Name: Microfluïdische Buffer Exchange voor Interference-free Micro / nanodeeltjes Cel engineering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Leer microfluïdische bufferwissel voor interferentievrije celengineering met micro- en nanodeeltjes. Deze methode scheidt vrije nanopartikels efficiënt van geëngineerde cellen voor regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De vrijgevige donatie van THP-1 cellen door Dr. Mark Chong en de assistentie bij microfabricatie door Dr. Yuejun Kang en Dr. Nishanth V. Menon (School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University) worden met grote dankbaarheid erkend. Dit project werd gefinancierd door het NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University). H.W.H. werd ondersteund door een postdoctoraal fellowship van de Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine).

1. nanodeeltjes (NP) Labeling van mesenchymale stamcellen en monocyten <ol><li> Cultuur mesenchymale stamcellen (MSCs) in Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en antibiotica ≥80% confluentie voorafgaand aan etikettering. Evenzo cultuur THP-1-cellen (ATCC) in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium aangevuld met 10% FBS tot een dichtheid van ~ 10 6 cellen / ml. </li><li> Load silica NP (~ 500 pm) met calceïne kleurstof-oplossing (200 M) met behulp van &#39;s nachts roeren. Fabriceren PLGA-calceïne AM (CAM) met behulp van een protocol eerder beschreven. 22 <ol><li> Los 250 g CAM en 100 mg PLGA (50:50) in chloroform bij 4 ° C. </li><li> Genereren enkelvoudige NP emulsie onder toepassing van een homogeniseerinrichting met hoge snelheid (13.600 xg, 60 sec) bij kamertemperatuur. Damp het chloroform in een chemische kap (≥3 uur) voordat collectie met behulp van centrifugeren (3400 xg gedurende 5 minuten), het wassen (double Distiwater gevuld), vriesdrogen en opslag -20 ° C. </li></ol></li><li> Incubeer CAM-PLGA NPs (1 mg) of calceïne silica NP (150 ug) in 0,01% poly-L-lysine (PLL) oplossing bij kamertemperatuur gedurende 15 - 20 min. </li><li> Centrifugeer bij 3400 xg gedurende 5 minuten om overtollige PLL supernatant vóór NP resuspensie verwijderen in 1 ml respectievelijke kweekmedium. </li><li> Incubeer de NP met cellen (MSCs of THP-1, ~ 1-2 x 10 6 cellen in totaal) gedurende ongeveer 24 uur (0,1 mg · ml -1 labeling concentratie). </li><li> Distantiëren en oogst de gemerkte hechtende MSCs middels 2 ml 0,25% trypsine (5 min, 37 ° C) en blussen met 6 ml DMEM. Spin down de cellen op (1000 xg, 4 min) en resuspendeer tot een concentratie van 10 mei-10 juni cellen / ml voor microfluïdische verwerking. Gebruik gemerkte THP-1-cellen (10 mei-10 juni cellen / ml) rechtstreeks microfluidics zuivering. </li></ol> 2. microfluïdische apparaat Voorbereiding <ol><li> Device Fabrication <ol><li> Fabriceren spiraal de microfluïdische inrichting (500 urn (w) x 115 urn (h)) met polydimethylsiloxaan (PDMS) vanaf een commerciële kit met standaard zachte lithografie stappen. 23 </li><li> Meng 30 g base prepolymeer en 3 g verharder grondig in een gewicht van de boot. De-gas van het mengsel in een exsiccator gedurende 60 minuten om eventuele luchtbellen te verwijderen. </li><li> Giet het PDMS mengsel op de siliciumwafer meester mal patroon met de spiraalvormige kanaal ontwerp zorgvuldig tot een hoogte van ~ 5-10 mm. </li><li> De-gas van het mengsel in een exsiccator vacuüm gedurende 60 minuten opnieuw om eventuele luchtbellen te verwijderen. Herhaal dit proces totdat alle luchtbellen worden geëlimineerd. </li><li> Genezen van de PDMS mengsel in een 80 ° C oven gedurende 2 uur totdat het PDMS is ingesteld. Zorg ervoor dat de wafer wordt tijdens het uitharden een constante hoogte apparaat niet gekanteld. </li><li> Knip de PDMS spiraal apparaat met behulp van een scalpel en zorgvuldig schil de PDMS plaat van de master mal. </li><li> Trim de randen van de inrichting met een scalpel glad oppervlak te verkrijgen voor binding. </li><li> Punch twee gaten (1,5 mm) voor de inlaten en twee gaten (1,5 mm) voor het uitlaten op het PDMS apparaat met behulp van een 1,5 mm biopsie puncher. </li><li> Was het apparaat met isopropanol (IPA) om eventueel vuil van het apparaat in een 80 ° C oven te verwijderen en te drogen gedurende 5 minuten. </li><li> Reinig de onderkant van de PDMS apparaat (met channel features) met behulp van plakband. </li><li> Reine zijde van een glasplaatje (2 &quot;door 3&quot;) met plakband. </li><li> Zorgvuldig te plaatsen en bloot de gereinigde oppervlakken van het PDMS apparaat en glaasje in de kamer van een plasma schoner en deze te onderwerpen aan vacuüm gedurende 60 sec. Vervolgens schakelt de plasma macht om maximum en laat de kamer druk totdat de kamer draait roze van kleur. <ol><li> Expose de oppervlakken aan de lucht plasma voor 60 sec. Het plasma zorgt reactieve species op de blootgestelde oppervlakken van de PDMS en glas die strakke binding geactiveerd wanneer in fysieke gebrachtal contact. Schakel de plasma stroom en druk van het plasma reiniger aan het apparaat glasplaatje los te halen. </li></ol></li><li> Binden de PDMS apparaat en glasplaatje samen door stevig te drukken op de plasma blootgestelde oppervlakken en ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen gevangen zitten tussen de twee oppervlakken. </li><li> Verwarm de gebonden apparaat met een kookplaat ingesteld op 80 ° C gedurende 2 uur om de binding te versterken. </li></ol></li><li> Device Operation <ol><li> Snijd twee buisstukken (1,52 mm OD) van ~ 15 - 20 cm van de inlaat spuiten en bevestig een injectiespuit (gauge 23) aan één uiteinde van elke buis. </li><li> Snijd twee buisstukken (1,52 mm OD) van ~ 5-10 cm van de uitlaten en hechten aan de afvoergaten van het PDMS apparaat. </li><li> Voorafgaand aan de lopende proeven, handmatig prime het apparaat met een spuit met 70% ethanol tot het stroomt uit de uitlaat slang. Laat de ethanol zitten voor 30 sec tot 1 min naar de inrichting te steriliseren. </li><li> Laad 30 ml gefiltreerd(0,2 um porie) schede buffer (fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,1% runderserumalbumine (BSA)) in de 60 ml spuit en zet de spuit op een injectiepomp. Stel de pomp op de juiste instellingen (Spuit maat: 60 ml, Volume: 60.000 pl). Noot: De toevoeging van BSA PBS is cel-cel binding en niet-specifieke binding tussen de cellen en de PDMS apparaat te verkorten. </li><li> Load 3 ml van gelabelde cellen in de 3 ml spuit en zet de spuit op een aparte injectiepomp. Stel de pomp op de juiste instellingen (Spuit size: 3 ml, Volume: 3000 pl). </li><li> Controleer of er geen luchtbellen gevangen zitten in het spuiten van een stabiele stroom te verzekeren. Verwijder eventuele luchtbellen door voorzichtig uitstoten paar druppels vloeistof uit het mondstuk. </li><li> Sluit de inlaat spuit tips en slang aan op de spuiten, en steek ze in de respectieve inlaten van het apparaat (mantel en sample inlaat). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen langs de buis. </li><li> Monteer de apparaten op een omkerened fase-contrast microscoop voor real-time beeldvorming tijdens cel sorteerproces. </li><li> Bevestig een klein afval beker en twee 15 ml buizen in de buurt van het apparaat op de microscoop podium met behulp van lijmen. </li><li> Plaats de uitlaat buizen in het afval beker. </li><li> Stel de stroomverhouding voor monster sheath buffer 01:10 en beginnen beide spuitpompen het sorteerproces starten (Voorbeeld: 120 pl / min voor monster spuit en 1200 pl / min gedurende sheath injectiespuit kanaal stromingssnelheid ~ 0,38 m / sec ). </li><li> Voer het apparaat gedurende 1,5 min voor het debiet te stabiliseren. Dit kan worden bevestigd door de aanwezigheid van inertially gerichte cellen in de buurt van het kanaal binnenwand onder felle-veld met fase contrast met behulp van een high-speed camera (~ 5000 - 10.000 frames per seconde (fps), belichtingstijd: 10-50 psec). </li><li> Plaats de uitlaat buizen in verschillende buizen naar de elutiemiddelen verzamelen uit de cel uitlaat en uitlaat afval. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wiraja, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+technology+for+tracking+cells%27+status+%26+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Ther%22%5BJournal%5D)">Aptamer technology for tracking cells' status & function.</a> Mol. Cell. Ther. 2, 33(2014).</li>
<li>Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosensors+for+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Nanosensors for Regenerative Medicine.</a> J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).</li>
<li>Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+imaging+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Clinical imaging in regenerative medicine.</a> Nat. Biotechnol. 32, 804-818 (2014).</li>
<li>Soenen, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+toxicity+of+inorganic+nanoparticles%3A+Common+aspects+and+guidelines+for+improved+nanotoxicity+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation.</a> Nano Today. 6, 446-465 (2011).</li>
<li>Donaldson, K., Poland, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotoxicity%3A+challenging+the+myth+of+nano-specific+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanotoxicity: challenging the myth of nano-specific toxicity.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 24, 724-734 (2013).</li>
<li>Veiseh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-+and+shape-dependent+foreign+body+immune+response+to+materials+implanted+in+rodents+and+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Size- and shape-dependent foreign body immune response to materials implanted in rodents and non-human primates.</a> Nat. Mater. 14, 643-651 (2015).</li>
<li>Jones, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+clearance+is+governed+by+Th1%2FTh2+immunity+and+strain+background%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle clearance is governed by Th1/Th2 immunity and strain background.</a> J. Clin. Invest. 123, 3061-3073 (2013).</li>
<li>Marchi, L. F., Sesti-Costa, R., Chedraoui-Silva, S., Mantovani, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+methods+for+the+isolation+of+murine+blood+neutrophils+with+respect+to+the+release+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+and+the+expression+of+immunological+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of four methods for the isolation of murine blood neutrophils with respect to the release of reactive oxygen and nitrogen species and the expression of immunological receptors.</a> Comp. Clin. Pathol. 23, 1469-1476 (2014).</li>
<li>Morton, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+metamaterials%3A+Microfabricated+arrays+to+steer%2C+refract%2C+and+focus+streams+of+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+of+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic metamaterials: Microfabricated arrays to steer, refract, and focus streams of biomaterials.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 105, 7434-7438 (2008).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker-specific+sorting+of+rare+cells+using+dielectrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+of+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Marker-specific sorting of rare cells using dielectrophoresis.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 102, 15757-15761 (2005).</li>
<li>Cummings, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streaming+dielectrophoresis+for+continuous-flow+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Eng.+Med.+Biol.+Mag%22%5BJournal%5D)">Streaming dielectrophoresis for continuous-flow microfluidic devices.</a> IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 22, 75-84 (2003).</li>
<li>Augustsson, P., Persson, J., Ekstrom, S., Ohlin, M., Laurell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decomplexing+biofluids+using+microchip+based+acoustophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Decomplexing biofluids using microchip based acoustophoresis.</a> Lab Chip. 9, 810-818 (2009).</li>
<li>Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+inertial+focusing%2C+ordering%2C+and+separation+of+particles+in+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+of+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 104, 18892-18897 (2007).</li>
<li>Hur, S. C., Henderson-MacLennan, N. K., McCabe, E. R. B., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deformability-based+cell+classification+and+enrichment+using+inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Deformability-based cell classification and enrichment using inertial microfluidics.</a> Lab Chip. 11, 912-920 (2011).</li>
<li>Mach, A. J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+scalable+blood+filtration+device+using+inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioengin%22%5BJournal%5D)">Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics.</a> Biotechnol. Bioengin. 107, 302-311 (2010).</li>
<li>Gossett, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+manipulation+and+transfer+of+microparticles+across+laminar+fluid+streams%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Inertial manipulation and transfer of microparticles across laminar fluid streams.</a> Small. 8, 2757-2764 (2012).</li>
<li>Amini, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+fluid+flow+using+sequenced+microstructures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Engineering fluid flow using sequenced microstructures.</a> Nat. Commun. 4, 1826(2013).</li>
<li>Sollier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+microfluidic+programming+of+microparticle-laden+flows+for+solution+transfer+around+cells+and+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Inertial microfluidic programming of microparticle-laden flows for solution transfer around cells and particles.</a> Microfluid. Nanofluid. 19, 53-65 (2015).</li>
<li>Lee, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+biophysical+markers+predictive+of+mesenchymal+stromal+cell+multipotency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+of+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Multivariate biophysical markers predictive of mesenchymal stromal cell multipotency.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 111, E4409-E4418 (2014).</li>
<li>Hou, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+retrieval+of+circulating+tumor+cells+using+centrifugal+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces.</a> Sci. Rep. 3, 1259(2013).</li>
<li>Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+and+drug-resistance+profiling+of+bacteremias+using+inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics.</a> Lab Chip. 15, 2297-2307 (2015).</li>
<li>Yeo, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference-free+Micro%2Fnanoparticle+Cell+Engineering+by+Use+of+High-Throughput+Microfluidic+Separation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Inter%22%5BJournal%5D)">Interference-free Micro/nanoparticle Cell Engineering by Use of High-Throughput Microfluidic Separation.</a> ACS Appl. Mater. Inter. 7, 20855-20864 (2015).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Edit%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Angew. Chem. Int. Edit. 37, 550-575 (1998).</li>
<li>Lee, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cell+cycle+synchronization+using+inertial+forces+in+spiral+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">High-throughput cell cycle synchronization using inertial forces in spiral microchannels.</a> Lab Chip. 11, 1359-1367 (2011).</li>
<li>Kuntaegowdanahalli, S. S., Bhagat, A. A., Kumar, G., Papautsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+microfluidics+for+continuous+particle+separation+in+spiral+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Inertial microfluidics for continuous particle separation in spiral microchannels.</a> Lab Chip. 9, 2973-2980 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De DFF cel zuiveringstechnologie hierin beschreven maakt een snelle en voortdurende scheiding van gelabelde cellen in een high throughput manier. Deze scheiding benadering is ideaal voor grote monstervolume of hoge celconcentratie monster verwerking, en beter dan conventionele een membraan filtratie die gevoelig zijn voor verstopping na langdurig gebruik. Evenzo affiniteit gebaseerde magnetische scheiding vereist extra cel labeling stappen die omslachtig en duur zijn. De gezuiverde cellen is aangetoond dat het etiket ag...

Engineering-cellen door middel beladen micro / nanodeeltjes (NP) is een eenvoudige genomische integratie-vrij en veelzijdige methode Bio-imaging vermogen verbeteren en versterken / aanvullen zijn natieve therapeutische eigenschappen regeneratieve geneeskunde. 1-3 cellulaire veranderingen worden bereikt door het merken van de plasmamembraan of cytoplasma met een sterke concentratie van de agent geladen NP&#39;s aan de bindingsplaatsen te verzadigen. Echter, een belangrijk nadeel van deze werkwijze is de grote hoeveelheid ongebonden deeltjes achterblijft in oplossing na cel keurmerkprocessen, die mogelijk nauwkeurige identificatie van deeltjes gemanipuleerde cellen kunnen verwarren of compliceren therapeutische resultaten. 4,5 Bovendien blootstelling aan NPs met transformerende middelen (groeifactoren, corticosteroïden, enz.) bij te hoge concentratie kan cytotoxiciteit en verkeerd gerichte blootstelling kan onbedoelde gevolgen op non-target cellen te induceren. Zelfs deeltjesvormige dragers omvattende of &quot;biocompatibel&quot; stoffen [bijvoorbeeld poly (melkzuur co-glycolzuur), PLGA] kan aanzetten potente immune cel responsen onder bepaalde omstandigheden ook. 6 Dit vooral gevaarlijk bij personen met een aangetast immuunsysteem (bijvoorbeeld reumatoïde artritis) die mogelijk vertragingen systemische klaring nanodeeltjes. 7 Aldus efficiënte verwijdering van vrije deeltjes vóór de invoering van deeltjes gemanipuleerde cellen is van groot belang voor toxiciteitsprofiel minimum te beperken en verkeerd blootstelling aan stof geladen deeltjes in vivo. Conventionele gradiënt centrifugatie wordt vaak gebruikt om gemanipuleerde cellen te scheiden van vrije deeltjes maar omslachtig en gebruikt in batch mode. Bovendien schuifspanning ervaren door cellen bij hoge snelheid centrifugatie en de bestanddelen van de dichtheidsgradiënt medium kan celintegriteit en / of invloed celgedrag beschadigen. 8 Microfluidics is een aantrekkelijk alternatief met sevrale scheiding technologieën, waaronder deterministische laterale verplaatsing (DLD) 9, dieletrophoresis 10,11 en acoustophoresis 12 ontwikkeld voor kleine deeltjes scheiding en buffer uitwisseling toepassingen. Echter, deze methoden lijden aan lage omzet (1-10 pl · min - 1) en zijn gevoelig voor verstopping problemen. Actieve scheidingen zoals dielectrophoresis-gebaseerde werkwijzen vereisen ook verschillen in intrinsieke diëlektroforetische celfenotypen of extra cel labeling stappen om scheiding te bereiken. Een veelbelovende benadering omvat inertie microfluïdische - de zijdelingse migratie van deeltjes of cellen in stroomlijnt richten op verschillende posities vanwege overheersende opwaartse krachten (F l) hoog Reynoldsgetal (Re) 13 Door de hoge stromingsomstandigheden en superieure maat resolutie. Het is vaak geëxploiteerd voor-afmeting gebaseerd celscheiding 14,15 en buffer uitwisseling toepassingen. 16-18 However, prestaties bufferuitwisseling blijft slecht met ~10-30% verontreiniging oplossing de afgescheiden cellen meestal dicht bij de grens tussen oorspronkelijke en nieuwe bufferoplossingen blijven. 16-18 Belangrijker is dat de grootteverdeling van doelcellen heeft vergelijkbare bereiken zijn nauwkeurige focussering en inertiale scheiding van de oorspronkelijke bufferoplossing die een probleem stelt met name bij de verwerking van heterogene afmetingen celtypes zoals mesenchymale stamcellen (MSCs). 19 We hebben eerder ontwikkelde een nieuwe inertie microfluidics celsortering techniek genaamd Dean Flow fractionering (DFF) voor het isoleren van circulerende tumorcellen (CTC&#39;s) 20 en bacteriën 21 uit vol bloed met behulp van een 2-inlaat, 2-outlet spiraal microkanaal apparaat. In deze video protocol, zullen we het proces van etikettering THP-1 (humane acute monocytische leukemie cellijn) surséance monocytische cellen (~ 15 pm) en MSC (10-30 pm) met calceïne-l beschrijvenoaded NP, gevolgd door fabricage en werking van de spiraalvormige DFF microdevice efficiënte terugwinning van gemerkte cellen en verwijdering van ongebonden NPs. 22 Deze stap zuiveringsstrategie maakt continue terugwinning van gelabelde suspensie en hechtende cellen gesuspendeerd in verse buffer oplossing zonder centrifugeren. Bovendien kan het tot verwerken tot 10 miljoen cellen · ml -1, een celdichtheid vatbaar regeneratieve geneeskunde toepassingen.

<table><tbody><tr><td>Cellijnen &amp; Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mesenchymale Stamcellen (MSCs)</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s gemodificeerd Eagle&rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal Runderserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 monocytcellen (THP-1)</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media</td><td>Lonza</td><td>12-702F</td><td></td></tr><tr><td>Reagentia &amp; Materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,01% poly-L-lysine (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Spuit</td><td>BD</td><td>302113</td><td>Spuit 3 ml Luer-Lock</td></tr><tr><td>60 ml Spuit</td><td>BD</td><td>309653</td><td>Spuit 60 ml Luer-Lock</td></tr><tr><td>Rund Serum Albumine (BSA)</td><td>Biowest</td><td>P6154-100GR</td><td></td></tr><tr><td>Calcein, AM (CAM)</td><td>Life Technologies</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>#P/7507/17</td><td>HPLC Grade 2,5 L</td></tr><tr><td>Fosfaat-Buffered Saline (PBS)</td><td>Lonza</td><td>17-516Q/12</td><td></td></tr><tr><td>Vlakke Microscoopglazen</td><td>Fisher Scientific</td><td>FIS#12-550D</td><td>75 x 25 x 1 mm3</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxaan (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD&reg; 184</td><td></td></tr><tr><td>Scotch tape</td><td>3M</td><td>21200702044</td><td>18 mm x 25 m</td></tr><tr><td>Silica NPs (&sim;200 &mu;m)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>748161</td><td>Poriegrootte 4 nm</td></tr><tr><td>Spuittip</td><td>JEC Technology</td><td>7018302</td><td>23 G 0,013 x 0,25</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25%)</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Slang</td><td>Spectra-Teknik</td><td>06419-01</td><td>0,02 x 0,06" 100</td></tr><tr><td>Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2191</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopsie punch</td><td>Harris Uni-Core</td><td>69036-15</td><td>1,50 mm</td></tr><tr><td>Exsiccator</td><td>Scienceware</td><td>111/4 IN OD</td><td></td></tr><tr><td>High-speed Camera</td><td>Phantom&nbsp;</td><td>V9.1</td><td></td></tr><tr><td>Inverteerde fasecontrastmicroscoop&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-002</td><td></td></tr><tr><td>Spuitpomp</td><td>Chemyx</td><td>CX Fusion 200</td><td></td></tr></tbody></table>

microfluïdische buffer exchange voor interference-free micro / nanodeeltjes cel engineering

Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering

Techniek cellen met actieve bestanddeel-loaded micro / nanodeeltjes (NP) wordt een steeds populaire methode om native therapeutische eigenschappen te verbeteren, in staat bio beeldvorming en controle cel fenotype. Een kritische nog onvoldoende gericht probleem is het grote aantal deeltjes die gebonden na labeling cel die niet gemakkelijk kan worden verwijderd met gebruikelijke centrifugatie blijven. Dit leidt tot een toename van bio imaging achtergrondruis en kan transformerende effecten op aangrenzende niet-doelwitcellen geven. In dit protocol, presenteren we een inertie-microfluidics gebaseerde buffer uitwisseling strategie genoemd als Dean Flow fractionering (DFF) naar gelabelde cellen uit vrije NP&#39;s in een high throughput wijze efficiënt te scheiden. De ontwikkelde spiraal microdevice vergemakkelijkt collecteren (&gt; 90% celherstel) van gezuiverde cellen (THP-1 en MSC&#39;s) gesuspendeerd in nieuw bufferoplossing, terwijl het bereiken van&gt; 95% afname van ongebonden fluorescerende kleurstof of kleurstof-geladen NP (silica of PLGA). Deze enkele-stap-afmeting gebaseerd cell zuiveringsstrategie maakt hoge verwerkingssnelheid cel (10 6 cellen / min) en is zeer bruikbaar voor grote celvolume zuivering van micro / nanodeeltjes gemanipuleerde cellen storingsvrije klinische toepassing te bereiken.

Na het labelen van de cellen met bio-imaging agens geladen NP nachts, worden de gelabelde cellen (met vrije deeltjes) geoogst en gezuiverd door DFF spiraalvormige microdevice gratis NP verwijderen in een enkele stap proces (Figuur 1A). De 2-inlaat, 2-outlet spiraal microkanalenplaat is ontworpen door engineering software en microfabricated gebruik van SU-8. De gestructureerde siliciumwafel wordt vervolgens gebruikt als een matrijs voor PDMS replica vormen met behulp van ...

Dit protocol beschrijft het gebruik van een inertiale-microfluidics gebaseerde buffer wisselkoersstrategie micro / nanodeeltjes gemanipuleerde cellen te zuiveren efficiënte uitputting van ongebonden deeltjes.

Microfluïdische Buffer Exchange voor Interference-free Micro / nanodeeltjes Cel engineering

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic ...

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van een handige, efficiënte en high-throughput microfluïdische zuiveringstechnologie om vrije nanodeeltjes van cellen te scheiden na celengineering met deze nanodeeltjes. De belangrijkste functie van deze technologie is het mogelijk maken van een snelle en efficiënte verwijdering van ongebonden nanodeeltjes. Na de celbehandeling verzamelen we alle cellen voor de verdere analyse. Deze microfluïdische celzuiveringstechnologie realiseert een efficiënte scheiding op basis van grootte dankzij de differentiële inertiële focusseringseffecten van cellen en nanodeeltjes in een spiraalvormig micro-apparaat.Het kan tot 10 miljoen cellen per ml concentratie verwerken, wat zeer nuttig is voor de regeneratieve geneeskunde, evenals voor celverwerking van grote volumes. Deze technologie is zeer gewenst in het veld van de celengineering, waarbij vaak nanodeeltjes worden gebruikt om cellen te labelen voor beeldvormingsdoeleinden of functionele controle. De procedure zal worden gedemonstreerd door Hui Min Tay, een onderzoeksassistent uit mijn laboratorium, en door Doctor David Yeo, een postdoctoraal onderzoeker uit het laboratorium van Professo

microfluidic-buffer-exchange-for-interference-free-micronanoparticle

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dielectrophoresis (DEP) is een effectieve methode om cellen te manipuleren. Printed circuit boards (PCB's) kan bieden goedkope, herbruikbare en effectief elektroden voor contact-free celmanipulatie binnen microfluïdische apparaten. Door het combineren van PDMS-based microfluïdische kanalen met dekglaasjes op PCB's, tonen we aan kralen en cel-manipulatie en scheiding binnen multichannel microfluïdische apparaten.

Scheiden Kralen en cellen in Multi-channel Microfluïdische apparaten met behulp van Dielectrophoresis en Laminar Flow

This video demonstrates a microfluidic system for a magnetic nanoparticle-based immunoassay. The detection system utilizes a microfluidic device incorporating a magnetic trap within its channels. Pre-formed immunocomplexes, comprised of antigen-coated magnetic nanoparticles bound to primary and peroxidase-conjugated secondary antibodies, are introduced into the channels. The immunocomplexes become captured in the porous magnetic trap upon applying an external magnetic field. Using a fluorogenic...

A Magnetic Nanoparticle-Based Immunoassay Using a Microfluidic Device

In dit artikel presenteren we een microfluïdische chip voor single cell analyse. Het maakt de kwantificering van intracellulaire eiwitten, enzymen, cofactoren, en tweede boodschappers via fluorescentie assays of immunoassays.

Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen

Dit protocol beschrijft een systeemarchitectuur voor het uitvoeren van geautomatiseerde scheidingen van kleine volumes (0,15–1,5 ml) deeltjes met behulp van een microfluïdisch apparaat, en bespreekt methoden om de prestaties en werking van acoustofluïdische apparaten te optimaliseren.

Een microfluïdische platform voor Precision Small-volume monster verwerking en het gebruik ervan te Grootte Aparte Biologische Deeltjes met een akoestische microdevice

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren en kweken van enkele cellen met een microfluïdische platform, dat een nieuw microwell-ontwerpconcept gebruikt om hoogwaardige isolatie van enkele cellen en langdurige klonale kweek mogelijk te maken.

Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur

We stellen een eenvoudige zelfassemblerende techniek voor van silica colloïdale nanodeeltjes om een nanofluïdische kruising te creëren tussen twee microkanalen in polydimethylsiloxaan (PDMS). Met behulp van deze techniek werd een nanoporeuze parelmembraan met een poriegrootte tot ~45 nm gebouwd binnen een microkanaal en toegepast op elektrokinetische preconcentratie van DNA-monsters.

Het creëren van Sub-50 Nm nanofluidic Knooppunten in PDMS microfluïdische chip via Self-assemblageproces van colloïdale deeltjes

Het protocol voor een nieuwe ionenconcentratie polarisatie (ICP) platform dat de voortplanting van de ICP zone kan stoppen, ongeacht de omstandigheden beschreven. Dit unieke vermogen van het platform ligt in het gebruik van fusie ion uitputting en verrijking, die twee polariteiten van de ICP fenomeen zijn.

Het samenvoegen van Ion Concentratie polarisatie tussen Naast elkaar Ion Exchange membranen aan de voortplanting van de Polarisatie Zone blokkeren

Het huidige protocol beschrijft een pneumatisch microfluïdisch platform dat kan worden gebruikt voor een efficiënte microdeeltjesconcentratie.

Pneumatisch aangedreven microfluïdisch platform voor microdeeltjesconcentratie

Microfluïdica is een krachtig hulpmiddel voor de ontwikkeling van diagnostische tests. Dure apparatuur en materialen, evenals bewerkelijke fabricage- en handlingtechnieken, zijn echter vaak vereist. Hier beschrijven we het fabricageprotocol van een acryl microfluïdisch apparaat voor magnetische micro- en nanodeeltjesgebaseerde immunoassays in een goedkope en eenvoudig te gebruiken omgeving.

Computer numerieke controle Micromilling van een microfluïdisch acrylapparaat met een gespreide beperking voor magnetische immunoassays op basis van nanodeeltjes

Dit protocol beschrijft een eenvoudig proces waarbij gebruik wordt gemaakt van handige plastic micromallen voor eenvoudige micro-embossingbewerkingen om microkanalen te fabriceren op nanogefibrilleerd cellulosepapier, waarbij een minimale breedte van 200 μm wordt bereikt.

Microembossing: een handig proces voor het vervaardigen van microkanalen op microfluïdica op basis van nanocellulosepapier

Het protocol beschrijft een geavanceerd microfluïdisch platform om de cytokinesecretiedynamiek van individuele menselijke perifere mononucleaire bloedcellen kwantitatief te meten. Het platform meet tot drie cytokines parallel (IL-6, TNFα en IL-1β) voor elke individuele cel die wordt gestimuleerd met lipopolysaccharide als voorbeeld.

Microfluïdische benadering om gelijktijdige en sequentiële cytokinesecretie van individuele polyfunctionele cellen op te lossen 

Leer microfluïdische bufferwissel voor interferentievrije celengineering met micro- en nanodeeltjes. Deze methode scheidt vrije nanopartikels efficiënt van geëngineerde cellen voor regeneratieve geneeskunde.

Microfluïdische Buffer Exchange voor Interference-free Micro / nanodeeltjes Cel engineering

Meer video's verkennen