Name: Continu-golf Thulium Laser voor Verwarming Cultured Cells om Cellulaire Thermal Effecten te onderzoeken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Leer hoe je RPE-cellen verwarmt met een 1,94 µm continu-golf Thulium laser om thermische effecten op cellen te bestuderen. Deze methode biedt nauwkeurige temperatuur- en tijdcontrole voor reproduceerbare resultaten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door een onderzoeksbijdrage van het Duitse Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF) (subsidie ​​# 13GW0043C) en en een Europees Bureau voor Ruimtevaart Onderzoek en Ontwikkeling (EOARD, subsidie ​​# FA9550-15-1-0443)

1. RPE Cell Culture <ol><li> Isolatie van RPE-cellen uit de ogen van de varkens <ol><li> Verkrijg verse enucleated porcine ogen van het lokale slachthuis. Houd ze koel (4 ° C) en in een donkere omgeving. </li><li> Verwijder extracellulaire weefsels met een schaar en week de ogen in een antiseptische oplossing gedurende 5 minuten. </li><li> Plaats de ogen in gesteriliseerde fosfaatgebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium (PBS (-)) tot gebruik. </li><li> Door middel van een scalpel dringt u de sclera ongeveer 5 mm achter de corneale limbus in. Resect het hele voorste gedeelte van het oog door middel van een schaar doorheen, parallel met de hoornvlies limbus. </li><li> Verwijder het voorste gedeelte van het oog (dat wil zeggen de hoornvlies en de lens) en de glasplaat. Voeg 1 ml PBS (-) toe en verwijder het neurale retina voorzichtig. OPMERKING: Deze &quot;oogbeker&quot;, bestaande uit de sclera, choroid en RPE, is nu klaar. </li><li> Voeg voorverwarmd (37 ° C) 0,25% trypsine toe in PBS (-) naar de oogbeker. Pas het volume zodanig aan dat ongeveer 80% van de oogbeker gevuld is met deze trypsine oplossing. </li><li> Incubeer de oogbeker met de trypsineoplossing in een 5% C02 incubator bij 37 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Verwijder de oogbeker uit de incubator en vervang de 0,25% trypsinoplossing met een PBS (-) oplossing met 0,05% trypsine + 0,2% ethylendiaminetetraazijnzuurtetrasodiumzout (EDTA · 4N). Incubeer de oogbeker gedurende 45 minuten in de incubator. OPMERKING: na 45 minuten zijn de RPE-cellen ofwel losweg verbonden aan het membraan van de Bruch of al vrijgekomen en drijvend in de trypsine-EDTA-oplossing. </li><li> Verzamel de RPE-cellen door zacht pipetten. Verzamel de cellen en de oplossing in een conische buis gevuld met 10 ml kweekmedium (DMEM hoge glucose met L-glutamine), inclusief 10% varkens serum, antibioticum / antimycotische en natriumpyruvaat (1 mM). OPMERKING: Het serum kan het effect van trypsine neutraliseren. </li><li> Centrifugeer deCel suspensie bij 400 xg gedurende 5 min bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de supernatant en voeg 10 ml fris medium toe. Centrifugeer opnieuw onder dezelfde omstandigheden gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder de supernatant en voeg een nieuw medium toe, zodat de celconcentratie resulteert in 5 x 10 5 cellen / ml (bepaald door de cellen te tellen met behulp van een hemocytometer). Meng goed door zacht pipetten. </li><li> Verdeel de celsuspensie in celcultuurschotels. Gebruik 3 ml per 60 mm diameter kweekschotel. OPMERKING: Deze cultuur heet passage nul (P0). </li><li> Bewaar de cellen in een 5% CO 2- incubator bij 37 ° C. Verander de helft van het gecondenseerde medium elke dag op fris medium. </li><li> Subcultuur (stap 1.2) als het confluent wordt. </li></ol></li><li> Subcultuur van de RPE-celkweek <ol><li> Verwijder het kweekmedium en spoel de cellen tweemaal met PBS (-). </li><li> Incubeer de cellen met PBS (-) oplossing met 0,05% trypsine + 0,2% EDTA iNa 5% CO 2 incubator bij 37 ° C gedurende 5 min. </li><li> Verwijder de RPE-cellen door zacht pipetteren en verzamel de cel suspensie in een conische buis gevuld met 10 ml kweekmedium, inclusief 10% varkens serum. </li><li> Centrifugeer de cel suspensie bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de supernatant en voeg een nieuw kweekmedium toe, waarbij de celconcentratie 5 x 10 5 cellen / ml wordt (bepaald door het cijfer met een hemocytometer te tellen). Verdeel de cellen in nieuwe kweekschotels van 60 mm diameter, zoals beschreven in stap 1.1.13. OPMERKING: De celcultuur is nu passage 1 (P1). </li><li> Nadat confluentie is bereikt, subcultuur de P1-cultuur naar P2, onder toepassing van dezelfde procedure beschreven in stappen 1.2.1-1.2.5. Vanuit de P2-cultuur zaaien de cellen op kleinere cultuurgerechten (30 mm binnendiameter) in plaats van 60 mm-diameter cultuurgerechten. </li><li> Voor de experimenten gebruik P2 of P3 culturen. </li></ol></li></ol> 2. ThulIum laserbestraling <ol><li> Constructie van het bestralingsstation <ol><li> Sluit een thuliumlaserapparaat (1,94 μm, vermogensbereik: 0-20 W) aan op een 0,22-NA, 365 μm kerndiametervezel. </li><li> Mechanisch fixeer de vezelpunt aan de metalen arm die horizontaal is bevestigd aan de verticale metalen post van het bestralingsstation. Plaats de verticale post zodanig dat de punt van de laservezel boven de kookplaat ligt waarop de celkweekschotel tijdens bestraling moet worden geplaatst. </li><li> Leg een wit papier op de hete plaat en draai de richtingstraal aan (λ = 635 nm, max = 1 mW, diameter op papierniveau ≈ 30 mm). Merk de omtrek van de doelbundel op het wit papier, zodat de positie waar de cultuurschotel wordt geplaatst tijdens bestraling, bekend is. OPMERKING: Het z-vlak van de vezelpunt kan veranderlijk zijn. Zonder enige extra beeldoptiek, wordt de diameter van de laserpunt op het celcultuurvlak 12 cm onder de vezelpunt geplaatst, iS ongeveer 30 mm, die bijna gelijk is aan de binnendiameter van de celcultuurschotel. Een schematische tekening van de installatie is weergegeven in figuur 1 . </li></ol></li></ol><img alt="Figuur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig1.jpg" /> Figuur 1: Schematisch beeld van het Thulium Laser Bestralingsstation. Op de verwarmingsplaat wordt een kweekschotel geplaatst. De cellen worden 12 cm onder de thulium laservezelpunt geplaatst, zodat de bundelgrootte bijna identiek is aan de binnendiameter van de kweekschotel (ongeveer 30 mm). De laserbestralingsprocedure wordt geregeld door een tijdgestuurde routine van het op maat gemaakte systeemontwerpplatform. De stroominstelling moet worden bepaald voordat het bestralingsprogramma is gestart. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54326/54326fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <olstart = &quot;2&quot;&gt; <li> Laserbestraling van de celcultuur <ol><li> 1 uur voor bestraling, vervang het kweekmedium volledig met 1,2 ml vers medium. OPMERKING: Dit is een CRITICAL STEP en moet strikt gevolgd worden. </li><li> Plaats het bestralingsstation (dat wil zeggen de kookplaat en de post waarmee de laservezel moet worden aangebracht) op een schone bank. </li><li> Verwijder de celcultuurschotel uit de incubator en plaats deze op de gemarkeerde positie op het kookplaat (stap 2.1.3). </li><li> Draag beschermende bril. Zet de thuliumlaser aan. Stel de stroom in zoals gewenst op het laserapparaat (afstemming van 0 - 20 W). Zet de emissie op. </li><li> Start een systeem design platform dat de laser bestraling en timing protocol (aanvullend bestand) regelt. </li><li> Onmiddellijk nadat u de kweekschotel op het hete plaat plaatst, klikt u op de &quot;voorverwarmingstijd&quot; om de timer voor 140 s te starten (&quot;voorverwarmingstijd 1&quot;); Dit houdt de temperatuur van het kweekmedium op 37 ° C voor bestraling. OPMERKING: na 140 seconden gaat een pieptoon aan en de volgende timer (&quot;voorverwarmingsduur 2&quot;) begint automatisch met 8 s. Gedurende deze 8 s kan de examinator de cultuurschotel openen. Na 148 seconden van voorverwarming wordt automatisch een 10 s-lange laserbestraling op de celcultuur uitgevoerd. In geval van nood moet u het laserapparaat uitgerust met een krachtstopknop om de laser onmiddellijk te stoppen. Dit is een CRITICAL STEP en moet streng gevolgd worden. Een bijzonder punt van voorzichtigheid heeft betrekking op het openen van de deksel van de schotel net voor bestraling, aan het begin van de 8 s voorverwarmingstijd. Het openen van de afdekking kan heel snel het medium oppervlak afkoelen. </li><li> Plaats het deksel onmiddellijk na het bestralen op de kweekbak, laat het koken op de kookplaat nog eens 7 s achter en plaats deze terug in de 5% CO 2- incubator bij 37 ° C. </li></ol></li><li> Meting van de temperatuurverdeling bij deCelniveau (temperatuurkalibratie) <ol><li> Maak kleine gaten (ongeveer 300 μm in diameter) dicht bij de bodem aan vier kanten (elke 90 °) van een 30 mm diameter kweekschotel (zonder cellen); Gebruik de tip van een naald (20G), verwarmd met een Bunsen-brander. Zet de gaten met elektrische isolatieband van buitenaf en maak een klein gat met een fijne naald, zodat alleen een fijne thermokoppel (200 μm in diameter) door dit gat onder waterdichte omstandigheden kan worden ingebracht. </li><li> Aan de buitenkant van de cultuurschotel onderkant trekt u 2 loodrechte diameters en zet u het kruispunt ( dwz het midden van de onderkant) als het coördinaat nul (0). Markeer elke 3 mm radiaal naar buiten naar buiten (ongeveer 0, 3, 6, 9, 12 en 15 mm) in elke richting langs de lijnen ( Figuur 2 , blauwe punten); Het aantal punten moet in totaal 21 zijn. </li><li> Vul de celcultuurschotel met 1,2 ml nieuw kweekmedium. Plaats de cultuur dZet een fijne thermokoppel (200 μm in diameter) in het zijgat en plaats de gevoelige punt op een gemarkeerde positie die moet worden gemeten. </li><li> Draag beschermende bril. Zet de thuliumlaser aan en stel de stroom handmatig in (tussen 0 en 20 W, in stappen van 0,1 W) van de laserontwerp. OPMERKING: Voor temperatuurkalibratie moeten metingen met de stroom in stappen van 3 W voldoende zijn. </li><li> Zet het systeem ontwerpplatform aan en klik op de knop &quot;Start Temp Acquisition&quot; (aanvullend bestand) om de temperatuurmeting te starten. </li><li> Voer dezelfde procedure uit als in stap 2.2.6. OPMERKING: Het controleprogramma meet de temperatuur van het ingebouwde thermokoppel elke 100 ms en toont de temperatuurprogressie tijdens bestraling in de GUI. </li><li> Voer deze procedures uit voor alle 21 meetpunten en bij verschillende stroominstellingen. Herhaal de hele procedure drie maal voor alle punten en voor alle krachtinstellingenGS om betrouwbare gegevens te verkrijgen. </li><li> De temperatuurgegevens exporteren als csv-gegevens, die uiteindelijk kunnen worden omgezet in een spreadsheet. Gemiddelde de maximale temperatuur aan het einde van de bestraling voor de triplicate metingen op elk punt. Gemiddelde de waarden van de punten op dezelfde cirkel (4 punten in totaal, behalve het centrale punt). </li><li> Bepaal de gemiddelde gemiddelde temperatuur op een grafiek, waarbij de afstand van het midden van de schotel (mm) als de x-as en de temperatuur stijgt (ΔT, ° C) als de y-as. Gebruik de fitfunctie van een wiskundig softwareprogramma om een ​​Gaussisch model aan te passen aan de rauwe data. Maak een Gaussische fit temperatuurverdeling. </li></ol></li></ol><img alt="Figuur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig2.jpg" /> Figuur 2: De punten voor temperatuurkalibratie in een celcultuurschotel. De temperatuurgegevens werden gemeten in het midden en op 5Radiale punten over 4 verschillende hoeken (blauwe punten). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54326/54326fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 3. Biologische beoordelingen voor celreacties na verschillende thermische bestralingen <ol><li> Evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen ( dwz levend, apoptotisch en dood) op basis van verschillende krachtinstellingen en de bepaling van de celdooddrempel <ol><li> Op de aangegeven tijdspunten ( dwz 3, 24 en 48 uur na bestraling), wassen de cellen met PBS (-) en gebruik een in de handel verkrijgbare kit om de levensvatbaarheid van de cel ( dwz vitaal, apoptotisch, dood) te beoordelen volgens de fabrikant protocol. </li><li> Bereid een kleuroplossing door 5 μL fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) -annexine V, 5 μl ethidium homodimer III en 5 μL Hoechst 33342 tot 100 μl 1x bindingsbuffer toe te voegen (alle zijn kitcomponenten). Bereid genoeg vlekoplossing voor om de cellen te bedekken. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten. </li><li> Was de celkweek tweemaal met de bindingsbuffer, vervang de bindingsbuffer met PBS (-) en zet de kweek op het stadium van een fluorescentiemicroscoop. </li><li> Schakel het lichtpad over naar de ooglens, selecteer het 4 &#39;, 6-Diamidin-2-fenylindol (DAPI) filter, schakel het verlichtingslicht in en zoek het geconcentreerde vlak met de 4x-doelstelling. </li><li> Verander het lichtpad naar de camera, zoek de afbeelding op het computerscherm in de microscoopbeeldsoftware en pas de focus aan. </li><li> Gebruik de steekfunctie ( dwz de functie om meerdere afbeeldingen over de schotel op te nemen en dan een enkel groot beeld te maken) van de microscoopspecifieke software om het fluorescentiebeeld van de gehele celcultuurschotel te verkrijgen. Gebruik 3 verschillende filtersets-DAPI, FITC, en tetramethylrhodamine (TRITC) - naar beeld Hoechst 33342-positieve cellen (alle celkernen), FITC-annexine V-positiVe-cellen (apoptotische) en respectievelijk ethidium homodimeer III-positieve cellen (dood). </li><li> Meet de straal (mm) van het dode (ethidium homodimer III-positief) gebied en de buitenste / binnenste straal van het apoptotische (annexine V-positieve) bandvormgebied in de gekleurde celculturen. Breng deze radii aan op de gemonteerde Gaussische functie van de temperatuurverdeling voor de bijbehorende vermogensinstelling. Bereken de exacte temperatuur op de rand van de doden of apoptotische regio om de drempeltemperaturen voor de cel dood en apoptotische verandering te verduidelijken. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Inagaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+efficacy+of+pure+yellow+%28577-nm%29+and+810-nm+subthreshold+micropulse+laser+photocoagulation+combined+with+yellow+%28561-577-nm%29+direct+photocoagulation+for+diabetic+macular+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema.</a> Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).</li>
<li>Roider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+retina+therapy+%28SRT%29+for+clinically+significant+diabetic+macular+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Selective retina therapy (SRT) for clinically significant diabetic macular edema.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (9), 1263-1272 (2010).</li>
<li>Brinkmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+temperature+determination+during+retinal+photocoagulation+on+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Real-time temperature determination during retinal photocoagulation on patients.</a> J Biomed Opt. 17 (6), 061219(2012).</li>
<li>Yoshimura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocoagulated+human+retinal+pigment+epithelial+cells+produce+an+inhibitor+of+vascular+endothelial+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Photocoagulated human retinal pigment epithelial cells produce an inhibitor of vascular endothelial cell proliferation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (8), 1686-1691 (1995).</li>
<li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+Thresholds+for+Exposure+to+NIR+and+Blue+Lasers+in+an+In+Vitro+RPE+Cell+System%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Damage Thresholds for Exposure to NIR and Blue Lasers in an In Vitro RPE Cell System.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (7), 3065-3073 (2006).</li>
<li>Shrestha, R., Choi, T. Y., Chang, W., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-precision+micropipette+sensor+for+cellular-level+real-time+thermal+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A high-precision micropipette sensor for cellular-level real-time thermal characterization.</a> Sensors (Basel). 11 (9), 8826-8835 (2011).</li>
<li>Gao, F., Ye, Y., Zhang, Y., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+bath+hyperthermia+reduces+stemness+of+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem%22%5BJournal%5D)">Water bath hyperthermia reduces stemness of colon cancer cells.</a> Clin Biochem. 46 (16-17), 1747-1750 (2013).</li>
<li>Jansen, E. D., van Leeuwen, T. G., Motamedi, M., Borst, C., Welch, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+dependence+of+the+absorption+coefficient+of+water+for+midinfrared+laser+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg+Med%22%5BJournal%5D)">Temperature dependence of the absorption coefficient of water for midinfrared laser radiation.</a> Lasers Surg Med. 14 (3), 258-268 (1994).</li>
<li>Iwami, H., Pruessner, J., Shiraki, K., Brinkmann, R., Miura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+a+laser-induced+sub-lethal+temperature+rise+on+RPE+cells+from+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Protective effect of a laser-induced sub-lethal temperature rise on RPE cells from oxidative stress.</a> Exp Eye Res. 124, 37-47 (2014).</li>
<li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+correlated+microthermography+maps+threshold+temperature+in+laser-induced+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Optics%22%5BJournal%5D)">Spatially correlated microthermography maps threshold temperature in laser-induced damage.</a> J Biomed Optics. 16 (3), (2011).</li>
<li>Morgan, C. M., Schatz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrophic+creep+of+the+retinal+pigment+epithelium+after+focal+macular+photocoagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Atrophic creep of the retinal pigment epithelium after focal macular photocoagulation.</a> Ophthalmology. 96 (1), 96-103 (1989).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Bij het bespreken van temperatuurgerelateerde biologische cellulaire reacties is niet alleen de temperatuur, maar ook de tijdsduur van de verhoogde temperatuur van belang, aangezien de meeste biochemische processen tijdafhankelijk zijn. Met name op het gebied van lasergeïnduceerde hyperthermie in oogheelkunde, door het korte tijdsbestek van milliseconden tot seconden, is het moeilijk om celthermische effecten te onderzoeken met precieze temperatuurregeling. Daarom is een laserbestralingsopstelling geschikt voor het celc...

Het begrijpen van temperatuurafhankelijke celbiologische reacties is van groot belang voor succesvolle hyperthermiebehandelingen. Retinale laserfotocoagulatie met een thermische laser, gebruikt in oogheelkunde, is een van de meest opgestelde laserbehandelingen in de geneeskunde. Zichtbaar licht, meestal van groene tot gele golflengten, wordt gebruikt in retinale laserbehandeling. Het licht wordt sterk geabsorbeerd door de melanine in retinale pigmentepitheliale (RPE) cellen, die de buitenste celmonolaag van het netvlies vormen. Er is recente interesse geweest bij artsen en onderzoekers bij zeer zachte thermische bestraling (sub-zichtbare fotocoagulatie) als een nieuwe therapeutische strategie voor verschillende soorten retinale aandoeningen 1 , 2 . Naar aanleiding van deze trend is onze interesse in RPE-cellen onder lethal verwarmen onder nauwkeurige temperatuurregeling, een techniek genaamd temperatuurgestuurde fotothermische therapie (TC-PTT). Recente optoAkoestische technologie van ons instituut heeft de real-time meting van temperatuurstijgingen op bestraalde plaatsen in het netvlies mogelijk gemaakt. Dit maakt het mogelijk om de temperatuur te verhogen tijdens bestraling 3 . Aangezien de sub-dodelijke hyperthermie op het retina, veroorzaakt door het verwarmen van RPE-cellen subletaal, niet eerder is overwogen door de onmogelijkheid om de temperatuur te meten en te reguleren, hebben de temperatuurafhankelijke celreacties van RPE-cellen na thermische laserbestraling Tot op heden zeer weinig bestudeerd. Bovendien is niet alleen het temperatuurverschil in detail besproken, maar ook het verschil in het celgedrag van de overlevende cellen na sublodale en dodelijke bestraling. Daarom, om wetenschappelijk bewijs op TC-PTT gebaseerde behandelingen te verzamelen, streven we ernaar om de temperatuurafhankelijke RPE-celbiologische reacties en hun mechanismen toe te lichten door gebruik te maken van in vitro experimentele opstellingen. Voor tZijn doel is het opzetten van een celverwarmingsinstallatie die voldoet aan de volgende voorwaarden: 1) een mogelijkheid tot snelle temperatuurstijgingen, 2) een nauwkeurig geregelde tijd en temperatuur en 3) een relatief groot aantal onderzochte cellen voor biologische experimenten . Wat de verwarmingsmethode betreft, is een klinische laser, zoals een frequentieverdubbelde Nd.YAG laser (532 nm), helaas ongeschikt voor celcultuurverwarming. Dit komt door het sterk verminderde aantal melanosomen in gekweekte RPE cellen. De laserlichtabsorptie kan inhomogeen zijn, en de temperatuurstijging op het cellulaire niveau is variabel tussen experimenten, zelfs bij bestraling met dezelfde stralingskracht. Verscheidene eerdere studies hebben melding gemaakt van het gebruik van zwart papier onder de schotelbodem tijdens bestraling 4 of het gebruik van extra melanosomen die gefagocytiseerd zijn door de cultuurcellen voor de experimenten 5 , 6 . Veel vanDe in vitro biologische studies om hyperthermie geïnduceerde celreacties te beoordelen zijn uitgevoerd met behulp van een kookplaat, een waterbad of een CO 2- incubator met een temperatuurinstelling 7 . Deze methoden vereisen een lange verwarmingsperiode, omdat het enige tijd duren ( dwz enkele minuten) om de gewenste temperatuur te bereiken. Bovendien is het moeilijk om een ​​gedetailleerde thermische geschiedenis ( dwz temperatuur vermenigvuldigd met de tijd) op het cellulaire niveau te verkrijgen door gebruik te maken van deze methoden. Bovendien kan de temperatuur tussen de cellen op verschillende posities in één kweekschotel verschillen door diffusie van variabele temperatuur. In de meeste gevallen is deze informatie over temporale en ruimtelijke temperatuur tijdens hyperthermie niet in aanmerking genomen voor biologische analyses, ook al kan de biologische celreactie kritisch beïnvloed worden door de temperatuur en de tijdsduur van de verhoogde temperatuur. Om deze problemen te overwinnen, een contiNuuwe-golf thulium laser werd hier gebruikt om de cellen te verwarmen. Thulium laserstraling (λ = 1,94 μm) wordt sterk geabsorbeerd door water 8 , en de cellen aan de onderkant van de kweekschotel worden thermisch gestimuleerd uitsluitend door thermische diffusie. De laservezel met een diameter van 365 μm ligt ongeveer 12 cm boven de kweekschotel, zonder enige optica tussenin. De diameter van de laserstraal divergeert zodanig dat het bijna gelijk is aan de binnendiameter van de cultuurschotel (30 mm) op het oppervlak van het kweekmedium. Met een consistente hoeveelheid kweekmedium is het mogelijk om de cellen te irradieren met de temperatuurverhoging Van hoge herhaalbaarheid. Met variabele energie instellingen kunt u bestraling met maximaal 20 W, en de gemiddelde temperatuur op het cellulaire niveau worden verhoogd tot ΔT ≈ 26 ° C in 10 s. Door de bestralingsomstandigheden te wijzigen is het ook mogelijk om het laserstraalprofiel te veranderen om de temperatuurverdeling te variërenOp in een cultuurschotel. Het is bijvoorbeeld mogelijk om met een Gauss-achtige temperatuurverdeling, zoals in de huidige studie, of met een homogene temperatuurdistributie te onderzoeken. Het laatste kan voordelig zijn voor het onderzoeken van de effecten van temperatuurafhankelijke celreacties, meer specifiek voor sublodale temperatuurstijgingen, maar niet voor celdoodspanning of wondgenezingsresponsen. In totaal kan thuliumlaserbestraling het onderzoek mogelijk maken van verschillende soorten biologische factoren, zoals gen / eiwituitdrukking, celdoodkinetiek, cel proliferatie en ontwikkeling van celfunctionaliteit, na verschillende thermische blootstellingen.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle&rsquo;s Medium - hoge glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796-500ML</td><td>Voeg (2)-(4) toe voor gebruik. Verwarm in een waterbad van 37 &deg;C voor gebruik.</td></tr><tr><td>Antibioticum Antimycotic-oplossing (100 &times;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955-100ML</td><td>Bevat 10.000 eenheden penicilline, 10 mg streptomycine en 25 &mu;g Amphotericin B in 1mL. Voeg 5,5 mL toe in 500 mL mediumfles (1) voor gebruik.</td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636-100ML</td><td>Voeg 5,5 mL toe in 500 mL mediumfles (1) voor gebruik (eindconcentratie: 1 mM)</td></tr><tr><td>Porcine serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12736C-500ML</td><td>Voeg 50 mL toe in 500 mL mediumfles (1) voor gebruik (eind: 10%)</td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine uit varkenspancreas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4799-25G</td><td></td></tr><tr><td>Etheen-diaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED-100G</td><td></td></tr><tr><td>Human VEGF Quantikine ELISA-kit</td><td>R&amp;D System</td><td>DVE00</td><td></td></tr><tr><td>Oxiselect Total Glutathione Assay-kit</td><td>Cell Biolabs, Inc</td><td>STA-312</td><td></td></tr><tr><td>Apoptotische/Nekrotiserende/Gezonde cellen detectie-kit</td><td>PromoKine</td><td>PK-CA707-30018</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Utrusting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thulium laser</td><td>Starmedtec GmbH</td><td>Prototype</td><td>0-20 W</td></tr><tr><td>365 mm kerndiametervezel</td><td>LASER COMPONENTS Germany</td><td>CF01493-52</td><td></td></tr><tr><td>Thermokoppel</td><td>Omega Engineering Inc</td><td>HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingsplaat</td><td>MEDAX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microplaatlezer (spectrofluorometer)</td><td>Molecular Device</td><td>Spectramax M4</td><td></td></tr><tr><td>Celhomogenisator</td><td>QIAGEN</td><td>TissueLyser LT</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ti</td><td></td></tr><tr><td>wiskundig softwareprogramma</td><td>The Mathworks. Inc</td><td>MATLAB Release 2015b</td><td></td></tr><tr><td>systeem-ontwerpplatform</td><td>National Instrument</td><td>Labview</td><td>Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench</td></tr></tbody></table>

continu-golf thulium laser voor verwarming cultured cells om cellulaire thermal effecten te onderzoeken

Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects

Hier wordt een originele methode voor het verwarmen van gekweekte cellen met behulp van een 1,94 μm continu-golf thuliumlaser voor biologische beoordeling. Thulium laserstraling wordt sterk geabsorbeerd door water en de cellen aan de onderkant van de kweekschotel worden verwarmd door thermische diffusie. Een laservezel met een diameter van 365 μm is ongeveer 12 cm boven de kweekbak geplaatst, zonder optica, zodat de laserbundeldiameter bijna gelijk is aan de binnendiameter van de kweekschotel (30 mm). Door in elk experiment een consistente hoeveelheid kweekmedium te houden, is het mogelijk om de cellen te irradieren met een zeer reproduceerbare temperatuurverhoging. Om de temperatuurverhoging en de verdeling ervan in één celcultuurschotel te kalibreren voor elke vermogensinstelling, werd de temperatuur gedurende 10 seconden bestraald bij verschillende posities en op het cellulaire niveau. De temperatuurverdeling werd weergegeven met behulp van een wiskundige grafische softwareProgramma, en het patroon over de cultuurschotel was in Gaussische vorm. Na laserbestraling kunnen verschillende biologische experimenten worden uitgevoerd om temperatuurafhankelijke celreacties te beoordelen. In dit manuscript wordt levensvatbaarheidsverf ( dwz onderscheiden van levende, apoptotische en dode cellen) geïntroduceerd om de drempeltemperaturen voor celapoptose en de dood na verschillende tijdstippen te bepalen. De voordelen van deze methode zijn de precisie van de temperatuur en de tijd van verwarming, evenals het hoge rendement bij het verwarmen van cellen in een hele celcultuurschotel. Bovendien staat het in staat om te studeren met een grote variëteit aan temperaturen en tijdsduur, die goed gecontroleerd kan worden door een geautomatiseerd besturingssysteem.

Temperatuurverdeling na verschillende stroominstellingen Alle temperatuurontwikkelingen voor elke enkele bestraling werden gecontroleerd bij de temperatuurkalibratie. Uit deze gegevens werd de maximale temperatuur op het gemeten punt verkregen en gedefinieerd als T max (° C). Zoals getoond in Figuur 3A , werd het programma uitgevoerd op het tijdstip wanneer de kweekschotel op de verwarming...

Hier wordt een originele experimentele opstelling voor het verwarmen van cellen in een cultuurschotel met behulp van 1,94 μm continu-wave laserstraling geïntroduceerd. Met behulp van deze methode kunnen de biologische reacties van retinale pigmentepitheliale cellen (RPE) na verschillende thermische blootstellingen worden onderzocht.

Continu-golf Thulium Laser voor Verwarming Cultured Cells om Cellulaire Thermal Effecten te onderzoeken

An original method to heat cultured cells using a 1.94 &#181;m continuous-wave thulium laser for biological assessment is introduced here. Thulium laser ...

Het algemene doel van deze procedure is om temperatuur-afhankelijke biologische celreacties in vitro te bestuderen door gekweekte cellen te verwarmen met nauwkeurige temperatuur- en tijdscontrole. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in gebieden die de reacties van cellen of weefsels op hyperthermie onderzoeken, zoals het onderzoek naar retinale laserbehandelingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is een snelle verwarming van cellen en een nauwkeurige controle over de verwarmingsduur, wat een hoge reproduceerbare thermische blootstelling tijdens experimenten mogelijk maakt.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de reacties van gekweekte retinale pigmentepitheelcellen op thermische laserbestraling, kan deze ook worden toegepast op andere modellen zoals kankercellen. We kregen het idee voor deze methode toen we melaninehoudende cellen verwarmden met zichtbaar laserlicht. Dit resulteerde echter in variërende temperatuurprofielen als gevolg van variaties in pigmentatie.Om de procedure te beginnen, plaatst u een hotplate in een instelbare metalen labstandaard op een schone werkbank. Stel de hotplate in op 39 graden Celsius. Bevestig een 0,22

continuous-wave-thulium-laser-for-heating-cultured-cells-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We ontwikkelden nieuwe intrinsieke multifunctionele nanovesicles genaamd porphysomes, welke structuur-afhankelijke fluorescentie zelf-afschrikken en unieke fotothermische eigenschappen hebben, waardoor het als krachtige fotothermisch therapie agenten. We formuleerden porphysomes behulp van hoge druk extrusie en onderzocht hun fotothermische therapie werkzaamheid bij een xenograft tumor model.

One Minute, Sub-One-Watt Fotothermische Tumor Ablation behulp Porphysomes, Intrinsieke Multifunctionele nanovesicles

Schokgolven tegenwoordig bekend om hun regeneratieve effecten. Daarom in vitro experimenten zijn van toenemend belang. We hebben daarom een model ontwikkeld voor in vitro schokgolf trials (IVSWT) die ons in staat stelt om na te bootsen in vivo omstandigheden waardoor storende fysieke effecten te vermijden.

Shock Wave Toepassing op celculturen

AN MRI-compatibele maat ontworpen laser gebaseerde verwarmingsapparaten ontwikkeld plaatselijke verhitting van subcutane tumoren verschaffen om afgifte van stoffen uit warmte gevoelige liposomen activeert specifiek op het tumorgebied.

Maat ontworpen laser gebaseerde Verwarming Apparaten voor gestuurde release van cisplatine van temperatuurgevoelige liposomen met Magnetic Resonance Image Guidance

Europium thenoyltrifluoroacetonate (EuTFC) een optische luminescentie lijn bij 612 nm, waarvan de activering efficiëntie sterk af met de temperatuur. Indien een monster bekleed met een dunne film van dit materiaal micro-afgebeeld, kan de 612 nm luminescentie reactie intensiteit worden omgezet in een rechtstreekse kaart monster oppervlaktetemperatuur.

High-resolution thermische Micro-imaging Met behulp europiumchelaat Lichtgevende Coatings

Deze methode streeft naar het lokaliseren van verticale ondergrondse defecten. Hier koppelen we een laser aan met een ruimtelijke lichtmodulator en trekken de video-ingang om deterministisch een monsteroppervlak te verwarmen met twee antifase gemoduleerde lijnen, met het verwerven van sterk opgeloste thermische beelden. De defectpositie wordt opgehaald om de thermische golfinterferentie minima te evalueren.

Subsurface Defect Localisatie door Gestructureerde Verwarming Met Laser Geprojecteerde Phot Thermische Thermografie

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de fabricage van ijzeroxide nanodeeltjes-shelled microbubbels (NSM's) door middel van zelfassemblage, synergetische magnetische, akoestische en optische responsiviteit in één nanotherapeutisch platform voor magnetische hyperthermie en fototherme combinatie kankertherapie.

Magnetische,akoestische en optisch-drievoudig-responsieve microbubbels voor magnetische hyperthermie en pothotothermale combinatie kankertherapie

Dit protocol presenteert technieken en methodologie die nodig zijn voor gerichte hyperthermische therapie in solide tumormodellen. De aanpak maakt gebruik van de fotothermische conversie van nabij-infrarood licht door intratumoraal geïnjecteerde gouden nanostaafjes om plaatselijke verwarming in de micro-omgeving van de tumor te induceren.

Induceren van gerichte milde hyperthermie in muizentumormodellen door fotothermische conversie van nabij-infrarood licht door intratumorale gouden nanostaafjes

Dit artikel presenteert de Frequency Domain Thermoreflectance (FDTR) techniek voor lokale niet-destructieve thermische karakterisering en beeldvorming.

De frequentiedomein-thermoreflectantietechniek voor thermische eigenschapsmetingen

Het effect van substrata stijfheid op cellulaire functie kan worden...

Het bestuderen van de effecten van Matrix stijfheid op de cellulaire functie gebruik Acrylamide-based Hydrogelen

In deze video gebruiken we een adenovirus het dragen van de Cre-recombinase-gen tot de primaire muis embryonale fibroblasten het dragen van een floxed Rac1 allel infecteren.

Adenovirus-gemedieerde Genetische Verwijdering van signaalmoleculen in gekweekte primaire muis embryonale fibroblasten

Leer hoe je RPE-cellen verwarmt met een 1,94 µm continu-golf Thulium laser om thermische effecten op cellen te bestuderen. Deze methode biedt nauwkeurige temperatuur- en tijdcontrole voor reproduceerbare resultaten.

Continu-golf Thulium Laser voor Verwarming Cultured Cells om Cellulaire Thermal Effecten te onderzoeken

Meer video's verkennen