Microfluïdische Buffer Exchange voor Interference-free Micro / nanodeeltjes Cel engineering

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van een handige, efficiënte en high-throughput microfluïdische zuiveringstechnologie om vrije nanodeeltjes van cellen te scheiden na celengineering met deze nanodeeltjes. De belangrijkste functie van deze technologie is het mogelijk maken van een snelle en efficiënte verwijdering van ongebonden nanodeeltjes. Na de celbehandeling verzamelen we alle cellen voor de verdere analyse. Deze microfluïdische celzuiveringstechnologie realiseert een efficiënte scheiding op basis van grootte dankzij de differentiële inertiële focusseringseffecten van cellen en nanodeeltjes in een spiraalvormig micro-apparaat.

Het kan tot 10 miljoen cellen per ml concentratie verwerken, wat zeer nuttig is voor de regeneratieve geneeskunde, evenals voor celverwerking van grote volumes. Deze technologie is zeer gewenst in het veld van de celengineering, waarbij vaak nanodeeltjes worden gebruikt om cellen te labelen voor beeldvormingsdoeleinden of functionele controle. De procedure zal worden gedemonstreerd door Hui Min Tay, een onderzoeksassistent uit mijn laboratorium, en door Doctor David Yeo, een postdoctoraal onderzoeker uit het laboratorium van Professor Xi.

Kweek mesenchymale stamcellen tot een confluentie van meer dan 80% op een zes-wellplaat voordat de cellen met de nanodeeltjes worden gelabeld. Kweek op dezelfde wijze THP-1-cellen tot een dichtheid van één miljoen cellen per milliliter. Los vervolgens één milligram silica-nanodeeltjes op in één milliliter van een tweehonderd micromolaire calciumkleurstofoplossing.

Laat de partikels vervolgens een nacht roeren. Fabriceer daarnaast PLGA calcium AM-nanodeeltjes volgens de methoden die beschreven zijn in de hier getoonde referentie. Meng óf 1 mg van de PLGA calcium AM-nanodeeltjes óf 150 µg van de calcium silica-nanodeeltjes in een 0,1% poly-l-lysine oplossing in water door de oplossing gedurende één minuut herhaaldelijk met een pipet op en neer te zuigen.

Laat het daarna 15 tot 20 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Centrifugeer vervolgens de nanodeeltjes. Verwijder het overtollige poly-l-lysine supernatant en resuspendeer de nanodeeltjes in één milliliter van het geschikte kweekmedium voor het te labelen celtype.

Voeg 1 milligrams van de gelabelde nanodeeltjes toe aan één milliliter medium voor elke miljoen cellen in kweek. Pipetteer het mengsel van cellen, nanodeeltjes en medium grondig gedurende één minuut. Incubeer het mengsel vervolgens gedurende ongeveer 24 hours.

Zodra de cellen zijn gelabeld, worden de stamcellen gedissocieerd en geoogst, en vervolgens opnieuw gesuspendeerd tot een concentratie van tussen 100 000 en 1 000 000 cellen per milliliter voor microfluïdische verwerking. Gebruik gelabelde THP-1 cellen bij dezelfde concentratie. Om het microfluïdische spiraalapparaat te vervaardigen, wordt eerst een siliconen wafer-mastermold geprepareerd met standaard microfabricagetechnieken.

Meng vervolgens 30 gram van het basis PDMS-prepolymeer en drie gram van een uithardingsmiddel grondig in een weegbootje. Ontgas het mengsel gedurende 60 minuten onder vacuüm om eventuele luchtbellen te verwijderen. Giet het PDMS-mengsel voorzichtig tot een hoogte van vijf tot 10 millimeter op de mastermold, die is voorzien van het spiraalkanaalontwerp.

Ontgas vervolgens het mengsel gedurende 60 minuten om eventuele luchtbellen te verwijderen. Herhaal dit proces totdat alle bellen zijn verdwenen. Plaats de wafer daarna in een oven en zorg ervoor dat de wafer tijdens het uitharden niet gekanteld is, om een constante apparaathoogte te garanderen.

Hard het PDMS uit bij 80 °C gedurende twee uur. Zodra het is afgekoeld, snijdt u het PDMS-spiraalapparaat uit met een scalpel en pelt u de PDMS-plaat voorzichtig van de mastermold. Gebruik vervolgens een scalpel om de randen van het apparaat bij te trimmen om een glad oppervlak voor de bonding te garanderen.

Gebruik vervolgens een biopsietpons van 1,5 millimeter om twee gaten voor de inlaat en twee gaten voor de uitlaat te maken. Was het device met isopropanol om eventuele resten te verwijderen. Droog het device vervolgens vijf minuten in een oven van 80 °C.

Gebruik vervolgens schilderstape om het onderste oppervlak van het PDMS-apparaat en één zijde van een glazen objectglas te reinigen. Plaats het objectglas en het PDMS-apparaat voorzichtig in een plasmakamer met de schone oppervlakken blootgesteld. Zet het plasmapower op maximaal, verlaag de kamerdruk totdat de kamer een roze kleur krijgt en stel de componenten gedurende 60 seconden bloot.

Verwijder vervolgens het objectglas en het PDMS-apparaat uit de kamer. Bond deze vervolgens door de met plasma behandelde oppervlakken stevig op elkaar te drukken. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen de twee oppervlakken gevangen raken.

Verwarm het gebonden apparaat gedurende twee uur op een warmteplaat die is ingesteld op 80 °C om de verbinding te versterken. Snijd twee stukken slang van 15 tot 20 cm lengte voor de inlaaten en bevestig aan één uiteinde van elke slang een naald van 23 gauge. Snijd vervolgens twee stukken van dezelfde slang van vijf tot 10 cm lengte voor de uitlaten en bevestig deze aan de uitlaatopeningen van het apparaat.

Prime het apparaat handmatig met een spuit met 70% ethanol voordat u de monsteranalyse start, totdat de vloeistof uit de uitlaatslang stroomt. Laat de ethanol minstens 30 seconden in het apparaat zitten om het te steriliseren. Laad vervolgens 30 milliliters gefilterde PBS met 1% BSA in een 60 milliliter spuit.

Laad daarnaast drie milliliter gelabelde cellen in een spuit van drie milliliter en controleer of er in geen van beide spuiten luchtbellen gevangen zitten. Verwijder eventuele luchtbellen door voorzichtig een paar druppels vloeistof uit de spuitmond te drukken. Sluit de inlaattips en slangen aan op de spuiten en bevestig de spuiten aan de spuitpompen.

Plaats de buisjes in de respectievelijke inlaatopeningen van het apparaat en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de slangetjes zitten. Nu de vloeistofdynamica is ingesteld, wordt het apparaat gemonteerd op een geïnverteerde fasecontrastmicroscoop voor real-time imaging tijdens het proces van cel sortering. Plaats een klein afvalbekertje en twee buisjes van 15 milliliter dicht bij het apparaat op de objecttafel van de microscoop.

Plaats de uitlaatslangen van beide uitgangen van het apparaat in het afvalbekerglas. Stel nu de stroomverhouding van monster tot sheath-buffer in op één op 10 door de stroomsnelheid van de monsterspuit op 120 µL per minuut en die van de sheath-spuit op 1.200 µL per minuut in te stellen. Laat het apparaat anderhalf minuut draaien om de stroomsnelheid te laten stabiliseren.

Gebruik een hogesnelheidscamera om onder bright-field met fasecontrast de aanwezigheid van inertieel gefocuste cellen nabij de binnenwand van het kanaal te bevestigen. Zodra een stationaire stroming is bereikt en het apparaat correct functioneert, worden de uitlaatslangen in verschillende vials geplaatst om afzonderlijke eluenten van de celuitlaat en de afvaluitlaat op te vangen. Dit apparaat is in staat om een gelabelde suspensie van THP-1 monocytaire cellen correct te scheiden van fluorescente silica-nanodeeltjes.

Hoge scheidingsrendementen werden behaald, zoals bevestigd door zowel high-speed imaging als flowcytometrie-analyse. De purificatiestrategie in één stap maakt continue terugwinning mogelijk van een gelabelde suspensie en adherente cellen die zijn gesuspendeerd in een verse bufferoplossing, zonder dat centrifugatie nodig is. Het apparaat is in staat tot een zeer efficiënte scheiding met zowel silica- als PLGA-nanodeeltjes en kan tot 10 miljoen cellen per milliliter scheiden met hetzelfde hoge rendement.

Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u cellen kunt labelen met nanodeeltjes, en hoe u de gelabelde cellen kunt zuiveren door overtollige ongebonden deeltjes te verwijderen met ons gespecialiseerde microfluïdische apparaat.