Name: Olfactorische gedrag getest door Computer Tracking Of Drosophila In een vier-kwadrant olfactometer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Leer olfactometrie met een vier-kwadrant opstelling voor het testen van olfactorisch gedrag bij Drosophila melanogaster. Deze methode maakt geautomatiseerde tracking en herhaalde experimenten met grote populaties vliegen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Terry Shelley voor het vervaardigen van de vliegenarena en de lichtdichte behuizing, Liz Marr voor hulp bij het onderhouden van de vliegenvoorraad, en Xiaojing Gao en Junjie Luo voor hulp met de Matlab-code die gebruikt werd voor gegevensanalyse. We danken Johan Lundström van het Monell Chemical Senses Center voor het demonstreren van zijn geurtoedieningopstelling. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Whitehall Foundation (CJP) en NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).

1. Setup Assembly <ol><li> Vervaardiging van de stervormige arena (19,5 cm bij 19,5 cm bij 0,7 cm) van polytetrafluorethyleen (PTFE) volgens het tekening (aanvullende materialen, SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf). De arena kan worden vervaardigd door een commerciële of een aangepaste installatie. </li><li> Verwerven twee glasplaten (20,25 cm bij 20,25 cm met een dikte van 2 mm) en een gat (~ 0,7 cm in diameter) precies in het midden van één van de glasplaten met een gediamanteerde boor. </li><li> Vervaardiging van een lichtdichte gedrag doos voor de gedrags-arena. Ook de vervaardiging van een lichtdichte camera doos voor de infrarood CCD videocamera volgens de verstrekte tekeningen (aanvullende materialen, SupplementalSketch_LightTightBox.pdf). De boxen kunnen worden vervaardigd door een commerciële of een aangepaste installatie. </li><li> Monteer de airconditioner aan de achterwand en de LED-reeksen aan de zijwanden van de doos gedrag. Plaats de temperatuursensorin de doos gedrag door middel van een kant gat voor real time temperatuur feedback en aanpassing (zie figuren 1 en 2 voor details). </li><li> Bevestig de IR-filter en circulaire polarisator aan de camera, en monteer de montage in het vak camera. Het gedrag doos en camera box worden gescheiden door een glazen venster voor een betere temperatuurregeling van de box gedrag (zie figuren 1 en 2 voor details). </li><li> Sluit de infrarood CCD camera op een camera adapter. Sluit de camera aan op een USB-converter. Sluit de USB-converter aan op een USB-poort van de computer voor data-acquisitie. </li><li> Installeer de driver voor de video-omzetter op de computer volgens de instructies van de fabrikant. Optioneel, installeer image processing software die door de fabrikant van de USB-video-omzetter voor toegang tot een breder scala van camera-instellingen en acquisitie parameters. </li><li> Sluit de airconditioner unit (door middel van &quot;output&quot;Op de rug van temperatuurregelaar) en de temperatuursensor (via&quot; thermokoppel &quot;op de rug van temperatuurregelaar) aan de temperatuurregelaar. Plaats de sonde in de doos gedrag. Opmerking: De temperatuurregeling in onze inrichting kan worden gehandhaafd geven temperatuur tussen 18 ° C en 30 ° C is. Hogere of lagere omgevingstemperaturen kan nuttig zijn voor thermogenetische (dTrpA1, TRPM8 of shibire ts) zijn experimenten om neuronale activiteit te manipuleren of te remmen synaptische transmissie. Voor de meeste experimenten wordt de temperatuur op 25 ° C. </li><li> Monteer de geur levering systeem in de volgende stappen (zie figuur 1B voor gedetailleerde schema&#39;s en aansluiting hulpstukken): <ol><li> Gebruik de lucht drukregelaar om de lucht input van de centrale lucht systeem te bedienen. Sluit een carbon luchtfilter (gevuld met houtskool) naar de drukregelaar om de lucht te zuiveren van de centrale eenir systeem. </li><li> Monteer de flow control systeem, bestaande uit meerdere kanalen geregeld door een hoge resolutie flowmeter buizen. </li><li> Verbind de uitgang van de koolstof luchtfilter de stroommeter buizen via een verdeler zoals getoond in Figuur 1B en 2F. Richt de uitgang van de stroommeter buizen met elektronisch geregelde 3-weg magneetafsluiters te regelen als schone lucht die de stroommeters in de kamer wordt uitgezet of in maat geur kamers 24 ingevoerd. </li><li> Installeer de solenoïdeklep controller volgens de handleiding van de fabrikant. </li></ol></li><li> Installeer de elektronische luchtstroom meter door aan te sluiten op een data-acquisitie-inrichting (DAQ) en een voeding volgens de handleiding van de fabrikant. Installeer de DAQ-interface software om gelijke debieten controleren in elk kwadrant van de arena voor elk experiment. </li></ol> 2. Olfactorische Stimuli Voorbereiding <ol><li> Bereid 5 geurmier kamers 24 die bestaan ​​uit een plastic buitenste container, glas innerlijke container, een op maat gemaakte PTFE deksel insert, originele verpakking deksel met centrale deel verwijderd, en twee one-way kleppen. Opmerking: Een O-ring om de PTFE deksel kan worden gebruikt om luchtlekkage vanuit de kamer tijdens geur geur perfusie voorkomen. Zie figuur 1 voor schema en Figuur 2 voor foto&#39;s van de kamers. </li><li> Gebruik vier geurstof kamers voor oplosmiddelcontroles, en één kamer voor een test geurstof. Vul het glazen recipiënten met 1000 pi oplosmiddel of geurstof verdunning (test geurstoffen + geschikte oplosmiddelen, meng goed voor experimenten), plaatst u de glazen container in de bijbehorende plastic kamer (niet morsen uit de vloeistof in de plastic kamer) en draai het deksel . Zorg ervoor dat u altijd gebruik maken van een schone kamer voor de test geurstof en oplosmiddel controles. Opmerking: Olfactorische aantrekkelijkheid kan worden veroorzaakt door 1/16 verdunning van appelazijn (5% zuurgraad) in water. Daarentegen kan olfactorische afstoting gedrag bestudeerd door een 10% verdunning van ethylpropionaat in minerale olie. Controle stimuli in deze gevallen zijn geur kamers met zuivere minerale olie. </li></ol> 3. Fly Voorbereiding <ol><li> Achter vliegt op standaard maïsmeel medium. Plaats 30 mannelijke en 30 vrouwelijke ouderlijke vliegen in een standaard fles, en laat ze eieren leggen voor 5 dagen bij 25 ° C of kamertemperatuur. </li><li> Voor elk experiment, verzamelt Bijlage In recent (&lt;1 dag oud) 25 mannelijke en 25 vrouwelijke vliegen onder korte CO 2 verdoving. </li><li> Houd vliegen in een flacon met standaard fly medium voor 2-4 dagen. </li><li> 40-42 uur voor het experiment, de overdracht van de vliegen zonder CO 2 verdoving &#160; een flesje met ~ 10 ml 1% agarose gel. Dit zal de vliegen bevochtigd zonder voedsel, waardoor hun locomotorische activiteit te verhogen houden. Opmerking: Meer dan 90% van de vliegen zou de hongerdood te overleven. Sommige genotypes zijn minder te genezenthy en kunnen het niet door een 40 uur honger. In die gevallen kortere periodes, zoals 24-28 uur acceptabel zijn, maar moet voor alle proefomstandigheden en herhalingen worden gehouden. </li></ol> 4. Behavioral Reacties op Aantrekkelijk en Repellent Geuren <ol><li> Schakel de temperatuurregelaar en zet deze op 25 ° C. </li><li> Sluit de geurstof kamers (controle en test geurstoffen) door de buis met de uitlaat van odorant kamer en de push-to-connect fitting op de doos gedrag. </li><li> Debiet in elk kwadrant door de luchtstroom meter om te controleren of de controle- en geurstof luchtstromen gelijk aan 100 ml / min. </li><li> Maak de PTFE fly arena en de glasplaten met 70% ethanol 2-3 keer en hen in staat stellen om volledig aan de lucht drogen (~ 3-4 min). </li><li> Bevestig de glasplaten naar de arena met klemmen. </li><li> Transfer vliegen zonder CO 2 verdoving in de arena door het gat in een van de glasplaten. achteruiter de overdracht plaats een cirkelvormige gaas op het gat om vliegen voorkomen ontsnappen. Noot: CO 2 anesthesie is aangetoond dat Drosophila gedrag 25 beïnvloeden en moeten niet worden gebruikt binnen 24 uur van een gedragsexperiment. </li><li> Plaats de arena met vliegen in de lichtdichte kamer, sluit de vier controle luchtstromen door het aansluiten van de slang aan de push-to-connect fitting op het gedrag vak aan de arena hoeken, sluit de deur van de kamer en wacht 10- 15 min te laten de vliegen wennen aan de nieuwe omgeving. Indien mogelijk, schakel de lichten uit in de kamer waar de experimenten worden uitgevoerd, om eventuele minimale licht lekken, dat kan vertekening van de experimentele resultaten te vermijden. </li><li> Voer een 5-10 min controle-experiment, waarbij vliegen worden blootgesteld aan 4 controle luchtstromen. </li><li> Analyseer de gegevens onmiddellijk (zie Data-analyse hieronder) om ervoor te zorgen dat de vliegen gelijkmatig verdeeld zijn in de arena, en de attractie Index is dichtbijop 0. Deze stap is noodzakelijk, omdat het gecontroleerd of er geen ongecontroleerde bronnen van voorkeur of vermijding in de arena (bijvoorbeeld lekkende licht van buitenaf, ongelijkmatige temperatuurverdeling, ongelijke arena, geurcontaminatie, etc.). Als de vliegen ongelijk verdeeld zijn of hun bewegingsactiviteit laag is, gooi de vliegen, weer schoon de arena (Stap 4.4) en het gebruik van een nieuwe partij van vliegen om het experiment te herhalen. </li><li> Sluit de test geurstof kamer naar de setup door het inschakelen van de 3-weg kleppen of opnieuw aansluiten van de connector buizen. </li><li> Run-test experiment gedurende 5-10 min en analyseren van de gegevens zoals besproken in paragraaf 5 hieronder (zie ook referentie 14 en figuur 3). Opnamen langer dan 20 min kan leiden tot gegevensbestanden die moeilijk berekenings proces kan zijn. Als langer experimentele opnamen gewenst zijn, snel stoppen en opnieuw beginnen met het volgen programma. Dit leidt tot een ~ 10 sec verschil tussen experimentele opnamen. </li><li> Discard vliegen. </li><li> Clean arena en glazen platen met 70% ethanol (stap 4.4), en vervang connector buizen binnen de lichtdichte behuizing. Om experimenten te versnellen, kan een nieuwe schone arena worden gebruikt, en de vuile arena schoongemaakt, terwijl het uitvoeren van experimentele runs. </li><li> Run ander experiment met een nieuwe partij van vliegen, indien nodig. Als er meerdere experimenten worden uitgevoerd op dezelfde dag, neem uiterste zorg om ervoor te zorgen dat er geen geurstof wordt achtergelaten in het systeem van een vorige test. Dit is meestal geen probleem met lage concentraties van geurstoffen of CO 2, maar hooggeconcentreerde stimuli tot 24 uur spleet tussen experimentele runs nodig zijn. Bovendien kunnen alle buizen na de stroomsnelheid buizen worden vervangen als geurstof worden vermoed bij controle-experimenten. Laat altijd de droge lucht op tussen de experimenten om continu te spoelen van het systeem </li></ol> 5. Data Analysis Opmerking: De voorgestelde vlieg volgen overname software (beschreven in Materials), tracks vliegen in real time tijdens de overname, en slaat de tijdstempel en de coördinaten van alle gedetecteerde vliegen in * .dat formaat. We hebben een op maat gemaakte Matlab routine om de gegevens om te zetten in een Matlab-formaat, en om de gegevens te analyseren ontwikkeld. Code voorbeelden worden in aanvullende materialen, maar de details van de uitvoering zal afhangen van de gebruikte software voor data-acquisitie. <ol><li> Laad de ruwe data. Maak een ruimtelijk masker dat de contouren van de arena volgt en het masker van toepassing op de ruwe gegevens om alle gegevens punten die buiten de arena dalen als zij vertegenwoordigen ruis (figuur 4A, Aanvullende Code MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask verwijderen. m). </li><li> Verwijder alle gegevens punten die bewegen met een snelheid onder de 0,163 cm / s voor langer dan 3 seconden, omdat deze gegevens is waarschijnlijk ruis of gegenereerd door niet-bewegende vliegen (figuur 4B, Aanvullende Code TemporalFiltering.m) zijn. </li><li> Visualiseer resterende gegevenspunten door ze uit te plotten in een keer of als enkele trajecten (Figuur 3, Aanvullende Code SingleTrajectoryViewer.m). Opmerking: De locatie van geur grenzen vier-veld waarschijnlijk afhankelijk van een aantal factoren, zoals de kenmerken van iedere geurstof en de luchtdebieten gebruikt. Zo zal zeer vluchtige geurstoffen waarschijnlijk vul de geur kwadrant vollediger dan minder volatiel geurstoffen. Het is dus waarschijnlijk dat iedere geurstof iets andere geur grenzen kunnen vertonen. Het gebruik van een foto-ionisatie detector geur grenzen meten kan problematisch zijn als het gebruik van een vacuüm om lucht monster van een bepaalde plek, en dus verstoort de geurstof concentratie op die plek. Toch kan de geur grenzen snel worden geschat op basis van fly behavioural data. Bijvoorbeeld kan een geur grens gebaseerd op gecumuleerd fly tracks in reactie op verschillende geuren duidelijk worden waargenomen in figuren 3C en 3D. </li><li> Calkeningen een attractie index om te bepalen of controle-experimenten te genereren geen voorkeur respons, en ook om toegang te krijgen tot de reactie op een geurstof (of optogenetic 9) stimulus. Om een ​​attractie Index (AI) te berekenen, gebruikt u de laatste 5 minuten van een controle- of testopname. Een maatregel aantrekkingskracht die tussen 1 (absolute attractie) en -1 (absolute afstoting) te verkrijgen, wordt de volgende formule gebruikt om de AI berekenen: <img alt="vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/54346/54346eq1.jpg" /> waarbij N test het aantal gegevenspunten in de test kwadrant, N besturing is het gemiddelde aantal gegevenspunten in de drie controlegroepen kwadranten. Deze maatregel is intuïtief als geen voorkeur door bijna nul waarden zouden worden vermeld. Dit betekent echter niet correct aan de verhouding van het totale aantal vliegen die zich in het kwadrant geurstof. Om deze maatregel te verkrijgen, kan een percentage index (PI) worden gebruikt: <img alt="vergelijking 2" src=&quot;/files/ftp_upload/54346/54346eq2.jpg&quot; /&gt; waarbij N test het aantal gegevenspunten in de test kwadrant en N totaal is het aantal datapunten in alle vier kwadranten. Deze formule levert een maat die tussen 0 en 1, met 0,25 overeenkomt met onbestaande gedragsmatige voorkeur (figuur 3E en 4C, aanvullende code AttractionIndex.m). </li><li> Run 5-10 herhalingen van elke experimentele conditie, met behulp van een nieuwe groep van vliegen voor elke herhaling. Vergelijk de aantrekkingskracht indexen tussen voorwaarden of tegen controles door het gebruik van de Kolmogorov-Smirnov niet-parametrische testen (figuur 3F, kstest2 functie in Matlab). </li></ol>

<ol><li>Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+mutants+of+Drosophila+isolated+by+countercurrent+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (3), 1112-1119 (1967).</li>
<li>Thorpe, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+studies+on+pre-imaginal+olfactory+conditioning+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+B%22%5BJournal%5D)">Further studies on pre-imaginal olfactory conditioning in insects.</a> Proc R Soc B. 127 (848), 424-433 (1939).</li>
<li>Tully, T., Quinn, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+conditioning+and+retention+in+normal+and+mutant+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster.</a> J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).</li>
<li>Anholt, R. R., Mackay, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+genetic+analyses+of+complex+behaviours+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative genetic analyses of complex behaviours in Drosophila.</a> Nat Rev Genet. 5 (11), 838-849 (2004).</li>
<li>Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Into+the+mind+of+a+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Into the mind of a fly.</a> Nature. 450 (7167), 193-197 (2007).</li>
<li>Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+sleep+and+circadian+mutants+reveals+mechanisms+underlying+regulation+of+sleep+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila.</a> Sleep. 31 (4), 465-472 (2008).</li>
<li>Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+monitoring+and+analysis+of+social+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila.</a> Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).</li>
<li>Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+ethomics+in+large+groups+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput ethomics in large groups of Drosophila.</a> Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).</li>
<li>Aso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mushroom+body+output+neurons+encode+valence+and+guide+memory-based+action+selection+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila.</a> Elife. 3, e04580(2014).</li>
<li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).</li>
<li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+of+tools+for+targeted+gene+expression+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila.</a> Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).</li>
<li>Venken, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering%3A+Drosophila+melanogaster+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome engineering: Drosophila melanogaster and beyond.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. , (2015).</li>
<li>Diao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plug-and-play+genetic+access+to+drosophila+cell+types+using+exchangeable+exon+cassettes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Plug-and-play genetic access to drosophila cell types using exchangeable exon cassettes.</a> Cell Rep. 10 (8), 1410-1421 (2015).</li>
<li>Lin, C. C., Prokop-Prigge, K. A., Preti, G., Potter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+odors+trigger+Drosophila+males+to+deposit+a+pheromone+that+guides+aggregation+and+female+oviposition+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Food odors trigger Drosophila males to deposit a pheromone that guides aggregation and female oviposition decisions.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Pettersson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+aphid+sex+attractant%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Systematics+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">An aphid sex attractant.</a> Insect Systematics & Evolution. 1 (1), 63-73 (1970).</li>
<li>Semmelhack, J. L., Wang, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Select+Drosophila+glomeruli+mediate+innate+olfactory+attraction+and+aversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion.</a> Nature. 459 (7244), 218-223 (2009).</li>
<li>Vet, L. E. M., Lenteren, J. C. V., Heymans, M., Meelis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+airflow+olfactometer+for+measuring+olfactory+responses+of+hymenopterous+parasitoids+and+other+small+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Entomology%22%5BJournal%5D)">An airflow olfactometer for measuring olfactory responses of hymenopterous parasitoids and other small insects.</a> Physiological Entomology. 8 (1), 97-106 (1983).</li>
<li>Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+responses+of+Drosophila+to+biogenic+levels+of+carbon+dioxide+depend+on+life-stage%2C+sex+and+olfactory+context%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context.</a> J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2739-2748 (2006).</li>
<li>Katsov, A. Y., Clandinin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motion+processing+streams+in+Drosophila+are+behaviorally+specialized%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Motion processing streams in Drosophila are behaviorally specialized.</a> Neuron. 59 (2), 322-335 (2008).</li>
<li>Gao, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+kinematics+and+motor-related+neurons+for+aversive+chemotaxis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific kinematics and motor-related neurons for aversive chemotaxis in Drosophila.</a> Curr Biol. 23 (13), 1163-1172 (2013).</li>
<li>Gao, X. J., Clandinin, T. R., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+sparse+olfactory+inputs+are+sufficient+to+mediate+innate+aversion+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Extremely sparse olfactory inputs are sufficient to mediate innate aversion in Drosophila.</a> PLoS One. 10 (4), e0125986(2015).</li>
<li>Ronderos, D. S., Lin, C. C., Potter, C. J., Smith, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Farnesol-detecting+olfactory+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Farnesol-detecting olfactory neurons in Drosophila.</a> J Neurosci. 34 (11), 3959-3968 (2014).</li>
<li>Riabinina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+and+expanded+Q-system+reagents+for+genetic+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations.</a> Nat Methods. 12 (3), 219-222 (2015).</li>
<li>Lundstrom, J. N., Gordon, A. R., Alden, E. C., Boesveldt, S., Albrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+building+an+inexpensive+computer-controlled+olfactometer+for+temporally-precise+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Psychophysiol%22%5BJournal%5D)">Methods for building an inexpensive computer-controlled olfactometer for temporally-precise experiments.</a> Int J Psychophysiol. 78 (2), 179-189 (2010).</li>
<li>Colinet, H., Renault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+effects+of+CO2+anaesthesia+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Letters%22%5BJournal%5D)">Metabolic effects of CO2 anaesthesia in Drosophila melanogaster.</a> Biology Letters. 8 (6), 1050-1054 (2012).</li>
<li>Ramdya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensory+interactions+drive+collective+behaviour+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila.</a> Nature. 519 (7542), 233-236 (2015).</li>
<li>Ofstad, T. A., Zuker, C. S., Reiser, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+place+learning+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visual place learning in Drosophila melanogaster.</a> Nature. 474 (7350), 204-207 (2011).</li>
<li>Beshel, J., Zhong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graded+encoding+of+food+odor+value+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Graded encoding of food odor value in the Drosophila brain.</a> J Neurosci. 33 (40), 15693-15704 (2013).</li>
<li>Steck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+behavioral+paradigm+for+Drosophila+olfaction+-+The+Flywalk%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction - The Flywalk.</a> Sci Rep. 2, 361(2012).</li>
<li>Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+Quantification+of+Odor-guided+Behavior+in+Drosophila+melanogaster+Using+the+Flywalk+Paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm.</a> J. Vis. Exp. (106), (2015).</li>
<li>Claridge-Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Writing+memories+with+light-addressable+reinforcement+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry.</a> Cell. 139 (2), 405-415 (2009).</li>
<li>Parnas, M., Lin, A. C., Huetteroth, W., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+discrimination+in+Drosophila%3A+from+neural+population+codes+to+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odor discrimination in Drosophila: from neural population codes to behavior.</a> Neuron. 79 (5), 932-944 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De vier-veld olfactometer beschreven is een veelzijdig gedragssysteem voor het bestuderen van de olfactorische reactie van grote populaties van wildtype en mutante Drosophila vliegt. Elk experiment duurt ~ 1 uur (inclusief setup, experimentele runs en schoonmaak), en 4-6 experimenten kunnen routinematig elke dag worden uitgevoerd. Een typische test met behulp 40-50 vliegen gedurende 5 minuten genereert ongeveer 450.000 bijgehouden gegevenspunten voor analyse. De beschreven configuratie kan ook worden gebruikt, ...

Het vermogen zich aan te passen en te reageren op de externe omgeving is van cruciaal belang voor het voortbestaan ​​van alle dieren. Een dier moet gevaren te vermijden, op zoek gaan naar voedsel en vind stuurlieden, en te leren van eerdere ervaringen. Sensorische systemen functioneren van verschillende stimuli, zoals visuele, chemische en mechanosensorische ontvangen en deze signalen naar het centrale zenuwstelsel worden uitgelegd en gedecodeerd. De hersenen stuurt vervolgens de juiste motor gedrag op basis van de waargenomen omgeving, zoals op zoek naar voedsel of ontsnappen uit een roofdier. Begrijpen hoe sensorische systemen detecteren de buitenwereld, en hoe de hersenen decodeert en stuurt beslissingen, is een grote uitdaging in de neurobiologie. Drosophila melanogaster is een krachtig modelsysteem voor het onderzoeken hoe neurale circuits gids gedrag. Behalve dat eenvoudig en goedkoop te handhaven, Drosophila vertonen veel verschillende, complexe stereotype gedrag, maar doen dit met een compact zenuwstelsel van ongeveer 100.000 neuronen. Krachtige genetische technieken bestaan ​​voor het manipuleren van het Drosophila genoom en duizenden transgene lijnen werden gegenereerd die selectief en reproduceerbaar dezelfde subsets van neuronen 10-13 labelen. Deze transgene lijnen kunnen worden gebruikt om selectief de activiteit van de gelabelde neuronen (activeren of remmen) te manipuleren en deze manipulaties kunnen worden gebruikt om te onderzoeken hoe de neurale helpfuncties gedrag. Meerdere gedrags assays ontwikkeld voor het bestuderen van verschillende Drosophila gedrag. Drosophila, zoals veel dieren gebruiken hun reukzin voor het geleiden vele gedragskeuzes, zoals het vinden van voedsel, partners vinden, en het vermijden van gevaar. Reukzin is daarom een ​​goede sensorische systeem voor het onderzoeken welke externe stimuli worden gedetecteerd en geïnterpreteerd door het zenuwstelsel van een dier om de juiste keuzes te leiden. Aldus worden een aantal testen ontwikkeld voor ONDERZOEKTing larven en volwassen olfactorische gedrag. Traditioneel, olfactorische gedrag in Drosophila werden bepaald door twee keuze T-doolhof paradigma, dat kan worden gebruikt voor het bepalen aangeboren en aangeleerd gedrag olfactorische 3. In deze assay worden ongeveer 50 vliegen de keuze tussen twee buizen: één buis bevat de betrokken geur en de andere bevat een sturing geurstof (meestal de geur oplosmiddel). De vliegen krijgen een bepaalde tijd om een ​​keuze te maken, en dan is het aantal vliegen die in de verschillende kamers worden geteld. Hoewel de T-doolhof is een eenvoudige test voor veel experimenten, zijn er verschillende beperkingen. Zo worden olfactorische gedrag gemeten op één tijdstip, en andere keuzes vóór dit tijdstip worden verwijderd. Ook de individuele gedrag van de vliegen in de populatie worden verwaarloosd. Bovendien, de T-doolhof vereist handmatige telling van vliegen, die fouten kunnen voeren. Tot slot, aangezien er slechts twee keuzen gemeten, ditvermindert de statistische power vaak nodig om subtiele gedragsveranderingen te detecteren. Een alternatief voor een twee-choice T-doolhof is een vier-kwadrant (vier-veld) olfactometer 14-18. In deze test, dieren verkennen een arena waarin elk van de vier hoeken van de arena is gevuld met een potentiële bron van geodoriseerde lucht. De arena heeft een gebobbeld stervorm om de vorming van vier experimenteel gedefinieerde geur kwadranten te maximaliseren. Indien een geur wordt geleverd in een van de hoeken dan enkel is opgenomen, dat één kwadrant. Het gedrag van de dieren kan worden gevolgd als ze binnenkomen en verlaten van de geur kwadrant, en gemakkelijk in vergelijking met hun gedrag in de drie controle kwadranten. De vier-kwadrant olfactometer assay dus dossiers ruimtelijke en temporele behavioral reactie op de geur stimuli over een groot experimenteel arena. De vier kwadranten olfactometer werd ontwikkeld door Pettersson et al. 15 en Vet et al. 17 aan de ol onderzoekenfabriek gedragsreacties van individuele parasitaire wespen. Faucher et al. 18 en Semmelhack en Wang 16 aangepast aan de setup van de olfactorische reacties van individuele Drosophila bewaken. De vier-kwadrant olfactometer is even gevoelig voor aantrekkende en afstotende reacties, waardoor een groot aantal testen geurstoffen en condities. -Maat geschreven fly tracking software, ontwikkeld door Alex Katsov 19 en momenteel onderhouden door Julian Brown (beschreven in Materials), introduceerde extra voordelen aan meer recente implementaties van de vier-kwadrant olfactometer 14,20-23. Het is nu mogelijk om te testen op 100 vliegen tegelijkertijd aan hoge spatiale (27,5 pixels / cm) en temporele (30 frames per seconde) resolutie, die toelaat extraheren verschillende parameters, zoals positie, snelheid en versnelling van vliegen op elk tijdstip. Dit maakt onderzoek naar de dynamiek van gedragsreacties de vliegen om geuren 20 </sup&gt;. Opgemerkt zij echter dat de identiteit van afzonderlijke vliegen binnen de bevolking gedurende de gehele periode volgen niet wordt gehandhaafd. In plaats daarvan wordt elk fly spoor opgenomen zolang als twee sporen vliegen niet snijden. Op welk moment worden nieuwe nummers toegewezen nadat de vliegen uiteen. Door het opnemen van andere video vastleggen software (gespecificeerd in tabel Materials), dezelfde configuratie maakt flexibel volgen periodes kunnen worden gebruikt om vliegen spoor tot 24 uur door middel van beelden met een lagere framesnelheid. Deze optie werd gebruikt voor het leggen van eieren gedrag van vliegen te bestuderen en hun lichaamshoudingen vergelijken met ovipositional voorkeuren 14. De vier-veld olfactometer kan ook worden gebruikt om reacties te bestuderen multimodale (bijvoorbeeld geur en visuele) stimuli, of optogenetic 9 of 21 thermogenetische stimulatie combineren met presentaties van sensorische stimuli. Bovendien is de hoge temporele resolutie kan extractie van trajecten for elke individuele fly in het ensemble dataset. Daarom is de methode maakt het mogelijk onderzoek naar olfactorische-begeleide bevolking gedrag en ook de individuele sociale interacties. De opbrengst van deze analysegegevens zijn robuust en zeer reproduceerbaar, waardoor het gebruik van de vier-veld olfactometer gedrags- schermen. We beschrijven hier de setup assemblage voor een vier-kwadrant olfactometer. We verder het gebruik ervan bij het bepalen olfactorische aantrekkingskracht als reactie op appelazijn en afstoting in reactie op sterk geconcentreerde ethylpropionaat tonen. Tenslotte beschrijven we en geven typisch code voor de analyse van de geregistreerde vlieg trackinggegevens.

<table><tbody><tr><td>Luchtverdelingssysteem&nbsp;</td><td></td><td></td><td>(Hoeveelheid nodig)</td></tr><tr><td>Slangen en connectoren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermoplastische NPT(F) Manifolds</td><td>Cole-Parmer, IL, USA</td><td>R-31522-31</td><td>1</td></tr><tr><td>Zeskantige reducerende&nbsp; nippel (1/4MNPT->1/8MNPT)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5232T314</td><td>1</td></tr><tr><td>Slang (ID:1/8)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5108K43</td><td>50 Ft</td></tr><tr><td>Slang (ID:1/16)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>52355K41</td><td>100 Ft</td></tr><tr><td>Geribbelde buisfittingen</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5117K71</td><td>1 pack</td></tr><tr><td>Push-to-connect buisfittingen</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5779K102</td><td>4</td></tr><tr><td>Geribbelde Buisfittingen (1/4MNPT->1/8BF)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5463K439</td><td>1 pack (10)</td></tr><tr><td>Geribbelde Buisfittingen (1/8MNPT->1/8BF)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5463K438</td><td>2 pack (10)&nbsp;</td></tr><tr><td>Geribbelde Buisfittingen (1/8MNPT->1/16BF)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5463K4</td><td>2 pack (10)&nbsp;</td></tr><tr><td>Geribbelde Buisfittingen (1/4MNPT->1/4BF)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>&nbsp; 5670K84</td><td>1</td></tr><tr><td>Zeskantige stop</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>48335K152</td><td>1</td></tr><tr><td>Luchtdrukregelaar, luchtfilter en stroommeters</td><td></td><td></td><td>(Hoeveelheid nodig)</td></tr><tr><td>Labatorium gasdroger unit</td><td>W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA</td><td>Model: L68-NP-303; stock #26840</td><td>1</td></tr><tr><td>Multitube frames voor 150 mm stroombuizen</td><td>Cole-Parmer, IL, USA</td><td>R03215-30</td><td>1</td></tr><tr><td>Multitube frames voor 150 mm stroombuizen</td><td>Cole-Parmer, IL, USA</td><td>R03215-76</td><td>1</td></tr><tr><td>150 mm stroombuizen</td><td>Cole-Parmer, IL, USA</td><td>R-03217-15</td><td>9</td></tr><tr><td>Ventilcartridge</td><td>Cole-Parmer, IL, USA</td><td>R-03218-72</td><td>9</td></tr><tr><td>Precisie luchtregelaar</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>6162K13</td><td>1</td></tr><tr><td>Solenoïde kleppen</td><td>Automate Scientific, Berkeley, CA</td><td>02-10i</td><td>4</td></tr><tr><td>Solenoïde kleppen controller</td><td>ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA</td><td>01-18</td><td>1</td></tr><tr><td>Elektronische stroommeter</td><td>Honeywell</td><td>AWM3100V</td><td>1</td></tr><tr><td>DAQ (NI USB-6009, National Instruments) en een&nbsp;</td><td>National Instruments</td><td>NI USB-6009</td><td>1</td></tr><tr><td>Voeding</td><td>Extech Instruments</td><td>382200</td><td>1</td></tr><tr><td>Geurkamers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polypropyleen breed mond fles 2 oz; 60 ml</td><td>Nalgene</td><td>562118-0002</td><td>Ten minste 5 vereist per experiment, maar een aparte kamer is vereist voor elke verdunning van elke geur. Beschikbaar bij Container Store, onderdeelnummer #635114)</td></tr><tr><td>Glazen geurkamer, 0.25 oz</td><td>Sunburst Bottle</td><td>LB4B</td><td>Ten minste 5 vereist per experiment&nbsp;</td></tr><tr><td>"In" klep voor geurkamer</td><td>Smart Products, Inc., CA, USA</td><td>214224PB-0011S000-4074</td><td>1 van deze onderdelen wordt gebruikt per geurkamer maar ze moeten vaak worden vervangen</td></tr><tr><td>"Uit" klep voor geurkamer</td><td>Smart Products, Inc., CA, USA</td><td>224214PB-0011S000-4074</td><td>1 van deze onderdelen wordt gebruikt per geurkamer maar ze moeten vaak worden vervangen</td></tr><tr><td>O-ring</td><td>RT Dygert International, MN, USA</td><td>AS568-029 Buna-N O-R</td><td>1 pack (100)</td></tr><tr><td>Vlieg arena, camera en gedragsboxen</td><td></td><td></td><td>(Hoeveelheid nodig)</td></tr><tr><td>Gedrag en camera box materiaal</td><td>Interstate plastics, CA, USA</td><td>ABS zwart geëxtrudeerd (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)</td><td>1803 sq inch</td></tr><tr><td>Teflon voor vlieg arena en geurkamerinzetstukken, 3/8" dik, 12" x 12"</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>8545K27&nbsp;</td><td>1</td></tr><tr><td>Glazen platen, 1/8" dik, 9" x 9"</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>8476K191&nbsp;</td><td>2</td></tr><tr><td>Dubbele actie thermo-elektrische controller</td><td>WAtronix Inc, CA, USA</td><td>DA12V-K-0</td><td>1</td></tr><tr><td>IR LED array</td><td>Advanced Illumination, Rochester, VT, USA</td><td>AL4554-88024, PS24-TL</td><td>2 LED arrays en een voeding</td></tr><tr><td>Air conditioner Unit</td><td>Melcor Store</td><td>&nbsp;MAA280T-12</td><td>1</td></tr><tr><td>Beeldvormingssysteem</td><td></td><td></td><td>(Hoeveelheid nodig)</td></tr><tr><td>Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA</td><td>PEC21211 KP</td><td>1</td></tr><tr><td>CCXC-12P05N Interconnect kabel</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA</td><td>SOCCXC12P05N</td><td>1</td></tr><tr><td>DC-700 Camera Adapter</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA</td><td>SODC700</td><td>1</td></tr><tr><td>B+W 40,5 093 IR filter</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA</td><td>65-072442</td><td>1</td></tr><tr><td>TiFFEN 40.5 mm Circulaire polarisator</td><td>Amazon</td><td></td><td>1</td></tr><tr><td>IR Videocamera</td><td>Industrial Vision Source, FL, USA</td><td>Sony XC-EI50 (SY-XC-E150

olfactorische gedrag getest door computer tracking of<em&gt; drosophila</em&gt; in een vier-kwadrant olfactometer

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

Een belangrijke uitdaging in de neurobiologie is te begrijpen hoe neurale circuits functioneren passende dier gedrag leiden. Drosophila melanogaster is een uitstekend modelsysteem voor deze onderzoeken als gevolg van de complexe gedragingen, krachtige genetische technieken, en compact zenuwstelsel. Laboratorium behavioral assays zijn lang gebruikt met Drosophila om de eigenschappen van de natuurlijke omgeving te simuleren en bestuderen van de neurale mechanismen die ten grondslag liggen aan de bijbehorende gedrag (bijv phototaxis, chemotaxis, zintuiglijke leren en geheugen) 1-3. Met de recente beschikbaarheid van grote collecties van transgene Drosophila lijnen die specifieke neurale subsets label, hebben gedragsproblemen assays genomen op een prominente rol voor neuronen te koppelen aan gedrag 4-11. Veelzijdig en reproduceerbare paradigma, tezamen met de onderliggende computationele routines voor gegevensanalyse, onontbeerlijk voor snelle tests kandidaat vlieglijnen diverse genotypes. Bijzonder geschikt zijn opstellingen die flexibel in het aantal geteste dieren, duur van experimenten en de aard van de aangeboden stimuli. De test van keuze ook genereren reproduceerbare data die gemakkelijk te verkrijgen en te analyseren. Hier presenteren wij een gedetailleerde beschrijving van een systeem en protocol voor het testen gedragsreacties van Drosophila vliegt in een grote vier-veld arena. De opstelling wordt hier gebruikt om responsen van vliegen naar een olfactorische stimulus testen; echter, de zelfde opstelling worden gewijzigd om meervoudige geur, visuele of optogenetic stimuli of een combinatie van deze testen. De olfactometer setup registreert de activiteit van vliegen bevolking te reageren op geuren, en computationele analysemethoden worden toegepast op fly gedrag te kwantificeren. De verzamelde gegevens worden geanalyseerd om een ​​snelle uitlezing van een experimenteel run, die essentieel is voor een efficiënte verzamelen van gegevens en het optimaliseren van de experimentele omstandigheden te krijgen.

De vier-kwadrant olfactometer assay registreert en analyseert de lopende activiteiten van veel vliegen over een groot behavioral ruimte. Geurstoffen kunnen worden ingebracht in de lucht-stromen die één, twee, drie of alle vier kwadranten voeren. Aangezien geuren, zal de vliegen vrij bewegen tussen de vier kwadranten. Dit gedrag is van cruciaal belang om te observeren omdat het aangeeft dat de VN-opzettelijke vertekeningen zijn niet opgenomen in de test. Deze vooroordelen kunnen omvatten ...

We beschrijven hier een gedragsopstelling en methode voor gegevensanalyse voor het meten van reukresponsen van maximaal 100 azijnvliegen (Drosophila melanogaster). Dit systeem kan worden gebruikt met enkele of meerdere reukstimuli en is aanpasbaar voor optogenetische activering of het tot zwijgen brengen van neuronale subsetten.

Olfactorische gedrag getest door Computer Tracking Of<em&gt; Drosophila</em&gt; In een vier-kwadrant olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

Het algemene doel van deze opstelling is het analyseren van het reukgedrag van vliegen in een vierkwadranten-olfactometer met behulp van een bijgevoegd geautomatiseerd script voor het volgen van vliegen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over hoe olfactorische neurale systemen de buitenwereld detecteren en hoe de hersenen gedragsmatige beslissingen decoderen en sturen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze veelzijdig en robuust is, en herhaalde tests van reukreacties door een populatie vliegen in een grote experimentele arena mogelijk maakt.Bereid voor dit protocol vijf geurkamers voor die bestaan uit een plastic buitencontainer, een glazen binnencontainer en een op maat gemaakt PTFE-dekselinzetstuk. Het inzetstuk is een origineel containerdeksel waarvan het centrale deel is verwijderd en waaraan twee eenrichtingskleppen zijn bevestigd. Gebruik vier van de geurkamers voor oplosmiddelcontroles en één kamer voor een testgeur.Zorg ervoor dat elke kamer schoon is en vul vervolgens een geurstoffencontainer met één milliliter oplosmiddel of geurstofverdunning. Controleer daarna de positie van de container in de plastic kamer en verzeker u ervan dat er geen vloeistof is gemorst. Sluit het deksel stevig af met de schroefdop en een O-ring op de PTFE-inzet om lekkages te voorkomen.Kweek de vliegen op standaard maïsmeelmedium. Plaats 30 mannetjes en 30 vrouwtjes in een standaard fles en laat ze vijf dagen lang eitjes leggen bij kamertemperatuur. Verzamel uit deze flessen pas uitgekomen vliegen.Verzamel voor elke experimentele cohort 25 mannelijke en 25 vrouwelijke vliegen onder korte koolstofdioxide-anesthesie en laat de cohort twee tot vier dagen oud worden op standaardvliegmedium. Verplaats de cohort 40 tot 42 uur voor het experiment naar een buisje met ongeveer 10 milliliter één procent agarosegel voor de vochtigheid, zonder voedsel. Uithongering helpt om de totale beweging te verhogen, en meer dan 90% van de vliegen moet het uithongeringsproces overleven.Indien meer dan 10% sterft, wat kan gebeuren bij een zwak genotype, probeer dan alle vliegen in het experiment één dag te laten vasten. Schakel ten minste vijf minuten van tevoren de temperatuurregelaar in en stel deze in op 25 °C. Verbind vervolgens de geurelementen via een plastic buisje met de arena.Controleer de luchtstroom in elk kwadrant van de arena met een elektronische debietmeter. Zorg ervoor dat zowel de controlestroom als de geurstroom lopen met 100 milliliters per minuut. Vliegen zijn zeer gevoelig voor luchtstroom, en het is essentieel dat de luchtstroom voor elk kwadrant voor elk experiment wordt geverifieerd.Reinig nu de arena en de glazen platen met 70% ethanol. Veeg alle onderdelen twee tot drie keer af en laat ze volledig aan de lucht drogen voordat u verdergaat. Klem vervolgens de glazen platen aan de arena vast.Breng vervolgens de vliegen zonder anesthesie over naar de arena. Laat ze met behulp van de zwaartekracht via het gat in een van de glasplaten naar binnen gaan en dek het gat vervolgens af met een rond gaas. Plaats de arena met de vliegen nu in de lichtdichte kamer.Sluit vervolgens de vier controleluchtstromen aan op elke hoek van de arena. Sluit de deur van de kamer en laat de vliegen 10 tot 15 minuten acclimatiseren aan de nieuwe omgeving. Voer na de acclimatisatieperiode een controle-experiment van vijf tot 10 minuten uit, waarbij de vliegen worden blootgesteld aan vier controleluchtstromen.Het is nu essentieel om de gegevens onmiddellijk te analyseren. Als de vliegen niet gelijkmatig over de arena zijn verdeeld, moet de arena opnieuw worden ingesteld. Het is cruciaal om het gedrag van controle-vliegen bij enkel schone lucht te testen.Hiermee kan snel worden vastgesteld of alle achtergrondonderstandigheden normaal zijn. Lichtlekkage, temperatuurschommelingen, een scheve arena of geurverontreiniging kunnen allemaal problemen veroorzaken. Gooi indien nodig de vliegen weg en maak de arena opnieuw schoon.Indien er een vermoeden is van contaminatie door geurstoffen, moet alle slangBewuizing worden vervangen. Herhaal de controle-test met nieuwe cohorten totdat de dieren geen voorkeur meer tonen voor een van de vier kwadranten. Sluit vervolgens de kamer met de testgeurstof aan op de opstelling via een driewegkraan, of sluit de slangen opnieuw aan en voer een testexperiment uit gedurende 5 tot 10 minuten.Stop en start het trackingprogramma bij langere experimentele opnames elke 20 minuten snel opnieuw, anders worden de databestanden te groot. Verwijder tussen de tests de vliegen, maak de arena en glasplaten schoon met 70% ethanol en vervang de verbindingsbuisjes. Houd de droge luchtstroom in stand om het systeem continu door te spoelen.Voor een optimale efficiëntie is het raadzaam om twee arena's te hebben, zodat er tijdens de runs schoongemaakt kan worden. Indien meerdere experimenten op dezelfde dag mislukken, dient men uiterst zorgvuldig te zijn om te garanderen dat er geen geur van een vorige run in het systeem achterblijft. Dit is normaal gesproken geen probleem bij lage concentraties geurstof of bij CO2, maar bij sterk geconcentreerde stimuli kan een tussenpoos van maximaal 24 uur tussen de experimentele runs noodzakelijk zijn.Gebruik voor de data-analyse de meegeleverde op maat gemaakte Matlab-routine om de gegevens naar een Matlab-formaat te converteren. Laad het ruwe databestand dat in realtime door de trackingsoftware is gegenereerd en maak een ruimtelijk masker dat de contouren van de arena volgt. Pas het masker toe op de ruwe gegevens om alle datapunten te verwijderen die buiten de arena vallen, aangezien deze ruis vertegenwoordigen.Verwijder vervolgens alle datapunten die langer dan drie seconden met een snelheid van minder dan 0,163 centimeters per second bewegen. Deze gegevens zijn waarschijnlijk ruis of vliegen die niet bewegen. Visualiseer nu de resterende datapunten door ze allemaal uit te zetten over de registratieperioden.De gegevens kunnen ook worden bekeken als individuele trajecten. Geurgrenzen kunnen snel worden geschat op basis van de gedragsgegevens van de vliegen. Bereken vervolgens de attractie-index en voer statistische tests uit zoals beschreven in het tekstprotocol.Er werden 25 mannelijke en 25 vrouwelijke vliegen getest in het gedragsapparaat. Als reactie op droge lucht verkenden de vliegen de gehele arena zonder voorkeur voor een bepaald kwadrant. De lijn geeft de gevolgde traject van één vlieg weer.Wanneer appelciderazijn in de luchtstroom van het kwadrant linksboven werd geïntroduceerd, werden de meeste vliegen aangetrokken door dat geurkwadrant. Wanneer een afstotende geurstof, 10% ethylpropionaat, in het kwadrant linksboven werd geïntroduceerd, werd dat kwadrant vermeden. De attractie-index van dat kwadrant bedroeg 0,68.Een attractie-index is de meest gebruikte index bij het meten van de olfactorische respons. Een waarde boven of onder nul duidt op attractie of repulsie. Het script compenseerde voor kleine variaties in de positie van de arena tussen de proeven.Datapunten die mogelijk ruis waren of van niet-bewegende vliegen, zijn verwijderd. Hoewel de test gedurende elke gewenste periode kan worden uitgevoerd, is het interessant om veranderingen in de bewegingen van de cohort over intervallen van 10 seconden te bekijken om geurhabituatie en andere fenomenen te kunnen waarderen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u olfactorisch gedrag effectief kunt uitvoeren en analyseren in een four-field assay.Zodra de methode beheerst is, kan elk olfactorisch experiment in ongeveer een uur worden voltooid, en we voeren routinematig vier tot zes experimenten per dag uit.

olfactory-behaviors-assayed-computer-tracking-drosophila-four

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In deze video artikel beschrijven we een nieuwe methode waardoor de bouw van odorant hellingen met een stabiele en controleerbaar geometrieën. We in het kort laten zien hoe deze gradiënten gebruikt kunnen worden om te screenen op olfactorische defecten (volledige en gedeeltelijke anosmie) en meer subtiele kenmerken van chemotaxis gedrag te bestuderen.

Hoge-resolutie Meting van Geur-Driven gedrag in Drosophila Larven

Hier beschrijven we hoe u de verworven videobeeld te optimaliseren voor een geur magnetische-tether (OMT) toestellen. We beschrijven ook twee monsters experimentele protocollen voor het bestuderen van visueel-olfactorische fusie.

Visueel Mediated Geur Tracking tijdens de vlucht in Drosophila

Fruitvliegen hebben een complex reuksysteem, kunnen honderden geurstoffen onderscheiden en hun reukvermogen gebruiken om gedragsbeslissingen te sturen. Deze video beschrijft de vierweg olfactometertest, een methode om reukgedragsreacties bij vliegen te bestuderen. De uitgelichte protocolclip laat zien hoe om te gaan met testvliegen en wat kritieke stappen zijn tijdens het uitvoeren van de test.

Vierweg Olfactometer-test: een methode om odorant-cued-reacties in Drosophila te beoordelen

Deze video beschrijft een methode om reukgedrag in de fruitvlieg te testen, het Y-doolhof. De aanbevolen protocolclip laat zien hoe u de test instelt en uitvoert.

Drosophila Y-doolhoftest: een methode om reukreacties bij vliegen te beoordelen

In deze video artikel beschrijven we een geautomatiseerde test om het effect van honger of verzadiging op olfactorische afhankelijke voedsel zoekgedrag meten de volwassen fruitvlieg Drosophila melanogaster.

A Single-fly test voor foerageergedrag in Drosophila

Wij stellen een keuze test om de invloed van geurstoffen op Drosophila gedrag via een Y-doolhof test onthullen.

Testen<em&gt; Drosophila</em&gt; Reukzin met een Y-doolhof Assay

De automatische tracking systeem Flywalk wordt gebruikt voor hoge-resolutie kwantificering van geur-begeleide gedrag in Drosophila melanogaster.

Hoge-resolutie Kwantificering van Geur-begeleide Gedrag in<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Met behulp van de<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

Dit protocol analyseert navigatie gedrag van Drosophila larve in reactie op de stimulatie van de gelijktijdige optogenetic van haar olfactorische neuronen. Licht van 630 nm golflengte wordt gebruikt voor het activeren van individuele olfactorische neuronen uitdrukken van een rood-verschoven kanaal rodopsine. Larvale verkeer gelijktijdig wordt bijgehouden, digitaal opgenomen en geanalyseerd met behulp van aangepaste-geschreven software.

Bijhouden van Drosophila larvale gedrag in reactie op de stimulatie van de Optogenetic van olfactorische neuronen

Autisme Spectrum Stoornis (ASS) wordt geassocieerd met verminderd sociaal en communicatief gedrag en het ontstaan van repetitief gedrag. Voor het bestuderen van de onderlinge relatie tussen ASS-genen en gedragsstoornissen in het Drosophila-model , worden in dit artikel vijf gedragsparadigma's beschreven voor het bepalen van sociale afstand, agressie, verkering, verzorging en gewenningsgedrag.

Paradigma's voor gedragsbeoordeling in het Drosophila-model van autismespectrumstoornis

Procedures voor het opnemen van high-density EEG en de blik gegevens tijdens computer game-based cognitieve taken zijn omschreven. Met behulp van een video-spel om cognitieve taken presenteren verbetert de ecologische validiteit zonder in te boeten experimentele controle.

De combinatie van Computer Game-Based Behavioural experimenten met High-Density EEG en infrarood Gaze Tracking

Leer olfactometrie met een vier-kwadrant opstelling voor het testen van olfactorisch gedrag bij Drosophila melanogaster. Deze methode maakt geautomatiseerde tracking en herhaalde experimenten met grote populaties vliegen mogelijk.

Olfactorische gedrag getest door Computer Tracking Of

Meer video's verkennen