Fabricage van Inverted Colloïdaal Crystal Poly (ethyleen glycol) Steiger: Een drie-dimensionale Cultuur van de Cel Platform for Liver Tissue Engineering

Het algemene doel van deze procedure is het vervaardigen van PEG-gebaseerde omgekeerde colloïdale kristalsteigers met een extracellulaire matrix voor toepassingen in leverweefselengineering. Leverweefselengineering is een veelbelovend vakgebied binnen de weefselengineering en regeneratieve geneeskunde. We creëren een 3D-engineered steiger die levercellen in staat stelt om hun functie gedurende een lange periode te behouden.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot geneesmiddelentesten, aangezien levercellen die met dit systeem zijn gekweekt hun functie mogelijk langer behouden en beter reageren op medicatie. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in tissue engineering, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals systemen die gebruikmaken van stamcellen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Hitomi, een promovendus uit mijn laboratorium.

Om de mallen voor de micro-beads voor te bereiden, knip eerst de uiteinden van hittebestendige microcentrifugebuisjes van 0.2 milliliter af op het niveau van 40 µL. Gebruik waterbestendige lijm om de bovenkant van de afgeknipte buisjes op glazen microscoopdekglaasjes te plakken en lijm vervolgens rondom de mallen. Vervang daarna het water in een vial met polystyreen microsferen door 70% ethanol.

Plaats de bolloysing in een ultrasoonbad en soniceer het mengsel gedurende drie minuten op 30 watt om de geaggregeerde bollen los te maken. Zodra de microsferen zijn voorbereid, pipetteert u 100 µL ethanol in elk van de vormen. Snijd vervolgens vier millimeter van de bovenkant van een 200 µL pipetpunt af en gebruik deze om tweemaal 25 µL van de polystyreenmicrosferen in de vorm te pipetteren.

Plaats de mallen op een kippende schudmachine en stel deze in op 120 RPM. Laat de monsters een nacht op de schudmachine staan. Plaats de mallen de volgende dag onder een microscoop en controleer of de sferen hexagonaal geordend zijn.

Laat de ethanol gedurende twee nachten bij kamertemperatuur verdampen. Plaats vervolgens het complex van mal en kraaltjes voorzichtig gedurende zes uur in een oven van 130 degrees Celsius om de polystyreenkraaltjes te annealen en het negatief van het 3D-steigerformaat te vormen. Synthetiseer eerst polyethyleenglycoldiacrylaat-macromeren met behulp van gevestigde protocollen zoals beschreven in deze twee referenties.

Bereid vervolgens een 50% oplossing van PEGDA in gedeïoniseerd water en centrifugeer het mengsel totdat het volledig is opgelost. Voeg voor scaffolds geconjugeerd aan extracellulaire matrix een extra 10% krill olie PEG NHS toe aan de 50% PEGDA-oplossing. Bereid daarna een 20% stamoplossing van de foto-initiator in 70% ethanol.

Voeg 50 µL van de foto-initiatoroplossing toe per milliliter van het PEGDA-mengsel. Vortex vervolgens het mengsel gedurende één minuut. Pel daarna de vormen van de glazen objectglazen af, duw de roosters voorzichtig uit met een spatel en plaats ze in aparte centrifugebuisjes van 1,5 ml.

Pipetteer 300 microliters van de PEGDA-oplossing in elke buis en centrifugeer de buizen vervolgens zodat de PEGDA-oplossing in het polystyreenrooster kan infiltreren. Verwijder daarna het rooster met een pincet uit de buis en dep voorzichtig het overtollige PEGDA-oplossing van het oppervlak. Plaats het rooster op met paraffinefolie bedekt glas, met het vlakke, cirkelvormige oppervlak naar boven gericht.

Stel het steiger vervolgens vijf minuten bloot aan ultraviolet licht van 365 nanometer met behulp van een UV-spotlamp. Plaats ongeveer tien gepolymeriseerde PEGDA-kristalroosters in een nieuw flacon en voeg 20 milliliters THF toe. Schud de flacons zes uur lang op een orbitale schudmachine bij 300 RPM.

Verwijder het vial elke één tot twee uur en vervang het polymeerbevattende oplosmiddel door vers THF. Voeg na de laatste spoeling water toe aan de gebruikte THF-oplossing om te controleren of de PS-bolletjes volledig zijn opgelost. Als de oplossing wit is, voer dan extra spoelingen uit totdat de oplossing transparant is.

Om de scaffolds te steriliseren, bereidt u een microcentrifugebuis van 50 milliliter voor met twee milliliters 70% ethanol per scaffold en plaatst u de scaffolds met een spatel in de buis. Laat de scaffolds één uur weken in ethanol. Giet na één uur de ethanol voorzichtig af en vervang deze door een gelijk volume steriele PBS.

Centrifuge vervolgens de scaffolds om eventuele luchtbellen te verwijderen. Bewaar de gecentrifugeerde scaffolds bij vier graden Celsius en haal ze elke één tot twee uur uit de centrifuge om de oplossing te vervangen door verse PBS. Na enkele wisselingen van PBS worden de scaffolds die gecoat moeten worden in collageen verwijderd en geplaatst in een buis met één milliliter collageen type one per te coaten scaffold.

Centrifugeer de buis vervolgens zoals voorheen en schud de scaffolds daarna 30 minuten bij 400 RPM op een orbitale schudder. Bewaar de scaffolds een nacht bij vier graden Celsius. Kweek hepatocarcinoma-cellen in 100 millimeter cellenkweekschalen met 10 milliliters kweekmedium.

Vervang het medium elke drie dagen totdat de celdichtheid 75 tot 80% van het cultivoppervlak bereikt. Wanneer de cellen klaar zijn, worden de scaffolds met de vlakke zijde naar boven toe voorzichtig in een 24-well plaat geplaatst. Spoel vervolgens elk scaffold af met twee milliliters PBS.

Suig de PBS af en voeg twee milliliter groeimedium toe aan de scaffolds. Verwijder na 30 minuten het medium en laat de scaffold een uur drogen. Oogst vervolgens de hepatocarcinoomcellen met de trypsine-digestiemethode.

Verwijder na het pelleten van de cellen het supernatant en resuspendeer de pellet zodat er één miljoen cellen per 25 µL aanwezig zijn. Pipetteer langzaam 25 µL van de celsuspensie direct bovenop elk scaffold. Dek vervolgens de plaat af en plaats deze gedurende de nacht in de incubator.

Breng vervolgens de scaffolds voorzichtig over naar een nieuwe 24-wells plaat en pipetteer twee milliliters medium in elke well voordat de plaat terug in de incubator wordt geplaatst. Hier wordt een scanning-elektronenmicroscoopopname van de scaffold getoond. Deze bestaat uit een hexagonaal dichtstgepakte rangschikking van poriën met een gemiddelde diameter van 100 tot 105 microns, die verbindingen vormen met de naburige poriën die hoofdzakelijk een diameter hebben tussen 35 en 40 microns.

Wanneer hepatocarcinoomcellen werden gezaaid, groeiden en prolifereerden de cellen op de scaffolds die vooraf waren gecoat met collageen type I, maar breidden ze zich in aantal niet uit op de onbehandelde scaffolds. Bovendien vertoonden de hepatocarcinoomcellen op de met collageen gecoate scaffolds een grotere celfunctie op een concentratieafhankelijke wijze. Op dag 14 secreteerden de hepatocarcinoomcellen die waren gekweekt in de ICC-scaffolds gecoat met 400 µg/mL meer dan drie keer zoveel albumine als de cellen die waren gekweekt in de onbehandelde scaffold.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om erop te letten dat de polystyreenbolletjes in het rooster correct zijn gerangschikt. Een gebrekkige rangschikking leidt tot een slechte onderlinge verbondenheid, wat de celactiviteit nadelig kan beïnvloeden. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u cel-geïnfiltreerde, op PEG gebaseerde omgekeerde colloïdale kristalskelets met een coating kunt vervaardigen.

Vergeet niet dat het werken met tetrahydrofuraan gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure, zoals het werken in een zuurkast en het dragen van handschoenen en een veiligheidsbril.