Name: High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Leer een high-throughput methode voor endogeen taggen van eiwitten in Trypanosoma brucei. Dit protocol maakt parallelle tagging van honderden eiwitten mogelijk voor grootschalige genomische studies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

SD werd ondersteund door een Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. Dit werk werd gefinancierd door Wellcome Trust-subsidies [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] aan Professor Keith Gull. We willen Professor Keith Gull bedanken voor nuttige gesprekken en inzichten.

1. 96-well Lange PCR Primer <ol><li> Pre-freeze 96-well PCR koeler in -80 ° C vriezer. </li><li> In een 10 ml buisje, maak Master Mix A: 2100 pl DDH 2 O, 105 ui PCR rang DMSO, 105 gl 10 mM dNTPs, 105 gl pPot matrijs (25 ng / ul) 9, voor een totaal volume van 2415 gl per plaat . </li><li> Aliquot 23 pi in elk putje van een 96-well PCR plaat. </li><li> Voeg 2 pl 100 uM primers samengevoegd aan elk putje beladen met een P20 12 kanaals multichannel pipet. Seal met film, plaat plaats op de pre-PCR gekoelde koeler en laten bevriezen gedurende ten minste 20 minuten bij -80 ° C. </li><li> In een 10 ml buisje, maak Master Mix B: 2048 pl DDH 2 O, 525 gl 10x buffer, 52,5 pl polymerase voor een totaal volume van 2626 gl per plaat. </li><li> Verwijder plaat en de PCR-koeler uit de -80 ° C vriezer. </li><li> Met de plaat nog op de PCR koeler, voeg 25 pi Master Mix B bovenop het bevroorn Master Mix A voor een totaal reactievolume van 50 pl. Dit is de tijd van cruciaal belang, en moet worden afgerond voordat Mix A kan ontdooien. Seal plaat met film. </li><li> Stel thermische cycler als volgt: 94 ° C gedurende 10 min, vervolgens 30 cycli van 94 ° C gedurende 15 sec, 65 ° C gedurende 30 sec, 72 ° C gedurende 2 minuten gevolgd door een laatste verlenging van 72 ° C gedurende 7 min . </li><li> Laad de PCR-plaat na het blok 94 ° C heeft bereikt. </li></ol> 2. Validatie van 96-well Long Primer PCR <ol><li> Zet een grote 1% (w / v) agarosegel in Tris-acetaat EDTA (TAE) loopbuffer met 4 x 28 putjes kammen om een ​​gel te geven met 4 rijen putjes. Lijn alternatieve tanden van de kam met de toppen van een 12-kanaals multichannel pipet. dompel voorzichtig de gel in TAE loopbuffer na de rijstroken worden geladen. </li><li> Load 1 kb DNA ladder in de 1 ste en 28 ste putje van elke rij. </li><li> P20 met een 12 kanaals multichannel pipet 2 pi PCR product directly elke laan van de gel (figuur 1A). Doe dit snel om de mogelijkheid van besmetting van de amplicons verminderen. <ol><li> Laad de PCR-producten van rij A van de PCR-plaat in de oneven genummerde rijstroken van de 1e rij van de gel (A1 - baan 3, A2 - laan 5 ...... A11 - laan 23, A12 - laan 25) en laadt de PCR-producten van rij B van de PCR-plaat in de even genummerde lanen van de 1e rij van de gel (B1 - laan 4, A2 - laan 6 ...... B11 - laan 24, B12 - laan 26). </li><li> Laad de PCR-producten van rij C en D van de PCR-plaat met hetzelfde patroon als hierboven beschreven, met rij C in de oneven genummerde lanen en rij D in de even genummerde rijstroken. Herhaal dit beladingspatroon totdat elk putje van de PCR-plaat op de gel geladen. DNA laadbuffer is niet vereist om deze gel geladen. </li></ol></li><li> Plaats de gel in de running tank en vul de tank met TAE-loopbuffer totdat de gel wordt ondergedompeld. Uitgevoerd bij 100 V gedurende 30 minuten envisualiseren met een UV transilluminator. Zie Figuur 1B een voorbeeld gel. Opmerking: PCR producten kan gedurende verscheidene weken voorafgaand aan transfectie worden bewaard bij -20 ° C </li></ol> 3. 96-well Transfectie <ol><li> Gebruik de T. brucei procyclische vorm cellijn SMOXP9 10 voor deze procedure en groeien in SDM-79 media met 10% FCS 10. </li><li> Met 1 x 10 7 cellen per transfectie (totaal 1,1 x 10 9 cellen) bij het ​​labelen van de N terminus van het eiwit en 2 x 10 7 cellen per transfectie (totaal 2,2 x 10 9 cellen) bij het ​​labelen van de C terminus van het eiwit. Handhaaf de cellen in mid-log (1,2 x 10 6 -1 x 10 7 cellen / ml) gedurende enkele dagen voorafgaand aan transfectie en oogst de cellen voor transfectie bij een dichtheid van 5-8 x 10 6 cellen / ml. </li><li> Laat bevroren PCR producten voor transfectie te ontdooien bij kamertemperatuur. </li><li> Aantal cellen met een haemocytometer of automatische cel teller. </li><li> Pellet vereiste aantal cellen in meerdere 50 ml buizen bij 800 xg gedurende 10 min. </li><li> Na centrifugeren verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 ml gemodificeerde cytomix (0,8 mM EGTA, 24 mM KCl, 0,15 mM CaCl2, 10 mM kaliumfosfaatbuffer pH 7,6, 25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 2,6 mM MgCl2, 0,5% (w / v) glucose, 100 ug / ml BSA, 1 mM hypoxanthine, 144 mM sucrose) per buis. Transfer alle GSM oplossingen voor een enkele buis en weer draaien bij 800 xg gedurende 10 min. </li><li> Na centrifugeren, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 23 ml gemodificeerd cytomix voor een uiteindelijke concentratie van 5 x 10 7 cellen / ml. </li><li> Terwijl cellen spinnen, voeg 1 ml SDM-79 medium aan elk putje van 4 x 24-putjes weefselkweekplaten. Label de platen AD en trek een ring rond goed A1 op elke plaat in permanent marker op plaat oriëntatie te helpen. </li><li> Sluit de plaat handler aan de electroporator. Op electroporator toestel de spanning 1500 V, de pulslengte op 100 psec en het aantal pulsen 12 en de puls interval 500 msec. Op de plaat handler stelt de pulsteller op 1. zodat dat electroporator één puls voor elk van de 12 kolommen van de plaat elektroporatie. </li><li> P200 met een 12 kanaals multichannel pipet de PCR-reacties van de PCR-plaat met de 96-well platen disposable elektroporatie, 4 mm tussenruimte. </li><li> Wanneer de cellen werden gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd om de uiteindelijke concentratie van 5 x 10 7 cellen / ml (stap 3,7), over te dragen aan een reagensreservoir. Pipetteer 200 ul van de cel-oplossing in elk putje van de plaat elektroporatie met een P200 12 kanaals multichannel pipet, mengen met PCR product door pipetteren. </li><li> Met behulp van weefsel verwijderen druppels van de bovenkant van de plaat om kortsluitingen te voorkomen. </li><li> Breng de afsluitfolie aangebracht in de plaat verpakking aan de bovenzijde van de plaat elektroporatie, positioning is om de gaten voor de elektroden onbedekte bovenaan en onderaan elke kolom staat. Voorkom dat de verhoogde punten gebruikt om de film te begeleiden. </li><li> Laad de elektroporatie plaat in de plaat handler en sluit het deksel. Druk op &#39;Pulse&#39; op de electroporator unit. </li><li> Na elektroporatie snel de cellen overbrengen van de 96-well plaat elektroporatie de 4 x 24-putjes weefselkweekplaten. Om de cellen te brengen, gebruikt een P200 12 kanaals multichannel pipet met elke tip ontbreekt, zodat de resterende 6 tips onmiddellijk boven het 6 rijen op een 24-well weefselkweekplaat. Breng de geëlektroporeerde cellen in 96-well platen in electroporations voorgeprogrammeerd patroon aan de 24-well weefselkweekplaten (Figuur 2A). </li><li> Bereid de P200 pipet tips - voor elke 96-well transfectie bereiden 2 dozen van 96 tips met elke andere kolom verwijderd. <ol><li> Transfer putten A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 op de 96-well elektroporatie plaatplaat Een rij A van de 24-well weefselkweek platen, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 in rij B, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 in rij C en D1 / D3 / D5 / D7 / D9 / D11 in rij D. Na overdracht van elke set van 6 putjes van de 96-well plaat om de 24-well plaat, worden de putten in de 96-well plaat vervolgens met inhoud van de overeenkomstige putjes van de 24- wells plaat en de was wordt vervolgens terug overgebracht naar de putjes van de 24-well plaat. </li><li> Transfer putjes E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 van de 96-well elektroporatie plaat 24 putjes B rij A, F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 in rij B, G1 / G3 / G5 / G7 / G9 / G11 in rij C en H1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11 in rij D. Na overdracht van elke set van 6 putten uit de 96-well plaat om de 24-well plaat, de putten in de 96 -well platen worden vervolgens gewassen met inhoud van de overeenkomstige putjes van de 24-well plaat en de was wordt vervolgens terug overgebracht naar de putjes van de 24-well plaat. </li><li> Transfer putjes A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A12 op de 96-well plaat elektroporatie 24-putjesplaat C rij A, B2 / B4 / B6 / B8 / B10 / B12 in rij B, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 in rij C en D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 in rij D. Na overdracht van elke set van 6 putten uit de 96 -well plaat om de 24-well plaat, worden de putten in de 96-well plaat vervolgens met inhoud van de overeenkomstige putjes van de 24-well plaat en de was wordt vervolgens terug overgebracht naar de putjes van de 24-well plaat. </li><li> Transfer wells E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 op de 96-well elektroporatie plaat 24 putjes D rij A, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12 in rij B, G2 / G4 / G6 / G8 / G10 / G12 in rij C en H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 in rij D. Na overdracht van elke set van 6 putten uit de 96-well plaat om de 24-well plaat, de putten in de 96 -well platen worden vervolgens gewassen met inhoud van de overeenkomstige putjes van de 24-well plaat en de was wordt vervolgens terug overgebracht naar de putjes van de 24-well plaat. </li></ol></li><li> Met behulp van een omgekeerde fase contrast microscoop, onderzoeken 1 en van elke kolom aan de cellen te controleren. Er zal een mix van levende en dode cellen met een te zijnaanzienlijke hoeveelheid celresten. Levende cellen kunnen worden onderscheiden van dode cellen omdat ze licht onder fasecontrast microscopie en zal bewegen. </li><li> Plaats de 24-well platen in een schone, plastic doos met een deksel dat een afdichting vormt. Zet de box aan een 28 ° C incubator. </li><li> Tussen 6-8 uur later, voeg 1 ml SDM-79 met 10% FCS bevattende 2x selectieve antibioticum aan elk putje. Onze ervaring cellijnen waar de genen hebben op het N-uiteinde zijn bestand tegen hogere concentraties van selectieve geneesmiddelen. Daarom worden bij Blasticidine als voorbeeld tagging op het N-uiteinde vereist een eindconcentratie van 20 ug / ml blasticidine en tagging op de C-terminus is een eindconcentratie van 10 ug / ml blasticidine. Opmerking: Transgene cellijnen zijn zichtbaar 9-10 dagen worden na transfectie. </li><li> Passage ten minste tweemaal in vers geneesmiddel en media voorafgaand aan analyse. Figuur 2B toont de resultaten van een typische 96-putjes ovectie voor tagging 96 verschillende eiwitten op de N terminus. Beoordelen elk putje door fasecontrast microscopie te bepalen of deze bevat gezonde, drug resistente cellen. Een gezonde en bevat voornamelijk (&lt;95%) zeer actieve cellen die helder in fase contract microscopie zijn. Daaropvolgende analyse door epifluorescentie microscopie of Western blot nodig om te bepalen of het eiwit met succes hebben. </li></ol>

<ol><li>Kelly, S., Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+in+Trypanosoma+brucei%3A+a+collection+of+vectors+for+the+expression+of+tagged+proteins+from+endogenous+and+ectopic+gene+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci.</a> Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).</li>
<li>Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 99 (1), 89-101 (1999).</li>
<li>Shi, H., Djikeng, A., Mark, T., Wirtz, L. E., Tschudi, C., Ullu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interference+in+Trypanosoma+brucei+by+heritable+and+inducible+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Genetic interference in Trypanosoma brucei by heritable and inducible double-stranded RNA.</a> RNA. 6 (7), New York, NY. 1069-1076 (2000).</li>
<li>Alsford, S., Turner, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+phenotyping+using+parallel+sequencing+of+RNA+interference+targets+in+the+African+trypanosome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput phenotyping using parallel sequencing of RNA interference targets in the African trypanosome.</a> Genome Res. 21 (6), 915-924 (2011).</li>
<li>Alsford, S., Eckert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+decoding+of+antitrypanosomal+drug+efficacy+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-throughput decoding of antitrypanosomal drug efficacy and resistance.</a> Nature. 482 (7384), 232-236 (2012).</li>
<li>Mony, B. M., MacGregor, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+dissection+of+the+quorum+sensing+signalling+pathway+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide dissection of the quorum sensing signalling pathway in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 505 (7485), 681-685 (2014).</li>
<li>Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Séraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration+%3A+Abstract+Nature+Biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration : Abstract Nature Biotechnology.</a> Nature Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li>
<li>Los, G. V., Encell, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HaloTag%3A+A+Novel+Protein+Labeling+Technology+for+Cell+Imaging+and+Protein+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).</li>
<li>Dean, S., Sunter, J. D., Wheeler, R. J., Hodkinson, I., Gluenz, E., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+enabling+efficient%2C+scalable+and+reproducible+gene+tagging+in+trypanosomatids%5BTitle%5D)+AND+%22Open+biol%22%5BJournal%5D)">A toolkit enabling efficient, scalable and reproducible gene tagging in trypanosomatids.</a> Open biol. 5 (1), 140197(2015).</li>
<li>Poon, S. K., Peacock, L., Gibson, W., Gull, K., Kelly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+and+optimized+single+marker+system+for+generating+Trypanosoma+brucei+cell+lines+expressing+T7+RNA+polymerase+and+the+tetracycline+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22Open+biol%22%5BJournal%5D)">A modular and optimized single marker system for generating Trypanosoma brucei cell lines expressing T7 RNA polymerase and the tetracycline repressor.</a> Open biol. 2 (2), 110037(2012).</li>
<li>Lam, S. S., Martell, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+meth%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature meth. 12 (1), 51-54 (2014).</li>
<li>Shu, X., Lev-Ram, V., Deerinck, T. J., Qi, Y., Ramko, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells%2C+tissues%2C+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLoS biology. , (2011).</li>
<li>Schimanski, B., Nguyen, T. N., Günzl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+tandem+affinity+purification+of+trypanosome+protein+complexes+based+on+a+novel+epitope+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient tandem affinity purification of trypanosome protein complexes based on a novel epitope combination.</a> Eukaryotic Cell. , (2005).</li>
<li>Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+stable+transformation+of+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Drastische verbeteringen in de gevoeligheid van proteomics en transcriptomics methoden in de afgelopen 5-10 jaar heeft waardevolle gegevens over duizenden genen en hun producten. De instrumenten aan te pakken de functie van deze eiwitten hebben geen gelijke tred gehouden. Tagging een eiwit vergemakkelijkt talrijke experimenten om de functie te bepalen. Zo kan een eiwit worden gefuseerd aan een fluorescerend eiwit in een verscheidenheid van verschillende kleuren localisatie en co-localisatie studies te vergemakkelijken. Markeringen ontwikkeld voor elektronenmicroscopie, zoals APEX2 of miniSOG 11,12 toestaan ​​ultrastructurele lokalisatie van het gecodeerde eiwit. Tags for biochemie, zoals TAP tag en ProtC-TEV-ProtA (PTP) tag 7,13 zodat zuivering van complexen geassocieerd met het eiwit voor het identificeren van bindingspartners of in vitro biochemische assays. De specifieke stappen die cruciaal zijn voor het succes van de protoc zijnol zijn: de opname van DMSO in de PCR Master Mix 1, het bevriezen van de PCR Master Mix 1 voorafgaand aan de toevoeging van de Master Mix 2, het gebruik van de commerciële polymerase in Master Mix 2 en de wijziging van de cytomix elektroporatie buffer. In onze ervaring, is het noodzakelijk om het dubbele van het aantal cellen te gebruiken voor C-terminale tagging transfecties als voor N-terminale tagging transfecties met het oog op een vergelijkbaar percentage van positieve putjes te bereiken. Daarom moeten alle stappen worden uitgevoerd zoals beschreven. Deze techniek is alleen kans van slagen als het transfecteren van het insect procyclische vorm trypanosoom. Bloedstroomvormen hebben een lagere transfectie-efficiëntie 14, bovendien zijn ze waarschijnlijk tijdens de selectie om te sterven als gevolg van de dichtheid-afhankelijke toxiciteit die geen verband houdt met de selectieve drug. Daarom is onze vorige protocol vertegenwoordigt de huidige beste technologie voor het etiketteren van bloed vorm trypanosomen 9. Het is ook waarschijnlijk dat de transfection efficiency zal afhangen van de specifieke trypanosoom isolaat variëren. Dit protocol werd geoptimaliseerd met behulp van 927 SMOX procyclische vormen - andere stammen kunnen extra optimalisatie nodig. Maatregelen die de kans op succes kunnen verhogen zijn: het verhogen van de hoeveelheid PCR amplicon, waardoor het aantal cellen in de transfectie. We presenteren een methode waarbij honderden eiwitten kunnen worden gelabeld parallel. Dit zal grootschalige studies te vergemakkelijken op lokalisatie en interactie, als aanvulling op bestaande grote datasets en het verstrekken van waardevolle informatie aan de gemeenschap. Primer templates zijn beschikbaar op aanvraag en een lijst van plasmiden templates beschikbaar is beschikbaar op: http://www.sdeanresearch.com/

Trypanosoma brucei is een protozoa parasiet die humane Afrikaanse trypanosomasis en Nagana bij runderen veroorzaakt. T. brucei ideaal organisme voor de analyse van eiwitfunctie door de combinatie van een hoge kwaliteit genoom talrijke proteomics en transcriptomics datasets en goed ontwikkelde moleculaire technieken 1-3. Vooruitgang in proteomics en sequencing hebben geresulteerd in grote datasets die potentieel interessante genen 4-6 te benadrukken; echter veel genen minimale informatie die bij hen in de bestaande gegevensbanken. Er is derhalve behoefte aan een high-throughput werkwijze voor het eiwit functionele karakterisatie steun. Expressie van een gelabeld eiwit kan een veelheid aan inzichten geven in de functie van een eiwit. Zo kan een eiwit gelabeld met een fluorescerend eiwit of epitoop gelokaliseerd door fluorescentiemicroscopie met informatie over waar de prot geeftein zou kunnen uitoefenen zijn biologische effect. Als alternatief, een eiwit gelabeld met een TAP 7, HaloTag 8 of His tag kan worden gezuiverd voor biochemische analyses en identificatie van de interactie tussen partners. We hebben onlangs ontwikkelde een robuuste tagging methode voor T. brucei 9. Dit was lange PCR primer met het DNA voor transfectie genereren en kon de tagging tientallen eiwitten in parallel - een significante verbetering van bestaande protocollen. We hebben nu een verbetering van de schaalbaarheid van dit protocol in procyclische vormen door een orde van grootte. Hier presenteren we onze werkwijze waar we PCR en transfectie uitgevoerd in 96-well platen, met de terugwinning en selectie zich in 24-well platen. Honderden proteïnen nu kan worden gelabeld parallel deze methode een kosteneffectieve en werkbare methode voor het coderen van het gehele genoom trypanosoom.

<table><tbody><tr><td>Oligonucleotide</td><td>Life technologies</td><td>na</td><td>alleen ontzouten (geen aanvullende zuivering gebruiken)</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roche</td><td>Inbegrepen bij de Expand HiFi pack</td><td>Moet PCR-kwaliteit zijn</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>elke gerenommeerde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expand HiFi polymerase</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>BTX ECM830</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td>Electroporator</td></tr><tr><td>HT-200 plate handler</td><td>Harvard Apparatus</td><td>HT-200</td><td>Behandelt de 96-well eletroplates</td></tr><tr><td>MOS 96 ELECTROPLATE 4 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0452</td><td>Electroplate voor de 96-well elektroporatie</td></tr><tr><td>Blasticidin S Hydrochloride</td><td>Melford</td><td>3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin b Gold</td><td>Invivogen</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Phleomycin</td><td>Melford</td><td>P0187</td><td></td></tr><tr><td>225 cm TC Flask, canted neck, phenolic cap</td><td>Appletonwoods</td><td>BC006</td><td></td></tr><tr><td>24 well culture plates</td><td>Appletonwoods</td><td>BC017</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&reg; PCR Cooler, iceless cold storage system voor 96 well plates en PCR tubes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z606634-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96-well Multiply&reg; PCR plate met laterale rand</td><td>Sarstedt</td><td>72.1979.203</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput gene tagging in<em&gt; trypanosoma brucei</em

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Verbeteringen in massaspectrometrie, sequencing en bioinformatica hebben grote datasets van potentieel interessante genen opgeleverd. Het taggen van deze eiwitten kan inzicht geven in hun functie door hun lokalisatie binnen de cel te bepalen en het identificeren van interactiepartners mogelijk te maken. We hebben onlangs een snelle en schaalbare methode gepubliceerd om Trypanosoma brucei-cellijnen te genereren die een getagd eiwit uit het endogene locus tot expressie brengen. De methode was gebaseerd op een plasmide dat we hebben gegenereerd en dat, in combinatie met lange primer PCR, kan worden gebruikt om een gen te modificeren zodat het een eiwit codeert dat aan beide uiteinden is getagd. Dit maakt het mogelijk om tientallen trypanosoom-eiwitten parallel te taggen, wat de grootschalige validatie van kandidaat-genen van belang vergemakkelijkt. Dit systeem kan worden gebruikt om eiwitten te taggen voor lokalisatie (met behulp van een fluorescent eiwit, epitoop-tag of elektronenmicroscopie-tag) of biochemie (met behulp van tags voor zuivering, zoals de TAP (tandem affinity purification) tag). Hier beschrijven we een protocol om de lange primer PCR en de elektroporatie uit te voeren in 96-well platen, waarbij het herstel en de selectie van transgene trypanosomen plaatsvindt in 24-well platen. Met deze workflow kunnen honderden eiwitten parallel worden getagd; dit is een orde van grootte verbetering ten opzichte van ons vorige protocol en grootschalige tagging op genoomniveau is nu mogelijk.

In deze representatieve transfectie werden de primers ontworpen met het TagIT perlmanuscript 9 en commercieel gesynthetiseerd. De 96-well PCR werd uitgevoerd en gevalideerd zoals beschreven (figuur 1A); in dit voorbeeld, 95/96 PCRs werden succesvol (Figuur 1B). Onze ervaring herhalen mislukt reacties hetzij de oorspronkelijke primers of opnieuw gesynthetiseerde primers niet tot een succesvolle PCR. De amplicons werden overgebracht in 96-well platen voor elektroporatie elektroporatie (Figuur 2A) en vervolgens overgebracht naar 24-well kweekplaten voor terugwinning en selectie. Na voldoende tijd om de selectie plaatsvindt, werden de putjes scoorden voor overleving voorafgaand aan verdere analyse. In dit voorbeeld 88/96 wells (92%) waren positief na 15 dagen selectie. <img alt = &quot;Figuur 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54342 / 54342fig1.jpg&quot; /&gt; Figuur 1: Validatie van lange primer PCR (A) Patroon voor het overbrengen van PCR-producten van 96-well PCR-plaat om de agarosegel voor de validatie van PCR.. (B) Een representatieve 96-wells PCR validatie gel voor het etiketteren 95 genen op de N- terminus en 1 amplicon die geen 5 &#39;homologie gericht om als negatieve controle in de transfectie. De monsters worden geladen op een 1% (w / v) agarosegel en opgelost bij 100 V gedurende 30 min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54342/54342fig2.jpg" /> Figuur 2: 96-well elektroporatie en selectie (A) Patroon voor het overbrengen van geëlektroporeerde cellen van 96-well elektroporatie plat.e naar 24-putjes weefselkweekplaten. (B) Een schema dat een typische levende / dode doelpunt na 15 dagen selectie in 24-well platen. Groen staat voor een succesvolle transfectie, grijs is een goed met slechts dode cellen. In dit voorbeeld, 88/96 (92%) van de putten die met succes getransfecteerde parasieten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Het toevoegen van een tag aan een eiwit is een krachtige manier om inzicht te krijgen in zijn functie. Hier beschrijven we een protocol om honderden Trypanosoma brucei-eiwitten parallel endogenetisch te taggen, zodat tagging op genoomschaal haalbaar is.

High-throughput Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Het algemene doel van deze methode is om proteïnen in Trypansoma brucei op een high-throughput manier te labelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het kinetoplastidenveld over de lokalisatie en potentiële functie van grote cohorten proteïnen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat grote aantallen proteïnen snel en eenvoudig in parallel gelabeld kunnen worden.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de lokalisatie, kunnen interacties van grote groepen eiwitten ook worden onderzocht door gebruik te maken van andere tags. Bijvoorbeeld de BirA-tag voor een bio-ID proximity mapping-experiment. De procedure zal worden gedemonstreerd door Ross Madden, een research assistant uit ons laboratorium.Voordat u met deze procedure begint, dient u een 96-well PCR-koeler voor te vriezen in de vriezer op -80 °C. Bereid Master Mix A door de volgende componenten in een buis van 10 mL samen te voegen: 100 µL gedestilleerd gedeïoniseerd water, 105 µL DMSO van PCR-kwaliteit, 105 µL 10 mM dNTP's en 105 µL pPOT-template.Giet Master Mix A in een reagentenreservoir en verdeel 23 µL Master Mix A over elke put van een 96-put PCR-plaat. Voeg met een P20 12-kanaals multichannelpipet twee µL van 100 µM gepoolde primers toe aan elke gevulde put. Seal de plaat met folie.Plaats het op de vooraf gekoelde PCR-koeler en laat het minimaal 20 minuten bevriezen bij -80 °C. Het invriezen van PCR Master Mix A is essentieel om een efficiënte hot start-reactie te garanderen, zelfs bij het gebruik van een specifieke hot start-polymerase. Dit leidt tot een reproduceerbare amplificatie met een hoog rendement.Terwijl de PCR-plaat in de vriezer staat, bereidt u Master Mix B. Combineer het volgende in een buis van 10 milliliter: 2.048 µL gedestilleerd gedeïoniseerd water, 525 µL 10X buffer en 52,5 µL polymerase, voor een totaalvolume van 2.626 µL per plaat. Haal de PCR-plaat en de PCR-koeler uit de vriezer van -80 °C.Terwijl de plaat nog op de PCR-koeler staat, voegt u snel 25 µL Master Mix B toe bovenop de bevroren Master Mix A in elke well, voor een totaal reactievolume van 50 µL. Dit is tijdskritisch en moet worden voltooid voordat Master Mix A kan ontdooien. Seal de plaat met folie.Stel de thermocycler als volgt in: 94 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door 30 cycli van 94 °C gedurende 15 seconden, 65 °C gedurende 30 seconden en 72 °C gedurende twee minuten, afgesloten met een laatste extensieperiode van 72 °C gedurende zeven minuten. Zodra het blok 94 °C heeft bereikt, plaatst u de PCR-plaat in de thermocycler en start u het amplificatieprogramma.Begin deze procedure met het maken van een grote 1% agarosegel in Tris-acetaat EDTA of TAE-loopbuffer, met vier rijen putjes. Laad een 1 kb DNA-ladder in het eerste en 28ste putje van elke rij. De volgende stap is het direct overbrengen van twee µL PCR-product, zonder DNA-laadbuffer, naar elke baan van de gel, volgens het hier getoonde patroon.De PCR-producten uit rij A en B van de PCR-plaat worden bijvoorbeeld respectievelijk in de oneven en even genummerde banen van de eerste rij van de gel geladen. Werk snel om de kans op contaminatie van de ampliconen te minimaliseren en laad de PCR-producten uit rij A van de PCR-plaat in de oneven genummerde banen van de eerste rij van de gel. Laad vervolgens de PCR-producten uit rij B van de PCR-plaat in de even genummerde banen van de eerste rij van de gel.Laad de PCR-producten van rij C en D van de PCR-plaat volgens hetzelfde patroon, waarbij rij C in de oneven genummerde lanes en rij D in de even genummerde lanes van de tweede rij van de gel wordt geladen. Ga door met dit laadpatroon totdat elke well van de PCR-plaat op de gel is geladen. Plaats de gel in het elektforesevat en vul het vat met TAE-runbuffer totdat de gel is ondergedompeld.Voer de run uit bij 100 volt gedurende 30 minuten. Visualiseer het resultaat met een UV-transilluminator. Hier wordt een representatieve agarosegel getoond voor de validatie van een 96-well PCR, waarbij 95 van de 96 PCR's succesvol waren.De mislukte PCR was H11. Deze procedure maakt gebruik van Trypansoma brucei, procyclische vorm, cellijn SMOXP9. Kweek de cellen tot de juiste dichtheid zoals beschreven in de protocoltekst en oogst het vereiste aantal cellen door centrifugatie bij 800 ×g gedurende 10 minuten.Begin met de voorbereidingen voor de elektroporatie terwijl de cellen worden gecentrifugeerd. Sluit de plaatbehandelaar aan op de elektroporator. Stel op de elektroporator-eenheid de spanning in op 1 500 volt, de pulslengte op 100 microseconds, het aantal pulsen op 12 en het pulsinterval op 500 milliseconds.Stel op de plaatrobot het aantal pulsen in op één. Breng de PCR-reacties met een P200 12-kanaals multikanalpipet over van de PCR-plaat naar een wegwerp electroporatieplaat met 96 putjes. Was de cellen in 10 milliliters gemodificeerde cytomix en centrifugeer opnieuw bij 800 ×g gedurende 10 minuten.Resuspendeer de cellen in 23 milliliters gemodificeerde cytomix voor een uiteindelijke concentratie van five times 10 to the seventh cellen per milliliter. Breng de celsuspensie over naar een reagentiereservoir. Pipetteer 200 µL van de celoplossing in elke put van de electroporatieplaat en meng dit met het PCR-product door te pipetteren.Gebruik een papieren zakdoekje om eventuele druppels van de bovenkant van de plaat te verwijderen om kortsluiting te voorkomen. Breng afsluitfolie aan op de bovenkant van de electroporatieplaat, waarbij de folie zodanig wordt geplaatst dat de gaten voor de elektroden aan de boven- en onderkant van elke kolom onbedekt blijven. Vermijd het afdekken van de verhoogde punten die dienen als geleiding voor de folie.Plaats de electroporatieplaat in de plaathandler en sluit het deksel. Druk op "pulse" op de electroporatie-unit. Na de electroporatie moeten de cellen snel worden overgebracht naar vier 24-wells weefselkweekplaten die per well één milliliter SDM-79 medium bevatten voor herstel.Gebruik een P200 12-kanaals multichannelpipet waarbij om en om een tip ontbreekt, zodat de resterende zes tips uitlijnen met de zes rijen op een 24-wells weefselkweekplaat. Nadat de cellen van de 96-wells plaat naar de 24-wells plaat zijn overgebracht, worden de wells in de 96-wells plaat gewassen met medium uit de overeenkomstige wells in de 24-wells plaat. Breng het wasmedium vervolgens terug naar de wells in de 24-wells plaat.Breng de geëlectroporeerde cellen van de 96-well electroporatieplaat over naar de 24-well weefkweekplaten volgens het hier getoonde vooraf gedefinieerde patroon. Bijvoorbeeld: cellen uit de oneven genummerde wells van rij A van de 96-well plaat worden overgebracht naar rij A van plaat A, terwijl cellen uit de even genummerde wells van rij A van de 96-well plaat worden overgebracht naar rij A van plaat C. Was na elke overdracht van cellen van de 96-well plaat naar de 24-well plaat de wells in de 96-well plaat met medium uit de overeenkomstige rij van de 24-well plaat. Breng het wasmiddel vervolgens terug over naar de 24-well plaat.Het overbrengen van cellen naar de 24-wells platen is complex, maar het is essentieel dat u de resulterende cellijnen kunt herleiden naar de juiste gen-ID. Het is cruciaal om deze stap snel uit te voeren om de cellen gezond te houden. Nadat alle geëlectroporeerde cellen zijn overgebracht naar de vier 24-wells platen, plaatst u de 24-wells platen in een schone plastic doos met een deksel dat een luchtdichte afsluiting vormt. Plaats de doos in een incubator op 28 °C.Voeg zes tot acht uur later aan elke put één milliliter SDM-79 met 10% FCS toe, waarin een selectief antibioticum is opgenomen. Incubeer gedurende negen tot 10 dagen bij 28 graden Celsius totdat de transgene cellijnen zichtbaar worden. Na een transfectie in een 96-well plaat voor het taggen van 96 verschillende eiwitten aan de endterminus, worden de cellen overgebracht naar 24-well weefselkweekplaten voor herstel en selectie.Vervolgens wordt elk putje beoordeeld om te bepalen of het gezonde, medicijnresistente cellen bevat. Een gezond putje bevat voornamelijk zeer actieve cellen die helder zijn bij fasecontrastmicroscopie. In dit voorbeeldschema staat groen voor een putje met een succesvolle transfectie en grijs voor een putje met alleen dode cellen.88 van de 96 putjes, oftewel 92%, bevatten succesvol getransfecteerde parasieten na 15 dagen selectie. Zodra de methode onder de knie is, duurt het ongeveer een uur van het tellen van de cellen tot het uitplaten ervan na electroporatie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de selectieve medicijnen zes tot acht uur na de transfectie moeten worden toegevoegd.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe grote cohorten eiwitten in Trypanosoma brucei getagd kunnen worden.

high-throughput-gene-tagging-in-trypanosoma-brucei

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Telomeren zijn essentieel voor chromosoom stabiliteit en de telomeer G-overhang structuur is essentieel voor telomerase-gemedieerde telomeren onderhoud. We hebben onlangs twee methoden voor het detecteren van de telomeer G-overhang structuur...

Onderzoek van de telomeren G-overhang Structuur in Trypanosoma brucei</em

Hier beschrijven we een werkwijze voor het gebruik van type I en type...

Genetische Manipulatie in<em&gt; Δku80</em&gt; Stammen voor Functionele genomische analyse van<em&gt; Toxoplasma gondii</em

De dynamica van glycosomen in Afrikaanse trypanosomen is moeilijk te bestuderen met traditionele celbiologietechnieken zoals elektronen- en fluorescentiemicroscopie. Als middel om dynamisch orgaangedrag waar te nemen, is een fluorescentie-orgaanrapportagesysteem gebruikt in combinatie met flowcytometrie om de glycosoomdynamica in real-time in levende parasieten te monitoren.

Met behulp van fluorescerende eiwitten naar Monitor Glycosome Dynamiek in de Afrikaanse Trypanosoom

Een zeer gevoelige ribozyme-gebaseerde test, toepasbaar voor high-throughput screening van chemicaliën die zich richten op het unieke proces van RNA-bewerking bij trypanosomatiden-pathogenen, wordt in dit artikel beschreven. Remmers kunnen worden gebruikt als hulpmiddelen voor hypothese-gedreven analyse van het RNA-bewerkingsproces en uiteindelijk als therapeutische middelen.

RNA Catalyst als verslaggever voor het screenen van geneesmiddelen tegen RNA Bewerken in Trypanosomen

Dit manuscript beschrijft het gebruik van een bioluminescente stam van Afrikaanse trypanosomen om de tracking van een late infectiefase mogelijk te maken en demonstreert hoe in vivo live beeldvorming kan worden gebruikt om infecties binnen het centrale zenuwstelsel in real-time te visualiseren.

Bioluminescentie Imaging te laat stadium Infectie van Afrikaanse trypanosomiasis Detect

Afrikaanse trypanosomen die in vitro gekweekt worden, ondergaan antigeenvariatie met een lage snelheid, zodat populaties bestaan uit parasieten die een dominante variant van het oppervlakteglycoproteïne (VSG) en een kleine populatie van 'geschakelde' varianten tot expressie brengen. Dit protocol beschrijft een snelle methode voor het detecteren en kwantificeren van deze populaties.

detectie van<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant oppervlakte glycoproteïne Schakelen van Magnetic Activated Cell Sorting en flowcytometrie

Deze methode van trypanosoom afscheiding van bloed is afhankelijk van hun oppervlakte lading minder negatief dan bloed zoogdiercellen. Geïnfecteerd bloed is geplaatst en worden behandeld op een anionenwisselaar kolom. Deze methode, de meest passende diagnose voor slaapziekte, biedt gezuiverde parasieten voor immunologische, biologische, biochemische, farmaceutische en moleculaire biologie onderzoek.

Zuivering van extracellulaire trypanosomen, met inbegrip van Staten in Afrika, van bloed door Anion-wisselaars (Diethylaminoethyl-gemengd met cellulose kolommen)

Hier beschrijven we een protocol om een gen knock-out in de extracellulaire amastigote van Trypanosoma cruzi te introduceren, met behulp van het crispr/Cas9-systeem. De groei fenotype kan worden opgevolgd door de celtelling van de Axenische amastigote cultuur of door proliferatie van intracellulaire amastigotes na de invasie van de cel van de host.

Introductie van een gen knock-out direct in het Amastigote stadium van Trypanosoma cruzi met behulp van het crispr/Cas9 systeem

We beschrijven een high-throughput colorimetrische test die β-galactosidase-activiteit meet in drie levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi, de veroorzaker van de ziekte van Chagas. Deze test kan worden gebruikt om trypanocidale verbindingen op een eenvoudige, snelle en reproduceerbare manier te identificeren.

In vitro Drugsscreening tegen alle levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi met behulp van parasieten die β-galactosidase tot expressie brengen

Deze studie toont een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van ultrastructuurexpansiemicroscopie in drie in vitro levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi, de ziekteverwekker die verantwoordelijk is voor de ziekte van Chagas. We nemen de geoptimaliseerde techniek voor cytoskeletale eiwitten en pan-proteoomlabeling op.

Ultrastructurele expansiemicroscopie in drie in vitro levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi

We beschrijven een methode om te bestuderen hoe pH reageert op omgevingssignalen in de glycosomen van de bloedbaanvorm van Afrikaanse trypanosomen. Deze aanpak omvat een pH-gevoelige erfelijke eiwitsensor in combinatie met flowcytometrie om de pH-dynamiek te meten, zowel als een tijdverlooptest als in een high-throughput screen-formaat.

Meten van dynamische glycosomale pH-veranderingen bij levende Trypanosoma brucei

Leer een high-throughput methode voor endogeen taggen van eiwitten in Trypanosoma brucei. Dit protocol maakt parallelle tagging van honderden eiwitten mogelijk voor grootschalige genomische studies.

High-throughput Gene Tagging in

Meer video's verkennen