Name: Concurrerende Transplantaties om hematopoietische stamcellen Fitness Evalueer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Leer een concurrerende muisbeenmergtransplantatie uit om hematopoëtische stamcellen in vivo te evalueren zonder cel sorteren. Deze methode biedt inzicht in stamcelbiologie en immunologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zijn dankbaar voor Roxann Hétu-Arbour voor hulp met de figuur ontwerp en de demonstratie van de procedures. Onderzoek in het lab werd ondersteund door een overgang onderscheiding van de Cole Foundation, Discovery verlenen geen. 419226-2012 van het Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada (NSERC) en de Canadese Stichting voor Innovatie (CFI Leaders Fund verlenen nr. 31377). KMH is een Chercheur-Boursier Junior voor het Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS).

Alle in dit protocol beschreven procedures zijn goedgekeurd door de institutionele dier ethische commissie en volg de Canadese Raad over Animal Care richtlijnen. Opmerking: Om steriele / specifieke pathogeen-vrije woonomstandigheden te behouden, voeren alle procedures in verband met directe omgang met levende muizen in een biologische veiligheid kast of een laminaire stroming kap. Reinigen of steriliseren kooien, beveiligingssystemen, huisvesting materialen, voer en water verstrekt aan de dieren op de juiste wijze. Gebruik alleen steriele, wegwerp naalden voor de injecties en voor bloedafname. Aseptische techniek is cruciaal tijdens de bereiding van het transplantaat. 1. Bereiding van ontvangende muizen <ol><li> Identificeer ontvangende muizen met oor inkepingen (of een andere methode door de lokale dier ethische commissie 8 is goedgekeurd) aan de individuele opvolging van perifeer bloed en beenmerg reconstructie na verloop van tijd mogelijk te maken. Weeg de muizen voor post-transplantatie follow-up. Onse ontvangende muizen die tussen 7 en 12 weken (minder dan 25 g). Let op: In de verstrekte voorbeeld werden CD45.1 + CD45.2 + ontvanger muizen in huis gefokt door het kruisen van C57BL / 6 muizen met congene B6.SJL muizen. </li><li> Bestralen ontvangende muizen met twee doses van 450 rad hematopoietische activiteit te vernietigen. Geef de eerste dosis van de dag vóór de transplantatie en de tweede 1-2 uur vóór de transplantatie. Let op: X-ray of gammastraling kan zowel worden gebruikt afhankelijk van de beschikbaarheid van geschikte faciliteiten. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Donor en Concurrent Bone Marrow Cells <ol><li> Euthanaseren donor (test- en controle; CD45.2 +) en concurrent (CD45.1 +; B6.SJL) muizen door CO 2 stikken, gevolgd door cervicale dislocatie of het gebruik van methoden die door de lokale dier ethische commissie goedgekeurd. </li><li> Plaats muizen op hun rug, benen wijd open, in een lege petrischaal of op een steriel gaasje (om het werkoppervlak schoon te houden) inside een biologisch veiligheidskabinet. Bevochtig de huid en vacht met 70% ethanol / 30% H 2 O (v / v). </li><li> Snijd de voet met een chirurgisch mes of een scherpe schaar. Opengesneden de huid langs het been en trek de huid weg met behulp van gekartelde tang. Knip overtollige spier. </li><li> Ontwrichten dijbeen door aan het been bot en het gebruik schaarbladen tegen het bekken als tegenkracht. Maak scheenbeen en het dijbeen van de knieschijf en verwijder de overige bits van de spieren en pezen. Plaats de botten in 2-3 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een 6-well weefselkweekplaat. </li><li> Verzamel beenmergcellen door spoelen beenderen met 5 ml steriel PBS. <ol><li> Houd het been voorzichtig met een pincet en plaats een 25 G naald bevestigd aan een 1 ml spuit gevuld met een uiteinde van het bot. Druk op de zuiger en het verzamelen van de cellen in een 15 ml conische buis. Herhaal zonodig om het centrum van het bot is wit. </li></ol></li><li> Distantiëren de cellen door herhaalde die door de naaldhet verkrijgen van een enkele celsuspensie. Vermijd luchtbellen en teveel kracht. Opmerking: Gebruik een iets grotere naald (22 G) levensvatbaarheid van de cellen te verbeteren bij deze stap. </li><li> Passeren de cellen door middel van een 70 um nylon zeef om te zorgen voor uniforme celsuspensie en puin en klonten te verwijderen. </li><li> Verwijder een aliquot voor celtelling met een hemocytometer. Centrifugeer de resterende celsuspensie bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Passen celdichtheid zoals vereist in steriel PBS (10 8 cellen / ml). Houd de cellen op ijs. </li></ol> 3. Vaststelling van Donor Cell HSC equivalenten <ol><li> Breng het equivalent van 3 x 10 6 cellen (30 ul) in een 5 ml ronde bodem polystyreen buis flowcytometrie kleuring. Voeg een gelijk volume van niet-gemerkt antilichaam tegen CD16 / CD32 om niet-specifieke kleuring te blokkeren (verdund in kleurbuffer (PBS aangevuld met 0,1% runderserumalbumine (BSA) en 1 mM EDTA) tot een eindconcentratie van 2,5 ug / ml). Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 90 ul fluorochroom-geconjugeerd antilichaam master mix bereid in vlekken buffer: gebiotinyleerde Lineage cocktail (B220, CD3e, CD11b, GR1, TER119), SCA1, CD117, CD135, CD150. Incubeer op ijs gedurende 30 min, beschermd tegen licht. Opmerking: Geschikte verdunningen bepaald voor elke partij van antilichaam. Zie Tabel Materialen voor verdunningen gebruikt in deze studie. </li><li> Voeg 2 ml kleurbuffer aan de cellen vortex en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C om ongebonden antilichaam te verwijderen. Giet supernatant en resuspendeer pellet door de knop. </li><li> Voeg 10 ul fluorochroom-geconjugeerde streptavidine verdund in vlekken buffer (zie Materials tabel). Incubeer op ijs gedurende 20 min, beschermd tegen licht. Was als in stap 3.3 om ongebonden streptavidine te verwijderen. </li><li> Het verwerven van de celmonsters met een flow cytometer met ten minste zes detektoren 9. Bepaal de frequentie van Lin - SCA1 + CD117 + CD135 - CD150 <sup&gt; + cellen (geschatte HSCs) in elk monster met behulp van de analyse matrijs getoond in Figuur 2 en zoals eerder gemeld 10,11. Opmerking: De frequentie van functionele HSC binnen die bevolking kan worden geschat tussen 1/3 en 1/5 2,12. </li><li> Vaststellen geschatte HSC equivalenten voor alle monsters 11, via een monster (typisch de concurrent B6.SJL CD45.1 + in dit voorbeeld) en basislijn zoals hieronder en in figuur 2. <ol><li> Bereken het aantal cellen vereist volgens de volgende formules: #transplanted HSCs / ontvanger = 5 x 10 5 cellen x HSC geschatte frequentie (vastgesteld referentiemonster, dit aantal is meestal tussen 75 en 125 voor wildtype C57BL / 6-muizen) 10-12. Opmerking: In figuur 2, voor monster A het resultaat 139 HSCs. Totaal getransplanteerde cellen (bij andere monsters, zoals Monster B in figuur 2) = # transgeplant HSC / HSC frequentie. Opmerking: In figuur 2, voor monster B, is het resultaat 197.826 (of ongeveer 2 x 10 5) totaal beenmergcellen. </li></ol></li><li> Bereken het totale aantal cellen nodig per graft ontvanger voor elk monster met behulp van de bovenstaande resultaten verkregen. Opmerking: Dit nummer moet 5 x 10 5 voor de basislijn monster (concurrent) zijn. <ol><li> Vermenigvuldig verkregen uit stap 3.7 door het aantal ontvangende muizen aantal en voeg voldoende cellen voor ten minste twee extra muizen ter compensatie van het dode volume in de spuit. </li></ol></li><li> Meng concurrent (bv CD45.1 +) en testcellen (CD45.2 +) in 1: 1 HSC equivalentverhouding berekend in stap 3.6 en pas het eindvolume van 200 ul per injectie met steriele PBS. Opmerking: Voor een groep van vijf ontvangende muizen zou de voorgestelde volume dus minstens 1,4 ml, bevattende 3,5 x 10 6 concurrent beenmergcellen (of973 geschatte HSCs voor monster A in figuur 2) en het equivalente aantal testcellen (in figuur 2, het equivalent voor monster B zou 197.826 x 7 = 1.384.782 beenmergcellen). </li></ol> 4. Beenmergplantatie <ol><li> Warm de ontvangende muizen bestraald in stap 1.2 met een rode warmtelamp verwijding van de bloedvaten te waarborgen en om de laterale staartaders meer toegankelijk. </li><li> Bereid een 1 ml tuberculine spuit uitgerust met een 27 G naald (of kleiner). Aspireren ongeveer 750 ul van de bereide celsuspensie (3 ontvangende muizen). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit. </li><li> Plaats de muis in een beveiligingssysteem. Onderzoek de staart en zoek naar de laterale staartaders die duidelijk zichtbaar op beide zijden van de staart moet zijn. Veeg de injectieplaats met ethanol. Steek de naald bevel op, parallel aan de huid en zachtjes op de zuiger. Injectie moet eenvoudig zijn. Als kracht is rewenste, de naald niet in de ader. Opmerking: Oudere muizen hebben dikkere huid, die kan het vinden van de ader moeilijker. Als de naald niet in de ader, plaats de naald proximaal van de eerste injectie. </li><li> Verwijder de naald en druk op de injectieplaats met een steriel gaasje voor een paar seconden om het bloeden te stoppen. Breng de muis in een schone kooi. Let op: Gebruik dezelfde spuit en naald voor drie injecties, waarna de naald te saai kunnen worden. </li><li> Voor post-transplantatie follow-up Injecteer 1 ml steriel PBS subcutaan aan de muizen rehydrateren van de eerste vijf dagen. antibiotica toe te voegen in het drinkwater om infecties te voorkomen (indien nodig; optioneel). Weeg muizen elke twee tot drie dagen voor de eerste drie weken en euthanize muizen die meer dan 15-20% van hun pre-transplantatie lichaamsgewicht verloren (of zoals bepaald door de lokale ethische commissie dier). </li></ol> 5. Analyse van perifeer bloed <ol><li> Verzamel een druppel bloed (eenpprox. 50-100 pi) in EDTA-buisjes. <ol><li> Om bloed te verzamelen van de onderkaak ader, gebruik dan een lancet of een 22 G naald op de huid van het gezicht in de buurt van de haarloze plek onder het kaakbeen doorboren en plaats het verzamelen buis naar de druppel bloed 13 te ontvangen. Verzamelen van bloed bij 4, 8, 12 en 16 weken na transplantatie om multi-lijn reconstitutie volgen. </li></ol></li><li> Voeg 1 ml vers bereide RT rode bloedcel lysisbuffer (9 delen 0,16 M NH4Cl + 1 deel 0,17 M Tris-HCl pH 7,65) naar de druppel bloed verzameld in stap 5.1.1. Meng en overdracht monster aan een 5 ml ronde bodem polystyreen buis geschikt voor flowcytometrie. Laat staan ​​voor 4 min bij RT. </li><li> Voeg 4 volumina ijskoude PBS. Meng door draaien end-to-end en breng onmiddellijk op ijs. Centrifugeer 10 minuten bij 200 xg bij 4 ° C. </li><li> Giet supernatant en resuspendeer pellet door de knop. Supernatant moet helder en rood. Voeg 2 ml vlekken buffer en vortex kort. Centrifugeer 5 minuten bij 200 XGAt 4 ° C. </li><li> Giet supernatant en resuspendeer pellet door de knop. </li><li> Ga verder met flowcytometrie kleuring met behulp van de algemeen protocol beschreven in stappen 3,1-3,3 en de volgende antilichamen voor de master mix: CD45.1, CD45.2, CD3e, CD19, GR1. </li><li> Het verwerven van de celmonsters met een flow cytometer met ten minste zes detektoren 9. Bepaal de frequentie van donor-afgeleide cellen voor elke stam (CD19 + B-lymfocyten, CD3e + T-lymfocyten, granulocyten GR1 licht) in elk monster met behulp van de analyse template uit figuur 3 en zoals gepubliceerd 10,11. </li></ol> 6. Analyse van Bone Marrow Reconstitutie <ol><li> Verzamel beenmergcellen zoals beschreven in paragraaf 2. Vlek de cellen voor flowcytometrie-analyse met behulp van de algemeen protocol beschreven in stappen 3,1-3,3 en de volgende antilichamen voor de master mix: Lineage cocktail, SCA1, CD117, CD135, CD150, CD45.1 , CD45.2. Detect lineage cocktail antilichamen onder gebruikmaking fluorochroom-geconjugeerd streptavidine zoals beschreven in stap 3.4. </li><li> Verwerven celmonsters met een flow cytometer met ten minste acht detectoren 9. Als slechts zes beschikbaar, voeg CD135 op hetzelfde kanaal als lineage paneel CD135 + cellen wordt uitgesloten. Bepaal de frequentie van donor afgeleide Lin - SCA1 + CD117 + CD135 - CD150 + HSCs in elk monster met behulp van de analyse template uit figuur 4 en zoals gepubliceerd 10. </li></ol>

<ol><li>Li, H. W., Sykes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+haematopoietic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation.</a> Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).</li>
<li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+purification+of+fetal+liver+hematopoietic+stem+cells+using+SLAM+family+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors.</a> Blood. 108 (2), 737-744 (2006).</li>
<li>Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells.</a> Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).</li>
<li>Rossi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Less+Is+More%3A+Unveiling+the+Functional+Core+of+Hematopoietic+Stem+Cells+through+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).</li>
<li>Till, J. E., McCulloch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+measurement+of+the+radiation+sensitivity+of+normal+mouse+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells.</a> Radiat Res. 14, 213-222 (1961).</li>
<li>Shen, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+Ly-5+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cloning of Ly-5 cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+GM+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Identification of GM mice.</a> Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).</li>
<li>Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+determination+of+rare+populations+by+flow+cytometry%3A+A+hematopoietic+stem+cell+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective.</a> Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).</li>
<li>Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frizzled-6+Regulates+Hematopoietic+Stem%2FProgenitor+Cell+Survival+and+Self-Renewal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal.</a> J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).</li>
<li>Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt4+enhances+murine+hematopoietic+progenitor+cell+expansion+through+a+planar+cell+polarity-like+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway.</a> PLoS One. 6 (4), e19279(2011).</li>
<li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li>
<li>Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+simple%2C+and+humane+method+for+submandibular+bleeding+of+mice+using+a+lancet%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet.</a> Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).</li>
<li>Santaguida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JunB+protects+against+myeloid+malignancies+by+limiting+hematopoietic+stem+cell+proliferation+and+differentiation+without+affecting+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal.</a> Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).</li>
<li>Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transplantation+via+antibody-based+clearance+of+hematopoietic+stem+cell+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches.</a> Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).</li>
<li>Zhang, C. C., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+hematopoietic+stem+cells+change+their+surface+phenotype+during+ex+vivo+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion.</a> Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).</li>
<li>Benveniste, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate-Term+Hematopoietic+Stem+Cells+with+Extended+but+Time-Limited+Reconstitution+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).</li>
<li>Fazekasde St Groth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evaluation+of+limiting+dilution+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">The evaluation of limiting dilution assays.</a> J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).</li>
<li>Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signaling+protein+Wnt4+enhances+thymopoiesis+and+expands+multipotent+hematopoietic+progenitors+through+beta-catenin-independent+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling.</a> Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).</li>
<li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).</li>
<li>Benz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+Stem+Cell+Subtypes+Expand+Differentially+during+Development+and+Display+Distinct+Lymphopoietic+Programs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).</li>
<li>Eppert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+gene+expression+programs+influence+clinical+outcome+in+human+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia.</a> Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).</li>
<li>McIntosh, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonirradiated+NOD%2CB6.SCID+Il2rgamma-%2F-+Kit%28W41%2FW41%29+%28NBSGW%29+mice+support+multilineage+engraftment+of+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De hier beschreven protocol is bedoeld om de relatieve geschiktheid van de donor (test) HSCs tegen bekende concurrent HSCs evalueren. De situatie van concurrentie verhoogt de relatieve gevoeligheid van de assay (eerder bescheiden afname van stamcellen fitness detecteren) en geeft een interne gekeurd voor de effectiviteit van bestraling en injectie. Er moet echter niet als een absolute maat voor HSC geschiktheid; een daling van de concurrerende reconstructie betekent niet automatisch dat de HSC niet goed zou presteren in...

Hematopoiese is een regeneratief proces dat het aanvullen van bloedcellen die zijn verloren door letsel, straling en celdood verzekert. Dit proces verzekert hematopoietische stamcellen (HSC) die grotendeels in de volwassen beenmerg bevinden. Bovendien kunnen hematopoëtische stamcellen worden gebruikt voor therapeutische doeleinden in auto-immuunziekten, hematologische maligniteiten en immuundeficiënties 1. Er is dus behoefte aan een beter begrip van de mechanismen die HSC functie te reguleren, met inbegrip van hun proliferatieve expansie en hun vermogen om te bereiken en engraft de ontvanger beenmerg na de transplantatie. Hoewel recente studies verschillende celoppervlak markers, zoals de SLAM familieleden CD150 en CD48, prospectief verrijken HSCs volwassen en foetale HSCs ongeveer 50% zuiver 2-4 gemeld, de gouden standaard maat voor functionele HSCs blijft in vivo repopulatie assay bepalen hun vermogen om te herstellen bloed cell productie in een bestraald gastheer 5. De in vivo klonale opnieuw bevolken test werd oorspronkelijk ontwikkeld door Till McCulloch en 6 en is sindsdien verfijnd en uitgebreid. Zoals oorspronkelijk gedefinieerd, HSC zorgen voor levenslang productie bloedcellen door middel van zelf-vernieuwing en differentiatie. De overdracht van HSC in een bestraalde ontvanger laat ons dus beoordelen: hun vermogen om te differentiëren door de analyse van de verschillende bloedcellijnen (T lymfocyten, B lymfocyten, granulocyten, monocyten) en hun vermogen tot zelfvernieuwing via seriële transplantatie. De test zou meestal om de vergelijking van de functionaliteit en / of de hoeveelheid van twee populaties van HSCs, bijvoorbeeld cellen uit twee muizen van verschillende genotypen of cellen die zijn behandeld of onbehandeld met verschillende factoren die de handhaving of uitbreiding van HSCs invloed kunnen hebben in de cultuur. Donor chimerisme, of de bijdrage van de overgedragen donor HSC to bloedcellen kan dan worden bepaald met stroomcytometrie analyse in het perifere bloed en beenmerg middels celoppervlaktemerkers of andere methoden die donor cellen onderscheiden van de ontvanger of gastheer. De meest gebruikte markers zijn zeker de twee allelen van het gen Ptprc of CD45 leukocyt antigen 7 die is gekozen voor de onderstaande voorbeelden. De klonale herbevolking test kan zowel competitief of niet-competitief zijn. In een niet-competitieve omgeving, zijn de controle en test HSC overgebracht in afzonderlijke ontvangende muizen en de resultaten voor elk celtype wordt onafhankelijk van de andere. In een competitieve omgeving, is de functie van zowel test- en controle HSCs afgemeten inwoners concurrent HSCs. De hier beschreven protocol gebruikt de competitieve omgeving maar kan ook worden aangepast voor niet-competitieve situaties. Beide benaderingen hebben hun voordelen en beperkingen, en we zullen ze te vergelijken in detail in dediscussie. We beschrijven ook verschillende benaderingen van het eigen vermogen van het aantal getransplanteerde HSC te garanderen, wordt uitgelegd hoe u de test voor de kwantificering van HSC aan te passen door beperkende verdunning assay (LDA), en geeft voorbeelden van zowel de geslaagde en mislukte transplantaties voor de interpretatie van de resultaten.

<table><tbody><tr><td>Microtainer tubes with K2EDTA</td><td>BD Biosciences</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>20 G naald</td><td>BD Syringe</td><td></td><td>Voor bloedafname uit de kaakslagader</td></tr><tr><td>LabQuake Shaker rotisserie</td><td>Thermo&nbsp; Scientific</td><td>C415110</td><td></td></tr><tr><td>Gezuiverd anti-muis CD16/CD32 (kloon 2.4G2, Fc Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>2.50 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>Pe-Cy7-geconjugeerd anti-muis CD3e (kloon 145-2C11)</td><td>eBioscience</td><td>25-0031</td><td>0.25 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>PE-geconjugeerd anti-muis CD19 (kloon 1D3)</td><td>eBioscience</td><td>12-0193</td><td>0.25 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-geconjugeerd anti-muis GR1 (kloon RB6-8C5)</td><td>eBioscience</td><td>47-5931</td><td>0.25 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>FITC-conjugaat anti-muis CD45.1 (kloon A20)</td><td>eBioscience</td><td>11-0453</td><td>2.50 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>eFluor450-geconjugeerd anti-muis CD45.2 (kloon 104)</td><td>eBioscience</td><td>48-0454</td><td>1.00 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>Gebiotinileerd anti-mens/muis CD45R (B220) (kloon RA3-6B2)</td><td>eBioscience</td><td>13-0452</td><td>1.25 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>Gebiotinileerd anti-muis CD3e (kloon 145-2C11)</td><td>eBioscience</td><td>13-0031</td><td>1.25 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>Gebiotinileerd anti-muis CD11b (kloon M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>13-0112</td><td>1.25 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>Gebiotinileerd anti-muis GR1 (kloon RB6-8C5)</td><td>eBioscience</td><td>13-5931</td><td>1.25 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>Gebiotinileerd anti-muis TER119 (kloon TER119)</td><td>eBioscience</td><td>13-5921</td><td>0.625 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>V500 streptavidin</td><td>BD Biosciences</td><td>56149</td><td>0.5 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>PE-geconjugeerd anti-muis CD117 (kloon 2B8)</td><td>BD Biosciences</td><td>553355</td><td>0.25 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>PE-Cy7-geconjugeerd anti-muis Ly6A/E (Sca1) (kloon D7)</td><td>BD Biosciences</td><td>558162</td><td>0.25 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>PerCP-eFluor710-geconjugeerd anti-muis CD135 (kloon A2F10)</td><td>eBioscience</td><td>46-1351</td><td>0.5 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>Alexa fluor 647-geconjugeerd anti-muis CD150 (kloon TC15-12F12.2)</td><td>Biolegend</td><td>115918</td><td>0.625 &mu;g/ml
BD Biosciences en eBioscience hebben niet hetzelfde kloond</td></tr><tr><td>1 ml tuberculine spuit met 27 G naald</td><td>BD Syringe</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>1 ml tuberculine spuit met 25 G naald</td><td>BD Syringe</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m cel zeef</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr></tbody></table>

concurrerende transplantaties om hematopoietische stamcellen fitness evalueer

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

De gouden standaarddefinitie van een hematopoëtische stamcel (HSC) is een cel die, wanneer overgebracht naar een bestraalde ontvanger, de capaciteit heeft om de bloedcelproductie gedurende de levensduur van de ontvanger opnieuw te vestigen. Dit protocol legt uit hoe een functioneel assay wordt ingesteld om de HSC-capaciteiten van twee verschillende populaties cellen te vergelijken, zoals beenmerg van muizen van twee verschillende genotypen, en hoe de ontvangende muizen door middel van flowcytometrie worden geanalyseerd. Het protocol gebruikt HSC-equivalenten in plaats van celsortering voor standaardisatie en bespreekt de voor- en nadelen van beide benaderingen. We bespreken verder verschillende variaties op het basisprotocol, inclusief seriële transplantaties, begrenzende verdunningsassays, homing-assays en niet-competitieve transplantaties, inclusief de voordelen en voorkeursgebruik van deze verschillende benaderingen. Deze assays zijn centraal voor de studie van HSC-functie en kunnen niet alleen worden gebruikt voor de onderzoeking van fundamentele intrinsieke aspecten van HSC-biologie, maar ook voor de ontwikkeling van preklinische assays voor beenmergtransplantatie en HSC-expansie in cultuur.

Een algemene beschrijving van de competitieve transplantatie setting, met inbegrip van de secundaire transplantaties (hieronder verder besproken) kan worden gevonden in figuur 1. Een vertegenwoordiger analyse voor pre-transplantatie van beenmerg HSC is te vinden in figuur 2. Meer gedetailleerde informatie over de uitsluiting van doubletten en dode cellen kan elders 9 te vinden. <str...

Dit protocol biedt stapsgewijze richtlijnen voor het opzetten van competitieve muisbeenmergtransplantatie-experimenten om hematopoëtische stam-/voorlopercellenfunctie te bestuderen zonder voorafgaande zuivering van stamcellen door celsortering.

Concurrerende Transplantaties om hematopoietische stamcellen Fitness Evalueer

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Het algemene doel van dit experiment is om de fitness van hematopoëtische stamcellen uit het beenmerg in vivo te bepalen met behulp van een competitieve transplantatie-assay. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de stamcelbiologie en hematopoëtische celtransplantatie over de impact van diverse manipulaties op de zelfvernieuwing van stamcellen na transplantatie. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat er een beperkt aantal dieren nodig is en dat er geen cel sortering aan te pas komt.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de functie van stamcellen, kan deze ook nuttig zijn in andere vakgebieden, zoals de immunologie, door het gebruik van gemengde beenmergchimeren. De initiële ontwikkeling van deze techniek in de jaren 60 maakte de weg vrij voor onderzoekers in het veld van de stamcelbiologie om de identiteit en functie van hematopoëtische stamcellen bij mensen en muizen te onderzoeken. De procedure zal worden gedemonstreerd door Roxanne Hetu-Arbour, een masterstudent in het laboratorium, en Edward Owusu Kwarteng, een PhD-student.Begin met het plaatsen van de muis in een biologische veiligheidskast op een chirurgisch platform

competitive-transplants-to-evaluate-hematopoietic-stem-cell-fitness

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit manuscript geeft een beschrijving van de methodologie die wordt gebruikt om muizenmodellen voor transductie-transplantatie te vestigen. Er wordt een gedetailleerd overzicht gegeven van technische fouten die moeten worden vermeden bij het uitvoeren van beenmergtransplantaties. Er moet een duidelijk begrip worden verkregen van het belang van hoog viraal titer, transfectie/transductie en bestraling.

Transductie-Transplantatie Mouse Model van myeloproliferatieve aandoening

Kwantificering van donor-afgeleide cellen is vereist voor het controleren van engraftment na stamceltransplantatie bij patiënten met Hemoglobinopathieën. Een combinatie van stroom cytometry gebaseerde cel sorteren, kolonie vorming assay, en na diverse analyses van korte tandem herhalingen kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van de proliferatie en differentiatie van de progenitoren in het compartiment van de erythroid.

Detectie van residuele Donor Erythroid voorlopercellen na hematopoietische stamceltransplantatie voor patiënten met Hemoglobinopathieën

We beschrijven het gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) te beoordelen van de kwaadaardige potentieel van genetisch gemanipuleerde hematopoietische cellen. HSCT is handig voor de evaluatie van verschillende kwaadaardige hematopoietische cellen in vivo , alsmede het genereren van een grote cohort van muizen met myelodysplastic syndromes (MDS) of leukemie ter evaluatie van nieuwe therapieën.

Gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie te beoordelen van de oorsprong van myelodysplastisch syndroom

Het doel van dit protocol is het isoleren van niet-menselijke primaten CD34+ cellen uit primer beenmerg, gen-wijzigen van deze cellen met lentivirale vectoren, en voor te bereiden een product infusie in de autologe host. Het protocol van de totale lengte is ongeveer 48 uur.

Voorbereiding en genetische modificatie van Nonhuman primaat hematopoietische stamcellen en voorlopercellen

Beschreven zijn protocollen voor de zeer efficiënte genoom bewerking van muriene hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPC) door het CRISPR/Cas9-systeem om snel muismodel systemen te ontwikkelen met hematopoietische systeemspecifieke genmodificaties.

Lentivirale CRISPR/Cas9-gemedieerde genoom bewerking voor de studie van hematopoietische cellen in ziekte modellen

Hier beschrijven we een betrouwbare methode voor het meten van de mitochondriale massa en membraan potentieel in ex vivo gekweekte hematopoietische stamcellen en T-cellen.

Meting van het mitochondriale massa-en membraanpotentiaal in hematopoietische stamcellen en T-cellen doorstroming Cytometrie

We beschrijven drie methoden van beenmergtransplantatie (BMT): BMT met total-body bestraling, BMT met afgeschermde bestraling en BMT-methode zonder pre-conditionering (adoptieve BMT) voor de studie van klonale hematopoiese in muismodellen.

Beenmergtransplantatieprocedures bij muizen om clonal hematopoiese te bestuderen

Dit protocol maakt het mogelijk om quiescente menselijke hematopoëtische stamcellen in vitro te behouden door het micromilieu van het beenmerg na te bootsen met behulp van overvloedige vetzuren, cholesterol, lagere concentraties cytokinen en hypoxie.

Een kweekmethode om rustgevende menselijke hematopoëtische stamcellen te behouden

Dit protocol beschrijft de intrafemorale injectie van enkele hematopoëtische of leukemische stamcellen, waaronder gen-bewerkte cellen, in muizenxenotransplantaatmodellen, die niet alleen de snelle en veilige transplantatie van cellen mogelijk maken, maar ook seriële analyses van het beenmerg.

Vereenvoudigde intrafemorale injecties met levende muizen maken continue beenmerganalyse mogelijk

Intrafemorale injecties maken de implantatie van een klein aantal hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) mogelijk door de cellen direct in de beenmergholte te plaatsen. Hier beschrijven we een experimenteel protocol van intrafemorale injectie van menselijke HSPC's in immunodeficiënte muizen.

Intrafemorale injectie van menselijke hematopoëtische stam- en voorlopercellen in immuungecompromitteerde muizen 

Hier presenteren we een protocol dat CRISPR/Cas9-technologie integreert met de Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-test om kandidaatgenen te identificeren die cruciaal zijn voor de abnormale proliferatieve capaciteit van hematopoëtische stam- en voorlopercellen.

Evaluatie van abnormale groeigerelateerde genen van hematopoëtische stam- en voorlopercellen door CRISPR/Cas9-technologie te combineren met celtelling

Leer een concurrerende muisbeenmergtransplantatie uit om hematopoëtische stamcellen in vivo te evalueren zonder cel sorteren. Deze methode biedt inzicht in stamcelbiologie en immunologie.

Concurrerende Transplantaties om hematopoietische stamcellen Fitness Evalueer

Meer video's verkennen