EDTA, meestal) en gebruik trypan blauw exclusie voor het tellen van levensvatbare cellen met een hemocytometer. Stel de gewenste celdichtheid (5 x 10 4 cellen per plug). </li><li> Bereid alle oplossingen (NaOH, foetaal runderserum, DMEM 5x, NaHCO3) afzonderlijk (tabel 1) onder steriele omstandigheden en houden op ijs gekoeld. Opmerking: De volgorde van toevoeging van de verschillende oplossingen is belangrijk om osmotische schokken of zuur in cellen voorkomen. </li><li> Uitvoeren cel dispersie (1,25 x 10 6 cellen) in de uiteindelijke collageen oplossing (5 ml) zo snel mogelijk. Meng goed (door en neer te pipetteren) terwijl het vermijden van luchtbellen, en dan snel distribueren 200 ul van de kant-en-klare oplossing in elk putje van een 96-wells plaat. Voorzichtig staking van de multi-well plaat op het werkgebied oppervlak van de celkweek kap om luchtbellen te verwijderen en om de oplossing gelijkmatig verdeeld in de putten. </li><li> Na het bijvullen alle putjes (deze stap duurt ongeveer 15-20 minuten per 96-well plaat), opslaan in de incubator. </li><li> Incubeer de plaat bij 37 ° C van 2 uur &#39;s nachts. Collageen gelering (dwz fibrillogenese) plaatsvindt binnen 30 minuten. Voeg cultuurmedium (100 pl / putje) aan de kweek van een nacht incuberen voeren. </li></ol> 2. Eerste laag van fibrine gel <ol><li> Fibrinogeen Solution Voorbereiding. LET OP: De dezelfde partij van fibrine gel moet idealiter worden gebruikt voor meer reproduceerbare results, fibrine gelvorming kan variëren tussen de verschillende batches van commerciële gevriesdroogde fibrinogeen. <ol><li> Gebruik altijd een vers bereide fibrinogeen-oplossing. Breng het gevriesdroogde fibrinogeen op kamertemperatuur voor het openen van het flesje te hydrateren kristalvorming te voorkomen. </li><li> Geleidelijk los het fibrinogeen in voorverwarmde (37 ° C) Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) met Ca2 + / Mg2 + in een werkende concentratie van 3 mg / ml (eens het bereiden van een 15% overmaat van de minimale vereiste eindvolume : bijvoorbeeld 17,25 mg in 5,75 ml van een 5 ml oplossing). <ol><li> Add voorverwarmde HBSS druppelsgewijs bij eerste fibrinogeenfragmenten solubiliseren. Breek grotere fragmenten met een spatel in de beker. Schud de beker af en toe mengen te vergemakkelijken. Gebruik geen opruier plaat tijdens de procedure. Los het resterende poeder door pipetteren de schorsing op en neer. </li></ol></li><li> Houd de fibrinogeen oplossing lauwe terwijl SteriLIZING de oplossing te leiden door een 0,22 urn filter. Opmerking: Als de HBSS is niet warm genoeg of fibrinogeen niet volledig is opgelost, kan de oplossing van het filter verstoppen. Eventueel vervangen filter of twee keer, waarbij het fibrinogeen concentratie kan verlagen en daardoor fibrinestolsel stijfheid. </li><li> Suspendeer de cellen van belang (bijvoorbeeld endotheelcellen) in kant-en-klare fibrinogeenoplossing tijdens het instellen van het eindvolume, als alternatieve procedure. </li></ol></li><li> De voorbereiding van de trombine Solutions. <ol><li> Bereid een voorraadoplossing in DDH 2 O (50 NIH eenheden / ml), vervolgens gesteriliseerd met behulp van een 0,22 pm filter. </li><li> Gebruik een fibrinogeen / trombine verhouding ≥1: 0,0075 (v / v) om de fibrine gel genereren. </li></ol></li><li> Het genereren van de fibrine Gel. <ol><li> Houd de steriele fibrinogeen en trombine voorraad oplossingen op ijs tijdens de volgende stappen. De fibrinegelen mogen vormen in 24-well platen. </li><li> Onmiddellijk overlay the oppervlak van elk putje met de fibrinogeen-oplossing (200 ul / putje) met vermijding luchtbelvorming. Werkwijze 6 putjes tegelijk. </li><li> Zodra de fibrinogeenoplossing het oppervlak van de putjes volledig bedekt, tilt de plaat bij 45 ° en voeg 1,5 pl trombine oplossing van de eerste put door laten vallen van de trombine in het midden van de put, en dan voorzichtig zwenken de plaat horizontaal voor 1-2 sec. <ol><li> Laat de plaat in een stabiele positie onder de laminaire stroming kap (5-10 min) tot de gelering / stollingsproces heeft gedaan (NB: het polymerisatieproces mogen niet worden gestoord, bijvoorbeeld door het transporteren van de plaat naar de incubator). </li></ol></li><li> Zodra de eerste zes putten polymeriseren, herhaal dezelfde volgorde (dat wil zeggen de 3 voorgaande stappen) voor de komende zes putten, totdat alle putten zijn verwerkt. </li></ol></li></ol> 3. De tweede laag van fibrine Gel en ingeklemd Collageen Plug <ol><li> KeuzeA: (Met behulp van de Collagen Plug Direct). <ol><li> Zorg ervoor dat de eerste laag van fibrine gel in alle putjes gepolymeriseerd door subtiel het kantelen van de plaat. Plaats de 96-well plaat met de collageengel pluggen aan de zijde van de 24-well plaat (die de fibrine gels) overdracht van de collageen pluggen verlichten. </li><li> Één druppel HBSS in elk putje van de plaat dat het collageenmateriaal pluggen. </li><li> Verwijder elke collageen stekker uit de put met een dunne naald bevestigd aan een injectiespuit (gebruikt als een handvat) of met behulp van een micro-lepel (zie video). Transfer elk collageen plug op de eerste fibrine gel laag met behulp van een of twee micro-lepels, terwijl ervoor te zorgen dat het collageen plug goed is gecentreerd in de put en dat steriliteit is goed onderhouden. </li><li> Overlay de eerder gevormde fibrine gel met de tweede laag fibrinogeenoplossing (300 gl / putje) en het trombine te voeren als beschreven in 2.3, waarbij minimaal 1:. 0,0075 ratio en een reeks van zes putjes tegelijk &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Optie B (Coating de Collageen Plug met een dun laagje van Growth Factor-gereduceerde Basement Membrane (GFRBM)). <ol><li> Koel alle bereide oplossingen en instrumenten vooraf en bewaar ze bij 4 ° C of op ijs (bijvoorbeeld pipetten, tips, reageerbuisjes) tijdens hanteren aangezien ingevroren aliquots van GFRBM zijn zeer gevoelig voor oververhitting frequentie tijdens ontdooien (de instructies van de fabrikant) . </li><li> Na verwijdering uit de putjes, genieten van elk collageen plug gedurende 2 minuten in een 1,5 ml centrifugebuis op ijs met 100 ul van een pure GRFBM oplossing. </li><li> Transfer elk gecoat plug op de eerste fibrine laag en tegelijkertijd is het goed gecentreerd, zoals eerder beschreven. Incubeer de plug-bevattende platen bij 37 ° C gedurende 5 minuten om de GRFBM vorming van een gel. Voeg de tweede fibrine laag als in stap 3.1.4. </li></ol></li></ol> 4. celkweekmedium Voorwaarden <ol><li> Vul elk putje kweekmedium (400 ui). De kweekmedia en supplementen worden geselecteerd op basis van de cellijn en de testomstandigheden. </li><li> aprotinine, een antifibrinolytisch agent kweekmedium voegen tot een eindconcentratie van 100 kallikreïneremmer eenheden (KIE) / ml. OPMERKING: Bewaar de platen in een celkweek incubator onder de voor de cellijn geteste omstandigheden. </li><li> Vullen kweken met vers medium om de dag of volgens het testschema en voeg aprotinine. Voor het toevoegen vers medium, enigszins kantelt de plaat (een 30-35 ° hoek) en hellen de pipet tegen de zijkant van de put terwijl voorzichtig afzuigen het geconditioneerde medium voortdurend onder toezicht. </li></ol>

<ol><li>Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+review%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biol%22%5BJournal%5D)">Metastasis review: from bench to bedside.</a> Tumour Biol. 35 (9), 8483-8523 (2014).</li>
<li>Roudsari, L. C., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+influence+of+angiogenesis+in+in+vitro+cancer+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems.</a> Adv Drug Deliv Rev. , (2016).</li>
<li>Bill, R., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+EMT+in+breast+cancer+metastasis%3A+Correlation+or+causality%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The relevance of EMT in breast cancer metastasis: Correlation or causality.</a> FEBS Lett. 589 (14), 1577-1587 (2015).</li>
<li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Three-Dimensional+%283D%29+Models+in+Cancer+Research%3A+an+Update%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">In Vitro Three-Dimensional (3D) Models in Cancer Research: an Update.</a> Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).</li>
<li>Obenauf, A. C., Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+at+a+Distance+Organ-Specific+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cancer%22%5BJournal%5D)">Surviving at a Distance Organ-Specific Metastasis.</a> Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).</li>
<li>Sykes, J. A. Separation of Tumor Cells from Fibroblasts. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSykes%2C+JA+%22Human+Tumor+Cells+In+Vitro%22">Human Tumor Cells In Vitro</a>. Fogh, J. 1, Chapter 1 1-22 (1975).</li>
<li>Lang, S. H., Stark, M., Collins, A., Paul, A. B., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Prostate+Epithelial+Morphogenesis+in+Response+to+Stroma+and+Three-Dimensional+Matrigel+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Experimental Prostate Epithelial Morphogenesis in Response to Stroma and Three-Dimensional Matrigel Culture.</a> Cell Growth Differ. 12 (12), 631-640 (2001).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+Oncogenesis+of+MCF-10A+Mammary+Epithelial+Acini+Grown+In+Three-Dimensional+Basement+Membrane+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and Oncogenesis of MCF-10A Mammary Epithelial Acini Grown In Three-Dimensional Basement Membrane Cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li>
<li>Shaw, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor cell invasion assays.</a> Methods Mol. Biol. 294, 97-105 (2005).</li>
<li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Dynamic+Reciprocity%3A+Engineering+Three-Dimensional+Culture+Models+of+Breast+Architecture%2C+Function%2C+and+Neoplastic+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling Dynamic Reciprocity: Engineering Three-Dimensional Culture Models of Breast Architecture, Function, and Neoplastic Transformation.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 342-352 (2005).</li>
<li>Hedlund, T. E., Duke, R. C., Miller, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Spheroid+Cultures+of+Human+Prostate+Cancer+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Spheroid Cultures of Human Prostate Cancer Cell Lines.</a> Prostate. 41 (3), 154-165 (1999).</li>
<li>Le, V. M., Lang, M. D., Shi, W. B., Liu, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Collagen-Based+Multicellular+Tumor+Spheroid+Model+for+Evaluation+of+the+Efficiency+of+Nanoparticle+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Artif.+Cells+Nanomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A Collagen-Based Multicellular Tumor Spheroid Model for Evaluation of the Efficiency of Nanoparticle Drug Delivery.</a> Artif. Cells Nanomed Biotechnol. 15, 1-5 (2014).</li>
<li>Neto, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Hanging+Spherical+Drop+System+for+the+Generation+of+Cellular+Spheroids+and+High+Throughput+Combinatorial+Drug+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">A Novel Hanging Spherical Drop System for the Generation of Cellular Spheroids and High Throughput Combinatorial Drug Screening.</a> Biomater Sci. 3 (4), 581-585 (2015).</li>
<li>Janvier, R., Sourla, A., Koutsilieris, M., Doillon, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+Fibroblasts+are+Required+for+PC-3+Human+Prostate+Cancer+Cells+to+Produce+Capillary-like+Formation+of+Endothelial+Cells+in+a+Three-dimensional+Co-culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Stromal Fibroblasts are Required for PC-3 Human Prostate Cancer Cells to Produce Capillary-like Formation of Endothelial Cells in a Three-dimensional Co-culture System.</a> Anticancer Res. 17 (3A), 1551-1557 (1997).</li>
<li>Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+Culture+System+as+a+Model+for+Studying+Cancer+Cell+Invasion+Capacity+and+Anticancer+Drug+Sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional Culture System as a Model for Studying Cancer Cell Invasion Capacity and Anticancer Drug Sensitivity.</a> Anticancer Res. 24 (4), 2169-2177 (2004).</li>
<li>Gobeil, S., Zhu, X., Doillon, C. J., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genome-Wide+shRNA+Screen+Identifies+GAS1+as+a+Novel+Melanoma+Metastasis+Suppressor+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Genome-Wide shRNA Screen Identifies GAS1 as a Novel Melanoma Metastasis Suppressor Gene.</a> Genes Dev. 22 (21), 2932-2940 (2008).</li>
<li>Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+Of+Ready-To-Use%2C+Storable+And+Reconstituted+Type+I+Collagen+From+Rat+Tail+Tendon+For+Tissue+Engineering+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation Of Ready-To-Use, Storable And Reconstituted Type I Collagen From Rat Tail Tendon For Tissue Engineering Applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2007).</li>
<li>Horie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Human+Lung+Cancer-associated+Fibroblasts+in+Three-dimensional+In+Vitro+Co-culture+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Characterization of Human Lung Cancer-associated Fibroblasts in Three-dimensional In Vitro Co-culture Model.</a> Biochem Biophys Res Commun. 423 (1), 158-163 (2012).</li>
<li>Banyard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Genes+Regulating+Migration+and+Invasion+Using+a+New+Model+of+Metastatic+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Identification of Genes Regulating Migration and Invasion Using a New Model of Metastatic Prostate Cancer.</a> BMC Cancer. 30 (14), 387(2014).</li>
<li>Palumbo, J. S., Degen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+and+Tumor+Cell+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen and Tumor Cell Metastasis.</a> Haemostasis. 31, Suppl. 1 11-15 (2001).</li>
<li>Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Stroma%2C+Tumor+Blood+Vessels%2C+and+Antiangiogenesis+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+J%22%5BJournal%5D)">Tumor Stroma, Tumor Blood Vessels, and Antiangiogenesis Therapy.</a> Cancer J. 21 (4), 237-243 (2015).</li>
<li>Luoto, K. R., Kumareswaran, R., Bristow, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Hypoxia+as+a+Driving+Force+in+Genetic+Instability%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Integr%22%5BJournal%5D)">Tumor Hypoxia as a Driving Force in Genetic Instability.</a> Genome Integr. 4 (1), 5(2013).</li>
<li>Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiologically+Relevant+In+Vitro+Tumor+Models+for+Drug+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Pathophysiologically Relevant In Vitro Tumor Models for Drug Screening.</a> Drug Discov Today. 20 (7), 848-855 (2015).</li>
<li>Longati, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Pancreatic+Carcinoma+Spheroids+Induce+a+Matrix-rich%2C+Chemoresistant+Phenotype+Offering+a+Better+Model+for+Drug+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">3D Pancreatic Carcinoma Spheroids Induce a Matrix-rich, Chemoresistant Phenotype Offering a Better Model for Drug Testing.</a> BMC Cancer. 13 (95), (2013).</li>
<li>Tan, P. H., Chia, S. S., Toh, S. L., Goh, J. C., Nathanm, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+Spatial+Configuration+of+Tumour+Cells+Confers+Resistance+to+Chemotherapy+Independent+of+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional Spatial Configuration of Tumour Cells Confers Resistance to Chemotherapy Independent of Drug Delivery.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2013).</li>
<li>Koutsilieris, M., Reyes-Moreno, C., Choki, I., Sourla, A., Doillon, C., Pavlidis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+Cytotoxicity+of+Human+MCF-7+and+MDA-MB+231+Breast+Cancer+Cells+is+Altered+by+Osteoblast-Derived+Growth+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy Cytotoxicity of Human MCF-7 and MDA-MB 231 Breast Cancer Cells is Altered by Osteoblast-Derived Growth Factors.</a> Mol Med. 5 (2), 86-97 (1999).</li>
<li>Lang, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+Response+of+Cell+Invasion+to+Matrix+Stiffness+in+Three-Dimensional+Biopolymer+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Biphasic Response of Cell Invasion to Matrix Stiffness in Three-Dimensional Biopolymer Networks.</a> Acta Biomater. 13, 61-67 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen openbaarmaking.

Als belangrijke technische voetnoot, is het essentieel dat geen ruimte bij het grensvlak tussen de centrale en perifere gelen. Anders kan het het vermogen van de cellen om te migreren / binnenvallen fibrinegel verminderen. Een ruimte tussen het collageen en fibrine gels kunnen gedurende de eerste 24 uur van de cultuur vormen indien trombine niet correct werd verdund. Het is ook mogelijk dat de cellijn getest kan de collageengel tot krimpen tijdens kweken, waarbij een relatief grote ruimte waardoor vormen tussen beide ge...

De fundamenteel biomedische kenmerken van kankercel invasie / migratie en daaropvolgende metastase inrichting is het onderwerp van intens onderzoek 1,2. Metastase is de ultieme fase van kanker en de klinische behandeling blijft ongrijpbaar. Een beter begrip van metastase op cellulair en moleculair niveau zal de ontwikkeling van efficiëntere therapieën 3 mogelijk. Verschillende eigenschappen van metastatische cellen kan worden verkend in vitro 4 met inbegrip van hun stemness en potentieel om een overgang staat (bv epithelioid-mesenchymale transitie) te verwerven om te migreren en binnenvallen in en uit de primaire tumor 5. Echter, de in vitro beoordeling van de invasie / metastasering processen een uitdaging sinds het vrijwel exclusief de bijdrage van het bloed / lymfatische circulatie. Organotypische culturen die tumor fragmenten insluiten in collageen gels hebben Previously gebruikt om kanker agressiviteit controleren. Hoewel de complexiteit van tumoren wordt bewaard (bijvoorbeeld de aanwezigheid van niet-kankercellen), tumorfragmenten blootgesteld aan beperkte diffusie medium, steekproeven variatie, en een overmatige groei van bindweefselcellen 6. Een alternatieve werkwijze bestaat erin groeiende kanker cellen in componenten van de extracellulaire matrix (ECM), die de driedimensionale (3D) celomgeving nabootst. De proliferatie van borstkankercellijnen in een collageen gel en / of basismembraan-afgeleide matrix onder de meest bestudeerde voorbeelden van 3D celkweek. Door het gebruik van specifieke 3D celcultuur-omgevingen, kan het ongeorganiseerd assemblage waargenomen voor borstkankercellen gekweekt onder standaard omstandigheden worden omgekeerd om de spontane vorming van de melkklieren acini en buisvormige structuren 7-10. Bovendien is de vorming van multicellulaire bolvormige tumoren afgeleid van adenocarcinoom cellen bijeen met verschillende technieken (bijvoorbeeld, opknoping druppels, drijvende bolletjes, agar inbedding) Nu vormt de meest gebruikte 3D celcultuur assay 11-13. Maar deze assay beperkt door de beperkte set kankercellijnen die sferoïden kunnen vormen en de korte periode om cellen te bestuderen in deze voorwaarden. In dit gevisualiseerd techniek we hierin introduceren geavanceerde 3D ​​celkweektest wanneer kankercellen plaats zijn ingebed in een collageengel om de in vitro vorming van een pseudo-primaire tumor die als alternatief kan worden bekleed met een kelder membraan-afgeleide matrix mogelijk. Eenmaal gevormd wordt de pseudo-primaire tumor dan ingeklemd in een acellulair matrix (fibrine gel in het onderhavige geval), waardoor de kankercellen aan het grensvlak tussen de twee compartimenten matrix kan passeren (zie figuur 1). Interessant secundaire tumor-achtige structuren afkomstig van de pseudo-primaire tumor met agressieve kankercellen verschijnen in hetfibrinegel. 3D dergelijk teeltsysteem biedt de vereiste flexibiliteit te onderzoeken, bijvoorbeeld antikankergeneesmiddelen, genexpressie en cel-cel en / of cel-ECM interacties 14-16. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54322/54322fig1.jpg" /> Figuur 1:.. Overzicht van de methode Schematisch overzicht van de methode om de 3D-celcultuur systeem als een model voor kanker studies genereren <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54322/54322fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>Lyofilisaat collageen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7661</td><td>van rattenstaartpees (oplosbare dispersie) of zelfgemaakt (zie Rajan et al., ref.#14)</td></tr><tr><td>Fibrinogeen (gevriesdroogd)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>F8630</td><td>Type I-S, 65 - 85% eiwit met &ge; 75% van het eiwit is klonterbaar</td></tr><tr><td>Trombine</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td>605157</td><td>&nbsp;Gibbstown, NJ; NIH eenheden/mg drooggewogen gewicht&nbsp;</td></tr><tr><td>Growth factor-reduced Matrigel&nbsp;</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>Voorheen van BD Biosciences</td></tr><tr><td>Aprotinine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6279&nbsp;</td><td>&nbsp;oplossing bij 5 - 10T IU/ml (Trypsine Inhibitor Unit)&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Micro-lepels</td><td>Fisher Scientific</td><td>2140115</td><td>Fisherbrand Handi-Hold Microspatula</td></tr><tr><td>96-wells plaat, ronde bodem</td><td>Sarstedt</td><td>3925500</td><td></td></tr><tr><td>24-wells plaat</td><td>Sarstedt</td><td>3922</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's aangepast Eagle's Medium</td><td>Sigma Chemical, Co.</td><td>D5546</td><td>DMEM</td></tr><tr><td>Foetaal Rundserum</td><td>VWR</td><td>CAA15-701</td><td>FBS, Canadese oorsprong.</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Sigma Chemical, Co.</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution&nbsp;</td><td>Sigma Chemical, Co.</td><td>H8264</td><td>HBSS</td></tr></tbody></table>

driedimensionale culture assay te ontdekken cancer cell invasiviteit en satellite tumorvorming

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Zoogdiercelcultuur in monolagen wordt algemeen gebruikt om diverse fysiologische en moleculaire processen te bestuderen. Echter, deze benadering van de groeiende cellen te bestuderen genereert vaak ongewenste artefacten. Daarom celkweek in een driedimensionale (3D) omgeving, vaak met behulp van extracellulaire matrixcomponenten, zich tot een interessant alternatief vanwege de grote gelijkenis met de natuurlijke in vivo weefsel of orgaan. We ontwikkelden een 3D celkweek systeem met twee compartimenten, namelijk (i) een centraal compartiment met kanker cellen ingebed in een collageen gel werkt als een pseudo-primaire macrospherical tumor en (ii) een perifere celvrije compartiment gemaakt van een fibrine gel, dat wil zeggen een extracellulaire matrix component verschilt van die in het centrum, die kankercellen kunnen migreren (invasie vooraan) en / of vormen microsferische tumoren die secundaire of satelliet tumoren. De vorming van satelliet tumoren in het perifere compartimentopvallend gecorreleerd aan de bekende agressiviteit metastatische oorsprong van de natieve tumorcellen die deze 3D kweeksysteem uniek. Deze celkweek benadering kan worden gesteld kankercel invasiviteit en motiliteit, cel-extracellulaire matrix interacties als een methode om antikankergeneesmiddel eigenschappen evaluatie uitgevoerd.

Zoals eerder vermeld, een interessant kenmerk van deze 3D celkweek test is dat kankercellen niet alleen kunnen migreren van het collageen stekker aan de aangrenzende fibrinegel, maar het ook tot secundaire tumoren (bijvoorbeeld satelliet tumor-achtige structuur). Dit kan direct worden waargenomen met een omgekeerde fase contrast microscoop bij lage en hoge vergroting door de gel dikte, vooral met een lange werkafstand condensor (figuur 2). Met deze 3D celkweek w...

Kankercellen worden ingebed in een collageengel en vervolgens tussen een acellulair fibrinegel gedaan om een 3D-kweeksysteem te genereren waarin de invasiviteit en vorming van satelliettumoren kunnen worden gemonitord.

Driedimensionale Culture Assay te ontdekken Cancer Cell Invasiviteit en Satellite tumorvorming

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Het algemene doel van deze procedure is om in collageen ingebedde kankercellen in een fibrinegel te plaatsen om een 3D-cultuursysteem te genereren voor het monitoren van de invasiviteit en vorming van satelliettumoren. Ons 3D-beeldingssysteem kan nieuwe mogelijkheden bieden voor het onderzoeken van diverse cellen en vele belangrijke varianten tijdens apoptose of migratie van kankercellen, of om de effectiviteit van antikankermiddelen te evalueren. Een aantrekken kenmerk van dit 3D-celcultuurmodel is de mogelijkheid om de concentratie van de extracellulaire matrix te variëren of een andere extracellulaire matrix te gebruiken voor de assemblage van het 3D-systeem.De procedure zal worden gedemonstreerd door Marie-France Cote, onderzoeksassistent in mijn laboratorium, en Audrey Turcotte, een promovendus onder mijn begeleiding. Begin met het mengen van gevriesdroogd type one collageen uit ratstaartpezen gedurende vijf mengbeurten van twee minuten op de hoge snelheidstand om het collageen gelijkmatig te verspreiden.Terwijl het collageen wordt geïncorporeerd, worden de gewenste tumorcellen geoogst met de passende enzymatische detacheringsoplossing. Vervolgens wordt de Trypaanblauw-uitsluitingsmethode toegepast voor de numeratie. Verdun de gedissocieerde cellen in DMEM tot een concentratie van 50.000 cellen per plug.Zodra het collageen klaar is, voegt u snel 1.250.000 cellen toe aan de collageenoplossing en pipetteert u deze om de cellen homogeen te verspreiden. Verdeel onmiddellijk 200 microliters van de enkelcellesuspensie over elke put van een 96-wells plaat. Tik de plaat na elke toevoeging voorzichtig tegen het werkvlak om eventuele luchtbellen te verwijderen en de oplossing gelijkmatig over de putten te verdelen.Wanneer alle cellen zijn toegevoegd, plaatst u de plaat gedurende ten minste twee uur in een incubator van 37 °C. Voeg na de eerste twee uur 100 µL kweekmedium aan elke put toe als de cellen gedurende de nacht gekweekt moeten worden. Om de eerste fibrinogellaag voor te bereiden, brengt u het gevriesdroogde fibrinogeen naar kamertemperatuur voordat u het flesje opent, om de vorming van hydraatkristallen te voorkomen. Draag het fibrinogeen vervolgens over naar een glazen bekerglas en voeg druppelgewijs HBSS van 37 °C toe aan het poeder om de fibrinogeenfragmenten op te lossen.Gebruik vervolgens een spatel om de grotere eiwitstukken fijn te maken, waarbij de bekerglas af en toe wordt geschud om het mengen te vergemakkelijken. Pipetteer de suspensie meerdere keren om het resterende eiwit op te lossen en steriliseer de oplossing door filtratie via een 22 micron filter. Bedek daarna onmiddellijk het oppervlak van elke well van een 24-well plaat met 200 microliters fibrinogen, waarbij u voorzichtig voorkomt dat er luchtbellen ontstaan.Zodra alle putjes grondig zijn gecoat, kantelt u de plaat onder een hoek van 45 graden, druppelt u vervolgens 1,5 µL trombine-oplossing in het centrum van één putje en draait u de plaat voorzichtig één tot twee seconden horizontaal. Behandel op dezelfde wijze nog vijf andere putjes met trombine en plaats de plaat vervolgens vijf tot 10 minuten in een stabiele horizontale positie onder een laminaire flow-kast, totdat de oplossingen geleren. Kantel de plaat voorzichtig om te bevestigen dat de fibrinegels volledig gepolymeriseerd zijn voordat u de collageenplug direct plaatst.Plaats vervolgens de 96-wells plaat met collageengelpluggen naast de 24-wells plaat met fibrinegels en voeg één druppel HBSS toe aan elke put met een collageenplug. Gebruik daarna een microschepje om één collageenplug naar het centrum van elke eerste fibrinegellaag in de 24-wells plaat te verplaatsen. Wanneer alle pluggen zijn overgeplaatst, voeg dan 300 microliter fibrinogeenoplossing toe aan elke put, gevolgd door de toevoeging van 2,25 microliter trombine, zoals zojuist gedemonstreerd.Om de collageenpluggen te voorzien van een dunne laag groeifactor-gereduceerd basaalmembraan vóór plaatsing, wordt elke plug overgebracht naar een 1,5 milliliter centrifugebuis op ijs met 100 microliters zuiver groeifactor-gereduceerd basaalmembraan. Na twee minuten weken wordt een enkele gecoate collageenplug in het midden van elke fibrine-laag geplaatst en worden de pluggen vijf minuten bij 37 graden Celsius geïncubeerd om het groeifactor-gereduceerde basaalmembraan te laten stollen. Voeg vervolgens de tweede fibrine-laag toe zoals zojuist gedemonstreerd.Wanneer de gels volledig gepolymeriseerd zijn, vult u elke well met 400 microliters van het geschikte kweekmedium en supplementen. Voeg vervolgens een antifibrinolytisch middel toe aan de wells. Incubeer de 3D-culturen vervolgens onder de juiste condities voor de geteste tumorcellijn.Kantel de plaat op de betreffende dagen voor het voeden van de cellen in een hoek van 30 tot 35 graden en houd een pipet schuin tegen de wand van elke put om het medium af te zuigen zonder de gels te verstoren. Voeg vervolgens 400 µL vers celcultuurmedium en een antifibrinolytisch middel toe aan elke gelcultuur. Deze 3D-celcultuurassay maakt een directe visualisatie mogelijk van de migratie van kankercellen vanuit de collageenplug naar de aangrenzende fibrinegel voor de vorming van secundaire tumoren, waardoor het gedrag van bekende metastatische cellen vergeleken kan worden met dat van niet- of zwak metastatische cellen.In dit experiment waren bijvoorbeeld talrijke satelliettumoren willekeurig verspreid door de fibrinegel die de metastatische cellijn B16 F10 bevatte, terwijl er geen satelliettumoren werden waargenomen voor de zwak metastatische B16 F0 cellijn. Daarentegen vormen deze muize mammaire kliercarcinoomcellen, die slecht metastatisch maar zeer invasief zijn, een migratiefront dat radiaal in de fibrinegel uitbreidt. Na 14 dagen kweek trekken de mammaire kliercarcinoomcellen zich terug van het migratiefront om stervormige structuren te vormen die sterk lijken op mammaire klierstructuren.Chemotherapeutische middelen kunnen worden getest op de ingebedde kankercellen, zoals in dit representatieve experiment waar een toenemende DNA-fragmentatie werd waargenomen gelijktijdig met een toename van de incidenties van door chemotherapeutica geïnduceerde apoptose van kankercellen. Wanneer de techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer zes uur worden voltooid of over twee dagen worden verspreid, afhankelijk van de initiële incubatieperiode van de collageenplug.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de vorming van openingen aan de interface tussen de centrale en de perifere gels te voorkomen, aangezien deze het vermogen van de kankercellen om de fibrinegel binnen te dringen kunnen verminderen. Na deze procedure kan metallografische of proteomische analyse worden uitgevoerd op de satellietkolonies, de collageenpluggen of de kankercellen om de differentiële expressie van genen en eiwitten van belang te identificeren. Na de ontwikkeling heeft deze techniek onderzoekers in het veld van de kankerbiologie de weg vrijgemaakt om migratie, apoptose, metastase-onderdrukkende genexpressie en angiogenese in diverse kankercellijnen te onderzoeken.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u kankercellen in een collageengel kunt inkapselen en deze kunt sandwichesen binnen een fibrinegel om de invasiviteit en de vorming van satelliettumoren te monitoren.

three-dimensional-culture-assay-to-explore-cancer-cell-invasiveness

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een test om kwantitatief te meten Transforming Growth Factor (TGF)-β-geïnduceerde invasie in 3-dimensionale collageen gels is beschreven. Deze test maakt gebruik van de MCF10A reeks van cel-lijnen, die verschillende stadia van de ontwikkeling van borstkanker te vertegenwoordigen. Deze methode kan worden vastgesteld om te worden gebruikt met andere cellijnen en kan worden gebruikt om andere potentiële activatoren of inhibitoren van een invasie te onderzoeken.

Sferoïde Assay voor TGF-β-geïnduceerde Invasion Measure

Deze video biedt een gedetailleerde methodologie om borstkankercellen te laten groeien in een 3D-keldermembraaneiwitmatrix, die het potentieel van 3D-cultuur illustreert bij de beoordeling van celinvasie in de omgeving.

3D-cultuur keldermembraantest: cultiveren van kankercellen op 3D-keldermembraaneiwitmatrix om celinvasie te bestuderen

This video demonstrates a method to establish a three-dimensional tumor spheroid and T cell co-culture. An agarose cast with microwells containing tumor spheroids is prepared, followed by the addition of T cells. After incubation, this setup allows studying the interaction of T cells with tumor spheroids in a controlled three-dimensional environment.

A Three-Dimensional Co-culture Model of Infiltrating T Cells in Tumor Spheroids

Dit artikel behandelt een methode om fluorescerend label collageen dat verder kan worden gebruikt voor zowel vaste en levende beeldvorming van 3D celculturen. Wij bieden ook een geoptimaliseerd protocol om endogene cytoskeleteiwitten van cellen gekweekt in 3D-omgevingen te visualiseren.

Het openbaren van de organisatie van het cytoskelet van invasieve kankercellen in 3D

Drie dimensionale cultuur van mammaire epitheelcellen op een gereconstitueerde basaalmembraan is een handige methode om de in vivo architectuur van de goedaardige borst herhalen, en het maligne fenotype onderscheiden van goedaardige borst fenotype. Belangrijk is dat dit systeem worden toegepast invasieve carcinomen studie in weefsels.

Drie dimensionaal culturen: Een hulpmiddel om te studeren Normaal Acinaire Architectuur versus maligne transformatie van cellen borst

Dit artikel geeft gedetailleerde methodologieën voor het gebruik van driedimensionale (3D) assays om borstkanker cel invasie kwantificeren. Concreet bespreken we het nodig om dergelijke assays procedures, kwantificering en gegevensanalyse, alsook werkwijzen voor het verlies van membraan integriteit die ontstaat wanneer cellen binnendringen onderzoeken.

Kwantificering van de Breast Cancer Cell Invasiviteit met een drie-dimensionale (3D) Model

Hier presenteren we een protocol voor co-cultuur in drie dimensies, wat nuttig is voor het onderzoeken van interacties tussen meerdere cellen en het beïnvloeden van het gedrag van kankercellen door de extracellulaire matrix. In dit experimentele model worden kankercellen gekweekt op collageengels ingebed met humane kanker-geassocieerde fibroblasten.

Driedimensionale Co-cultuur Model voor Tumor-stromale Interactie

Invasie van omliggende normale weefsels is een typerend kenmerk van kwaadaardige tumoren. We bieden hier een eenvoudige, semi-geautomatiseerde microplaattest van invasie in een natuurlijke 3D biomatrix die met een aantal modellen van gevorderde menselijke kankers is geëxemplifeerd.

Driedimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Deze methode evalueert de invasie van kankercellen uit sferoïden in een omringende 3D-matrix.  Sferoïden worden gegenereerd via de hanging drop-kweekmethode en vervolgens ingebed in een matrix bestaande uit basement membraanmaterialen en type I collageen.  Invasie uit de sferoïden wordt vervolgens gemonitord.

Een Cancer Cell Sferoïde Assay om Invasion beoordelen in een 3D-instelling

De processen die blaas kanker invasie vertegenwoordigen mogelijkheden voor biomerker en therapeutische ontwikkeling. Hier presenteren we een blaas kanker invasie model waarin 3D-cultuur tumor spheroïden, time-lapse beeldvorming en confocale microscopie. Deze techniek is handig voor het definiëren van de kenmerken van de invasieve proces en voor het screenen van therapeutische agenten.

3D-celcultuur voor het bestuderen van de invasie en evalueren van Therapeutics in blaaskanker

De gepresenteerde aanpak evalueert tegelijkertijd kankercelinvasie in 3D-sferoïde testen en T-celcytotoxiciteit. Sferoïden worden gegenereerd in een steiger-vrije agarose multi-microwell gegoten. Co-cultuur en inbedding in type I collageen matrix worden uitgevoerd in hetzelfde apparaat dat het mogelijk maakt om kankercel invasie en T-cel gemedited cytotoxiciteit te controleren.

Monitoring Cancer Cell Invasion en T-Cell Cytotoxicity in 3D Cultuur

Leer een driedimensionale kweekmethode om kankercellen in te bedden in collageen en te omhullen met fibrinegel. Dit systeem maakt het mogelijk om satelliettumorvorming en invasiviteit te monitoren voor kankeronderzoek.

Driedimensionale Culture Assay te ontdekken Cancer Cell Invasiviteit en Satellite tumorvorming

Meer video's verkennen