Name: SNARE-gemedieerde Fusie van Single proteoliposomen met Tethered Ondersteund dubbellagen in een microfluïdische Flow Cell gecontroleerd door gepolariseerde TIRF Microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Leer SNARE-gemedieerde fusie van enkele proteoliposomen met behulp van gepolariseerde TIRF-microscopie. Deze methode maakt detectie van individuele fusiegebeurtenissen met hoge tijdsresolutie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Vladimir Polejaev (Yale West Campus Imaging Core) voor het ontwerp en de bouw van de gepolariseerde TIRF-microscoop, David Baddeley (Yale University) voor hulp bij instrumentatie voor tweekleurige detectie, en James E. Rothman (Yale University) en Ben O'Shaughnessy (Columbia University) en leden van hun groepen voor stimulerende discussies. EK wordt ondersteund door een Kavli Neuroscience Scholar Award van de Kavli Foundation en NIH-subsidie 1R01GM108954.

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Succesvolle implementatie van de SUV-SBL fusie test hier beschreven is afhankelijk kritisch over een aantal belangrijke stappen, zoals functionele reconstructie van eiwitten in liposomen, het verkrijgen van goede kwaliteit SBLs, en het kiezen van de juiste beeldvorming parameters om enkele moleculen te detecteren. Hoewel het wat tijd en moeite kunnen nemen om te slagen, wanneer de test succesvol is geïmplementeerd, biedt het een schat aan informatie over het fusieproces niet beschikbaar zijn van een andere in vitro<...

Membraan fusie is een universeel biologisch proces nodig is voor intracellulaire handel in vetten en eiwitten, secretie, de bevruchting, de ontwikkeling en omhuld virus binnenkomst in gastheerorganismen 1-3. Voor de meeste intracellulaire fusiereacties waaronder afgifte van hormonen en neurotransmitters via exocytose wordt de energie twee lipide bilagen smelten door vorming van een vier-helix bundel tussen cognate oplosbare N-ethylmaleimide-gevoelige factor attachment eiwitreceptor (SNARE) eiwitten, verankerd in het blaasje (v-SNARE) en het doelmembraan (t-SNARE) 4 resp. Synaptische vesikel exocytose is de meest strak gereguleerd fusiereactie en voordat één milliseconde na aankomst van een actiepotentiaal 1,4,5. De fusie porie, de initiële verbinding tussen de twee compartimenten fuseren, kunnen flikkeren open en meerdere malen gesloten voordat het opnieuw afsluiten of het uitbreiden van onomkeerbaar 5-7. De voormalige resultatenin voorbijgaande, &quot;kiss &amp; run&quot; fusion, terwijl de laatste leidt tot volledige fusie. Factoren die het evenwicht tussen deze twee modi van fusie en mechanismen reguleren poriën flikkeren zijn niet goed begrepen 5,8. SNARE eiwitten zijn nodig voor exocytose; synaptische blaasje fusie wordt na splitsing van SNAREs afgeschaft door neurotoxins 9. Bulk fusie-experimenten met kleine unilamellaire vesikels (SUV&#39;s) aangetoond dat SNAREs niet alleen vereist, maar ook voldoende membraanfusie 10 rijden. In deze massa assay SUV gereconstitueerd met v-SNAREs (v-SUV) werden gedoteerd met fluorescente fosfolipiden (N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) -phosphoethanolamine (NBD-PE) en ( N -. (lissamine rhodamine B sulfonyl) -phosphoethanolamine (LR-PE) en gemengd met ongelabeld blaasjes met t-SNAREs (t-SUV) Aanvankelijk was de fluorescentie van NBD-PE in v-SUV is geblust door Förster resonance energy transfer (FRET ) naar LR-PE. Zoals labeLED v-SUV fuseren met ongelabelde t-SUV, is de fluorofoor oppervlaktedichtheid in het nu gecombineerde membraan verminderd en de resulterende toename van NBD-PE fluorescentie meldt de mate van lipide mengen 10. Aangezien het grootste deel test is eenvoudig in te stellen en te analyseren, is het op grote schaal gebruikt om de mechanismen van SNARE gemedieerde fusie 10-14 bestuderen. Het heeft echter verscheidene beperkingen, zoals lage gevoeligheid en slechte tijdsresolutie. Belangrijker, als ensemble metingen is gemiddelde resultaten voor alle gebeurtenissen maken onderscheid tussen docking en fusion, alsmede opsporing van hemifusion tussenproducten moeilijk. De afgelopen tien jaar verschillende groepen, waaronder de onze, zijn er nieuwe tests ontwikkeld om fusie gebeurtenissen bij de enkele blaasje level 15-27 volgen. Ha en collega&#39;s gebruikt v-SUV vastgebonden op een oppervlak en bewaakt hun fusie met gratis t-SUV 18,19. Lipide mengen werd gevolgd met behulp van FRET tussen twee lipide gebonden fluoroforen embedden in de v- en t-SUV&#39;s, respectievelijk, met behulp van totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie 18. Later, Brunger het laboratorium gebruikt een enkele lipide-label soorten samen met een inhoud marker voor gelijktijdige detectie van lipiden en inhoud te mengen 20,28. Zowel de lipide en de inhoud merkers werden opgenomen in hoge zelfdovende concentraties; fusie met ongelabelde SUV resulteerde in fluorescentie dequenching 20,28. Anderen hebben v-SUV gefuseerd met vlakke dubbellagen opgelost in t-SNAREs 15-17,21-27,29. De vlakke geometrie van het doel (t-SNARE bevattende) dubbellaag beter bootst de fysiologische fusieproces van kleine, zeer gebogen blaasjes met een platte plasmamembraan. De Steinem groep toegepast poriën spanning membranen opgelost in t-SNAREs, opgehangen boven een poreus siliciumnitride substraat en gedetecteerd fusion individuele v-SUV met behulp van confocale laser scanning microscopie 23. anderen fgebruikte v-SUV&#39;s naar vlakke dubbellagen opgelost in t-SNAREs, ondersteund op een glazen substraat 15-17,21,22,24-27,29. Het grote voordeel van het gebruik van ondersteunde bilagen (SBLs) dat TIRF microscopie kan worden gebruikt voor docking en fusiegebeurtenissen met uitstekende signaal-ruisverhouding en zonder interferentie van vrije v-SUV detecteren, hoewel behulp microfluïdische ook resolutie eenmalige gebeurtenis gebruikt standaard ver-field epifluorescentie microscopie 24. Een belangrijk punt van zorg is de vraag of en hoe substraat-bilaag interacties invloed op ondersteunde bilaag kwaliteit en het fusieproces. Vroeg werk gebruik gemaakt van vlakke SBLs die direct werden ondersteund op een glazen of kwarts substraat 15-17. Deze SBLs werden door adsorptie, barsten, verspreiding en fusie van t-SUV membranen op het substraat. Het werd al snel besefte echter dat het weglaten van een belangrijke t-SNARE component, SNAP25, van SBLs op deze manier bereid resulteerde in v-SUV docking en fusion kinetiek indistinguishable van die verkregen met een totale t-SNAREs 17. Omdat SNAP25 absoluut voor fusie is nodig in vivo 30,31, werd de fysiologische relevantie van deze vroege pogingen in twijfel te trekken. Tamm de groep overwon deze uitdaging door het gebruik van beter gecontroleerd ondersteunde bilaag vorming 21. Vroeger Langmuir-Blodgett depositie voor het eiwit-vrij eerste folder van de SBL, gevolgd door de fusie van die monolaag met t-SUV&#39;s 21. Dit resulteerde in SNAP25-afhankelijke fusie. Om potentiële artefacten geassocieerd met een dubbellaag direct afgezet op een glassubstraat zonder nader Langmuir-Blodgett methoden voorkomen Karatekin et al. Werd een zachte, gehydrateerde poly (ethyleenglycol) (PEG) kussen tussen de bilaag en het substraat 24. Deze modificatie resulteerde ook in SNAP25-afhankelijke fusie 24. Dubbellagen kussens op een zachte polymeerlaag was gekend om transmembraan beter behoudenmobiliteit en de functie 32-eiwit, en was gebruikt in fusion studies met virussen 33. Bovendien gePEGyleerd dubbellagen lijken wat vermogen om zichzelf te genezen behouden en zijn zeer robuust 34,35. Eerst wordt een fractie van commercieel verkrijgbare, lipide-gebonden PEG-ketens zijn opgenomen in de t-SUV membraan. Wanneer deze t-SUV burst en vormen een vlakke dubbellaag op een glazen substraat, een PEG borstel omvat zowel bladen van de vlakke bilaag. Omdat vorming vlakke dubbellaag wordt aangedreven door adhesie van het PEG-ketens rond t-SUV op het hydrofiele glasoppervlak, liposoom barsten en vlakke bilaag vorming betrekkelijk ongevoelig voor de lipidesamenstelling gebruikt. Wanneer echter grote hoeveelheden cholesterol zijn opgenomen, waardoor de cohesieve eigenschappen van de SUV, de SUV kan niet spontaan barsten. Als dit het geval is, kan osmotische shock of tweewaardige ionen worden toegepast om vlakke bilaag vorming 25 helpen. Zoals hierboven vermeld, in dit apdering een PEG borstel omvat beide zijden van de vlakke, ondersteund dubbellaag. De borstel tegenover de microfluïdische stromingskanaal helpt om niet-specifieke hechting van inkomende v-SUV die ook meestal bedekt met een PEG-laag voorkomen. Vorming van V- en t-SNARE complexen begint vanaf de membraan-distale N-uiteinden en verloopt in etappes in de richting van het membraan-proximale domeinen 36. Voor de v-SUV om met de t-SBL, V- en t-SNARE N-termini nodig boven het PEG borstels, die lijkt op het geval onder de omstandigheden van de assay uitsteken. Borstelhoogte kan worden aangepast aan andere eiwitten dan SNAREs bestuderen door het variëren van de dichtheid van gepegyleerde lipiden en PEG ketenlengte 37,38. Een ander voordeel van de PEG borstels die de proximale oppervlakken van het fuseren van bilagen is dat zij bootsen de drukke omgeving van biologische membranen die zijn verpakt met 30.000-40.000 integrale membraaneiwitten per vierkante micron 39. Net als de PEG-ketens in deze test, de Repulsive eiwit laag die biologische membranen moeten opzij worden geduwd om te zorgen voor contact tussen de twee fosfolipiden dubbellagen voor fusie te komen. Microfluïdische stromingskanalen worden in deze test, omdat ze unieke voordelen bieden. Ten eerste microfluïdische stroom kunnen meer uniforme afzetting van t-SUV te verspreiden en de zekering t-SBL vormen. Ten tweede, de kleine kanaal volume (&lt;1 pl) minimaliseert monster consumptie. Ten derde, de kleine volumina vereist waarvan de hele experiment constant debiet te worden uitgevoerd. Stroom verwijdert zwak, vermoedelijk aspecifiek, gehecht v-SUV van SBL 16. Het heeft ook een constante dichtheid van v-SUV boven de t-SBL, het vereenvoudigen van kinetische analyse 17. Tenslotte worden gedokt blaasjes gemakkelijk te onderscheiden van vrije degenen door de stroming 25 uitgevoerd. Ten vierde, meerdere microkanalen kunnen worden gebruikt op dezelfde dekglaasje, elk probing een andere toestand. Dit maakt vergelijking van de voorwaarden During dezelfde experimentele run. Een soortgelijke aanpak is gebruikt door de van Oijen groep fusie tussen influenzavirus en kussens SBLs 33 bestuderen. Bij TIRF microscopie, de exponentiële verval van het verdwijnende veld (met vervalconstante ~ 100 nm) fluorescentie excitatie beperkt tot die moleculen die in de directe nabijheid van het glas-buffer interface. Dit minimaliseert bijdrage van fluorescente moleculen die verder weg zijn, verhoogt de signaal-ruisverhouding en maakt enkel molecuul gevoeligheid belichtingsraam tijden van 10-40 msec. Het verdwijnende veld leidt ook tot een toename van signaal-fusie: de overdracht gemerkte lipiden uit de SUV in de SBL, bevinden zij zich gemiddeld sterker bekrachtigingsveld. Deze toename in fluorescentie wordt sterker grotere liposomen. Als gepolariseerd licht wordt gebruikt om het verdwijnende veld genereren extra effecten bijdragen tot een verandering in fluorescentie bij transfer van etiketten van de SUV in de SBL. Sommige lipide kleurstoffen overgang dipool georiënteerd met een voorkeurs gemiddelde hoek ten opzichte van de dubbellaag waarin zij zijn ingebed. Hierdoor ontstaat een verschil in de hoeveelheid fluorescentie die door de fluoroforen wanneer zij in de SUV versus de SBL, aangezien het gepolariseerde bundel kleurstoffen anders prikkelen de twee membranen. In het eerste geval zal de excitatie balk interactie met overgang dipolen georiënteerde rond de sferische SUV, terwijl voor het laatste, zal dipool oriëntaties worden beperkt door de vlakke SBL geometrie. Wanneer bijvoorbeeld s-gepolariseerd invallend licht (gepolariseerd loodrecht op het vlak van inval) wordt gebruikt, excitatie efficiënter als de kleurstof in de SBL dan in SUV voor een lipide kleurstof transitiedipool evenwijdig aan het membraan 29,40 (zoals die van Dil of heb 41-43). Een SUV gedoteerd met zo&#39;n fluorofoor verschijnt dimmen wanneer het dokken op de SBL (figuur 7, Representat<html> ive resultaten). Als een fusie porie opent en verbindt de SUV en SBL membranen, fluorescerende probes diffunderen in de SBL en meer kans te worden enthousiast over de-s gepolariseerde verdwijnende veld 25,27,29. Bijgevolg het fluorescentiesignaal geïntegreerd rondom de fusieplaats sterk toeneemt tijdens de kleurstofoverdracht van de SUV in de SBL 27 (Figuur 3 en Figuur 7). Een bijkomende factor die bijdraagt ​​aan veranderingen die gepaard fusie wordt dequenching van fluorescente labels zoals ze worden verdund wanneer overgebracht in de SBL signaal. De bijdrage van dequenching gewoonlijk klein in vergelijking met verdwijnende veld verval en polarisatie-effecten in de hier beschreven test, omdat slechts een kleine fractie ( <img alt="vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq1.jpg" /> ) Van de lipiden zijn gelabeld. Het signaal stijging op fusie kan worden benut om fusie porie eigenschappen afleiden door de tijd te vergelijken,1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg &quot;/&gt;, die nodig is voor een lipide te ontsnappen via een porie die vrij doorlaatbaar voor lipiden aan de werkelijke release tijd, <img alt="vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq3.jpg" /> . Als de twee tijdschalen vergelijkbaar zou worden geconcludeerd dat de poriën weer weinig weerstand tegen lipide flow. Indien de werkelijke lostijd aanzienlijk langer is dan de tijd voor diffusie beperkte release, zou een proces aangeven, zoals poriën flikkeren, vertragen lipide release. De diffusie beperkte release tijd, <img alt="vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq2.jpg" /> , Afhankelijk van de grootte van de fuser en liposoom lipide-diffusie; haar ramingen vereist deze twee parameters te worden gekwantificeerd. De single molecule gevoeligheid van de test maakt het mogelijk lipide diffusie te meten door het bijhouden van meerdere afzonderlijke lipide fluoroforen na hun vrijlating in het SBL voor elke fusie event 26. De grootte van elke versmelten vesiclekan worden geschat 27 door het combineren van (i) de intensiteit van een enkele lipide kleurstof, (ii) de verandering in de totale fluorescentie rond docking site na alle fluoroforen op fusie worden overgebracht in de SBL, (iii) de bekende etikettering dichtheid van SUV lipiden, en (iv) de oppervlakte per lipide. Voor veel fusiegebeurtenissen werden de werkelijke lipide afgifte samengesteld worden veel langzamer dan verwacht door diffusie gecontroleerde afgifte 27 zijn, zoals eerder werd opgemerkt uitgaande uniforme SUV maat 44. Uitgaande vertraging van lipide afgifte wordt veroorzaakt door het trillen poriën, een kwantitatief model maakt schatting van &quot;porie openheid&quot;, de fractie van tijd de poriën blijft ook voor fusie-27. Wanneer praktisch is belangrijk om fusie mechanismen waarbij zowel lipide en oplosbare inhoud labels testen. Bijvoorbeeld zou lipide afgifte vertraagd worden door andere dan de porie trillen werkwijzen, zoals restrictie lipide diffusie door de SNARE eiwitten die surround thij porie. Als dit het geval zou zijn, dan los van de inhoud zou release van lipide labels voorafgaan, op voorwaarde dat de porie is groot genoeg om doorgang van oplosbare probes mogelijk te maken. Een fundamentele fout in de benadering kan in de veronderstelling dat de overdracht van gemerkte lipiden SBL vindt plaats via een smalle fusie porie verbinden de SBL een vesicle die grotendeels zijn pre-fusie-vorm heeft behouden. Lipid overdracht in de SBL kan ook het gevolg zijn van de snelle uitzetting van de fusie porie met een gelijktijdige, extreem snelle ineenstorting van de SUV in de SBL membraan, zoals eerder gesuggereerd op basis van lipide vrijlating data alleen 29. Monitoring zowel lipide en inhoud kort tegelijk bleek dat veel poriën afgedicht na het loslaten alle lipide labels, maar bleven sommige van hun oplosbare lading 27. Dit geeft aan dat ten minste enkele liposomen niet samen in de SBL na fusie en dat het lipide kleurstofoverdracht in de SBL gebeurt door een fusie porie. Bovendien, lIPID en inhoud vrijlating vond plaats gelijktijdig 27, waardoor het onwaarschijnlijk is dat de vertraging van lipide vrijlating was te wijten aan hinder van lipide diffusie door de SNARE eiwitten rond de porie 45. Een SUV-SBL fusie-protocol dat niet controleren oplosbaar inhoud vrijlating is eerder gepubliceerd door Karatekin en Rothman 25. Hier worden meer recente ontwikkelingen opgenomen, namelijk de gelijktijdige controle van lipiden en de inhoud vrij te geven en de schatting van SUV, lipide, en fusie porie eigenschappen 27. Het protocol begint met instructies voor het bereiden van de microfluïdische cellen, gemaakt door het binden van een poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) elastomeer blok met groeven met een glas dekglaasje 25. Vervolgens wordt de bereiding van v-SUV met zowel lipide en inhoud markers toegelicht. Afdelingen 4 en 5 geven instructies voor de montage van de microfluïdische cellen, de vorming van de SBLs in situ en het controleren op gebreken en vloeibaarheid, de invoering van vSUV&#39;s in de stroom cellen en detectie van fusiegebeurtenissen. Hoofdstuk 6 bevat instructies voor data-analyse.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Milli-Q (MQ) water</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>J.T. Baker</td><td>3040-05</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 190 Proof</td><td>Decon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A416P4</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cholride (KCl)</td><td>AmericanBio</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>AmericanBio</td><td>AB00490</td><td></td></tr><tr><td>N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>409911000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Buffers</td></tr><tr><td>HEPES-KOH buffer (pH 7.4)</td><td></td><td></td><td>25 mM HEPES-KOH, 140&nbsp;mM KCl, 100&nbsp;&mu;M EGTA, 1&nbsp;mM DTT</td></tr><tr><td colspan="4">Solvents</td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>J.T. Baker</td><td>9180-01</td><td>in glazen fles, LET OP, draag PPE</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J.T. Baker</td><td>9070-03</td><td>in glazen fles, LET OP, draag PPE</td></tr><tr><td colspan="4">Liposoombereiding</td></tr><tr><td>Gastight Hamilton spuit</td><td>Hamilton</td><td>var. grootten</td><td>gebruik alleen glazen spuit met oplosmiddelen (Chloroform/ Methanon, 2:1, v/v)</td></tr><tr><td>Glazen buizen Pyrex Vista 11 ml, 16x100 mm schroefdop kweekbuis</td><td>Pyrex&nbsp;</td><td>70825-16</td><td>grondig schoonmaken, spoelen met chloroform</td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine, 16:0-18:1 PC (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457</td><td>Lipiden komen opgelost in CHCl3 of als lyfiliseerde poeder in verzegelde flacons. Bij openen in delen verdelen. Extra opslaan als gedroogde lipidefilms onder inerte atmosfeer bij -20 &deg;C. Houd voorraden in CHCl3/MeOH (2:1, v/v) bij -20 &deg;C. Laat op RT komen voordat u opent</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfo-L-serine (natriumzout), 18:1 PS (DOPS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td>Zoals hierboven.</td></tr><tr><td>1-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine, 18:0-20:4 PE (SAPE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850804</td><td>Zoals hierboven.</td></tr><tr><td>L-&alpha;-fosfatidylinositol-4,5-bisfosfaat (hersenen, varkens) (ammoniumzout), hersenen PI(4,5)P2</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046</td><td>Zoals hierboven.</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammoniumzout), 18:1 NBD PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810145</td><td>Zoals hierboven.</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleenglycol)-2000] (ammoniumzout), 18:1 PEG2000 PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880130</td><td>Zoals hierboven.</td></tr><tr><td>cholesterol (schapenwol, >98%)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td>Zoals hierboven.</td></tr><tr><td>DiD' olie; DiIC18(5) olie (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine Perchloraat)</td><td>Molecular Probes</td><td>D-307</td><td></td></tr><tr><td>Rotavapor R-210</td><td>Buchi</td><td>R-210</td><td>verwarmingsbad boven Tm van gebruikte lipiden</td></tr><tr><td>OG n-Octyl-&beta;-D-Glucopyranoside</td><td>Affymetrix</td><td>0311</td><td>bewaar bij -20 &deg;C, laat op RT komen voordat u opent</td></tr><tr><td>Schudden - Eppendorf Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyze Dialyse Cassettes, 20k MWCO, 3&nbsp;ml</td><td>life technologies</td><td>66003</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 Adsorbenten</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep&nbsp;Dichtheidsgradiënt Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeerbuis, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2&nbsp;ml, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>Beckman SW41 Ti rotor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuflorhodamineB</td><td>Molecular Probes</td><td>S-1307</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Column&nbsp;Chromatografie Kolommen, 2.5 &times; 10 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>7372512</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose CL-4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0150-01</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Orange Protein Gel Stain</td><td>Molecular Probes</td><td>S-6650</td><td>5.000x Concentraat in DMSO</td></tr><tr><td colspan="4">PDMS blok</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone elastomeren kit, PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex glazen petrischaal, 150 x 20 mm, compleet met deksel</td><td>Corning</td><td>3160-152</td><td></td></tr><tr><td>Gatjespons - Herbruikbare Biopsie Pon, 0.75&nbsp;mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>Handmatige Gatjesponsmachine&nbsp;</td><td>SYNEO</td><td>MHPM-UNV</td><td></td></tr><tr><td>Boor .035 x.026 x 1.5 304 SS TiN gecoate ronde pons</td><td>SYNEO</td><td>CR0350265N20R4</td><td>boordiameter: 0,9 mm, ponsboorgrootte: 0

snare-gemedieerde fusie van single proteoliposomen met tethered ondersteund dubbellagen in een microfluïdische flow cell gecontroleerd door gepolariseerde tirf microscopie

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

In de alomtegenwoordige proces van membraanfusie de opening van een fusie porie stelt de eerste verbinding tussen twee voorheen afzonderlijke compartimenten. Tijdens neurotransmitter of afgifte van hormonen via exocytose, de fusie porie kan kortstondig openen en sluiten herhaaldelijk, het reguleren van de lading vrijgavekinetiek. Pore ​​dynamiek ook de wijze van blaasje recycling vast te stellen; onomkeerbare nieuwe sluiting leidt tot voorbijgaande, &quot;kiss-and-run&quot; fusion, terwijl verwijding leidt tot een volledige fusie. Om beter te begrijpen welke factoren regeren porie dynamiek, ontwikkelden we een test om membraanfusie te controleren met behulp van gepolariseerd totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie met &#39;single molecule gevoeligheid en ~ 15 msec tijdsresolutie in een biochemisch goed gedefinieerde in vitro systeem. Fusie van fluorescent gelabelde kleine unilamellaire blaasjes met v-SNARE eiwitten (v-SUV&#39;s) met een vlakke bilaag lager t-SNAREs, ondersteund op een zachte polymeer kussen (t-SBL, t-ondersteunde bilaag) Wordt bewaakt. De test maakt gebruik van microfluïdische stromingskanalen die zorgen voor een minimale steekproef consumptie, terwijl het leveren van een constante dichtheid van SUV&#39;s. Het benutten van de snelle verbetering van het signaal bij overdracht van lipide etiketten van de SUV naar de SBL tijdens de fusie, wordt kinetiek van lipiden kleurstofoverdracht gecontroleerd. De gevoeligheid van TIRF microscopie laat volgen enkele fluorescerende lipide labels, waaruit lipide diffusiviteit en SUV grootte kan worden afgeleid voor elke samensmelting. vrijmaking van kleurstof tijden lipide kan veel langer dan verwacht voor ongehinderde doorgang door permanent open poriën. Met een model dat veronderstelt vertraging van lipide afgifte wordt veroorzaakt door het trillen porie een porie &quot;openheid&quot;, de fractie van tijd de poriën ook voor fusie blijft, kunnen worden geschat. Een oplosbaar marker kan worden ingekapseld in de SUV&#39;s voor de gelijktijdige monitoring van lipiden en oplosbare lading release. Dergelijke metingen geven een aantal poriën hersluiten na het verliezen van een gedeelte van het oplosbare lading.

SBL Kwaliteit Het is cruciaal om de kwaliteit en de vloeibaarheid van de SBL vóór het fusie-experiment controleren. De fluorescentie onderaan glaszijde van een microfluïde kanaal moet uniform zijn, zonder duidelijke gebreken. Als een luchtbel passeert hoewel het kanaal, laat meestal zichtbare littekens op de SBL. Als er zulke grote schaal littekens / defecten, geen gebruik maken van dat kanaal. Soms SUV&#39;s ...

Hier presenteren we een protocol om enkele, SNARE-bemiddelde fusie gebeurtenissen tussen liposomen en ondersteund dubbellagen in microfluïdische kanalen met gepolariseerde TIRFM, met &#39;single molecule gevoeligheid en ~ 15 msec tijdsresolutie te detecteren. Lipide en oplosbare lading afgifte kan gelijktijdig worden gedetecteerd. Liposoom grootte, lipide diffusie, en fusie porie eigenschappen worden gemeten.

SNARE-gemedieerde Fusie van Single proteoliposomen met Tethered Ondersteund dubbellagen in een microfluïdische Flow Cell gecontroleerd door gepolariseerde TIRF Microscopie

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Het algemene doel van deze assay is het observeren van individuele membraanfusie-gebeurtenissen aangestuurd door neuronale en exocytotische SNARE-eiwitten, om de fundamentele mechanismen van neurotransmitter- en hormoonafgifte te begrijpen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van membraanfusie, zoals hoe vrachtafgifte plaatsvindt via een dynamische fusieporie en het lot van de porie na fusie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat verschillende stadia van vesikel-docking, fusie voor opening en de kinetiek van de vrachtafgifte kunnen worden waargenomen voor individuele gebeurtenissen binnen biochemisch gedefinieerde omgevingen.Hoewel deze methode inzicht kan geven in exocytose, kan zij ook worden toegepast op andere membraanfusiereacties, zoals de fusie van envelopvirussen met doelcelmembranen tijdens een infectie. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat er veel verschillende stappen beheerst moeten worden, van microfabricage tot eiwitzuivering en imaging. Begin met het voorbereiden van een siliconen master-mal met behulp van standaard fotolithografische technieken en het hier getoonde sjabloon.Voeg vervolgens 100 milliliters PDMS-basis en 10 milliliters van het uithardingsmiddel toe aan een wegwerpplasticbeker en roer het mengsel goed door. Plaats de beker daarna in een vacuümdesiccator. Zet het vacuüm aan, maar houd dit nauwlettend in de gaten om te voorkomen dat het mengsel overstroomt.Giet na het ontgassen een grote druppel van het ontgaste PDMS-mengsel in een glazen petrischaal en druk de mal op het PDMS, waarbij de kant van het sjabloon naar boven is gericht om te voorkomen dat er luchtbellen onder de wafer worden ingesloten. Giet nu ontgast PDMS op het sjabloon totdat dit bedekt is met vijf tot acht millimeter van het polymeer. Als er een luchtbel ontstaat, verwijder deze dan voorzichtig met een pipetpunt.Plaats de met PDMS bedekte mal op het vlakke oppervlak van een oven en bak deze drie uur lang bij 60 °C. Gebruik vervolgens een nieuw scalpellamaasje om een PDMS-blok uit te snijden dat de gevormde kanaalstructuren bevat. Let erop dat het uitgesneden blok op een dekglas moet passen.Plaats vervolgens het blok zodanig dat de zijkant met de kanaalgroeven naar boven wijst en gebruik een gaatjespons om in één vloeiende beweging door het blok te ponsen. Zorg ervoor dat het uitgeponste stukje uit elk van de acht gatlocaties wordt verwijderd. Plak na voltooiing de blokgroeven met de groeven naar beneden op een schoon stuk aluminiumfolie.Knip nu de slangetjes af zodat ze aan één uiteinde een lichte schuinte hebben, en gebruik een pincet om de slangetjes voor ongeveer een derde in de gestanste gaten te duwen. Knip de buisjes zo af dat ze het bufferreservoir en de spuitenpomp kunnen bereiken. Om de slangetjes aan de spuiten op de spuitenpomp te bevestigen, knipt u een kort stuk uit een dikkere siliconenslang en steekt u de dunnere slang in één zijde hiervan.Dit kant-en-klare blok PDMS kan enkele maanden bewaard worden. Plaats het PDMS-blok eerst gedurende ten minste 20 minuten onder hoog vacuüm om opgeloste gassen te verwijderen en het risico op luchtbellen in de microfluïdische kanalen tijdens het fusie-experiment te verminderen. Controleer vervolgens of het gebied van de microscopietafel is ingesteld op de gewenste temperatuur.Terwijl de temperatuur stabiliseert, bereid je de NBD-PE fluorescent gelabelde kleine unilamellaire vesicles met t-SNARE-eiwitten, of eiwitvrije controles, voor door 30 µL van de vesicles te verdunnen met 60 µL buffer. Zuig de oplossing vervolgens op in een spuit van drie milliliter. Druk het grootste deel van de lucht boven het monster uit terwijl je de spuit verticaal houdt.Sveel daarna verzegelt u de tip met paraffinefolie en creëert u een vacuüm door de zuiger naar beneden te trekken. Tik tijdens het trekken van het vacuüm tegen de cilinder van de spuit om het ontgassen van de oplossing te versnellen. Herhaal dit proces een paar keer totdat er geen luchtbellen meer ontstaan wanneer het vacuüm wordt toegepast.Gebruik vervolgens een hypodermische naald met een diameter die iets groter is dan de microfluïdische buisjes om een gat in de dop van een microcentrifugebuis te maken. Vul de ontgaste kleine unilamellaire vesicles in de microcentrifugebuis, plaats deze in de houder op de microscooptafel en laat de oplossing equilibreren tot de ingestelde temperatuur. Plaats een schoon dekglas in een plasmareiniger en behandel het dekglas ongeveer vijf minuten lang met luchtplasma.Verwijder vervolgens het dekglas en plaats dit, met de behandelde zijde naar boven, op een paar pluisvrije tissues die als kussen dienen. Plaats daarna het PDMS-blok, met de gestructureerde zijde naar beneden, op het dekglas. Gebruik een pincet om voorzichtig op het blok te drukken, maar druk niet zo hard dat het glas breekt.Plaats de geassembleerde flowcell op de microscooptafel. Sluit vervolgens de slangen aan op de reservoirs met kleine unilamellaire vesikels en op de spuitpomp. Begin met het aspireren van de kleine unilamellaire vesikels met een snelheid van drie µL per minuut totdat de oplossing de kanalen volledig vult.Wanneer de oplossingen in alle kanalen omhoog beginnen te bewegen in de slang aan de uitgangszijde, verminder dan de stroomsnelheid naar 0,5 microliters per minuut en incubeer gedurende 30 tot 45 minuten. De tijd tussen de plasmabehandeling van het glazen dekglas en het instromen van de SUV's in het kanaal mag 10 minuten niet overschrijden, aangezien het effect van de plasmabehandeling tijdelijk is. Controleer de kanalen op lekken met fluorescentie-imaging met een objectief met lage vergroting en spoel vervolgens alle kanalen met ontgaste buffer om ongebonden vesicles weg te wassen.Schakel vervolgens over naar het olie-immersie-objectief met hoge vergroting voor TIRF-microscopie en bevestig de flowcel door deze met tape op de microscopietafel te plakken. Sluit het velddiagram tot een diameter van ongeveer 40 µm en pas de intensiteit van het 488-nm excitatielicht via de software aan, zodat de fluorescentie in het belichte gebied aanzienlijk, maar niet volledig, wordt gebleekt. De fluorescentie-intensiteit in het midden van het belichte gebied moet lager zijn dan aan de randen, aangezien intacte NBD-PE-moleculen binnenkomen en een bepaalde afstand diffunderen voordat ze bleken.Indien de oppervlakte-adherente SUV's echter niet knappen, zouden alle fluoroforen in het blootgestelde gebied moeten bleken. Om de resultaten van de metingen in de rusttoestand te verifiëren, dient men de belichting te stoppen en enkele minuten later opnieuw te starten om te zien of de fluorescentie is hersteld. Ontgas de reconstitutiebuffer en gebruik deze om de stockoplossing van de gereconstitueerde v-SNARE small unilamellar vesicles te verdunnen, zodanig dat de resulterende oplossing 10 tot 100 fusiegebeurtenissen in het gezichtsveld produceert gedurende 60 seconden.Te veel fusiegebeurtenissen verhogen de achtergrondfluorescentie en maken de detectie en analyse van de gebeurtenissen moeilijk. Omgekeerd kan een te lage fusiesnelheid leiden tot een gebrekkige statistiek. Laat de v-SNARE gereconstitueerde kleine unilamellaire vesicles door het kanaal stromen met een stroomsnelheid van 2 µL per minuut, en schakel over naar de juiste excitatie- en emissie-instellingen om lipidemenging te monitoren.Stel vervolgens de TIRF-hoek en polarisatie in zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Exciteer en monitor continu de fluorescentie van de vesicles met behulp van een 561-nanometer laser. Wanneer de vesicles het stroomkanaal bereiken en aanhechten aan en fuseren met de ondersteunde dubbellaag, begint het achtergrondfluorescentiesignaal zich op te bouwen.Pas de intensiteit van de excitatielaser via de software aan om de achtergrondfluorescentie continu weg te bleken, zodat nieuwe dockings- en fusiegebeurtenissen gemakkelijk kunnen worden waargenomen. Neem verschillende video's op op diverse posities in een bepaald kanaal. Controleer de NBD-PE-fluorescentie om te verifiëren dat de ondersteunde bilaag op deze posities geen defecten vertoont.De fluorescentieherstel na fotobleken wordt hier getoond voor een gereconstitueerde ondersteunde dubbellaag van t-SNARE die relatief defectvrij en fluïde was. Het gebied wordt gefotografeerd bij een lage lichtblootstelling om het fluorescentieherstel door diffusie van NBD-gelabelde lipiden te volgen. Het is eenvoudiger om docking- en fusiegebeurtenissen waar te nemen wanneer uitsluitend de fluorescentie van lipide-labels wordt gemonitord.In de hier getoonde reeks beelden werd elke 18 milliseconden een frame opgenomen. Bij fusie worden de lipidelabels overgedragen naar de ondersteunde dubbellaag en diffunderen ze weg van de fusiestelle. In sommige gevallen is het wenselijk om de lipidemenging en de afgifte van oplosbare cargo gelijktijdig te monitoren.Hier wordt een representatieve gebeurtenis getoond die gelijktijdige lipidemenging en het vrijkomen van oplosbare cargo beschrijft. Bij de hoge concentraties die voor encapsulatie worden gebruikt, is de fluorescentie van de oplosbare inhoud, in het rood weergegeven, aanvankelijk zelf-gequencht. Een scherpe toename in lipidfluorescentie, in het blauw weergegeven, is indicatief voor lipidemenging als gevolg van een fusiegebeurtenis, zoals bij de eerder getoonde enkelkleurige monitoring van lipidemarkers.Het openen van de poriën laat de oplosbare inhoudsstof vrij en heft de initiële zelf-quenching van de kleurstof in het lumen van de vesikel op. Dit leidt tot een toename van het signaal van de oplosbare lading, weergegeven in het rood. Opvallend is dat de fluorescentie van de lading een stabiel plateau bereikte.Dit geeft aan dat de porie weer is gesloten nadat alle lipidelabels en een fractie van de oplosbare lading waren vrijgekomen. Aan het einde neemt het signaal van de oplosbare inhoud, in rood weergegeven, zeer snel af. Dit is waarschijnlijk te wijten aan ofwel een snelle volledige fusie of het openspringen van de liposomen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een microfluïdische flowcel bereidt vanuit een ondersteunde dubbellaag gereconstitueerd met t-SNARE-eiwitten, en hoe u individuele vesikelfusiegebeurtenissen kunt monitoren en analyseren met behulp van TIRF-microscopie. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

snare-mediated-fusion-single-proteoliposomes-with-tethered-supported

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Ondersteund vlakke bilagen zijn krachtige instrumenten die kunnen worden gebruikt om de moleculaire interacties in een immunologische synaps model. Hier tonen we methoden voor het verankeren van celadhesie eiwitten waarvan bekend is dat moduleren synapsvorming naar de bovenste folder van de lipide bilyer en synapsvorming met behulp van TIRF microscopie visualiseren.

Ondersteunde Planar dubbellagen voor de vorming van studie van immunologische synapsen en Kinapse

We hebben een celfusie test die SNARE-gemedieerde membraanfusie events kwantificeert door geactiveerde expressie van β-galactosidase.

Analyse van SNARE gemedieerde membraanfusie gebruiken enzymatische celfusie Assay

-Polarisatie gebaseerde Total Internal Reflection Fluorescentie microscopie (pTIRFM) maakt real-time detectie van celmembraan dynamiek. Dit artikel beschrijft de uitvoering van pTIRFM voor de studie van membraan remodeling tijdens gereguleerde exocytose. De techniek is generaliseerbaar naar andere celbiologische processen die veranderingen in de membraan vorm direct of indirect te betrekken.

Imaging Plasma Membraan Vervormingen Met pTIRFM

Hier wordt de bereiding van eiwit-gefunctionaliseerde planaire glas-ondersteunde lipide bilayers, de bepaling van eiwitmobiliteit binnen en de meting van eiwitdichtheden getoond. Een routekaart voor het bouwen van een ruisonderdrukte Total Internal Reflection microscoop wordt geschetst, die het mogelijk maakt om enkele bilayer-residente fluorochromen met hoge ruimtelijk-temporele resolutie te visualiseren.

Single Molecule Fluorescentie Microscopie op Ondersteunde Planar dubbellagen

Dit protocol wordt een nieuwe methode voor de kwantitatieve visualisatie van complexe vorming van SNARE-eiwitten, gebaseerd op Förster resonance energie-overdracht en levensduur van de fluorescentie microscopie imaging waardoor beschreven.

Visualiseren van intracellulaire SNARE mensenhandel door fluorescentie levensduur microscopie Imaging

Mitochondriale fusie is een belangrijke homeostatische reactie die ten grondslag ligt aan mitochondriale dynamiek. Hier beschreven is een in vitro reconstitution systeem om mitochondriale binnenmembraan fusie die membraan tethering, docking, hemifusion, en porie opening kan oplossen. De veelzijdigheid van deze aanpak bij het verkennen van celmembraansystemen wordt besproken.

Een modelmembraanplatform voor het reconstrueren van mitochondriale membraandynamica

Dit protocol beschrijft de vorming van ondersteunde lipide bilayers en de toevoeging van cytoskeletale filamenten en motoreiwitten om de dynamiek van gereconstitueerde, membraangebonden cytoskeletale netwerken te bestuderen met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Reconstitutie van membraangebonden minimale actinecorticosterces op ondersteunde lipidebilagen

Hier wordt een protocol gepresenteerd om de binding, mobiliteit en assemblage van afzonderlijke moleculen op kunstmatige overvolle lipidemembranen uit te voeren en te analyseren met behulp van single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopie.

Single-Molecule Diffusie en assemblage op polymeer-crowded lipide membranen

Dit protocol beschrijft hoe TIRF-microscopie kan worden gebruikt om individuele ionkanalen te volgen en hun activiteit in ondersteunde lipidemembranen te bepalen, waardoor het samenspel tussen laterale membraanbeweging en kanaalfunctie wordt gedefinieerd. Het beschrijft hoe de membranen moeten worden voorbereid, de gegevens moeten worden vastgelegd en de resultaten moeten worden geanalyseerd.

Single-Molecule Imaging van Laterale Mobiliteit en Ion Channel Activity in Lipid Bilayers met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopie

Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van hoe monsters te maken voor single-eiwittracking in solid-supported lipid bilayers. Het verklaart ook een eenvoudige fluorescentiemicroscoop met enkelvoudige moleculegevoeligheid en een hoge framerate. Tot slot beschrijven we de procedure voor het extraheren van single-protein trajecten.

Tracking van enkele eiwitten in lipide-dubbellagen met behulp van fluorescentiemicroscopie

Leer SNARE-gemedieerde fusie van enkele proteoliposomen met behulp van gepolariseerde TIRF-microscopie. Deze methode maakt detectie van individuele fusiegebeurtenissen met hoge tijdsresolutie mogelijk.

SNARE-gemedieerde Fusie van Single proteoliposomen met Tethered Ondersteund dubbellagen in een microfluïdische Flow Cell gecontroleerd door gepolariseerde TIRF Microscopie (Video) | JoVE Journal

SNARE-gemedieerde Fusie van Single proteoliposomen met Tethered Ondersteund dubbellagen in een microfluïdische Flow Cell gecontroleerd door gepolariseerde TIRF Microscopie

Meer video's verkennen