Name: Co-cultuur van de levens- Microbiome met Microengineered Human darmvlokken in een Gut-on-a-Chip microfluïdische apparaat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Leer co-cultuur van het darmmicrobioom met menselijke darmvlokken in een gut-on-a-chip microfluïdische opstelling. Deze methode maakt onderzoek naar gastro-intestinale ziekten en geneesmiddelontwikkeling mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Sri Kosuri (Wyss Institute aan de Harvard University) voor het verstrekken van de GFP-gelabelde E. coli-stam. Dit werk werd ondersteund door de Defense Advanced Research Projects Agency onder Coöperatieve Overeenkomst Nummer W911NF-12-2-0036, de Food and Drug Administration onder contract #HHSF223201310079C, en het Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering aan de Harvard University. De opvattingen en conclusies in dit document zijn die van de auteurs en mogen niet worden geïnterpreteerd als de officiële beleidslijnen, noch uitgedrukt noch geïmpliceerd, van het Army Research Office, Army Research Laboratory, Food and Drug Administration of de Amerikaanse overheid. De Amerikaanse overheid is gemachtigd om herdrukken te reproduceren en te distribueren voor overheidsdoeleinden ongeacht eventuele copyrightvermeldingen hierop.

1. Microfabricage van een Gut-on-a-chip-apparaat Opmerking: De gut-on-a-chip is een microfluïdische apparaat door transparante, gasdoorlatende siliconenpolymeer (polydimethylsiloxaan, PDMS), die twee evenwijdige microkanalen (1 mm breed x 150 urn hoogte x 1 cm lengte) gescheiden door een flexibel poreuze (10 urn poriëndiameter, 25 urn afstand porie tot porie) PDMS membraan 5,9. Fabriceren de darm-on-a-chip (Figuur 1A, links) na de stappen. <ol><li> Microfabricage orde van de Gut-on-a-chip 5,9. <ol><li> Bereid uitgeharde, ontgaste PDMS door mengen van de PDMS-prepolymeer en hardingsmiddel (15: 1 w / w) en plaats deze in het vacuüm exsiccator gedurende 30 minuten. </li><li> Giet 30 g en 3 g uitgeharde, ontgaste PDMS op elk siliconenmal dat SU-8 micropatterns basis van de boven- en microkanalen van de darm-on-a-chip, respectievelijk. harden daarna bij 60 ° C in een droogoven gedurende loosten 4 uur. </li><li> Demold de bovenste en onderste PDMS lagen van elkaar siliconenmal door het snijden langs de rand met een chirurgische scalpel. Punch 6 holes (twee ingangen, twee uitgangen en twee vacuümkamers) met behulp van een biopsie puncher (2,0 mm in diameter gat). </li><li> Bereid de poreus membraan door het gieten van 10 g onverhard en ontgast PDMS op een gesilaniseerd silicium wafer met paal arrays met ronde pilaren (10 micrometer in doorsnede, 25 pm hoog) bedekken met een platte, gesilaniseerd PDMS steunlaag (15: 1, w / w; 1 cm dik). Plaats een 3 kg gewicht presser de installatie en harden van het polymeer bij 60 ° C gedurende 12 uur of langer. </li><li> Demold het opzetten van een poreus PDMS membraan gehecht aan de drager PDMS plaat van de siliciumwafel door voorzichtig optillen van de hoek van de plaat van de wafel, en afpellen tot poreuze PDMS membraan volledig wordt losgemaakt van de wafel. </li><li> Maak de kanaalzij van een bovenlaag (PDMS, 15: 1, w / w) en het poreuze membraan kant van de plasma gegenereerd door een draagbare corona behandelingsinrichting gedurende 1 minuut en 3 seconden respectievelijk. </li><li> Plaats de plasma behandelde oppervlakken van de poreuze PDMS membraan en bovenste microkanaal laag in een conforme contact door het plaatsen van elk stuk in parallel zonder luchtbellen. </li><li> Incubeer de gehele opzet bij 80 ° CO / N voor irreversibele binding van de twee PDMS lagen. </li><li> Trek het PDMS dragerlaag van het samenstel van een bovenlaag met een poreus membraan door voorzichtig optillen van de hoek van de steunlaag en afpellen tot de steunlaag volledig losgemaakt van de bovenlaag van het membraan. </li><li> Scheur de gedeelten van het membraan zich via vacuümkamers (de twee kamers aan weerszijden van het hoofdkanaal) met een fijne pincet tip holle vacuümkamers maken. </li><li> Maak de kant met het membraan bevestigd aan het bovenste stuk en de kant met de kanalen gegraveerd op het onderste stuk plasma op dezelfde wijze als beschreven in stap 1.1.6 gedurende 1 min. </li><li> Lijn de bovenste microkanaal laag met een poreus membraan en de onderste laag met een conforme contact door het plaatsen van elk stuk in parallel zonder luchtbellen onder een stereoscoop. </li><li> Hard de hele opstelling in een droge oven bij 80 ° CO / N om een ​​volledig gamma gut-on-a-chip microfluïdische apparaat met twee holle vacuümkamers naast het microfluïde kanaal cel te produceren. </li></ol></li><li> Sluit slang aan de inlaat en uitlaat van elke poort verbonden met de bovenste of onderste microkanalen in een darm-on-a-chip via een 90 ° gebogen roestvrijstalen stomp einde voorziene naald. </li><li> Sluit de slang aan de gaten in verband met de vacuümkamers met een 90 ° gebogen roestvrijstalen stomp einde voorziene naald. </li><li> Steriliseer de microkanalen leidingen door stromend 70% (v / v) ethanol onder toepassing van een 1 ml gesteriliseerd wegwerpspuit. </li><li> Uitdrogen van de microkanalen en slangen in een 60 ° C droge oven O / N. </li></ol> 2. Groei micromachineEred darmvlokken in de Gut-on-a-chip-apparaat <ol><li> Seed darmepitheelcellen (bv Caco-2BBE) op een Gut-on-a-chip microdevice 5,9. <ol><li> Steriliseer het apparaat met 70% (v / v) ethanol (zie stap 1,4) met een 1 ml gesteriliseerde wegwerpspuit gevolgd door drogen in een 60 ° C droge oven O / N (zie stap 1,5) voorafgaand aan de activering oppervlak. </li><li> Expose de complete opstelling van een gut-on-a-chip microsysteem (dat wil zeggen, een orgaan van de darm-on-a-chip is aangesloten op slangen) aan UV-licht (253,7 nm) en ozon gelijktijdig gedurende 40 min. </li><li> Afkoelen van het apparaat bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten onder UV-licht in een bioveiligheid kast (BSC). </li><li> Introduceren 100 gl van de ECM coating oplossingsgericht een mengsel van 50 ug / ml type I collageen en 300 ug / ml extracellulaire matrix verdund in serumvrij Dulbecco&#39;s Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) - in zowel bovenste en onderste microkanalen met een wegwerpbare , steriele 1 ml spuit. </li><li> IncubatE de hele opstelling in een 37 ° C bevochtigde 5% CO2 incubator gedurende 1 uur. </li><li> Ontgas 50 ml voorverwarmde (37 ° C) volledig kweekmedium (DMEM, 20% v / v foetaal runderserum (FBS), 100 eenheden / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine, in hoeveelheden verdeeld in een 3 ml wegwerpspuit) met een 50 ml filtersysteem (0,45 urn poriegrootte) in de BSC gedurende 1 min. <ol><li> Passeer de voorverwarmde medium door het filtersysteem en tik zachtjes op de gefilterde medium voor 1 min om eventuele luchtbellen of opgelost gas in het medium te verwijderen. </li></ol></li><li> Plaats het monster van compleet medium ontgast in een 3 ml wegwerpspuit en incuberen in een 37 ° C bevochtigde 5% CO2 incubator gedurende 1 uur. </li><li> Verbinden twee 3 ml wegwerpspuiten bevattende ontgast, voorverwarmd compleet cultuurmedium aan de bovenste en onderste microkanalen. </li><li> Stromen de volledige ontgast celkweekmedium in het bovenste microkanaal met een injectiespuit pomp met het volumetrischestroomsnelheid van 30 pl / uur (overeenkomend met de schuifspanning van 0,02 dyne / cm 2) in een 37 ° C bevochtigde 5% CO2 incubator O / N. </li></ol></li><li> Vorming van Microengineered Caco-2 Villi in de Gut-on-a-chip. <ol><li> Gebruik Caco-2BBE cellen na verloop getal tussen 50 en 65. </li><li> Kweek Caco-2-cellen in een T75 kolf die compleet cultuurmedium in een 37 ° C bevochtigde 5% CO2 incubator gedurende 4-5 dagen volledig confluente cellen te verkrijgen. </li><li> Voeg 10 ml Ca2 + en Mg2 + -vrij PBS volledig confluente Caco-2-cellen gekweekt in een T75 fles, wassen cellen, dan zuigen uit PBS. Herhaal deze stap twee keer. </li><li> Voeg 1 ml van 0,05% trypsine / EDTA-oplossing en incuberen in een 37 ° C bevochtigde 5% CO2 incubator gedurende 5 min. </li><li> Resuspendeer de cellen gedissocieerd met 10 ml voorverwarmd volledig celkweekmedium (met FBS) door op en neer pipetteren 3-5 keer. </li><li> Spin down de cel schorsing door centrifugation bij 500 xg gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. </li><li> Resuspendeer opnieuw met 1 ml voorverwarmd compleet medium om celdichtheid passen bij ~ 1,5 x 10 5 cellen / cm2 in het apparaat. Gebruik hemocytometer om de celdichtheid te schatten. </li><li> Infundeer 100 ul van de geresuspendeerde Caco-2-cellen in de bovenste microkanaal (lumen zijde) door een 1 ml wegwerpspuit bevestigd aan een 25 G5 / 8 naald op de uitgang van slang verbonden met het bovenste microkanaal. </li><li> Klem alle inlaten en uitlaten van de slang verbonden met het bovenste en onderste microkanalen gebruik bindmiddel clips. </li><li> Incubeer de hele opstelling in een 37 ° C bevochtigde 5% CO2 incubator gedurende 1 uur tot toestaan ​​gedissocieerde Caco-2 cellen te hechten aan het oppervlak van het poreuze membraan. </li><li> Verwijder de klemmen en hervat de stroom kweekmedium alleen de bovenste microkanaal bij 30 ul / uur via een injectiepomp tot cellen vormen een intacte monolayer van 24-36 uur. Gebruik de fase contrast of differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie tot cel-cel contacten in een cel monolaag te bevestigen. </li><li> Wanneer cellen vormen een monolaag, perfuseren het kweekmedium in zowel de bovenste (lumen) en onderste (capillaire) microkanalen op dezelfde stroomsnelheid van 30 gl / uur. </li><li> Toepassing van mechanische vervormingen nabootsen peristaltiek-achtige bewegingen 5,9. <ol><li> Schakel de vacuümpomp met de spanning apparatuur. </li><li> Sluit de vacuümkamers de vacuümregelaar via buis met een roestvrij stalen connector. </li><li> Stel de stretching beweging van 10% gemiddelde cellijn met een frequentie van 0,15 Hz met de cyclische sinusfunctie modus op de vacuüm het beheersen van software en klik op &#39;Start&#39;. </li></ol></li><li> Handhaaf de constante stroom kweekmedium (30 gl / uur) in zowel bovenste en onderste microkanaal de confluente Caco-2 monolagen onder mechanische vervormingen (10%, 0,15 Hz) gedurende ~ 100 uur. Let op: Caco-2-cellen sponkertijd ondergaan villus morfogenese met gegolfde 3D-projecties uitgebreid in de richting van het lumen van de epitheliale microkanaal 5,8-10. </li></ol></li><li> Om het orgel-level functies van het levende menselijke darm na te bootsen met lumen-capillaire weefsel-interface in de darm-on-a-chip 10, volg de aanwijzingen zoals hiervoor beschreven. <ol><li> Grow microengineered Caco-2 villi door herhalen van de stappen 2,1-2,2. </li><li> Flow de voorverwarmde co-kweekmedium (een mengsel van de volledige Caco-2 celcultuurmedium en totale HMVECs cultuurmedium, 1: 1 v / v) om de bovenste en onderste microkanalen bij 30 ul / uur. </li><li> Introduceren 100 pl gedissocieerde humane normale capillaire microvasculaire endotheelcellen (HMVECs; uiteindelijke celdichtheid, ~ 5,0 x 10 5 cellen / cm2) in de onderste microkanaal door de identieke werkwijze beschreven in stappen van 2.2.3 tot 2.2.9. </li><li> Plaats een uitgeharde PDMS rechthoekig stuk (0,5 cm x 1 cm x 1 cm, breedte x lengte x hoogte; 15: 1, w/ w elastomeer: ​​verharder) op de top van de darm-on-a-chip apparaat, dan draait u de hele setup-apparaat op zijn kop (dat wil zeggen, de bovenste microkanaal gezichten aan de andere kant, en de lagere microkanaal gezichten aan de bovenkant). </li><li> Incubeer de opstelling in een 37 ° C bevochtigde 5% CO2 incubator gedurende 1 uur om gedissocieerde HMVECs te hechten aan het oppervlak van het poreuze membraan in de onderste microkanaal. </li><li> Neem een hele setup van de CO 2 incubator, en draai de setup opnieuw. </li><li> Flow voorverwarmd co-kweekmedium (een mengsel van de volledige Caco-2 celcultuurmedium en totale HMVECs cultuurmedium, 1: 1 v / v) in zowel bovenste en onderste microkanalen bij 30 ul / uur met mechanische stretching bewegingen ( 10%, 0,15 Hz) gedurende ten minste drie dagen tot cel-cel contacten van een endotheel monolaag vormen. </li></ol></li></ol> 3. Host-gut Microbiome Co-cultuur in het Gut-on-a-chip microdevice <ol><li> Voer pre-cultuur of de bacteriële cellen als volgt samen te cultuur commensal gut microbiome op de microengineered darmvlokken. <ol><li> Resuspendeer de gevriesdroogde probiotische bacteriekweek poedervormige mengsel in 10 ml van het mengsel (1: 1, v / v) geautoclaveerd Lactobacilli MRS bouillon en Reinforced Clostridium Medium. </li><li> Pas de uiteindelijke celdichtheid ongeveer 0,2 eenheden optische dichtheid (bij 600 nm) door toevoeging van geschikte hoeveelheid drager, vervolgens 3 ml aliquot van microbiële celsuspensie in een 10 ml steriele wegwerpbare buis. </li><li> Plaats de buisjes bevattende microbiële cellen geresuspendeerd in de anaërobe container. Voeg twee pakjes anaërobe gasvormende sachet in de container. Het vat deksel stevig en incubeer de container opgezet zonder schudden in een 37 ° C bevochtigde 5% CO2 incubator O / N. </li></ol></li><li> Enten van Microbiome en Co-cultuur met darmepitheelcellen 5,10. <ol><li> Bereid 3 ml wegwerp spuiten met ontgast antibiotic-vrij celkweekmedium (dat wil zeggen, DMEM met 20% FBS). Zie 2.1.6 voor het ontgassen procedure van het kweekmedium. </li><li> Neem een hele opzet van de darm-on-a-chip apparaat met microengineered villi van de CO 2 incubator, ga dan naar de bioveiligheid kast. </li><li> Verwijderen injectiespuiten verbonden Tubing gekoppeld aan de bovenste en onderste microkanalen. Sluit spuiten bereid in 3.2.1 om het apparaat terug te brengen naar de CO 2 incubator, dan vloeien dit antibioticum-vrij kweekmedium gedurende 12 uur voorafgaand aan het zaaien van microbiome. </li><li> Spin down de voorgekweekt probiotische bacteriële mengsel cellen (zie stappen van 3,1) bij 10.000 g gedurende 5 min. Aspireren de supernatant middels vacuüm, vervolgens resuspenderen in een antibiotisch-vrij DMEM medium (uiteindelijke celdichtheid, ~ 1,0 x 10 7 CFU / ml). </li><li> Infuseren de celsuspensie in het lumen van het microkanaal met de &quot;kiemvrij&quot; darmvlokken met een 1 ml wegwerpspuit bevestigd aan een 25G5 / 8 naald. Kan de hechting van microbiële cellen aan de apicale oppervlak van de darmvlokken van ~ 1,5 uur zonder stroom door klemming alle buiseinde. </li><li> Perfuseren de voorverwarmde antibiotica-vrij kweekmedium in zowel de bovenste en onderste microkanalen bij 40 gl / uur met cyclische ritmische vervormingen (10%, 0,15 Hz). </li><li> Voor de co-cultuur van groene fluorescentie eiwit (GFP) -gemerkte E. coli (E. coli GFP, niet-pathogene DH5-alfa E. coli gastheer) cellen met 10,11 microengineered villi, pre-kweken GFP E. coli-cellen in geautoclaveerd LB-medium bij 37 ° C onder schudden voorwaarde (200 rpm) gedurende 12 uur. Herhaal de procedure van 3.2.5 naar 3.2.6 co-cultuur van GFP E. uit te voeren coli-cellen met microengineered villi. </li></ol></li><li> Afbeelding Cellen 5,8-10 <ol><li> Voer DIC, epifluorescentie, of een laser scanning confocale microscopie voor het opnemen van microbiële en epitheliale morfologie 5,8,10. <ol><li> Voor de DIC imaging, neem een setup van gut-on-a-chip microsysteem van de CO 2 incubator, plaatst u het setup-apparaat op het podium van een microscoop, dan nemen de cel morfologie. </li><li> Voor fluorescentie beeldvorming van villus epitheel stroom PBS wassen van de cellen met 100 pl / uur gedurende 10 minuten. <ol><li> Fix villi met 4% (w / v) paraformaldehyde gedurende 15 min. vloeien dan PBS wassen van de cellen met 100 pl / uur gedurende 10 minuten. </li><li> Permeabilize de villi met 0,3% (v / v) Triton X-100 verdund in PBS dat 2% (w / v) runderserumalbumine (BSA) gedurende 10 min. vloeien dan PBS wassen van de cellen met 100 pl / uur gedurende 10 minuten. </li><li> Blok cellen met 2% (w / v) BSA oplossing in PBS gedurende 1 uur. vloeien dan PBS wassen van de cellen met 100 pl / uur gedurende 10 minuten. </li><li> Voeg 300 nM 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindool dihydrochloride (DAPI) verdund in PBS voor de nucleaire kleuring onder bescherming tegen licht. </li><li> Voeg 25 eenheden / ml van fluorescente phalloidin(Phalloidin-CF647 conjugaat), opgelost in PBS voor de F-actine kleuring onder lichte bescherming. </li><li> Beelden opnemen van de fluorescent gekleurde cellen met een laser scanning confocale microscoop. Opmerking: Een 25X doelstelling is tijdens de confocale microscopie met de juiste optische zoom toegepast. In figuur 3B werd ongeveer 525X vergroting gebruikt. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444, 1027-1031 (2006).</li>
<li>Tremaroli, V., Backhed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interactions+between+the+gut+microbiota+and+host+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism.</a> Nature. 489, 242-249 (2012).</li>
<li>Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C. M., Brett Finlay, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+Microbiota+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gut Microbiota in Health and Disease.</a> Physiol. Rev. 90, 859-904 (2010).</li>
<li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+microbiome+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The human microbiome project.</a> Nature. 449, 804-810 (2007).</li>
<li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).</li>
<li>Round, J. L., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota+shapes+intestinal+immune+responses+during+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9, 313-323 (2009).</li>
<li>Garrett, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communicable+ulcerative+colitis+induced+by+T-bet+deficiency+in+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system.</a> Cell. 131, 33-45 (2007).</li>
<li>Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-on-a-Chip+microenvironment+induces+human+intestinal+cells+to+undergo+villus+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation.</a> Integr Biol. 5, 1130-1140 (2013).</li>
<li>Huh, D., Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+of+human+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nat Protoc. 8, 2135-2157 (2013).</li>
<li>Kim, H. J., Li, H., Collin, J. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+microbiome+and+mechanical+deformation+to+intestinal+bacterial+overgrowth+and+inflammation+in+a+human+gut-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113, E7-E15 (2016).</li>
<li>Miller, W. G., Lindow, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+GFP+cloning+cassette+designed+for+prokaryotic+transcriptional+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An improved GFP cloning cassette designed for prokaryotic transcriptional fusions.</a> Gene. 191, 149-153 (1997).</li>
<li>Odijk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+direct+current+trans-epithelial+electrical+resistance+in+organ-on-a-chip+microsystems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems.</a> Lab Chip. 15, 745-752 (2015).</li>
<li>Lentle, R. G., Janssen, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+characteristics+of+digesta+and+their+influence+on+flow+and+mixing+in+the+mammalian+intestine%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+B%22%5BJournal%5D)">Physical characteristics of digesta and their influence on flow and mixing in the mammalian intestine: a review.</a> J Comp Physiol B. 178, 673-690 (2008).</li>
<li>Granato, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface-associated+lipoteichoic+acid+acts+as+an+adhesion+factor+for+attachment+of+Lactobacillus+johnsonii+La1+to+human+enterocyte-like+Caco-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii La1 to human enterocyte-like Caco-2 cells.</a> Appl Environ Microbiol. 65, 1071-1077 (1999).</li>
<li>Dewhirst, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+oral+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The human oral microbiome.</a> J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).</li>
<li>Grice, E. A., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The skin microbiome.</a> Nat Rev Microbiol. 9, 244-253 (2011).</li>
<li>Hay, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+bacterial+colonisation+of+the+genital+tract+and+subsequent+preterm+delivery+and+late+miscarriage%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+J%22%5BJournal%5D)">Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent preterm delivery and late miscarriage.</a> Br Med J. 308, 295-298 (1994).</li>
</ol>

Donald E. Ingber is een oprichter van Emulate Inc., heeft aandelen in het bedrijf en leidt het wetenschappelijke adviescomité. De andere auteurs hebben geen financiële openbaarmakingen.

Inzicht in gastheer-microbiome interacties is van cruciaal belang voor het bevorderen van de geneeskunde; Echter, traditionele celkweekmodellen uitgevoerd in een plastic schaal of een statische wells plaat ondersteunt de stabiele co-kweek van menselijke intestinale cellen met levende darmorganismen langer dan 1-2 dagen vanwege microbiële cellen meestal overgroeien de zoogdiercellen in vitro. De overgrowing microbiële populatie snel verbruikt zuurstof en voedingsstoffen, daarna overmatige hoeveelheid van metabol...

De menselijke darm herbergt een verbluffend uiteenlopende reeks microbiële species (&lt;1000 soorten) en een enorm aantal microbiële cellen (10 keer meer dan het humane gastheercellen) en genen (100 keer meer dan het humane genoom) 1. Deze menselijke microbiomes spelen een sleutelrol bij het ​​metaboliseren van voedingsstoffen en xenobiotica, reguleren immuunresponsen en onderhouden intestinale homeostase 2. Niet verrassend, gezien deze diverse functies, de commensal darm microbiome moduleert uitgebreid gezondheid en ziekte 3. Zo is het begrijpen van de rol van de darm microbioom en gastheer-microbe interacties zijn van groot belang voor gastro-intestinale (GI) gezondheid te bevorderen en nieuwe therapieën voor darmziekten 4. De bestaande in vitro modellen darm (bijvoorbeeld statische kweken) beperken gastheer-microbiome co-cultuur een korte periode (&lt;1 dag) omdat microbiële cellen overgroeien en compromis darmwandfunctie 5. Surrogaat diermodellen (bv kiem-vrije 6 of genetisch gemanipuleerde muizen 7) zijn ook niet vaak gebruikt om te studeren gastheer-gut microbioom crosstalk omdat de kolonisatie en stabiele handhaving van de menselijke darm microbiome zijn moeilijk. Om deze uitdagingen te overwinnen, ontwikkelden we onlangs een biomimetische mens &quot;Gut-on-a-Chip&quot; microphysiological systeem (Figuur 1A, links) op de host-darm microbiome interacties die plaatsvinden in de levende menselijke darm 5,8 emuleren. De darm-on-a-chip micro-inrichting bevat twee evenwijdige microkanalen gescheiden door een flexibel, poreus, extracellulaire matrix (ECM) beklede membraan bekleed met humane intestinale epitheliale Caco-2 cellen nabootsen het darmlumen-capillair weefsel-grensvlak (Figuur 1A , rechts) 9. Vacuüm gedreven cyclische ritmische vervormingen veroorzaken fysiologische mechanische vervormingen dat veranderingen normaal induc na te bootsened door peristaltiek (Figuur 1A, rechts). Interessant wanneer Caco-2-cellen worden gekweekt in de darm-on-a-chip voor meer dan 100 uur, vormen zij spontaan driedimensionale (3D) darmvlokken met tight junctions, apicale borstelzomen, proliferatieve cellen beperkt tot basale crypten, slijmproductie, toegenomen drug metaboliseren activiteit (bijvoorbeeld cytochroom P450 3A4, CYP3A4), en verbeterde glucose heropname 8. In deze &quot;kiemvrij &#39;micromilieu, was het mogelijk om co-kweek het probioticum Lactobacillus rhamnosus GG of therapeutische vorming van een probiotische bacteriekweek mengsel met menselijke epitheelcellen gedurende twee weken 5,10. In deze studie beschrijven we het gedetailleerd protocol host-gut microbiome co-kweek uitgevoerd in de darm-on-a-chip apparaat voor een langere periode. Daarnaast bespreken we kritieke problemen en mogelijke uitdagingen in aanmerking komen voor een brede toepassing van deze host-microbiome co-cultuur pROTOCOL.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) bevattend 25 mM glucose en 25 mM HEPES</td><td>Gibco</td><td>10564-011</td><td>Verwarm het op 37 &deg;C in een waterbad.</td></tr><tr><td>Difco Lactobacilli MRS bouillon</td><td>BD</td><td>288120</td><td>Autoclaaf draaien op 121 &deg;C gedurende 15 min.</td></tr><tr><td>Poly(dimethylsiloxaan)</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>15:1 (w/w), PDMS : verhardingsmiddel</td></tr><tr><td>Caco-2BBE humane colorectale carcinoomlijn</td><td>Harvard Digestive Disease Center</td><td></td><td>Humaan colorectaal adenocarcinoom&nbsp;</td></tr><tr><td>Heat-inactivated FBS</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>20% (v/v) in DMEM</td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine-glutamine</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>1/100 verdunning in DMEM</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-fenylindoldihydrochloride</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td>Kernkleuring</td></tr><tr><td>Phalloidine-CF647-conjugaat (25 eenheden/ml)</td><td>Biotium</td><td>00041</td><td>F-actinekleuring</td></tr><tr><td>Flexcell FX-5000 spanningssysteem</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>FX5K</td><td>Peristaltiek-achtige rekbeweging (10% celspanning, 0,15 Hz frequentie)</td></tr><tr><td>Inverteerde epifluorescentiemicroscoop</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td><td>Beeldvorming, DIC</td></tr><tr><td>Scannende confocale microscoop</td><td>Leica</td><td>DMI6000</td><td>Beeldvorming, Fluorescerend</td></tr><tr><td>UVO Cleaner</td><td>Jelight Company Inc</td><td>342</td><td>Oppervlakteactivering van de gut-chip</td></tr><tr><td>Type I collageen&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A10483-01</td><td>Extracellulair matrixcomponent voor celcultuur in de chip</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>354234</td><td>Extracellulair matrixcomponent voor celcultuur in de chip</td></tr><tr><td>1 ml wegwerpspuit</td><td>BD</td><td>309628</td><td>Cel- en media-injectiemateriaal</td></tr><tr><td>25 G 5/8 naald</td><td>BD</td><td>329651</td><td>Cel- en media-injectiemateriaal</td></tr><tr><td>Spuitpomp</td><td>Braintree Scientific Inc.</td><td>BS-8000</td><td>Injectieapparatuur in de chip</td></tr><tr><td>VSL#3</td><td>Sigma-Tau Pharmaceuticals</td><td>7-45749-01782-6</td><td>Een formulering van 8 verschillende commensale darmmicroben</td></tr><tr><td>Reinforced Clostridial Medium</td><td>BD</td><td>218081</td><td>Anaërobe bacteriecultuurmedium</td></tr><tr><td>GasPak EZ Anaerobe Container System met Indicator</td><td>BD</td><td>260001</td><td>Anaërobe gasgenererend zakje&nbsp;</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>157-4-100</td><td>Fixeren van de cellen voor kleuring</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Permeabiliseren van de cellen</td></tr><tr><td>Bovine serumalbumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>Blokkingsmiddel voor kleuring van de cellen</td></tr><tr><td>Coronabehandelaar</td><td>Electro-Technic Products</td><td>BD-20AC</td><td>Plasmagenerator voor fabricage van de chip</td></tr><tr><td>Steriflip&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SE1M003M00</td><td>Het complete kweekmedium ontgassen</td></tr><tr><td>Wegwerphemocytometer</td><td>iNCYTO</td><td>DHC-N01</td><td>Voor handmatige celtelling</td></tr></tbody></table>

co-cultuur van de levens- microbiome met microengineered human darmvlokken in een gut-on-a-chip microfluïdische apparaat

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Hier beschrijven we een protocol om op lange termijn co-cultuur van multi-species menselijke darm microbiome voeren met microengineered darmvlokken in een menselijke darm-on-a-chip microphysiological apparaat. We herhalen het darmlumen-capillaire weefsel-interface in een microfluïdische apparaat, waar de fysiologische mechanische vervormingen en vloeistof shear stroming voortdurend worden toegepast op peristaltiek na te bootsen. In het lumen microkanaal, de menselijke darm epitheel Caco-2-cellen worden gekweekt om een ​​&#39;kiemvrij&#39; villus epitheel te vormen en te regenereren kleine darmvlokken. Pre-gekweekte microbiële cellen geënt in het lumen kant om een ​​gastheer-microbe ecosysteem stellen. Na microbiële cellen zich aan het apicale oppervlak van de villi, vloeistofstroom en mechanische vervormingen worden hervat aan een stationair micro waarin vers kweekmedium constant toegevoerd en ongebonden bacteriën (evenals bacteriële afval) continu verwijderd produceren. Na uitgebreide co-cultuur from dagen tot weken, worden meerdere microkolonies totaal willekeurig worden geplaatst tussen de villi en zowel microbiële en epitheelcellen levensvatbaar blijven en functionele ten minste één week in kweek. De co-cultuur protocol kan worden aangepast om een veelzijdig platform voor andere gastheer-microbiome ecosystemen welke in diverse menselijke organen, die in vitro onderzoek van de rol van menselijke microbiome orkestreren gezondheid en ziekte kunnen vergemakkelijken.

Aan de menselijke darm gastheer-microbiome ecosysteem in vitro na te bootsen, is het moet een experimenteel protocol bij de stabiele lange termijn co-cultuur van darmbacteriën en menselijke darmepitheelcellen reconstitueren onder fysiologische omstandigheden zoals peristaltiek-achtige mechanica en fluïdumstroming ontwikkelen. Hier maken we gebruik van een biomimetische gut-on-a-chip microdevice (Figuur 1A) co-kweek levende microbiële cellen...

We beschrijven een in vitro protocol co-cultuur darm microbioom en darmvlokken voor een langere periode met een menselijke darm-on-a-chip microphysiological systeem.

Co-cultuur van de levens- Microbiome met Microengineered Human darmvlokken in een Gut-on-a-Chip microfluïdische apparaat

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Het algemene doel van dit protocol is om de villusgroei van menselijke darmcellen aan te tonen onder peristaltiek-achtige bewegingen en stroming in een gut-on-a-chip microfluïdisch apparaat, en om te laten zien hoe deze cellen gecocultureerd kunnen worden met een levend darmmicrobioom. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van de gastroenterologie, klinische microbiologie en farmaceutische wetenschappen om ziekte genetically mechanismen te identificeren en de effectiviteit en toxiciteit van nieuwe drugverbindingen te valideren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat onderzoekers in staat zijn om in vitro een levensvatig en functioneel post-microbioom ecosysteem van de levende menselijke darm te creëren met behulp van een microfysiologisch systeem.De implicaties van deze techniek kunnen worden uitgebreid naar ziekten zoals colitis ulcerosa of de ziekte van Crohn, aangezien de stabiele co-cultuur van gastheercellen met het microbioom de complexiteit van deze ziekten kan nabootsen. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de complexe interacties tussen het darmmicrobioom en het immuunsysteem in de darm, kan deze ook worden toegepast op

co-culture-living-microbiome-with-microengineered-human-intestinal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit protocol beschrijft een microfluïdisch co-cultuur model voor gelijktijdige en gelokaliseerde cultuur van epitheliale cellen en bacteriën. Dit model kan gebruikt worden voor het onderzoeken van de rol van verschillende oplosbare moleculaire signalen op pathogenese en het scherm van de effectiviteit van de vermeende probiotische bacteriestammen.

Microfluïdische Co-cultuur van epitheliale cellen en bacteriën voor het onderzoeken van Oplosbaar Signal-gemedieerde interacties

In this video, we describe the methodology for setting up an ex vivo gut organ culture system to study the interactions between mouse intestinal tissue fragments and specific gut bacteria. The device consists of two pairs of input-output ports, the first connecting the intestinal tissue lumen and supplying the specific bacterial suspension into it, and the second continuously supplying media to the device's wells to maintain ex vivo tissue viability.

An Ex Vivo Gut Organ Culture System to Study Host-Microbiota Interactions

Hier presenteren we een protocol om primaire cellen, weefselmodellen en punchbiopten gedurende maximaal 28 dagen te cocultiveren in een microfluïdische multi-orgaan chip. Humane dermale microvasculaire endotheelcellen, leveraggregaten en huidbiopten werden met succes gecombineerd in een gemeenschappelijke mediacirculatie.

De Multi-orgel Chip - Een Microfluïdische platform voor lange termijn Multi-weefsel Coculture

Hier presenteren we een protocol voor het kweken van de darmflora van de dikke darm in vitro, met behulp van een reeks van bioreactoren die de fysiologische omstandigheden van de gastro-intestinale tractus simuleren.

Toepassing van geavanceerde In Vitro kweken van technologie om te bestuderen van de menselijke darmflora

Dit artikel presenteert een unieke methode voor het analyseren van gastheer-microbioom interacties met behulp van een nieuw darmorgaancultuursysteem voor ex vivo experimenten.

Een darmorgaankweeksysteem voor het analyseren van host-microbiota-interacties

Biopsie-afgeleide intestinale organoïden en organ-on-a-chips technologieën worden gecombineerd in een microfysiologisch platform om regiospecifieke darmfunctionaliteit te recapituleren.

Het combineren van menselijke organoïden en organ-on-a-chip-technologie om intestinale regiospecifieke functionaliteit te modelleren

neuroHuMiX is een geavanceerd darm-op-een-chip-model om de interacties van bacteriële, epitheel- en neuronale cellen te bestuderen onder proximale en representatieve co-cultuuromstandigheden. Dit model maakt het mogelijk om de moleculaire mechanismen te ontrafelen die ten grondslag liggen aan de communicatie tussen het darmmicrobioom en het zenuwstelsel.

Een darm-op-een-chip-model om de darmmicrobioom-zenuwstelsel-as te bestuderen

Dit protocol beschrijft een in vitro model van necrotiserende enterocolitis (NEC), dat kan worden gebruikt voor mechanistisch onderzoek naar de pathogenese van ziekten. Het beschikt over een microfluïdische chip bezaaid met darmenteroïden die zijn afgeleid van de menselijke neonatale darm, endotheelcellen en het darmmicrobioom van een pasgeborene met ernstige NEC.

Microfluïdisch model van necrotiserende enterocolitis met menselijke neonatale darmenteroïden en een dysbiotisch microbioom

Integratie van darmorganoïden bij honden en een Gut-on-a-Chip microfluïdisch systeem biedt relevante translationele modellen voor menselijke darmziekten. De gepresenteerde protocollen maken 3D-morfogenese en dynamische in vitro modellering van de darm mogelijk, wat helpt bij de ontwikkeling van effectieve behandelingen voor darmziekten bij honden en mensen met One Health.

Driedimensionale morfogenese bij darm-op-een-chip bij honden met behulp van darmorganoïden afkomstig van patiënten met inflammatoire darmaandoeningen

Dit artikel beschrijft een protocol voor het maken van een microfluïdisch vagina-op-een-chip (Vagina Chip) kweekapparaat dat de studie van menselijke gastheerinteracties met een levend vaginaal microbioom onder micro-aerofiele omstandigheden mogelijk maakt. Deze chip kan worden gebruikt als hulpmiddel om vaginale ziekten te onderzoeken en om mogelijke therapeutische tegenmaatregelen te ontwikkelen en te testen.

Modelleren van gezonde en dysbiotische vaginale micro-omgevingen in een menselijke vagina-op-een-chip

Ons gedetailleerde protocol schetst de creatie en het gebruik van het geavanceerde darm-op-chip-model, dat menselijk darmslijmvlies simuleert met 3D-structuren en verschillende celtypen, waardoor een diepgaande analyse van immuunresponsen en cellulaire functies als reactie op microbiële kolonisatie mogelijk is.

Immunocompetent darm-op-chip-model voor het analyseren van immuunresponsen van het darmslijmvlies

Leer co-cultuur van het darmmicrobioom met menselijke darmvlokken in een gut-on-a-chip microfluïdische opstelling. Deze methode maakt onderzoek naar gastro-intestinale ziekten en geneesmiddelontwikkeling mogelijk.

Co-cultuur van de levens- Microbiome met Microengineered Human darmvlokken in een Gut-on-a-Chip microfluïdische apparaat

Meer video's verkennen