Olfactorische gedrag getest door Computer Tracking Of Drosophila In een vier-kwadrant olfactometer

Het algemene doel van deze opstelling is om olfactorisch gedrag van vliegen te meten in een olfactometer met vier kwadranten met behulp van een geautomatiseerd vliegen-tracking software script. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over hoe olfactorische neurale systemen de externe wereld detecteren, en hoe de hersenen gedragsbeslissingen decoderen en leiden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het veelzijdig en robuust is, en herhaald testen van olfactorische reacties door een populatie vliegen in een grote experimentele arena mogelijk maakt.

Bereid voor dit protocol vijf geurkamers voor die bestaan uit een plastic buitencontainer, glazen binnencontainer en een op maat gemaakte PTFE deksel inzetstuk. Het inzetstuk is een originele container deksel met het centrale deel verwijderd, en twee aangehechte eenrichtingskleppen. Gebruik vier van de geurkamers voor oplosmiddel controles, en één kamer voor een testgeur.

Zorg ervoor dat elke kamer schoon is, en laad vervolgens een geurcontainer met één milliliter oplosmiddel of geurverdunning. Controleer vervolgens de positie van de container in de plastic kamer, en zorg ervoor dat er geen vloeistof is gemorst. Bevestig het deksel met de schroefdop en een O-ring op het PTFE-inzetstuk om lekkages te voorkomen.

Kweek de vliegen op standaard moutmeel medium. Plaats in een standaard fles 30 mannetjes en 30 vrouwtjes, en laat eieren vijf dagen bij kamertemperatuur leggen. Verzamel uit dergelijke flessen pas uitgeslopen vliegen.

Verzamel voor elke experimentele cohort 25 mannetjes en 25 vrouwtjes vliegen onder korte koolzuurverdoving en laat de cohort twee tot vier dagen op standaard vliegen medium verouderen. 40 tot 42 uur voor het experiment, breng de cohort over naar een fles met ongeveer 10 milliliters een percent agarose gel voor luchtvochtigheid zonder voedsel. Uithongering helpt om de hele beweging te verhogen, en meer dan 90% van de vliegen zou het uithongeringsproces moeten overleven.

Als meer dan 10% sterft, wat kan gebeuren bij een zwak genotype, probeer dan een dag uithongering voor alle vliegen in het experiment te gebruiken. Schakel ten minste vijf minuten van tevoren de temperatuurregelaar in en stel deze in op 25 graden Celsius. Verbind vervolgens de geurkamers via een plastic buis met de arena.

Controleer de luchtstroomsnelheid in elk kwadrant van de arena met behulp van een elektronische flowmeter. Zorg ervoor dat de controle en geurluchtstromen beide draaien op 100 milliliters per minuut. Vliegen zijn erg gevoelig voor luchtstroom, en het is van cruciaal belang dat de luchtstroom voor elk kwadrant wordt geverifieerd vóór elk experiment.

Reinig nu de arena en de glazen platen met 70% ethanol. Veeg alle onderdelen twee tot drie keer schoon, en laat ze volledig drogen voordat u verder gaat. Klem vervolgens de glazen platen aan de arena vast.

Breng vervolgens de vliegen over naar de arena zonder verdoving. Laat ze door het gat in een van de glazen platen vallen door gebruik te maken van de zwaartekracht, en dek vervolgens het gat af met een cirkelvormig gaas. Plaats nu de met vliegen geladen arena in de lichtdichte kamer.

Verbind vervolgens de vier controleluchtstromen met elke arenahoek. Sluit de deur van de kamer en laat de vliegen zich 10 tot 15 minuten aanpassen aan de nieuwe omgeving. Na de acclimatisatieperiode, voer een controle-experiment van vijf tot tien minuten uit waarbij vliegen worden blootgesteld aan vier controleluchtstromen.

Het is essentieel om de gegevens onmiddellijk te analyseren. Als de vliegen niet gelijkmatig verdeeld zijn in de arena, moet de arena worden reset. Het is van cruciaal belang om het gedrag van controlevliegen te testen op alleen schone lucht.

Dit zal snel verifiëren dat alle achtergrondcondities normaal zijn. Lekkend licht, temperatuuronbalans, gekantelde arena of een geurvervuiling kunnen allemaal problemen veroorzaken. Gooi indien nodig de vliegen weg en reinig de arena opnieuw.

Als een geurvervuiling wordt vermoed, vervang dan alle buisjes. Blijf het controle-experiment herhalen met nieuwe cohorts totdat de dieren geen voorkeur tonen voor een van de vier kwadranten. Verbind vervolgens de testgeurkamer met de opstelling via een driewegklep, of sluit de buisjes opnieuw aan en voer een testexperiment uit voor vijf tot tien minuten.

Voor langere experimentele opnames, stop en start het trackingprogramma snel elke 20 minuten, anders worden de gegevensbestanden te groot. Gooi tussen tests de vliegen weg, reinig de arena en glazen platen met 70% ethanol, en vervang de verbindingsbuizen. Laat de droge luchtstroom doorgaan om het systeem continu te spoelen.

Voor efficiëntie is het goed om twee arena's te hebben zodat schoonmaken tijdens uitvoeringen kan worden gedaan. Als meerdere experimenten op dezelfde dag verkeerd zijn, wees dan uiterst voorzichtig om ervoor te zorgen dat er geen geur in het systeem achterblijft van een eerdere uitvoering. Dit is normaal gesproken geen probleem met lage concentraties van geur of met CO2, maar voor sterk geconcentreerde stimuli kan een hiaat van maximaal 24 uur tussen experimentuitvoeringen nodig zijn.

Voor de gegevensanalyse, gebruik de meegeleverde op maat gemaakte Matlab routine om de gegevens om te zetten in een Matlab-formaat. Laad het ruwe gegevensbestand dat in realtime door de trackingsoftware is gemaakt, en maak een ruimtelijke masker dat de contouren van de arena volgt. Pas het masker toe op de ruwe gegevens om alle gegevenspunten die buiten de arena vallen te verwijderen, omdat deze ruis vertegenwoordigen.

Verwijder vervolgens alle gegevenspunten die zich minder dan 0,163 centimeter per seconde verplaatsen gedurende langer dan drie seconden. Deze gegevens zijn waarschijnlijk ruis, of vliegen die niet bewegen. Visualiseer nu de resterende gegevenspunten door ze allemaal te plotten gedurende de opnameperioden.

De gegevens kunnen ook worden bekeken als enkele trajecten. Geurgrensen kunnen snel worden geschat op basis van de vlieggedragsgegevens. Bereken vervolgens de aantrekkingsindex, en voer statistische tests uit zoals beschreven in het tekstprotocol.

25 mannetjes