Name: Voorbereiding en Toepassingen van organotypische thymus Slice Culturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Leer de voorbereiding van thymus-slices voor immunologisch onderzoek naar T-celontwikkeling. Deze methode behoudt de thymus-architectuur en maakt in situ analyse van thymocytenmigratie en -signalering mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Marilaine Fournier bedanken voor haar opmerkingen over het manuscript en Josée Tessier voor technische assistentie. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1<tmMom> #4175 werden verkregen via het NIAID Exchange Program, NIH. Ondersteuning voor dit onderzoek wordt geboden door een subsidie van de SickKids Foundation en CIHR-IHDCYN (NI15-002), een exploitatiesubsidie van de CIHR-III (MOP-142254), en opstartfondsen van de FRQS (Établissement de jeunes chercheurs) en Hôpital Maisonneuve-Rosemont Foundation aan HJM. HJM is een junior 1-onderzoeker van de FRQS, een CIHR New Investigator (MSH-141967) en een ontvanger van een Cole Foundation Early Career Transition-award.

Protocollen voor alle dierproeven werden goedgekeurd door de Animal Care Comite op het Centre de recherche - Hôpital Maisonneuve-Rosemont. 1. Oogsten Muis Thymus voor de bereiding van de thymus Slices en Single Cell Schorsingen <ol><li> Euthanaseren de muis met CO 2 gevolgd door cervicale dislocatie. </li><li> In een laminaire stroming kap, speld de muis buikzijde tot een dissectie board. Spuit de muis met 70% ethanol. Verwijder overtollig alcohol door deppen met een gaasje om te voorkomen dat ethanol uit het invoeren van de borstholte en schade aan het weefsel. </li><li> Til de huid aan de basis van het borstbeen met een pincet en een snede door de huid. Verleng de snit van de huid naar boven aan elke voorpoot. </li><li> Een aanvullend snede aan de onderkant van het borstbeen met het membraan scheiden van de ribbenkast. Snijd vervolgens elke zijde van de ribbenkast naar het sleutelbeen. Flip de ribbenkast over de richting van het hoofd waardoor de borstholte. De twee lobben vande thymus liggen boven het hart. </li><li> Verwijder het bindweefsel rond de thymus lobben behulp van een tang, micro-dissectie schaar en / of scherp gebogen schaar. Gebruik een paar fijne tip gebogen tang om de individuele lobben tillen van onderaf of via de resterende bindweefsel. Opmerking: Raak de thymus niet direct te begrijpen. </li><li> Plaats de thymus lobben in een 15 ml conische buis met PBS en zet apart op ijs totdat het nodig is. </li></ol> 2. Agarose Embedding en Vibratome snijden van thymus Lobes <ol><li> Bereid 4% agarose-oplossing voor het inbedden door het oplossen van 2 g laag-smeltpunt agarose in 50 ml steriele PBS en de magnetron op een lage stand totdat de agar volledig is opgelost. Bedek kolf met aluminiumfolie en in een waterbad van 55 ° C tot aan gebruik. </li><li> In een weefselkweek kap bereiden compleet RPMI-1640 medium dat 10% foetaal runderserum bevat (FBS), 4 mM L- glutamine, 1 x penicilline / streptomycine, en 10 uM2-mercaptoethanol. </li><li> Voeg 1,5 ml compleet RPMI-1640 media per goed op een 6-well celkweek plaat en plaats een celkweek insert in elk putje. Stel de plaat opzij in een incubator bij 37 ° C totdat het nodig is. </li><li> Bereid een slushy ijswater bad met water en ijs in een ijsemmer. </li><li> Verwijder voorzichtig alle resterende bindweefsel rond elk thymus kwab met behulp van fijne tip pincet. Doe dit terwijl de thymus kwab is ondergedompeld in PBS in een weefselkweek schotel, na de overdracht op een tissue doekje doordrenkt met PBS, of onder een dissectie microscoop. </li><li> Laat de agarose afkoelen onder 40 ° C, wanneer de kolf net handwarm, zodat oververhitting van het weefsel. Giet de afgekoelde 4% agarose in een weefsel matrijs tot een hoogte van 1 cm ~. </li><li> Gebruik een pincet de thymus kwab zorgvuldig overdragen aan een weefsel wipe en rol voorzichtig te drogen zonder beschadiging van het weefsel. Zorg ervoor dat het weefsel droogt volledig of het zal tijdens het snijden uit de agarose schuift. </li><li> Schuif de nok in de agarose en plaats deze horizontaal (aan oppervlak van elk segment te verhogen) of verticaal (om het aantal segmenten te verhogen) aan de bodem van de vorm. Plaats de vorm in ijswater gedurende 5-10 minuten om de agarose te stollen. </li><li> Gedurende deze tijd, bereidt de vibratome voor het snijden door het monteren van de bufferbak, assembleren de objectplaatje en plaatsen van de vibratome mes. Leg een stuk tape laboratorium op het monster disc. Steriliseer de schone, geassembleerd werkruimte met 70% ethanol. </li><li> Zodra de agarose stolt, draai de mal en druk voorzichtig in het midden van de agarose ingebedde kwab vrij te geven. </li><li> Gebruik een scherp mes om het overtollige agarose rondom de lob verlaten ~ 2 mm van agarose aan weerszijden en trim ~ 0,5 cm aan de onderzijde. </li><li> Beveiligde elk agarose blok met een druppel weefsellijm het stuk tape op het objectplaatje. Meerdere blokken worden gelijmd op de band. </li><li> Lijn de vibratome mes with bovenkant agarose blok. Vul het buffer lade met steriel PBS tot het mes en agarose blok (s) volledig worden ondergedompeld. </li><li> Gedeelte agarose ingebed weefsel plakjes te verkrijgen met een dikte van 400-500 urn. Zet de vibratome tot 0,225 mm / sec snelheid, 100 Hz, en 5 °. </li><li> Gebruik een gebogen spatel om de thymus plakjes verzamelen in een weefselkweek plaat met steriel PBS als ze zijn gesneden. Gooi de eerste en de laatste slice. </li><li> Onderzoek de plakken onder een lichtmicroscoop op 4x vergroting. Kies de plakken met intacte thymus weefsel en de omringende agarose (figuur 1A). </li><li> Breng de plakjes op de plaat in stap 2.3 bereid door met een pipet tip om schuif de thymus slice uit de gebogen spatel op de celkweek insert. Elke insert is geschikt voor ~ 3 plakjes. Controleer de segmenten elkaar niet of celkweek insert wanden raken. </li><li> Handhaving van de plaat bij 37 ° C totdat het nodig is. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Voorbereiding van de Thymocyten voor overlay <ol><li> Isoleer thymus lobben zoals in hoofdstuk 1. Distantiëren de lobben handmatig een enkele celsuspensie met een gesteriliseerde 15 ml weefselmaler gevuld met 5 ml steriel PBS dat 2% FBS maken. Overdracht van de cellen om een ​​15 ml conische buis. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 545 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml van 1x ACK lysis buffer (0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2 EDTA) bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten om rode bloedcellen te lyseren. </li><li> De buis wordt tot 15 ml met PBS dat 2% FBS. Centrifugeer de cellen bij 545 g gedurende 5 min bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de cellen in 10 ml PBS dat 2% FBS en cellen passeren door een 255 urn zeef. </li><li> Aantal cellen met een hemocytometer. Centrifugeer de cellen bij 545 g gedurende 5 min bij 4 ° C en resuspendeer de celpellet in PBS met 2% FBS bij een concentratie van 1 x 10 7 cellen per ml. </li><li> Label de cellen met cellulaire kleurstoffen zoals carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) volgens de protocollen van de fabrikant wanneer geen thymocyten van muizen die congenic markers of genetisch gecodeerde fluorescente reporters te onderscheiden van segment endogene cellen. </li><li> Na de laatste wasbeurt van de gelabelde cellen, resuspendeer de cel pellet in volledige RPMI-1640 media bij 1-3 x 10 6 cellen per 15 ul. </li></ol> 4. overlay Thymocyten op de thymus Slices <ol><li> Gebruik een pipet om alle vloeistof rond de thymus schijfjes op de insert te zuigen. Let op: Wees voorzichtig om te voorkomen dat schade aan de agarose. Wanneer de agarose is beschadigd, zal de overlay thymocyten niet hechten aan het oppervlak slice door verlies van oppervlaktespanning. </li><li> Zonder het segment met de pipet tip, overlay 15 ul van thymocyten bereid in hoofdstuk 3 op elke thymus slice. </li><li> Incubeer de plate bij 37 ° C gedurende 2 uur om de cellen te migreren naar de thymus plakjes. </li><li> Na 2 uur, spoel de thymus segmenten 3 maal met 1 ml PBS om overmaat overlay thymocyten die nog niet gemigreerd in het weefsel te verwijderen. </li><li> Incubeer de plaat bij 37 ° C totdat de thymus schijfjes gereed zijn geoogst, kenmerkend 1-72 uur, afhankelijk van het experiment. </li></ol> 5. dissociatie van thymus Slices voor flowcytometrie <ol><li> Bereid een microcentrifugebuis voor elk segment door toevoeging van 150 pl PBS met 2% FBS. </li><li> Voeg 1 ml PBS met 2% FBS aan de weefselkweek insert met de thymus plakjes en roer met een gebogen spatel om de plakken los te maken van het oppervlak van de celkweek insert. </li><li> Breng het segment van het inzetstuk aan de microcentrifugebuis met een gebogen spatel. </li><li> Handmatig verstoren de plak met behulp van een microcentrifugebuis monster stamper. Voeg 150 ul PBS die 2% FBS tot een eindvolume 300pl. </li><li> Filter de gedissocieerde weefsel door een 40 pm filter in een nieuwe microcentrifugebuis. De gefilterde cellen zijn klaar om te worden gekleurd voor flowcytometrische analyse 40. </li><li> Filtercellen nogmaals alvorens ze op een flowcytometer zodat de agarose wordt verwijderd en gaat de stroom cytometer niet verstoppen. </li><li> Het verwerven van de cellen op een flowcytometer en analyseren van gegevens zoals eerder beschreven 40. </li></ol>

<ol><li>Carpenter, A. C., Bosselut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decision+checkpoints+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decision checkpoints in the thymus.</a> Nat Immunol. 11, 666-673 (2010).</li>
<li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of T cells.</a> Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).</li>
<li>Vrisekoop, N., Monteiro, J. P., Mandl, J. N., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+thymic+positive+selection+and+the+mature+T+cell+repertoire+for+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Revisiting thymic positive selection and the mature T cell repertoire for antigen.</a> Immunity. 41, 181-190 (2014).</li>
<li>Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+self-reactive+T+cells+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selection of self-reactive T cells in the thymus.</a> Annu Rev Immunol. 30, 95-114 (2012).</li>
<li>Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+thymocyte-stromal+cell+interactions+visualized+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy.</a> Science. 296, 1876-1880 (2002).</li>
<li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journey+through+the+thymus%3A+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).</li>
<li>Halkias, J., Melichar, H. J., Taylor, K. T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+migration+during+human+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Tracking migration during human T cell development.</a> Cell Mol Life Sci. 71, 3101-3117 (2014).</li>
<li>Yin, X., Chtanova, T., Ladi, E., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymocyte+motility%3A+mutants%2C+movies+and+migration+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymocyte motility: mutants, movies and migration patterns.</a> Curr Opin Immunol. 18, 191-197 (2006).</li>
<li>Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+microenvironments+for+T+cell+differentiation+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection.</a> Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).</li>
<li>Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+the+T+cell+repertoire%3A+what+thymocytes+see+%28and+don%27t+see%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see).</a> Nat Rev Immunol. 14, 377-391 (2014).</li>
<li>Ross, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+phases+in+the+positive+selection+of+CD8%2B+T+cells+distinguished+by+intrathymic+migration+and+T-cell+receptor+signaling+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinct phases in the positive selection of CD8+ T cells distinguished by intrathymic migration and T-cell receptor signaling patterns.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E2550-E2558 (2014).</li>
<li>Hu, Z., Lancaster, J. N., Sasiponganan, C., Ehrlich, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR4+promotes+medullary+entry+and+thymocyte-dendritic+cell+interactions+required+for+central+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CCR4 promotes medullary entry and thymocyte-dendritic cell interactions required for central tolerance.</a> J Exp Med. 212, 1947-1965 (2015).</li>
<li>Anderson, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+an+immunological+self+shadow+within+the+thymus+by+the+aire+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein.</a> Science. 298, 1395-1401 (2002).</li>
<li>Takaba, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fezf2+Orchestrates+a+Thymic+Program+of+Self-Antigen+Expression+for+Immune+Tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance.</a> Cell. 163, 975-987 (2015).</li>
<li>McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+deletion+of+thymocytes+can+occur+in+the+cortex+with+no+involvement+of+the+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla.</a> J Exp Med. 205, 2575-2584 (2008).</li>
<li>Stritesky, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+thymic+selection+quantified+using+a+unique+method+to+capture+deleted+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Murine thymic selection quantified using a unique method to capture deleted T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4679-4684 (2013).</li>
<li>Anderson, G., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+article%3A+thymus+organ+cultures+and+T-cell+receptor+repertoire+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Review article: thymus organ cultures and T-cell receptor repertoire development.</a> Immunology. 100, 405-410 (2000).</li>
<li>Hare, K. J., Jenkinson, E. J., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vitro models of T cell development.</a> Semin Immunol. 11, 3-12 (1999).</li>
<li>de Pooter, R., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+potential+and+development+in+vitro%3A+the+OP9-DL1+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">T-cell potential and development in vitro: the OP9-DL1 approach.</a> Curr Opin Immunol. 19, 163-168 (2007).</li>
<li>Lian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathymically+injected+hemopoietic+stem+cells+can+differentiate+into+all+lineage+cells+in+the+thymus%3A+differences+between+c-kit%2B+cells+and+c-kit+%3C+low+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Intrathymically injected hemopoietic stem cells can differentiate into all lineage cells in the thymus: differences between c-kit+ cells and c-kit < low cells.</a> Stem Cells. 15, 430-436 (1997).</li>
<li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathymic+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Intrathymic Injection.</a> Methods Mol Biol. 1323, 203-209 (2016).</li>
<li>Goldschneider, I., Komschlies, K. L., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+thymocytopoiesis+in+rats+and+mice.+I.+Kinetics+of+appearance+of+thymocytes+using+a+direct+intrathymic+adoptive+transfer+assay+for+thymocyte+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Studies of thymocytopoiesis in rats and mice. I. Kinetics of appearance of thymocytes using a direct intrathymic adoptive transfer assay for thymocyte precursors.</a> J Exp Med. 163, 1-17 (1986).</li>
<li>Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T+cell+development+from+hematopoietic+progenitor+cells+by+delta-like-1+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro.</a> Immunity. 17, 749-756 (2002).</li>
<li>de Pooter, R. F., Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+T+lymphocytes+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 330, 113-121 (2006).</li>
<li>Dervovic, D. D., Ciofani, M., Kianizad, K., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+and+functional+evaluation+of+in+vitro+generated+to+ex+vivo+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparative and functional evaluation of in vitro generated to ex vivo CD8 T cells.</a> J Immunol. 189, 3411-3420 (2012).</li>
<li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaggregate+thymus+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Reaggregate thymus cultures.</a> J Vis Exp. (18), (2008).</li>
<li>Anderson, G., Owen, J. J., Moore, N. C., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+epithelial+cells+provide+unique+signals+for+positive+selection+of+CD4%2BCD8%2B+thymocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Thymic epithelial cells provide unique signals for positive selection of CD4+CD8+ thymocytes in vitro.</a> J Exp Med. 179, 2027-2031 (1994).</li>
<li>Anderson, G., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+thymus+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fetal thymus organ culture.</a> CSH Protoc. , (2007).</li>
<li>Mazda, O., Watanabe, Y., Gyotoku, J., Katsura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+dendritic+cells+and+B+cells+in+the+clonal+deletion+of+Mls-reactive+T+cells+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Requirement of dendritic cells and B cells in the clonal deletion of Mls-reactive T cells in the thymus.</a> J Exp Med. 173, 539-547 (1991).</li>
<li>Ceredig, R., Jenkinson, E. J., MacDonald, H. R., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cytolytic+T+lymphocyte+precursors+in+organ-cultured+mouse+embryonic+thymus+rudiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Development of cytolytic T lymphocyte precursors in organ-cultured mouse embryonic thymus rudiments.</a> J Exp Med. 155, 617-622 (1982).</li>
<li>Fairchild, P. J., Austyn, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+predispose+the+fetal+thymus+to+positive+selection+of+CD4%2BCD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Developmental changes predispose the fetal thymus to positive selection of CD4+CD8 T cells.</a> Immunology. 85, 292-298 (1995).</li>
<li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nat Immunol. 6, 143-151 (2005).</li>
<li>Le Borgne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nat Immunol. 10, 823-830 (2009).</li>
<li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-998 (2009).</li>
<li>Ueda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mst1+regulates+integrin-dependent+thymocyte+trafficking+and+antigen+recognition+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mst1 regulates integrin-dependent thymocyte trafficking and antigen recognition in the thymus.</a> Nat Commun. 3, 1098(2012).</li>
<li>Dzhagalov, I. L., Chen, K. G., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+self-reactive+T+cells+in+the+thymus%3A+a+timeline+for+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Elimination of self-reactive T cells in the thymus: a timeline for negative selection.</a> PLoS Biol. 11, e1001566(2013).</li>
<li>Halkias, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+chemokine+gradients+control+human+thymocyte+migration+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Opposing chemokine gradients control human thymocyte migration in situ.</a> J Clin Invest. 123, 2131-2142 (2013).</li>
<li>Au-Yeung, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+temporal+requirements+revealed+for+Zap70+catalytic+activity+during+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development.</a> Nat Immunol. 15, 687-694 (2014).</li>
<li>Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Hogquist, K. A., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+temporal+patterns+of+T+cell+receptor+signaling+during+positive+versus+negative+selection+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Distinct temporal patterns of T cell receptor signaling during positive versus negative selection in situ.</a> Sci Signal. 6, (2013).</li>
<li>Hu, Q., Nicol, S. A., Suen, A. Y., Baldwin, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+thymic+positive+and+negative+selection+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Examination of thymic positive and negative selection by flow cytometry.</a> J Vis Exp. (68), e4269(2012).</li>
<li>Mombaerts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAG-1-deficient+mice+have+no+mature+B+and+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes.</a> Cell. 68, 869-877 (1992).</li>
<li>Hogquist, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76, 17-27 (1994).</li>
<li>Weist, B. M., Kurd, N., Boussier, J., Chan, S. W., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+regulatory+T+cell+niche+size+is+dictated+by+limiting+IL-2+from+antigen-bearing+dendritic+cells+and+feedback+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic regulatory T cell niche size is dictated by limiting IL-2 from antigen-bearing dendritic cells and feedback competition.</a> Nat Immunol. 16, 635-641 (2015).</li>
<li>Melichar, H. J., Ross, J. O., Taylor, K. T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+interactions+and+sustained+TCR+signaling+characterize+thymocyte-thymocyte+interactions+that+support+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stable interactions and sustained TCR signaling characterize thymocyte-thymocyte interactions that support negative selection.</a> J Immunol. 194, 1057-1061 (2015).</li>
<li>Hadjantonakis, A. K., Macmaster, S., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+and+mice+expressing+different+GFP+variants+for+multiple+non-invasive+reporter+usage+within+a+single+animal%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal.</a> BMC Biotechnol. 2, (2002).</li>
<li>Schaefer, B. C., Schaefer, M. L., Kappler, J. W., Marrack, P., Kedl, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+antigen-dependent+CD8%2B+T-cell%2F+dendritic+cell+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Observation of antigen-dependent CD8+ T-cell/ dendritic cell interactions in vivo.</a> Cell Immunol. 214, 110-122 (2001).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van thymus segmenten en representatieve resultaten efficiënte positieve en negatieve selectie overlay preselectie MHC klasse-I beperkte TCR transgene thymocyten door flowcytometrie. Dit systeem is gebruikt met soortgelijke succes positieve selectie van MHC klasse II beperkte CD4 + T-cellen van voorselectie DP thymocyten 32 ondersteunen, en in aanwezigheid van agonist antigeen negatieve selectie en thymus T reg ontwikkeling 11,12, 36...

T-cellen differentiëren door een reeks van ontwikkelings tussenproducten in de thymus gedurende welke zij verschillende checkpoints dat het genereren van een functioneel, zelfverdraagzaam T cel repertoire 1-3 garanderen tegenkomen. Positieve selectie bevordert de overleving van thymocyten met T-cel receptoren (TCR) kunnen herkennen, met een lage tot matige affiniteit, peptide gepresenteerd door major histocompatibility complexe moleculen (MHC) op corticale thymus epitheelcellen (CTEC) 2,3. Negatieve selectie en regulatoire T (T reg) ontwikkeling cel bijdragen aan de totstandkoming van zelf-tolerantie via het wegnemen of misbruik van thymocyten die sterk reageren op self-peptide gepresenteerd door MHC 2,4. Onrijpe CD4 + CD8 + dubbel positieve (DP) thymocyten expressie TCRs die het selectieproces overgaan differentiëren in rijpe T-cel subpopulaties, waarvan de meeste zijn MHC klasse I-beperkte CD8 + cytotoxischeof MHC klasse II beperkte CD4 + helper enkel positieve (SP) T-cellen, voor het verlaten van de thymus tot effector functies in de secundaire lymfoïde organen 1-3. Wat de complexiteit van T cel ontwikkeling is de dynamische migratie en cellulaire ontmoetingen ontwikkelen thymocyten gehele stromale cel netwerk 5-9. Deze stromale cellen spelen verschillende rollen in thymocyten ontwikkeling en zijn verschillend verdeeld over de thymus corticale en medullaire regio&#39;s waar de positieve en negatieve selectie plaatsvinden 10. Hoewel positieve selectie vindt plaats in de eerste plaats in de cortex, er is een groeiend bewijs dat DP thymocyten migreren naar het merg en blijven TCR signalen voordat ze differentiëren in mature T-cellen suggereert dat het merg extra signalen kunnen verschaffen die nodig zijn voor de voltooiing van positieve selectie en lineage differentiatie 11,12. Verder,ondanks de aanwezigheid van gespecialiseerde medullaire thymus epitheelcellen (MTES) die expressie en huidige weefsel beperkte antigenen vergemakkelijken deletie van autoreactieve thymocyten 13,14, een groot deel van de negatieve selectie plaatsvindt in de cortex in reactie op alomtegenwoordig tot expressie zelf peptide door dendritische cellen 15,16. Zo moet nauwkeurige modellen van T-cel ontwikkeling een zeer georganiseerde thymus micromilieu te voorzien, met intacte corticale en medullaire regio&#39;s, dat de interactie tussen thymocyten en stromale cellen faciliteert en ondersteunt thymocyt migratie deze cellen ondergaan positieve en negatieve selectie. Als aanvulling ex vivo analyse van thymocyten als middel bestuderen positieve en negatieve selectie, een aantal in vitro, in situ en in vivo modellen van T cel ontwikkeling ontwikkeld 17-22. Het is altijd moeilijk recapitulerenpositieve selectie in vitro, maar co-cultuur van stamcelpopulaties of T cel voorlopers met stromale cellen die Notch-ligand, met name OP9-DL1 / 4 cellen, heeft de mogelijkheid om T lineage inzet en beperkte positieve selectie ondersteunen waardoor het een waardevol in vitro model studie T cel ontwikkeling 23-25. Beperkingen van dit systeem omvatten echter het feit dat deze cellen het unieke peptide machines gevonden in thymus stromale cellen en de driedimensionale thymus micromilieu. Hoewel technisch omslachtig, in situ en in vivo modellen van thymus selectie enkele obstakels met betrekking tot in vitro systemen te overwinnen. Reaggregate thymus orgel culturen (RTOC) bevatten gedefinieerde mengsels van thymocyten en thymus stromale cellen 18,26,27. Deze thymus epitheelcellen reaggregates behouden MHC klasse I en II expressie en kan Developme ondersteunennt van zowel conventionele T-cel subsets, maar nog steeds niet gedefinieerd corticale en medullaire structuren. Foetale thymus orgaankweek (FTOC) is een populair model T cel ontwikkeling die met thymocyten via hangende-druppel cultuur lymphodepleted thymus lobben of via injectie van thymocyten kan worden gezaaid in lymphoreplete thymus lobben en ondersteunen efficiënte ontwikkeling van CD4 + en CD8 + T cellen na verloop van tijd in cultuur 18,28-31. Aan het begin van de cultuur van de foetale thymus lobben is er een gebrek aan mTECs, maar gedefinieerd corticale en medullaire structuren kunnen ontwikkelen in de tijd afhankelijk van de omstandigheden. Een belangrijke overweging is dat dit model voorkeur kan ondersteunen foetale versus volwassen T cel ontwikkeling. Tenslotte intrathymic injectie van gedefinieerde thymus voorlopers in volwassen muizen is technisch uitdagend, maar geeft duidelijk een omgeving te steunen T cel ontwikkeling in vivo. Deze in situ en in vivo modellen zijn uitstekende hulpmiddelen to studie T cel ontwikkeling en het gebruik ervan moet worden beschouwd als een experiment-by-experiment basis. Thymus segmenten hebben echter onlangs ontwikkeld tot een veelzijdige complementair model thymus de selectie in situ met de mogelijkheid om unieke, complexe en algemeen hogere throughput experimenten tegemoet. Thymus plakjes handhaven van de integriteit van de corticale en medullaire regio&#39;s en bieden een kader van stromale cellen die thymocyten migratie ondersteunt tijdens de ontwikkeling en efficiënte positieve en negatieve selectie 11,32-39. Thymocyt subsets toegevoegd boven op de thymus plakjes migreren in het weefsel en hun geschikte micro-omgeving niche 34,37. De overlay thymocyten kan worden onderscheiden van de thymus segment endogene cellen via congenic merkers of fluorescente labels en kunnen in kweek gedurende enkele dagen worden gehandhaafd. Thymus slice organotypische kweken kan worden gebruikt om verschillende aspecten bestuderenT cel ontwikkeling zoals thymus keuze, thymocyten gedrag (migratie en cellulaire interacties) en thymocyten lokalisatie, onder anderen. De mogelijkheid krijgen om ~ 20 thymus segmenten per muis genereren, de schaalbaarheid van experimenten in het algemeen groter dan andere in situ modellen van thymus selectie. Hoewel de bereiding van thymus segmenten vereist gespecialiseerde apparatuur, zoals de vibratome en de levensduur van thymus segmenten in cultuur beperkt blijven door celverlies tijd via celdood en het ontbreken van een inkapselend membraan, thymus segmenten vormen een uitstekend model voor de analyse van thymus selectie van gesynchroniseerde populaties van thymocyten binnen een volwassen thymus micromilieu. Hier beschrijven we de voorbereiding van de thymus plakjes (met inbegrip van het oogsten van de thymus, agarose inbedding van thymus lobben en vibratome snijden van het ingebedde weefsel), isolatie en overdeksel thymocyten en dissociatie van thymus plakken voor flowcytometrische analyse.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000S&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NuSieve GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50080</td><td>Low melting temperature agarose</td></tr><tr><td>Embedding Mold (Truncated - T12)</td><td>Polyciences</td><td>18986</td><td>22 mm x 22 mm vierkant, ingekort tot 12 mm x 12 mm</td></tr><tr><td>Double Edge Prep Blades</td><td>Personna</td><td>74-0002</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Adhesive</td><td>3M&nbsp;</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>0.4 &micro;m Cell Culture Inserts&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353090</td><td>Van verschillende geteste merken, deze hielden de cellen het beste bovenop de plakjes</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline</td><td>ThermoFisher</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 met L-glutamine</td><td>Wisent</td><td>350-000-CL</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Wisent</td><td>080-110</td><td>Heat inactivated</td></tr><tr><td>L-Glutamine, 200 mM</td><td>Wisent</td><td>609-065-EL</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine, 100x</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15890</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tenbroeck Tissue Grinders</td><td>Wheaton</td><td>357426</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Mesh Filter</td><td>Component Supply</td><td>U-CMN-255</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tube Sample Pestle</td><td>Bel-Art</td><td>F19922-0000</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro;m Nylon Cell Strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Forceps Inox Tip</td><td>Dumont&nbsp;</td><td>RS-5047</td><td>Fijne punt gebogen pincet, maat.17 x.10 mm</td></tr><tr><td>Micro Forceps</td><td>Dumont&nbsp;</td><td>RS-5090&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding en toepassingen van organotypische thymus slice culturen

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Thymus selectie verloopt in een unieke en zeer georganiseerde thymus micromilieu resulteert in de vorming van een functioneel, zelfverdraagzaam T cel repertoire. In vitro modellen voor T lineage betrokkenheid en ontwikkeling te bestuderen hebben waardevolle inzichten in dit proces. Maar deze systemen niet de volledige driedimensionale thymus milieu noodzakelijk voor T cel ontwikkeling en derhalve onvolledig benaderingen van in vivo thymus selectie. Enkele problemen met betrekking tot modellering T cel ontwikkeling kan worden overwonnen door in situ modellen die een intact micro thymus die volledig achter de thymus ontwikkelen winkelwagentje T cellen. Thymus slice organotypische culturen aanvulling op bestaande in-situ technieken. Thymus segmenten de integriteit van de thymus corticale en medullaire gebieden en een platform voor de ontwikkeling van overlay thymocyten van een bepaald ontwikkelingsstadium of endogene Tc bestuderenells binnen een volwassen thymus micromilieu. Gezien de mogelijkheid om ~ 20 sneetjes per muis genereren, thymus plakjes presenteren een uniek voordeel in termen van schaalbaarheid voor high throughput experimenten. Verder is de relatieve gemak bij het genereren thymus plakjes en potentieel verschillende subsets thymus en andere celpopulaties overlappen van verschillende genetische achtergronden vergroot de veelzijdigheid van deze methode. Hier beschrijven we een protocol voor de voorbereiding van de thymus plakjes, isolatie en bekleding van thymocyten en dissociatie van thymus plakken voor flowcytometrische analyse. Dit systeem kan ook worden aangepast om onconventionele T cel ontwikkeling te bestuderen en thymocyten migratie thymocyt-stromale cel interacties en TCR signalen geassocieerd met thymus selectie door twee-foton microscopie te visualiseren.

Thymus plakjes ondersteuning analyse van de verschillende aspecten van de T-cel ontwikkeling, zoals positieve en negatieve selectie. Voor een succesvolle experimenten, de kwaliteit van de thymus slice staat voorop. Daarom moet thymus plakjes worden onderzocht om de integriteit van de thymusweefsel waarborgen en dat de agarose rond de thymus slice intact (Figuur 1A). Oppervlaktespanning kan worden aangetast wanneer de agarose beschadiging veroorzaakt ee...

We beschrijven de bereiding van thymus segmenten die in combinatie met flowcytometrie, kan worden gebruikt om positieve en negatieve selectie van T-cellen ontwikkelen modelleren. Thymus segmenten kunnen ook worden aangepast voor de in situ analyse van thymocyten migratie, lokalisatie en signalering via immunofluorescentie en twee-foton microscopie.

Voorbereiding en Toepassingen van organotypische thymus Slice Culturen

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren van thymussnijden die, in combinatie met flowcytometrie, kunnen worden gebruikt om de positieve en negatieve selectie van emitterende T-cellen te modelleren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de ontwikkeling van T-cellen, zoals welke signalen de positieve en negatieve selectie van emitterende T-cellen in situ reguleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat thymussnijden de integriteit van de thymuscortex en medulla behouden, en een platform bieden om de ontwikkeling van gedefinieerde subsets van thymocyten binnen een intacte thymische micro-omgeving te bestuderen.Begin met het vastpinnen van een geëuthanaseerde muis op een dissectieplank met de ventrale zijde naar boven. Bespuit de muis met 70% ethanol en dep het overtollige ethanol vervolgens weg met gaas om te voorkomen dat het de borstholte binnendringt en het weefsel beschadigt. Til daarna de huid aan de basis van het sternum op met een pincet en maak een incisie door de huid.Verleng de incisie in de huid naar boven tot aan elke voorpoot. Maak een extra incisie aan de basis van het sternum om het diafragma van de borstkas te sch

preparation-and-applications-of-organotypic-thymic-slice-cultures

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze video toont de dissectie en verwijdering van de foetale thymus en de voorbereiding van de ex vivo kweken van 2-dGuo behandeld thymus.

Bereiding van 2-dGuo behandelde Thymus Organ culturen

We beschrijven een methode om organotypische hippocampale slices die gemakkelijk kan worden aangepast aan andere hersengebieden te bereiden. Brain plakjes worden gelegd op poreuze membranen en cultuur media is toegestaan ​​om een ​​interface te vormen. Deze methode behoudt de bruto-architectuur van de hippocampus voor maximaal 2 weken in cultuur.

Organotypische hippocampus Slice culturen

Een methode om organotypische segmenten van de E12.5 muriene embryonale middenhersenen genereren is beschreven. De organotypische slice culturen kan worden gebruikt om het gedrag van dopaminerge neuronen of andere ventrale middenhersenen neuronen te observeren.

Organotypische Slice culturen van embryonale ventrale middenhersenen: Een systeem om Dopaminerge Neuronale Development Study In vitro</em

Een techniek om NG2-cellen en oligodendrocyten te bestuderen met behulp van een slice-kweeksysteem van de voorhersenen en het cerebellum wordt beschreven. Deze methode maakt onderzoek van de dynamica van proliferatie en differentiatie van cellen binnen de oligodendrocytlijn mogelijk, waarbij de extracellulaire omgeving gemakkelijk kan worden gemanipuleerd terwijl de weefselcytoarchitectuur behouden blijft.

Organotypische Slice culturen om te studeren Oligodendrocyte Dynamics en Myelination

Hier beschrijven we een techniek voor het bestuderen van de hippocampus postnatale neurogenese met de organotypische slice cultuur techniek. Deze werkwijze maakt in vitro manipulatie van volwassen neurogenese en maakt de directe toepassing van farmacologische middelen aan de gekweekte hippocampus.

Organotypische Slice Culturen voor Studies van Postnatale Neurogenese

Het bestuderen van medullaire thymische epitheelcellen in vitro is grotendeels onsuccesvol geweest, omdat huidige 2D-kweeksystemen het in vivo scenario niet nabootsen. Het 3D-kweeksysteem dat hierin wordt beschreven - een gemodificeerd organotypisch model voor huidcultuur - heeft zich superieur getoond in het nadoen van mTEC-proliferatie, differentiatie en het behoud van promiscue genregulatie.

3D Organotypische Co-cultuur Model Supporting Medullary Thymic epitheelcelproliferatie, Differentiatie en Promiscuous Gene Expression

Dit protocol beschrijft een methode voor gelijktijdige beeldvorming van thalamocortical axon vertakking en de synapse formatie in organotypic cocultures van de thalamus en cortex cerebri. Individuele thalamocortical axonen en hun presynaptische terminals worden gevisualiseerd door een eencellige electroporation techniek met DsRed en synaptophysin van GFP-gelabeld.

Visualisatie van Thalamocortical Axon vertakking en de Synapse formatie in Organotypic Cocultures

Wij bieden een methode voor de generatie, de teelt en de systematische analyse van organotypic plakjes afgeleid van lymfkliertest Long tumoren. Ook beschrijven we hoe u kunt optimaliseren voor segment dikte en drug concentraties te behandelen tumor segmenten te selecteren.

Vaststelling en analyse van Tumor segment Explants als een voorwaarde voor het kenmerkende testen

Dit artikel beschrijft een nieuwe methode voor het genereren van tumor antigeen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige Thymus emigants (iTE) door een driedimensionaal (3D) Thymus cultuur systeem. iET zijn een homogene deelverzameling van T-cellen die nauw verwant zijn aan naïeve T-cellen met de capaciteit voor proliferatie, Geheugenvorming en tumor onderdrukking.

Een driedimensionaal Thymic cultuur systeem voor het genereren van Murine geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige tumor antigen-specifieke Thymic emigranten

Hier presenteren we een methode ter voorbereiding organotypic segment culturen van muis cerebellum en myelineschede kleuring door immunohistochemistry geschikt voor onderzoek naar mechanismen van myelinisering en remyelination in het centrale zenuwstelsel.

Voorbereiding en immunokleuring van Myelinating Organotypic cerebellaire segment culturen

Dit protocol beschrijft de bereiding van organotypische plakculturen (OTSC's). Deze techniek vergemakkelijkt de ex vivo kweek van intact meercellig weefsel. OTSC's kunnen onmiddellijk worden gebruikt om te testen op hun respectieve respons op geneesmiddelen in een meercellige omgeving.

Organotypische plakculturen als preklinische modellen van tumormicro-omgeving bij primaire alvleesklierkanker en metastase

Leer de voorbereiding van thymus-slices voor immunologisch onderzoek naar T-celontwikkeling. Deze methode behoudt de thymus-architectuur en maakt in situ analyse van thymocytenmigratie en -signalering mogelijk.

Voorbereiding en Toepassingen van organotypische thymus Slice Culturen

Meer video's verkennen