Microfluïdische Buffer Exchange voor Interference-free Micro / nanodeeltjes Cel engineering

Het algemene doel van deze procedure is om een gemakkelijke, efficiënte en hoogdoorvoerige microfluïdische zuiveringstechnologie te demonstreren om vrije nanodeeltjes van cellen te scheiden, na cel-engineering met de nanodeeltjes. De belangrijkste wens van deze technologie is om de snelle en efficiënte verwijdering van ongebonden nanodeeltjes mogelijk te maken. Na de celbewerkingsprocedure verzamelen we al onze ses-fa-tion. Deze microfluïdische celzuiveringstechnologie bereikt efficiënte op grootte gebaseerde scheiding dankzij de differentiële inertiële focuseffecten van cellen en nanodeeltjes in een spiraal micro-apparaat.

Het kan tot 10 miljoen cellen per mil concentratie verwerken, wat zeer nuttig is voor regeneratieve geneeskunde, evenals voor het verwerken van cellen in batchvolumes. Deze technologie is zeer gewenst op het gebied van cel-engineering, dat vaak nanodeeltjes gebruikt om cellen te bewerken, voor beeldvormingsdoeleinden of functiecontrole. Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Hui Min Tay, een onderzoeksassistent uit mijn laboratorium, evenals door Doctor David Yeo, een postdoctoraal onderzoeker van Professor Xi's laboratorium.

Kweek mesenchymale stamcellen tot groter dan 80% confluency op een zes-welplaat voordat u de cellen labelt met de nanodeeltjes. Kweek op vergelijkbare wijze THP-1 cellen tot een dichtheid van een miljoen cellen per milliliter. Los vervolgens een milligram silica nanodeeltjes op met een milliliter van tweehonderd micromolar calcium kleurstof oplossing.

En roer de deeltjes een nacht lang door. Fabriceer ook PLGA calcium AM nanodeeltjes met behulp van methoden beschreven in de hier getoonde referentie. Meng een milligram van de PLGA calcium AM nanodeeltjes of 150 microgram van de calcium silica nanodeeltjes in 0,1% poly-l-lysine oplossing in water door de oplossing gedurende een minuut op en neer te pipetteren.

En laat het vervolgens 15 tot 20 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Centrifugeer vervolgens de nanodeeltjes. Verwijder het overtollige poly-l-lysine supernatant en schud de nanodeeltjes opnieuw op in een milliliter van het juiste kweekmedium voor het celtype dat moet worden gelabeld.

Voeg 1 milligram van de gelabelde nanodeeltjes toe aan één milliliter medium voor elke een miljoen cellen in cultuur. Pipetteer het mengsel van cellen, nanodeeltjes en medium gedurende één minuut grondig. En incubeer vervolgens het mengsel gedurende ongeveer 24 uur.

Nadat ze zijn gelabeld, dissociëren en oogsten we de stamcellen en schud ze opnieuw op tot een concentratie van tussen 100.000 en 1.000.000 cellen per milliliter voor microfluïdische verwerking. Gebruik gelabelde THP-1 cellen bij dezelfde concentratie. Om het microfluïdische spiraalapparaat te fabriceren, bereidt u eerst een siliconen wafer master mal voor met behulp van standaard microfabricagetechnieken.

Meng vervolgens 30 gram van de basis PDMS prepolymer en drie gram van een verhardingsmiddel grondig in een weegboot. Ontgast het mengsel onder vacuüm gedurende 60 minuten om eventuele luchtbellen te verwijderen. Giet het PDMS-mengsel op de master mal, gepattend met het spiraalkanaalontwerp, zorgvuldig tot een hoogte van vijf tot tien millimeter.

Ontgast vervolgens het mengsel gedurende 60 minuten om eventuele luchtbellen te verwijderen. Herhaal dit proces totdat alle bellen zijn verdwenen. Plaats vervolgens de wafer in een oven en zorg ervoor dat de wafer niet kantelt tijdens het verharden, om een constante apparaathoogte te garanderen.

Verhard de PDMS gedurende twee uur op 80 graden Celsius. Zodra het is afgekoeld, snijdt u het PDMS spiraalapparaat uit met een scalpel en pel de PDMS plaat voorzichtig van de master mal. Gebruik vervolgens een scalpel om de randen van het apparaat bij te snijden om een ​​glad oppervlak voor het verbinden te garanderen.

Gebruik vervolgens een 1,5 millimeter biopsie pons om twee gaten voor de ingangen en twee gaten voor de uitgangen te maken. Was het apparaat met isopropanol om eventuele puinhopen te verwijderen. En droog het apparaat in een oven van 80 graden Celsius gedurende vijf minuten.

Gebruik vervolgens afscheidingstape om het onderste oppervlak van het PDMS-apparaat en een zijde van een glazen dia schoon te maken. Plaats de glazen dia en het PDMS-apparaat voorzichtig in een plasmakamer met de schone oppervlakken blootgesteld. Zet de plasmakracht aan maximaal, verlaag de kamerdruk totdat de kamer roze van kleur wordt, en leg de componenten 60 seconden bloot.

Verwijder vervolgens de dia en het PDMS-apparaat uit de kamer. En verbind ze door de plasma-belichte oppervlakken stevig op elkaar te drukken. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen de twee oppervlakken vastzitten.

Verwarm het verbonden apparaat op een hotplate ingesteld op 80 graden Celsius gedurende twee uur om de verbinding te versterken. Snijd twee stukken buis van 15 tot 20 centimeter lang voor de ingangen, en bevestig een 23 gauge naald aan een uiteinde van elk buis. Snijd vervolgens twee stukken van dezelfde buis van vijf tot tien centimeter lang voor de uitgangen en bevestig ze aan de uitgangsgaten van het apparaat.

Voordat u het monster laat lopen, primeer het apparaat handmatig met een spuit bevattende 70% ethanol totdat het uit de uitgangsbuis stroomt. Laat de ethanol minimaal 30 seconden in het apparaat zitten om het te steriliseren. Laad vervolgens 30 milliliter gefilterd PBS met 1% BSA in een 60 milliliter spuit.

Laad ook drie milliliter gelabelde cellen in een drie milliliter spuit en controleer of er geen luchtbellen in een van beide spuiten zitten. Verwijder eventuele luchtbellen door voorzichtig een paar druppels vloeistof uit de spuitmond te druppelen. Verbind de ingangsspuittips en -buizen met de spuiten en zet de spuiten vast op de spuitpompen.

Voer de buizen in hun respectievelijke ingangen van het apparaat in en zorg ervoor dat er geen bellen langs de buizen zijn. Met de fluidica nu ingesteld, monteer het apparaat op een omgekeerde fasecontrastmicroscoop voor real-time beeldvorming