High-throughput Gene Tagging in

Het algemene doel van deze methode is om proteïnen in Trypansoma brucei op een high-throughput manier te labelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het kinetoplastidenveld over de lokalisatie en potentiële functie van grote cohorten proteïnen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat grote aantallen proteïnen snel en eenvoudig in parallel gelabeld kunnen worden.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de lokalisatie, kunnen interacties van grote groepen eiwitten ook worden onderzocht door gebruik te maken van andere tags. Bijvoorbeeld de BirA-tag voor een bio-ID proximity mapping-experiment. De procedure zal worden gedemonstreerd door Ross Madden, een research assistant uit ons laboratorium.

Voordat u met deze procedure begint, dient u een 96-well PCR-koeler voor te vriezen in de vriezer op -80 °C. Bereid Master Mix A door de volgende componenten in een buis van 10 mL samen te voegen: 100 µL gedestilleerd gedeïoniseerd water, 105 µL DMSO van PCR-kwaliteit, 105 µL 10 mM dNTP's en 105 µL pPOT-template.

Giet Master Mix A in een reagentenreservoir en verdeel 23 µL Master Mix A over elke put van een 96-put PCR-plaat. Voeg met een P20 12-kanaals multichannelpipet twee µL van 100 µM gepoolde primers toe aan elke gevulde put. Seal de plaat met folie.

Plaats het op de vooraf gekoelde PCR-koeler en laat het minimaal 20 minuten bevriezen bij -80 °C. Het invriezen van PCR Master Mix A is essentieel om een efficiënte hot start-reactie te garanderen, zelfs bij het gebruik van een specifieke hot start-polymerase. Dit leidt tot een reproduceerbare amplificatie met een hoog rendement.

Terwijl de PCR-plaat in de vriezer staat, bereidt u Master Mix B. Combineer het volgende in een buis van 10 milliliter: 2.048 µL gedestilleerd gedeïoniseerd water, 525 µL 10X buffer en 52,5 µL polymerase, voor een totaalvolume van 2.626 µL per plaat. Haal de PCR-plaat en de PCR-koeler uit de vriezer van -80 °C.

Terwijl de plaat nog op de PCR-koeler staat, voegt u snel 25 µL Master Mix B toe bovenop de bevroren Master Mix A in elke well, voor een totaal reactievolume van 50 µL. Dit is tijdskritisch en moet worden voltooid voordat Master Mix A kan ontdooien. Seal de plaat met folie.

Stel de thermocycler als volgt in: 94 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door 30 cycli van 94 °C gedurende 15 seconden, 65 °C gedurende 30 seconden en 72 °C gedurende twee minuten, afgesloten met een laatste extensieperiode van 72 °C gedurende zeven minuten. Zodra het blok 94 °C heeft bereikt, plaatst u de PCR-plaat in de thermocycler en start u het amplificatieprogramma.

Begin deze procedure met het maken van een grote 1% agarosegel in Tris-acetaat EDTA of TAE-loopbuffer, met vier rijen putjes. Laad een 1 kb DNA-ladder in het eerste en 28ste putje van elke rij. De volgende stap is het direct overbrengen van twee µL PCR-product, zonder DNA-laadbuffer, naar elke baan van de gel, volgens het hier getoonde patroon.

De PCR-producten uit rij A en B van de PCR-plaat worden bijvoorbeeld respectievelijk in de oneven en even genummerde banen van de eerste rij van de gel geladen. Werk snel om de kans op contaminatie van de ampliconen te minimaliseren en laad de PCR-producten uit rij A van de PCR-plaat in de oneven genummerde banen van de eerste rij van de gel. Laad vervolgens de PCR-producten uit rij B van de PCR-plaat in de even genummerde banen van de eerste rij van de gel.

Laad de PCR-producten van rij C en D van de PCR-plaat volgens hetzelfde patroon, waarbij rij C in de oneven genummerde lanes en rij D in de even genummerde lanes van de tweede rij van de gel wordt geladen. Ga door met dit laadpatroon totdat elke well van de PCR-plaat op de gel is geladen. Plaats de gel in het elektforesevat en vul het vat met TAE-runbuffer totdat de gel is ondergedompeld.

Voer de run uit bij 100 volt gedurende 30 minuten. Visualiseer het resultaat met een UV-transilluminator. Hier wordt een representatieve agarosegel getoond voor de validatie van een 96-well PCR, waarbij 95 van de 96 PCR's succesvol waren.

De mislukte PCR was H11. Deze procedure maakt gebruik van Trypansoma brucei, procyclische vorm, cellijn SMOXP9. Kweek de cellen tot de juiste dichtheid zoals beschreven in de protocoltekst en oogst het vereiste aantal cellen door centrifugatie bij 800 ×g gedurende 10 minuten.

Begin met de voorbereidingen voor de elektroporatie terwijl de cellen worden gecentrifugeerd. Sluit de plaatbehandelaar aan op de elektroporator. Stel op de elektroporator-eenheid de spanning in op 1 500 volt, de pulslengte op 100 microseconds, het aantal pulsen op 12 en het pulsinterval op 500 milliseconds.

Stel op de plaatrobot het aantal pulsen in op één. Breng de PCR-reacties met een P200 12-kanaals multikanalpipet over van de PCR-plaat naar een wegwerp electroporatieplaat met 96 putjes. Was de cellen in 10 milliliters gemodificeerde cytomix en centrifugeer opnieuw bij 800 ×g gedurende 10 minuten.

Resuspendeer de cellen in 23 milliliters gemodificeerde cytomix voor een uiteindelijke concentratie van five times 10 to the seventh cellen per milliliter. Breng de celsuspensie over naar een reagentiereservoir. Pipetteer 200 µL van de celoplossing in elke put van de electroporatieplaat en meng dit met het PCR-product door te pipetteren.

Gebruik een papieren zakdoekje om eventuele druppels van de bovenkant van de plaat te verwijderen om kortsluiting te voorkomen. Breng afsluitfolie aan op de bovenkant van de electroporatieplaat, waarbij de folie zodanig wordt geplaatst dat de gaten voor de elektroden aan de boven- en onderkant van elke kolom onbedekt blijven. Vermijd het afdekken van de verhoogde punten die dienen als geleiding voor de folie.

Plaats de electroporatieplaat in de plaathandler en sluit het deksel. Druk op "pulse" op de electroporatie-unit. Na de electroporatie moeten de cellen snel worden overgebracht naar vier 24-wells weefselkweekplaten die per well één milliliter SDM-79 medium bevatten voor herstel.

Gebruik een P200 12-kanaals multichannelpipet waarbij om en om een tip ontbreekt, zodat de resterende zes tips uitlijnen met de zes rijen op een 24-wells weefselkweekplaat. Nadat de cellen van de 96-wells plaat naar de 24-wells plaat zijn overgebracht, worden de wells in de 96-wells plaat gewassen met medium uit de overeenkomstige wells in de 24-wells plaat. Breng het wasmedium vervolgens terug naar de wells in de 24-wells plaat.

Breng de geëlectroporeerde cellen van de 96-well electroporatieplaat over naar de 24-well weefkweekplaten volgens het hier getoonde vooraf gedefinieerde patroon. Bijvoorbeeld: cellen uit de oneven genummerde wells van rij A van de 96-well plaat worden overgebracht naar rij A van plaat A, terwijl cellen uit de even genummerde wells van rij A van de 96-well plaat worden overgebracht naar rij A van plaat C. Was na elke overdracht van cellen van de 96-well plaat naar de 24-well plaat de wells in de 96-well plaat met medium uit de overeenkomstige rij van de 24-well plaat. Breng het wasmiddel vervolgens terug over naar de 24-well plaat.

Het overbrengen van cellen naar de 24-wells platen is complex, maar het is essentieel dat u de resulterende cellijnen kunt herleiden naar de juiste gen-ID. Het is cruciaal om deze stap snel uit te voeren om de cellen gezond te houden. Nadat alle geëlectroporeerde cellen zijn overgebracht naar de vier 24-wells platen, plaatst u de 24-wells platen in een schone plastic doos met een deksel dat een luchtdichte afsluiting vormt. Plaats de doos in een incubator op 28 °C.

Voeg zes tot acht uur later aan elke put één milliliter SDM-79 met 10% FCS toe, waarin een selectief antibioticum is opgenomen. Incubeer gedurende negen tot 10 dagen bij 28 graden Celsius totdat de transgene cellijnen zichtbaar worden. Na een transfectie in een 96-well plaat voor het taggen van 96 verschillende eiwitten aan de endterminus, worden de cellen overgebracht naar 24-well weefselkweekplaten voor herstel en selectie.

Vervolgens wordt elk putje beoordeeld om te bepalen of het gezonde, medicijnresistente cellen bevat. Een gezond putje bevat voornamelijk zeer actieve cellen die helder zijn bij fasecontrastmicroscopie. In dit voorbeeldschema staat groen voor een putje met een succesvolle transfectie en grijs voor een putje met alleen dode cellen.

88 van de 96 putjes, oftewel 92%, bevatten succesvol getransfecteerde parasieten na 15 dagen selectie. Zodra de methode onder de knie is, duurt het ongeveer een uur van het tellen van de cellen tot het uitplaten ervan na electroporatie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de selectieve medicijnen zes tot acht uur na de transfectie moeten worden toegevoegd.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe grote cohorten eiwitten in Trypanosoma brucei getagd kunnen worden.