Protocol voor het isoleren van de muis Cirkel van Willis
22 oktober 2016
We beschrijven hier een reproduceerbaar protocol voor het isoleren van de muis cirkel van Willis.
Het algemene doel van deze dissectieprocedure is om de muis-Willis-cirkel te isoleren om de studie van de grote bloedvaten van de muiscerebrovasculaire te vergemakkelijken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de studie van cerebrovasculaire genexpressie bij verschillende ziekten die de hersenvaten aantasten, zoals de ziekte van Alzheimer en cerebrale amyloïde angiopathie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de grote bloedvaten snel en gemakkelijk kunnen worden geïsoleerd zonder de bloedvatstructuur te veranderen.
Begin door met Iris-schaar een incisie van vier centimeter lang te maken in de buikwand en het peritoneum van een dodelijk verdovende muis net onder de ribbenkast. Maak vervolgens een incisie van een paar millimeter lang in het diafragma en vervolg de incisie over de hele lengte van de ribbenkast om de pleurale holte bloot te leggen. Til het borstbeen op en klem de punt vast met een hemostaat, waarbij het hemostaat op de nek rust.
Trim vervolgens voorzichtig het vetweefsel dat het borstbeen met het hart verbindt. Steek nu een 15-gauge profusie naald door het linker ventrikel in de top van het hart en gebruik scharen om een van de leverkwabben door te snijden om een uitlaat voor de perfusie te maken. Perfuseer het dier met 25 tot 50 milliliter PBS met een pompsnelheid van 2,5 milliliter per minuut gedurende ongeveer tien minuten.
De lever moet verkleuren terwijl het bloed wordt vervangen door PBS. Wanneer de vloeistof uit de lever volledig helder is, stopt u met perfusie. Om de hersenen te isoleren, maakt u met Iris-schaar een middenlijn incisie langs de huid van de nek tot de neus.
Trim de huid weg met de Iris-schaar om de schedel bloot te leggen en om eventueel resterend spier- en vetweefsel te verwijderen. Plaats vervolgens de punten van de Iris-schaar in één zijde van het foramen magnum en schuif de punten voorzichtig langs het binnenoppervlak van de schedel naar de uitwendige gehoorgang. Maak een soortgelijke incisie aan de andere kant van het foramen magnum, gevolgd door een middenlijnsnede langs het binnenoppervlak van het interpariëtale bot tot het begin van de sagittale sutuur.
Plant de gesloten Iris-schaar in het voorste bot tussen de ogen in de sagittale sutuur en open de bladen om de schedel in tweeën te splitsen. Pak met behulp van een pincet de reukbollen vast en gebruik de Iris-schaar om de zenuwverbindingen op het ventrale oppervlak van de hersenen af te snijden. Dompel vervolgens de hersenen in een 60 millimeter petrischaal met ijskoud PBS.
Om de Willis-cirkel te isoleren, draag de schaal over naar een ijspakketje onder een dissectiescoop en draai de hersenen op hun dorsale oppervlak om de Willis-cirkel te visualiseren. Gebruik de kleine pincetten om de voorste hersenslagader vast te grijpen aan de basis van de reukkwabben en oefen druk uit om de slagaders los te maken van het vaatcontinuüm. Snijd de middelste hersenslagader op dezelfde manier door.
Gebruik vervolgens de scherpe uiteinden van de pincetten om de middelste hersenslagader vast te grijpen en til het begin van de achterste communicerende slagaders op, waardoor beide set slagaders los worden gekoppeld van de hersenen. Til vervolgens de voorste slagaders op en trek ze voorzichtig over het optische chiasma in anterieure dorsale richting. Verwijder op dezelfde manier de superieure en achterste kleine herseneslagader, gevolgd door het verplaatsen van de basilaire slagader.
Gebruik tenslotte de pincetten om de hele Willis-cirkel voorzichtig over te brengen in een 60 millimeter petrischaal met ijskoud PBS en zet de vaten op hun plaats met kleine spelden, waarbij je met twee pincetten voorzichtig eventueel overgebleven hersenweefsel verwijdert. De Willis-cirkel moet in één stuk komen en licht transparant zijn vanwege de afwezigheid van restbloed in de vaten. De schone Willis-cirkel moet specifiek vasculaire gladde spiercelmarkers tot expressie brengen, zoals Smooth Muscle Actin, Smooth Muscle-Myosin Heavy Chain en Smoothelin.
Neuronale markeren, zoals myeline oligodendrocyte glycoproteïne of microtubulus-geassocieerd eiwit 2, zouden daarentegen nauwelijks detecteerbaar zijn in de Willis-cirkel. Verder is de expressie van de endotheelmarker E-Selectin in niet-Willis-cirkel hersenweefsel zeer vergelijkbaar met die van Willis-cirkelmonsters, wat mogelijk de aanwezigheid van een hersencapillairnetwerk reflecteert. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in twee uur worden voltooid als deze goed wordt uitgevoerd.
Terwijl u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden dat muis-cerebrale vaten erg fijn zijn en gemakkelijk breken. Daarom moet de dissectie heel voorzichtig worden uitgevoerd, zonder haast, om ervoor te zorgen dat de hele structuur in één stuk wordt geoogst. Na de ontwikkeling van deze techniek, baant het de weg voor onderzoekers op het gebied van inflammatoire neurale ziekten om cerebrale vaataandoeningen te onderzoeken in muismodellen van Alzheimer en gerelateerde ziekten zoals cerebrale amyloïde angiopathie.
Nadat u deze video hebt bekeken, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de Willis-cirkel van een muis kunt isoleren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een reproduceerbaar protocol voor het isoleren van de cirkel van Willis bij muizen, wat essentieel is voor het bestuderen van de cerebrovasculatuur. De methode maakt een snelle en eenvoudige isolatie van grote vaten mogelijk zonder hun structuur te veranderen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Cerebrovasculair onderzoek
- Muismodellen
Achtergrond
- De cirkel van Willis is een kritieke structuur in de cerebrale vasculatuur van de muis.
- Inzicht in de cerebrovasculaire genexpressie is essentieel voor het bestuderen van ziekten zoals Alzheimer.
- Het isoleren van grote vaten kan inzichten bieden in de cerebrovasculaire gezondheid.
- Deze techniek verbetert de mogelijkheid om de effecten van diverse ziekten op de cerebrale vaten te bestuderen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het isoleren van de cirkel van Willis bij muizen.
- Het faciliteren van onderzoek naar cerebrovasculaire genexpressie.
- Het verbeteren van het begrip van ziekten die de hersenvaten beïnvloeden.
Gebruikte methoden
- Dissectie van de buikwand en het peritoneum met een irisschaar.
- Incisie in het diafragma om de pleuraholte bloot te leggen.
- Klemmen van het sternum voor toegang tot de cirkel van Willis.
- Behoud van de vaatstructuur tijdens de isolatie.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol maakt een effectieve isolatie van de cirkel van Willis mogelijk.
- Grote bloedvaten kunnen worden bestudeerd zonder structurele wijzigingen.
- Deze methode kan worden toegepast op diverse cerebrovasculaire studies.
- Faciliteert onderzoek naar genexpressie in relatie tot cerebrovasculaire aandoeningen.
Conclusies
- Het beschreven protocol is reproduceerbaar en efficiënt.
- Het biedt een waardevol instrument voor onderzoekers die de cerebrovasculaire gezondheid bestuderen.
- Toekomstige studies kunnen deze methode gebruiken om ziektemanismen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het isoleren van de cirkel van Willis bij muizen maakt directe studie van cerebrovasculaire genexpressie in ziektestudies mogelijk, wat bijdraagt aan de validatie van targets voor neurodegeneratieve en vasculaire aandoeningen. Deze dissectiemethode biedt een reproduceerbare bron van grote vaten voor moleculaire screening, wat de vroege ontdekking van biomarkers en mechanistische inzichten vergemakkelijkt. Door de vasculaire structuur te behouden, wordt het voorspellende vertrouwen bij preklinische risicoreductie van targets voor de ziekte van Alzheimer en cerebrale amyloïde angiopathie verhoogd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar vasculaire gladspier- en endotheelmarkers in ziekterelevante cerebrovasculaire weefsels.
- Operationele waarde: Biedt een consistent biologisch systeem voor het beoordelen van target-engagement en pathway-modulatie.
- Predictieve waarde: Ondersteunt hypothesetoetsing van veranderingen in genexpressie die gekoppeld zijn aan modellen van de ziekte van Alzheimer en cerebrale amyloïde angiopathie.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Maakt kwantitatieve analyse mogelijk van eiwitexpressie, posttranslationele modificaties en secretoomprofielen uit geïsoleerde vaten.
- Operationele waarde: Genereert gestandaardiseerde weefselpreparaten die geschikt zijn voor multiplex-assays en biomarker-screening.
- Assay-gereedheid: Maakt schaalbare preparatie van cerebrovasculaire monsters mogelijk voor high-content screening-workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen de identificatie van vasculaire targets in de ontdekkingsfase en preklinische validatie in muismodellen voor ziekten.
- Mechanische risicoreductie: Verduidelijkt de cerebrovasculaire bijdragen aan neurodegeneratie, waardoor ambiguïteit bij de selectie van targets wordt verminderd.
- Ziekterelevantie: Modelleert direct menselijke cerebrovasculaire pathologieën, waaronder cerebrale amyloïde angiopathie en atherosclerose.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm door geïsoleerd cerebrovasculair weefsel te leveren voor targetvalidatie, assayontwikkeling en mechanistische screening voorafgaand aan de identificatie van lead-verbindingen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothese-gestuurd onderzoek naar cerebrovasculaire genexpressie in ziektemodellen.
- Screening: Levert reproduceerbare vasculaire preparaten voor biomarker- en targetexpressie-profilering.
- Analytica: Maakt kwantitatieve read-outs mogelijk, zoals Western blot, immunofluorescentie en ELISA voor vaat-specifieke targets.
- Translationeel onderzoek: Verbindt moleculaire bevindingen in geïsoleerde vaten met pathofysiologische processen in preklinische modellen.
- Hergebruik op bedrijfsniveau: Vestigt een herbruikbaar dissectieprotocol voor cerebrovasculaire targetvalidatie in meerdere projecten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van targets door directe analyse van ziekterelateerd cerebrovasculair weefsel mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid en standaardisatie bij de isolatie van vaten in verschillende laboratoria en studies.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door biologische onzekerheid bij de selectie van cerebrovasculaire targets te verminderen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering van targets op basis van vasculaire expressie en relevantie van signaalpaden.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in muisdissectie en cerebrovasculaire anatomie onder een microscoop.
- Afhankelijk van perfusieapparatuur, irisscharen, pincetten en koude PBS voor het behoud van de vaten.
- Vereist standaardisatie van de timing en techniek van de dissectie om de structurele integriteit te waarborgen.
- Houd rekening met de biologische variabiliteit in vatgrootte en vertakking tussen verschillende muizenstammen en leeftijden.
- Beperkt tot moleculaire analyse aan het eindpunt; niet geschikt voor real-time functionele assays of live imaging assays.
