Vergelijking van de drie verschillende methoden voor het bepalen van de cel proliferatie in borstkanker cellijnen

Het algemene doel van deze demonstratie is om drie verschillende assays voor celproliferatie te vergelijken en de voor- en nadelen van elke methode te presenteren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het kankeronderzoek, zoals de keuze voor de meest geschikte methode voor het bepalen van de celproliferatie. De voorbereiding van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor de cell imager moeilijk aan te leren zijn.

Er is een scherpstelling op de cellen vereist voordat het juiste masker voor het tellen van cellen wordt toegepast. Om deze procedure te starten, kweekt u twee MCF-7-cellijnen gedurende drie dagen tot een confluentie van 75 tot 80% in T75 vierkante centimeter weefselkweekflessen met fenolrood-vrij DMEM. Verwijder na drie dagen de cellen uit de flessen door het medium in een afvalbak te gieten.

Was vervolgens onmiddellijk de cellaag met twee milliliter voorverwarmde twee keer trypsin. Aspireer de trypsin en voeg nog eens twee milliliter voorverwarmde trypsin toe aan de cellaag voordat deze in een incubator wordt geplaatst. Zodra de cellen zijn losgekomen, worden ze gewassen met 10 milliliter verwarmd vers gesupplementeerd DMEM.

Breng vervolgens de celsuspensie over naar een steriele buis van 15 milliliter en centrifugeer deze gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Aspireer na vijf minuten voorzichtig het supernatant en gooi dit weg. Resuspendeer daarna de celpellet in vijf milliliter vers aangevuld DMEM.

Om een cel telling uit te voeren, verdunt u 100 µL van de celsuspensie in 900 µL van één keer DPBS. Plaats vervolgens een nieuwe 60-µm sensor op de automatische cel teller. Houd de zuiger ingedrukt en dompel de sensor onder in de verdunde celsuspensie.

Laat de zuiger van de celsteller langzaam los. Verwijder vervolgens de sensor uit de celsteller wanneer dit voltooid is. Zaai de cellen in een eindvolume van 100 µL in een 96-wells plaat bij een confluentie van ongeveer 20% om ruimte te laten voor celgroei en de meting van de proliferatie over drie tot vijf dagen.

Om het celgetal met een hemocytometer te bepalen, worden zowel het medium als de trypsine voorverwarmd tot 37 °C in een celkweekincubator, oven of waterbad. Aspireer vervolgens het medium van de cellen in een afvalbak. Was ze daarna één keer met 30 µL trypsine (2×) en aspireer het medium opnieuw in de afvalbak.

Was daarna de cellen opnieuw met 30 µL van tweevoudig trypsine en incubeer ze gedurende vijf minuten bij 37 °C. Tik voorzichtig tegen de rand van de plaat om de cellen los te maken. Voeg vervolgens 50 µL aangevuld DMEM toe en meng de cellen door middel van pipetteren totdat er een enkelcellige suspensie is gevormd.

Plaats het glazen dekglas over de telkamers en druk dit aan totdat de refractieringen van Newton zichtbaar zijn tussen de randen van het dekglas en de helocytometer. Pipetteer vervolgens voorzichtig 20 µL van de celсусpensie onder het dekglas en laat de telkamer door capillaire werking vullen. Visualiseer daarna de telkamers in de rasterindeling onder 10x vergroting.

Ontdooi in deze procedure het luminescentiereagens gedurende 30 minuten in een waterbad van 22 °C. Keer de fles voorzichtig om om een homogeen mengsel te verkrijgen. Laat vervolgens één plaat met gezaaide cellen 30 minuten lang equilibreren bij kamertemperatuur.

Voeg vervolgens 100 µL luminescentiereagens toe aan elke put. Meng de inhoud gedurende twee minuten op een orbitale schudder. Laat de plaat daarna 10 minuten incuberen bij kamertemperatuur.

Om een luminescentie-experiment in te stellen met de software van de multi-mode plaatlezer, schakelt u de multi-mode plaatlezer in en opent u de software. Selecteer in de Task Manager Experimenten en Maak Nieuw. Selecteer vervolgens Bestand in de zijwerkbalk en selecteer onder het tabblad Protocol Procedure.

Select vervolgens Greiner 96 flat bottom als plaattype en vink het vakje Use Lid aan. Selecteer de actie Read onder het vak Read method. Kies daarna Luminescence als detectiemethode en klik op OK. Selecteer in het vak Read Step de te scannen putjes onder het tabblad Full Plate en selecteer de putjes die als blanco putjes moeten dienen.

Stel de Filter Set in op Empty Filter. Stel de Gain in op 135, met een Integration Time van 5 seconden per well en een Read Height van 6,5 millimeter. Klik op OK om de instellingen voor de luminescentiemeting op te slaan.

Om een luminescentiemeting uit te voeren, schuift u de plaatdrager uit door het tabblad Instrument Control te selecteren en op Plate Out te klikken. Plaats de 96-well plaat op de plaatdrager en zorg dat het deksel gesloten is. Sluit de plaatdrager door onder het tabblad Instrument Control op Plate In te klikken.

Klik vervolgens op Read Now in de werkbalk om een luminescentiemeting uit te voeren. Exporteer daarna de RLU-metingen van elke put naar een spreadsheet voor verdere analyse. Om een celbeeldexperiment op te zetten, schakelt u de multi-mode celimager in en opent u de software.

Selecteer in de Taakbeheerder het tabblad Experimenten en Create New. Klik op de werkbalk Bestand op het tabblad Protocol en vervolgens op het tabblad Procedure. Selecteer de actie Set Temperature.

Zet de Incubator op On en stel de Temperatuur in op 37 °C. Vink Preheat aan en klik vervolgens op OK om de instellingen op te slaan. Selecteer daarna de actie Read.

Klik op Image als detectiemethode. Selecteer vervolgens het Endpoint/Kinetic leestype en het Filters opticatype en klik op OK. Klik daarna op het tabblad Full Plate en selecteer de wells op de plaat die gefotografeerd moeten worden. Klik op OK om de instellingen op te slaan.

Select nu het 2,5-keer objectief uit het vervolggedeelte Objectieven. Selecteer onder het tabblad Kanalen GFP 469,525 en Bright Field. Vink Auto Exposure aan voor beide kanalen en selecteer de auto exposure-well.

Klik op Opties om de instellingen voor de automatische focus te bepalen. Selecteer bij de opties voor automatische focus de methode Scan en vervolgens automatische focus. Klik op OK om de instellingen op te slaan.

Stel vervolgens de horizontale en verticale offset ten opzichte van het centrum van de put in op nul. Selecteer de optie om meerdere beelden per put te scannen in een montage van drie bij twee. Klik daarna op OK om de procedure-instellingen op te slaan.

Om het experiment op de geselecteerde plaat uit te lezen, klikt u op het tabblad Instrument Control en selecteert u de functie Plate Out. Plaats een 96-well plaat op de plaathouder en zorg dat het deksel gesloten is. Selecteer onder het tabblad Instrument Control de functie Plate In.

Selecteer vervolgens Read Now in het tabblad plate, en herhaal de meting elke 24 uur, tot 96 uur na het zaaien. Om een afbeelding te analyseren, klikt u op het tabblad Data van de gefotografeerde plaat en selecteert u Picture GFP 469, 525 plus Bright Field. Dubbelklik vervolgens op de gefotografeerde well.

Klik nu op een geladen afbeelding. Selecteer Analyze en kies vervolgens de enkelvoudige afbeelding van de montage die moet worden geanalyseerd. Klik daarna op OK. Vink vervolgens alleen het GFP-kanaal aan en stel de parameters in zoals beschreven in Tabel 3.

Klik daarna op Start om de parameters op de gefotografeerde cellen toe te passen. Bekijk het masker voor celtelling dat over de gefotografeerde cellen is geplaatst, welke wordt gebruikt om het aantal cellen per afbeelding te bepalen. Klik op Apply Changes en behoud deze instellingen voor elke plaat die gedurende het experiment wordt gefotografeerd.

In deze figuur is een lineaire regressieanalyse uitgevoerd om de correlatieve relaties te vergelijken tussen de verschillende onderzochte methoden voor het meten van de celproliferatie in MCF-7-LeGO-cellen en MCF-7-delta 40p53-cellen. Er is een Pearson-correlatiecoëfficiënt berekend en de significantie tussen de verschillende methoden voor het meten van de celproliferatie is bepaald. De sterkste correlatie werd waargenomen bij de vergelijking tussen de luminescentie-gebaseerde assay en de cell imager.

Hier worden de representatieve afbeeldingen getoond van GFP-positieve MCF-7-LeGO en MCF-7-delta 40p53 borstkankercellen, vastgelegd met de celimager elke 24 uur totdat de cellen een confluentie van bijna 100% bereiken. Deze methode levert nuttige cellulaire informatie op, waaronder de mogelijkheid om de celgroei over meerdere dagen visueel te monitoren en de celgrootte en celmorfologie tussen verschillende cellijnen te vergelijken. Hier wordt een samenvatting van de voor- en nadelen van elke geteste methode getoond, wat de veelzijdigheid van elke methode aantoont en lezers zal helpen bij het kiezen van de meest geschikte methode.

Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in drie verschillende assays voor celproliferatie en kunt u bepalen welke assay het beste past bij uw eigen experimentele ontwerp.