Vergelijking van de drie verschillende methoden voor het bepalen van de cel proliferatie in borstkanker cellijnen
September 3rd, 2016
Dit protocol beschrijft het gebruik van drie verschillende methoden voor het analyseren van celproliferatie in borstkankercellijnen. Dit omvat het gebruik van conventionele celtelling, op luminescentie gebaseerde celviabiliteit en celtelling door het gebruik van een celimager. Elk biedt voordelen voor de reproduceerbare meting van celproliferatie.
Het algemene doel van deze demonstratie is om drie verschillende celproliferatie-assays te vergelijken en de voor- en nadelen van elke methode te presenteren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het onderzoeksgebied van kanker, zoals het gebruik van de meest geschikte celproliferatiemethode. De voorbereiding van deze methode is cruciaal, omdat de stappen van de celimager moeilijk te leren zijn.
Ze vereisen dat u zich op de cellen concentreert voordat u het juiste celtellingsmasker toepast. Om deze procedure te beginnen, laat u twee MCF-7-cellijnen gedurende drie dagen groeien tot 75 tot 80%confluentie in de T75 vierkante centimeter weefselkweekkolven met fenolroodvrij DMEM. Na drie dagen verwijdert u de cellen uit de kolven door het medium in een afvalcontainer te gieten.
Was vervolgens de cellaag onmiddellijk met twee milliliter tweemaal trypsine. Aaspibeer de trypsine en voeg nog eens twee milliliter voorverwarmd trypsine toe aan de cellaag voordat u deze in een incubator plaatst. Zodra de cellen los zijn komen te zitten, wast u ze met 10 milliliter verwarmd vers aangevuld DMEM.
Breng vervolgens de celsuspensie over in een steriele 15 milliliter buis en centrifugeer deze vijf minuten bij kamertemperatuur. Na vijf minuten aaspibeert en verwijdert u voorzichtig het supernatant. Hierna suspendeert u de celpellet opnieuw in vijf milliliter vers aangevuld DMEM.
Om een celtelling uit te voeren, verdunt u 100 microliter van de celsuspensie in 900 microliter van eenmaal DPBS. Plaats vervolgens een nieuwe 60-micrometer sensor op de geautomatiseerde celteller. Houd de zuiger ingedrukt en dompel de sensor onder in de verdunde celsuspensie.
Laat de zuiger langzaam los op de celteller. Verwijder vervolgens de sensor van de celteller wanneer u klaar bent. Zaai de cellen in een eindvolume van 100 microliter in een 96-wellsplaat bij ongeveer 20%confluentie om ruimte te bieden voor celgroei en meting van proliferatie gedurende drie tot vijf dagen.
Om de celtelling te bepalen met behulp van een hemocytometer, verwarmt u zowel het medium als trypsine voor tot 37 graden Celsius in een celkweekincubator, oven of waterbad. Aspibeer vervolgens het medium van de cellen in een afvalcontainer. Was ze vervolgens eenmaal met 30 microliter tweemaal trypsine en aaspibeer het medium opnieuw in de afvalcontainer.
Was vervolgens de cellen opnieuw met 30 microliter tweemaal trypsine en incubeer ze gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Tik voorzichtig op de rand van de plaat om de cellen los te maken. Voeg vervolgens 50 microliter aangevuld DMEM toe en meng de cellen door pipetteren totdat er een enkele celsuspensie is gevormd.
Plaats het glazen dekglas over de telkamers en bevestig het totdat Newton's refractieringen worden gezien tussen de randen van het dekglas en de hemocytometer. Pipetteer vervolgens voorzichtig 20 microliter van de celsuspensie onder het dekglas en laat de telkamer worden gevuld door capillaire beweging. Beeld vervolgens de telkamers in de rasterindeling af onder 10x vergroting.
Bij deze procedure ontdooit u het luminescentiereagens in een waterbad van 22 graden Celsius gedurende 30 minuten. Draai de fles voorzichtig om om een homogene mix te verkrijgen. Equilibreer vervolgens één plaat met gezaaide cellen gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.
Voeg vervolgens 100 microliter luminescentiereagens toe aan elke put. Meng de inhoud gedurende twee minuten op een orbitale shaker. Laat vervolgens de plaat gedurende 10 minuten op kamertemperatuur incuberen.
Om een luminescentie-experiment op te zetten met behulp van de multi-mode plate reader-software, zet u de multi-mode plate reader aan en opent u de software. Selecteer in de Task Manager Experimenten en Nieuw Maken. Selecteer vervolgens Bestand uit de zijbalk en selecteer onder het Protocol-tabblad Procedure.
Selecteer vervolgens Greiner 96 platte bodem als plaattype en vink het vakje Gebruik Deksel aan. Selecteer de Lees-actie onder de Leesmethode-box. Selecteer vervolgens Luminescentie als detectiemethode en klik op OK. Selecteer in de Leesstap-box de putten die moeten worden gescand onder het Volledige Plaat-tabblad en selecteer putten om als blanco putten te fungeren.
Stel de Filter Set in op Leeg Filter. Stel de Versterking in op 135, met een Integratietijd van 5 seconden per put en een Lees Hoogte van 6,5 millimeter. Klik op OK om de instellingen voor het luminescentie-leesproces op te slaan.
Om een luminescentie-leesproces uit te voeren, werpt u de plaathouder uit door het Instrument Control-tabblad te selecteren en klik op Plate Uit. Plaats de 96-wellsplaat op de plaathouder, zorg ervoor dat het deksel op zit. Sluit de plaathouder door te klikken op Plate In onder het Instrument Control-tabblad.
Klik vervolgens op Nu Lezen in de werkbalk om een luminescent leesproces uit te voeren. Exporteer daarna de RLU-metingen voor elke put naar een spreadsheet voor verdere analyse. Om een celbeeldexperiment op te zetten, zet u de multi-mode celimager aan en opent u de software.
Selecteer in de Task Manager het Experimenten-tabblad en Nieuw Maken. Klik op het Protocol-tabblad op de File-werkbalk en vervolgens op het Procedure-tabblad. Selecteer de Set Temperatuur-actie.
Stel de Incubator in op Aan en stel de Temperatuur in op 37 graden Celsius. Vink Voorverwarm aan en klik vervolgens op OK om de instellingen op te slaan. Selecteer vervolgens de Lees-actie.
Klik op Afbeelding als detectiemethode. Selecteer vervolgens het Endpoint/Kinetic leestype en de Filters opticatype en klik op OK. Klik vervolgens op het Volledige Plaat-tabblad en selecteer de putten op de plaat die moeten worden afgebeeld. Klik op OK om de instellingen op te slaan.
Selecteer nu de 2,5 keer objectief uit de vervolgkeuzelijst Objectieven. Selecteer onder het Kanalen-tabblad GFP 469,525 en Bright Field. Vink Automatische Belichting aan voor beide kanalen en selecteer de automatische belichtingsput.
Om de autofocusinstellingen te bepalen, k
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft de vergelijking van drie verschillende methoden voor het analyseren van celproliferatie in borstkankercellijnen. Deze methoden omvatten conventioneel celtelling, luminescentie-gebaseerde celviabiliteit en celtelling met behulp van een celimager, elk met zijn eigen voordelen voor reproduceerbare meting.
Belangrijkste Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Kankeronderzoek
- Celproliferatie-assays
Achtergrond
- Het begrijpen van celproliferatie is cruciaal in kankeronderzoek.
- Verschillende assays kunnen verschillende resultaten en inzichten opleveren.
- Voorbereiding en uitvoering van deze assays vereisen specifieke vaardigheden.
- MCF-7 cellijnen worden vaak gebruikt in borstkankerstudies.
Doel van het Onderzoek
- Om de effectiviteit van drie celproliferatiemethoden te vergelijken.
- Om de meest geschikte methode voor specifieke onderzoeksbehoeften te identificeren.
- Om een gedetailleerd protocol voor onderzoekers te bieden.
Gebruikte Methoden
- Conventioneel celtelling
- Luminescentie-gebaseerde celviabiliteitstest
- Celtelling met behulp van een celimager
- Voorbereiding van MCF-7 cellijnen in cultuur
Belangrijkste Resultaten
- Elke methode heeft verschillende voor- en nadelen.
- Celimager vereist zorgvuldige voorbereiding en focus.
- Conventioneel tellen is eenvoudig maar kan gevoeligheid missen.
- Luminescentie-assays leveren kwantitatieve gegevens over levensvatbaarheid op.
Conclusies
- Het kiezen van de juiste proliferatie-assay is essentieel voor nauwkeurige resultaten.
- Onderzoekers moeten rekening houden met de specifieke vereisten van hun studies.
- Training in het gebruik van geavanceerde methoden zoals celbeeldvorming wordt aanbevolen.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Reliable quantification of cell proliferation is foundational for early oncology discovery, enabling robust target validation and comparative assessment of compound effects in breast cancer models. Selecting the optimal proliferation assay impacts predictive confidence, assay scalability, and cross-study reproducibility, directly influencing portfolio triage and downstream screening workflows. Methodological rigor in proliferation measurement supports risk-adjusted advancement decisions and enterprise-wide assay standardization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of therapeutic hypotheses in breast cancer cell lines.
- Supports functional target validation by measuring proliferation changes in response to genetic or pharmacological perturbations.
- Facilitates mechanistic de-risking through comparative analysis of proliferation outputs across methods.
- Provides data continuity for predictive confidence in early-stage decision making.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, reproducible proliferation assays for compound screening campaigns.
- Supports assay standardization and scalability, especially with luminescence and imaging-based platforms.
- Enables high-throughput readiness and platform reuse for diverse compound libraries.
- Delivers quantitative outputs suitable for robust cross-condition comparisons.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro proliferation metrics with disease-relevant breast cancer models.
- Provides morphological and confluence data via imaging, supporting translational biomarker exploration.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting longitudinal monitoring.
- Reduces biological ambiguity in preclinical candidate selection.
Pipeline & Workflow Integration
These proliferation assays integrate from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and screening workflows in oncology R&D.
- Discovery Biology: Quantitative proliferation measurement clarifies pathway activity and validates target engagement.
- Screening: Assay reproducibility and scalability enable reliable compound evaluation and hit triage.
- Analytics: Statistical outputs, including correlation and regression analyses, facilitate method comparison and data-driven decisions.
- Translational Research: Imaging-based methods provide morphological insights relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Standardized protocols support cross-program assay deployment and data harmonization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in proliferation-based readouts.
- Operational Value: Enhances assay standardization, reproducibility, and throughput across R&D teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation by enabling robust comparative analyses.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology assets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in cell culture, imaging, and luminescence assay setup.
- Demands access to multi-mode plate readers, cell imagers, and analytical software infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of assay protocols and data analysis pipelines.
- Adaptation across different cell lines or disease models may require protocol optimization.
- Each method presents trade-offs in sensitivity, throughput, and data richness that must be matched to project needs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
Preparing Cells for Proliferation Assays
2:49
Determining Cell Count Using a Hemocytometer
4:21
Determining Cell Proliferation Using Luminescence-based Assay
7:02
Determining Cell Count Using a Cell Imager
10:40
Results: Comparison of Three Different Methods Measuring Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines
12:10
Conclusion
