Continu-golf Thulium Laser voor Verwarming Cultured Cells om Cellulaire Thermal Effecten te onderzoeken

Het algemene doel van deze procedure is om temperatuur-afhankelijke biologische celreacties in vitro te bestuderen door gekweekte cellen te verwarmen met nauwkeurige temperatuur- en tijdscontrole. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in gebieden die de reacties van cellen of weefsels op hyperthermie onderzoeken, zoals het onderzoek naar retinale laserbehandelingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is een snelle verwarming van cellen en een nauwkeurige controle over de verwarmingsduur, wat een hoge reproduceerbare thermische blootstelling tijdens experimenten mogelijk maakt.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de reacties van gekweekte retinale pigmentepitheelcellen op thermische laserbestraling, kan deze ook worden toegepast op andere modellen zoals kankercellen. We kregen het idee voor deze methode toen we melaninehoudende cellen verwarmden met zichtbaar laserlicht. Dit resulteerde echter in variërende temperatuurprofielen als gevolg van variaties in pigmentatie.

Om de procedure te beginnen, plaatst u een hotplate in een instelbare metalen labstandaard op een schone werkbank. Stel de hotplate in op 39 graden Celsius. Bevestig een 0,22 NA-vezel met een kerndiameter van 365 micrometer aan de horizontale arm van de standaard.

Plaats de metalen arm boven de hotplate en pas de standaard aan zodat de vezelpunt 12 centimeter boven de hotplate staat. Verbind een 1,94 micrometer 20 watt Thulium-laser met een 365 nanometer een milliwatt sturingsstraal naar de vezelpunt. Plaats een kweekschaal met een diameter van 30 millimeter op de hotplate.

Volg zorgvuldig de omtrek van de schaal op het oppervlak van de hotplate en verwijder vervolgens de schaal. Schakel de sturingsstraal in en pas de standaard aan tot het centrum van de straalvlek op de hotplate overeenkomt met de getraceerde cirkel. Schakel vervolgens de sturingsstraal uit.

Om te beginnen met de temperatuurkalibratieprocedure, verwarmt u de punt van een 20 gauge naald met een Bunsen-brander. Met de verwarmde naaldpunt, prikt u het kweekschaal van 30 millimeter diameter dicht bij de bodem op vier punten 90 graden uit elkaar om gaten van ongeveer 300 micrometer in diameter te maken. Plak elektrische tape over de gaten.

Gebruik een fijne naald om een ​​gaatje van ongeveer 200 micrometer diameter te prikken door de tape die elk gat bedekt. Teken aan de onderkant van de kweekschaal een lijn tussen elk paar gaten die 180 graden uit elkaar staan. Begin bij de kruising van de lijnen en markeer elke drie millimeter radiaal langs elke lijn om de 21 meetpunten aan te geven.

Plaats vervolgens exact 1,2 milliliter vers kweekmedium dat voorverwarmd is tot 37 graden Celsius in de schaal. Bedek de schaal en plaats de schaal in de getraceerde cirkel op de hotplate. Verbind een thermokoppel met een diameter van 200 micrometer met de laserbesturingscomputer en open het temperatuurkalibratieprotocol.

Plaats het thermokoppel in een van de gaten in de schaal zodat de punt op de bodem van de schaal staat op een van de markeerlocaties. Het is erg belangrijk om te controleren of de punt van het thermokoppel de bodem van de schaal raakt met de gemeten precisie, omdat de temperatuur kan variëren naargelang de diepte. Wacht tot het kweekmedium is gestabiliseerd op 37 graden Celsius.

Schakel vervolgens de Thulium-laser in en stel de laservermogen in op het gewenste startniveau. Controleer of de voorverwarmduur is ingesteld op 140 en acht seconden en start vervolgens de voorverwarmsequentie. Nadat 140 seconden zijn verstreken, zoals aangegeven door een hoorbare piep, verwijdert u onmiddellijk het deksel van de kweekschaal.

Wacht tot de voorverwarming is voltooid en de 10-seconden bestraling plaatsvindt. Bedek vervolgens onmiddellijk de schaal. Meet de temperatuur op de 21 markeerlocaties op deze manier.

Voer deze procedure drie keer uit met tussenpozen van drie wattvermogen die het bereik van het laservermogen overspannen. Wanneer u klaar bent, schakelt u de Thulium-laser uit. Exporteer en analyseer de temperatuurgegevens.

Voor het experiment kweekt u retinale pigmentepitheelcellen in kweekschalen met een diameter van 30. Houd de celculturen op 37 graden Celsius in een 5% koolstofdioxide atmosfeer en controleer ze met behulp van een live celbeeldsysteem. Een uur voor de bestraling vervangt u het kweekmedium in elke schaal door exact 1,2 milliliter vers kweekmedium.

Breng de culturen terug naar de incubator. Controleer of de bestralingsinstallatie klaar is en of de hotplate is ingesteld op 39 graden Celsius. Wanneer u klaar bent om met de bestraling te beginnen, start u de Thulium-laser op het gewenste vermogen.

Open het experimentprotocol en controleer of de voorverwarmduur is ingesteld op 140 en acht seconden. Plaats een RPE-celcultuur in een gesloten schaal op de gemarkeerde positie op de hotplate en start onmiddellijk de 140 en acht seconden voorverwarmsequentie. Verwijder het schaaldeksel na 140 seconden voorverwarming.

Wacht tot de voorverwarming is voltooid en de 10-seconden bestraling plaatsvindt. Bedek onmiddellijk de schaal, wacht zeven seconden en plaats de schaal vervolgens terug in de incubator. Bestraal aanvullende monsters bij toenemende laservermogens.

Wanneer u klaar bent, schakelt u de Thulium-laser uit. Om de celviabiliteitsbeoordeling te beginnen, wast u de bestraalde cellen met PBS. Verkrijg een kit die in staat is om levende apoptotische en necrotische cellen te onderscheiden.

Combineer vervolgens in laag licht 500 microliter bindingsbuffer met 25 microliter ethidium homodimer-3, FITC annexine en Hoechst 33342. Bewaar de cellen in deze kleuroplossing op kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Was vervolgens de cellen tweemaal met 1X bindingsbuffer.

Vervang de bindingsbuffer door PBS en plaats de cel op het podium van een fluorescentiemicroscoop met DAPI-, FITC- en TRITC-filters. Stel de microscooplichtbaan in op de oculaire lens en selecteer de DAPI-filter. Schakel het verlichtingslicht in en vind het focusvlak met een 4X objectief