Olfactorische gedrag getest door Computer Tracking Of

Het algemene doel van deze opstelling is het analyseren van het reukgedrag van vliegen in een vierkwadranten-olfactometer met behulp van een bijgevoegd geautomatiseerd script voor het volgen van vliegen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over hoe olfactorische neurale systemen de buitenwereld detecteren en hoe de hersenen gedragsmatige beslissingen decoderen en sturen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze veelzijdig en robuust is, en herhaalde tests van reukreacties door een populatie vliegen in een grote experimentele arena mogelijk maakt.

Bereid voor dit protocol vijf geurkamers voor die bestaan uit een plastic buitencontainer, een glazen binnencontainer en een op maat gemaakt PTFE-dekselinzetstuk. Het inzetstuk is een origineel containerdeksel waarvan het centrale deel is verwijderd en waaraan twee eenrichtingskleppen zijn bevestigd. Gebruik vier van de geurkamers voor oplosmiddelcontroles en één kamer voor een testgeur.

Zorg ervoor dat elke kamer schoon is en vul vervolgens een geurstoffencontainer met één milliliter oplosmiddel of geurstofverdunning. Controleer daarna de positie van de container in de plastic kamer en verzeker u ervan dat er geen vloeistof is gemorst. Sluit het deksel stevig af met de schroefdop en een O-ring op de PTFE-inzet om lekkages te voorkomen.

Kweek de vliegen op standaard maïsmeelmedium. Plaats 30 mannetjes en 30 vrouwtjes in een standaard fles en laat ze vijf dagen lang eitjes leggen bij kamertemperatuur. Verzamel uit deze flessen pas uitgekomen vliegen.

Verzamel voor elke experimentele cohort 25 mannelijke en 25 vrouwelijke vliegen onder korte koolstofdioxide-anesthesie en laat de cohort twee tot vier dagen oud worden op standaardvliegmedium. Verplaats de cohort 40 tot 42 uur voor het experiment naar een buisje met ongeveer 10 milliliter één procent agarosegel voor de vochtigheid, zonder voedsel. Uithongering helpt om de totale beweging te verhogen, en meer dan 90% van de vliegen moet het uithongeringsproces overleven.

Indien meer dan 10% sterft, wat kan gebeuren bij een zwak genotype, probeer dan alle vliegen in het experiment één dag te laten vasten. Schakel ten minste vijf minuten van tevoren de temperatuurregelaar in en stel deze in op 25 °C. Verbind vervolgens de geurelementen via een plastic buisje met de arena.

Controleer de luchtstroom in elk kwadrant van de arena met een elektronische debietmeter. Zorg ervoor dat zowel de controlestroom als de geurstroom lopen met 100 milliliters per minuut. Vliegen zijn zeer gevoelig voor luchtstroom, en het is essentieel dat de luchtstroom voor elk kwadrant voor elk experiment wordt geverifieerd.

Reinig nu de arena en de glazen platen met 70% ethanol. Veeg alle onderdelen twee tot drie keer af en laat ze volledig aan de lucht drogen voordat u verdergaat. Klem vervolgens de glazen platen aan de arena vast.

Breng vervolgens de vliegen zonder anesthesie over naar de arena. Laat ze met behulp van de zwaartekracht via het gat in een van de glasplaten naar binnen gaan en dek het gat vervolgens af met een rond gaas. Plaats de arena met de vliegen nu in de lichtdichte kamer.

Sluit vervolgens de vier controleluchtstromen aan op elke hoek van de arena. Sluit de deur van de kamer en laat de vliegen 10 tot 15 minuten acclimatiseren aan de nieuwe omgeving. Voer na de acclimatisatieperiode een controle-experiment van vijf tot 10 minuten uit, waarbij de vliegen worden blootgesteld aan vier controleluchtstromen.

Het is nu essentieel om de gegevens onmiddellijk te analyseren. Als de vliegen niet gelijkmatig over de arena zijn verdeeld, moet de arena opnieuw worden ingesteld. Het is cruciaal om het gedrag van controle-vliegen bij enkel schone lucht te testen.

Hiermee kan snel worden vastgesteld of alle achtergrondonderstandigheden normaal zijn. Lichtlekkage, temperatuurschommelingen, een scheve arena of geurverontreiniging kunnen allemaal problemen veroorzaken. Gooi indien nodig de vliegen weg en maak de arena opnieuw schoon.

Indien er een vermoeden is van contaminatie door geurstoffen, moet alle slangBewuizing worden vervangen. Herhaal de controle-test met nieuwe cohorten totdat de dieren geen voorkeur meer tonen voor een van de vier kwadranten. Sluit vervolgens de kamer met de testgeurstof aan op de opstelling via een driewegkraan, of sluit de slangen opnieuw aan en voer een testexperiment uit gedurende 5 tot 10 minuten.

Stop en start het trackingprogramma bij langere experimentele opnames elke 20 minuten snel opnieuw, anders worden de databestanden te groot. Verwijder tussen de tests de vliegen, maak de arena en glasplaten schoon met 70% ethanol en vervang de verbindingsbuisjes. Houd de droge luchtstroom in stand om het systeem continu door te spoelen.

Voor een optimale efficiëntie is het raadzaam om twee arena's te hebben, zodat er tijdens de runs schoongemaakt kan worden. Indien meerdere experimenten op dezelfde dag mislukken, dient men uiterst zorgvuldig te zijn om te garanderen dat er geen geur van een vorige run in het systeem achterblijft. Dit is normaal gesproken geen probleem bij lage concentraties geurstof of bij CO2, maar bij sterk geconcentreerde stimuli kan een tussenpoos van maximaal 24 uur tussen de experimentele runs noodzakelijk zijn.

Gebruik voor de data-analyse de meegeleverde op maat gemaakte Matlab-routine om de gegevens naar een Matlab-formaat te converteren. Laad het ruwe databestand dat in realtime door de trackingsoftware is gegenereerd en maak een ruimtelijk masker dat de contouren van de arena volgt. Pas het masker toe op de ruwe gegevens om alle datapunten te verwijderen die buiten de arena vallen, aangezien deze ruis vertegenwoordigen.

Verwijder vervolgens alle datapunten die langer dan drie seconden met een snelheid van minder dan 0,163 centimeters per second bewegen. Deze gegevens zijn waarschijnlijk ruis of vliegen die niet bewegen. Visualiseer nu de resterende datapunten door ze allemaal uit te zetten over de registratieperioden.

De gegevens kunnen ook worden bekeken als individuele trajecten. Geurgrenzen kunnen snel worden geschat op basis van de gedragsgegevens van de vliegen. Bereken vervolgens de attractie-index en voer statistische tests uit zoals beschreven in het tekstprotocol.

Er werden 25 mannelijke en 25 vrouwelijke vliegen getest in het gedragsapparaat. Als reactie op droge lucht verkenden de vliegen de gehele arena zonder voorkeur voor een bepaald kwadrant. De lijn geeft de gevolgde traject van één vlieg weer.

Wanneer appelciderazijn in de luchtstroom van het kwadrant linksboven werd geïntroduceerd, werden de meeste vliegen aangetrokken door dat geurkwadrant. Wanneer een afstotende geurstof, 10% ethylpropionaat, in het kwadrant linksboven werd geïntroduceerd, werd dat kwadrant vermeden. De attractie-index van dat kwadrant bedroeg 0,68.

Een attractie-index is de meest gebruikte index bij het meten van de olfactorische respons. Een waarde boven of onder nul duidt op attractie of repulsie. Het script compenseerde voor kleine variaties in de positie van de arena tussen de proeven.

Datapunten die mogelijk ruis waren of van niet-bewegende vliegen, zijn verwijderd. Hoewel de test gedurende elke gewenste periode kan worden uitgevoerd, is het interessant om veranderingen in de bewegingen van de cohort over intervallen van 10 seconden te bekijken om geurhabituatie en andere fenomenen te kunnen waarderen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u olfactorisch gedrag effectief kunt uitvoeren en analyseren in een four-field assay.

Zodra de methode beheerst is, kan elk olfactorisch experiment in ongeveer een uur worden voltooid, en we voeren routinematig vier tot zes experimenten per dag uit.