Name: Ontwikkeling van een Insert Co-cultuur systeem van twee mobiele soorten in de afwezigheid van cel-cel Contact (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Leer een insert co-cultuur methode voor het bestuderen van paracrine signalering tussen twee celtypen zonder direct cel-cel contact. Dit systeem maakt analyse van opgeloste factoren en hun effecten op doelcellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door een Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Canada-subsidie aan MGM. JR is een NSERC-Vanier studentfellow.

NB: Elk van de volgende stappen worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming kap zoals vereist voor zoogdierlijke celkweek. Daarnaast is de algemene richtlijnen voor een optimale steriele cel teelt toe te passen, bv., Weggooien tips elk moment dat ze kunnen leiden tot kruisbesmetting, het verminderen van de hoeveelheid tijd die cellen worden blootgesteld aan de lucht bij het ​​uitvoeren van complete media verandert, behoren maar voorzichtig al roerend celsuspensies om hun homogene pipetteren, etc. zorgen voor Bovendien, inserts zijn een soort plasticware die een speciale behandeling nodig hebben. Ten eerste, wanneer inserts worden gemanipuleerd, vermijd contact met de kwetsbare membraan, die gemakkelijk scheuren en kon daarom het experiment in gevaar brengen. Ook is het niet geschikt vacuümaspiratie van het celkweekmedium te voeren, aangezien het risico van het membraan perforeren of dissociëren hechtende cellen. Vervolgens inserts hangen los in de multiwell weefselkweekplaat en derhalve is voorzichtigheid geboden wanneer moVing de plasticware of wanneer pipetteren om te voorkomen dat dissociatie hechtende cellen. Bovendien, bij gebruik wisselplaten met grote poriën, is er een mogelijkheid dat het celkweekmedium sijpelt door het membraan en derhalve is het belangrijk om regelmatig te controleren het vloeistofniveau. Merk tenslotte op dat het volgende protocol is ontworpen voor hechtende cellen en vereist kleine wijzigingen om geschikt voor suspensie cellen. 1. Algemene richtlijnen voor het uitvoeren van insert co-cultuur experimenten <ol><li> Seeding celtype # 1 in inserts <ol><li> Haal de inzetstukken uit de verpakking. </li><li> Plaats de inzetstukken in een lege multi- weefselkweek plaat van de juiste dimensie. Om dit te doen, greep de bovenste rand van het inzetstuk met een pincet. </li><li> Om de hechting te verbeteren en verspreiden van hechtende cellen, de conditie van de inzetstukken met celkweekmedium voorafgaand aan het zaaien. Hiervoor bedekken het gehele oppervlak van het membraan met celkweek mediuben met behulp van een micropipet. LET OP: Doe dit voor zo veel inserts als nodig is. </li><li> Plaats de deksel op de plaat en incubeer gedurende ten minste 1 uur of O / N onder dezelfde omstandigheden (gewoonlijk 37 ° C, 5-10% CO 2). </li><li> Wanneer de inserts worden geconditioneerd, verwijder alle van de celkweek medium met behulp van een micropipet. Gooi het gebruikte medium. </li><li> Zaad celtype # 1 in vers celcultuurmedium op dezelfde wijze als in een plaat met meerdere putjes. Om dit te doen, trek een geschikt volume van de celsuspensie met een micropipet en afzien van de vloeistof in de insert. OPMERKING: Bereid zoveel inserts als nodig is. </li><li> Na zaaien alle inserts, schud de plaat naar links en rechts en heen en weer om de cellen gelijkmatig te verdelen. Vermijd cirkelvormige bewegingen, aangezien hierdoor de cellen te accumuleren in het midden van de inzetstukken. </li><li> Plaats de deksel op de plaat en incubeer zoals door volgens cellulaire eisen (meestal 37 ° C, 5-10% CO <sub&gt; 2). </li></ol></li><li> Seeding celtype # 2 in meerdere putjes weefselkweekplaten <ol><li> Seed celtype # 2 in vers celcultuurmedium volgens punt 1. </li><li> Bereid zoveel putten als nodig is voor het aantal inserties. Schommel de plaat als in stap 1.1.7), zodat de cellen gelijkmatig verdeeld in de putjes. </li><li> Plaats de deksel op de plaat en incubeer onder dezelfde omstandigheden (gewoonlijk 37 ° C, 5-10% CO 2). </li></ol></li><li> Verfrissende medium in inserts <ol><li> Met behulp van een micropipet verwijderd geheel of gedeeltelijk het celkweekmedium in de inzetstukken met celtype # 1. Gooi het gebruikte medium. </li><li> Teken een geschikt volume van verse celkweekmedium. Prettig zitten de punt op de binnenwand van het inzetstuk en langzaam bereid het celkweekmedium. </li><li> Plaats de deksel op de plaat en incubeer volgens stap 1.1.4. </li></ol></li><li> Verfrissende medium in meerdere putjes weefselkweekplaten <ol><li> Met een micropiPette, verwijdert een deel of alles van het celkweekmedium in de putjes die celtype # 2. Gooi het gebruikte medium. </li><li> Teken een geschikt volume van verse celkweekmedium. Rust de punt op de binnenwand van de put en langzaam bereid het celkweekmedium. </li><li> Plaats de deksel op de plaat en incubeer volgens vooraf vastgestelde celkweek protocollen. </li></ol></li><li> Overbrengen inserts met celtype # 1 tot multiwell weefselkweek platen met celtype # 2. OPMERKING: Voer deze stap als beide celtypen de juiste groeifase hebben bereikt. <ol><li> Voorafgaand aan de overdracht van de inserts in putten, alle noodzakelijke mediumveranderingen, zoals eerder in stap 1,3) en 1,4 beschreven). OPMERKING: Op dit punt is het belangrijk om de juiste hoeveelheden media afgeven in beide compartimenten zoals vermeld in de instructies van de fabrikant invoegen. </li><li> Met behulp van een pincet, pak de bovenste rand van een insert met mobiele tYpe # 1 en voorzichtig plaats deze in de juiste putje met celtype # 2. </li><li> Na de overdracht van alle inserts, controleren op de aanwezigheid van luchtbellen onder het membraan van inserts. LET OP: Luchtbellen voorkomen elke uitwisseling over het membraan van het inzetstuk en kan het gehele experiment in gevaar brengen. </li><li> Als er luchtbellen aanwezig zijn, heel voorzichtig til de insert uit de put met een pincet en duik terug in de cel kweekmedium. De bellen verdwijnen. Als ze zijn nog steeds aanwezig, probeer voorzichtig dompelen inserts terug in de cel kweekmedium in een hoek. LET OP: Wees niet kloppen of roer inserts om te voorkomen dat dissociatie hechtende cellen. </li><li> Na het verwijderen van alle luchtbellen en controleren of de volumes van de media in beide compartimenten, leg het deksel op de plaat en incubeer. </li></ol></li><li> Verfrissende media in een co-kweeksysteem LET OP: Hoewel het membraan gemakkelijk maakt media uitwisselingen tussen insert en goed, het verversen van het medium is gedaan inbeide compartimenten sinds de tijd nodig om evenwicht in de bovenste en onderste compartimenten alleen bereikt door diffusie vrij lang. <ol><li> Verfrissende medium in inserts met celtype # 1 geschiedt op dezelfde wijze als in stap 1,3). </li><li> Tot middelgroot putjes die celtype # 2 vernieuwen, schuif de insert naar de zijkant om een ​​ruimte breed genoeg om een ​​pipet tip tegemoet te creëren. Vernieuw de medium zoals in stap 1.4). </li><li> Controleer op de aanwezigheid van luchtbellen en controleer de volumes als per stappen 1.5.3) tot en met 1.5.5). </li></ol></li></ol> 2. Voorbeeld: het meten van de effecten van cytokinen uitgescheiden door LPS-geactiveerde microglia N9 op neuronale PC12 cellen OPMERKING: De volgende stappen zijn bedoeld voor specifieke fles, goed en gerecht maten. Toch kan het protocol worden aangepast voor elke plasticware dimensies. Voor media en samenstelling zie Tabel Materials. <ol><li> Zaaien en differentiërende PC12 cellen in multiputjes weefselkweekplaten <ol><li> Warm routine PC12 celkweekmedium, PC12 differentiatie medium en trypsine-EDTA in een 37 ° C waterbad. </li><li> Gebruik PC12 cellen bij 60-80% confluentie van een 75 cm2 kolf. </li><li> Met een 15 mm Pasteur pipet, voert vacuümaspiratie van de gehele cel kweekmedium in de kolf. </li><li> Voorzichtig spoelen cel monolaag met 5 ml steriel fosfaatgebufferde zoutoplossing en verwijder de vloeistof met een Pasteur pipet. Zorg dat er geen cellen distantiëren bij deze stap. </li><li> Bedek de cel monolaag met 3 ml trypsine-EDTA en incubeer gedurende 2-3 minuten bij 37 ° C. </li><li> Zorg ervoor dat alle cellen worden losgemaakt onder een microscoop. Als zeer weinig cellen zweven, incubeer gedurende een langere periode van maximaal 5 minuten. </li><li> Voeg 10 ml routine PC12 celkweekmedium om de trypsine-EDTA inactiveren. </li><li> Met een 10 ml pipet voorzichtig vermaal terwijl ervoor te zorgen dat de meeste cellen worden losgemaakt van de bodem of de kolf. Voorkomen dat luchtbellen in de celsuspensie. </li><li> Met dezelfde 10 ml pipet de celsuspensie in een 50 ml centrifugebuis. </li><li> Centrifugeer 1 min bij 3200 xg </li><li> Verwijder het supernatant met een pasteurpipet en dat daarbij de pellet te verstoren. </li><li> Voeg 10 ml van routine PC12 celkweekmedium met een 10 ml pipet. LET OP: Dit volume kan worden aangepast als de pellet is ongewoon klein of groot. </li><li> Vermaal met dezelfde 10 ml pipet om de pellet gehomogeniseerd. PC12 cellen vaak samenklonteren, zodat ten minste 20 pipetteren en noodzakelijk downare. LET OP: Terwijl krachtig vermalende nodig is, voorkomen dat luchtbellen in de celsuspensie. </li><li> In een 1,5 ml tube, voor te bereiden een geschikte verdunning van de celsuspensie in trypan blauw. Tel de cellen met een hemocytometer volgens vooraf vastgestelde protocollen 74. </li><li> In een afzonderlijke 50 ml buis, splitsing van de celsuspensiemet PC12 differentiatie medium om een verdunde celsuspensie geschikt te krijgen voor het zaaien van putten van een 24-well plaat (30.000 ¢ / cm 2, 0,6 ml per putje volgens het protocol van de fabrikant). OPMERKING: De 24-well plaat moet vooraf worden bekleed met collageen zoals door vooraf vastgestelde protocollen 75. </li><li> Verdeel 0,6 ml van de celsuspensie per putje met behulp van een micropipet. </li><li> Als alle putten worden uitgezet, rock de plaat als in stap 1.1.7). </li><li> Om de juiste differentiatie van PC12 cellen, incubeer de 24-well platen gedurende 7-9 dagen bij 37 ° C in een 5% CO 2 vochtige atmosfeer in PC12 differentiatiemedium 15,16 voordat co-kweek-experimenten. </li><li> Voeren veranderingen van medium elke andere dag door het verwijderen van de helft van de vloeistof en vervangen door een gelijk volume verse PC12-differentiatie medium. </li></ol></li><li> Zaaien N9 microglia in de inserts en behandelen met LPS <ol><li> Een dag voor het uitvoeren van de co-cultuur experimenten, pre-behandeling PTFE 0,4 urn poriën inzetstukken met routine N9 celkweekmedium om celhechting te optimaliseren volgende stappen 1.1.1) tot 1.1.4) </li><li> Warm routine N9 celcultuurmedium en trypsine-EDTA in een 37 ° C waterbad. </li><li> Ondertussen, weegt ongeveer 10 mg LPS in een 1,5 ml buis voor later gebruik. LET OP: Aangezien LPS is een krachtige pro-inflammatoire endotoxine en vereist bijzondere veiligheidsmaatregelen, bril, handschoenen en een stofmasker wordt sterk aanbevolen. </li><li> Gebruik N9 cellen bij 80-90% confluentie van een 75 cm2 kolf. </li><li> Volg de stappen 2.1.3) tot 2.1.14). Gebruik altijd routine N9 celkweekmedium in plaats van routine PC12 celkweekmedium. Merk ook op dat N9 microglia niet bij elkaar zo veel als PC12-cellen op te knappen klonteren, waardoor minder pipetteren en neer kan nodig bij stap 2.1.13 zijn). </li><li> In een afzonderlijke 50 ml tube, splitsing van de celsuspensie met N9 celkweekmedium te obtain een verdunde celsuspensie geschikt zaaien inserts ontworpen te houden in 24-well platen (60.000 ¢ / cm 2, 0,05 ml per inzetstuk volgens het protocol van de fabrikant, voor membraanoppervlak zie informatie van de producent). Opmerking: Deze inserts worden reeds bekleed met collageen door de fabrikant en zijn geoptimaliseerd voor celadhesie. </li><li> Verdeel 0,05 ml van de celsuspensie per insert met een micropipet. </li><li> Als alle inserts worden uitgezet, rock de plaat als in stap 1.1.7). </li><li> Voer seriële verdunningen van LPS via N9 behandelingsmedium tot 4 ug / ml, 2 ug / ml en 1 ug / ml werkoplossingen verkrijgen. </li><li> Pipetteer 0,05 ml 4 ug / ml werkoplossing in een de set inzetstukken om een ​​eindverdunning van 2 ug / ml werd verkregen. </li><li> Herhaal stap 2.2.10) voor de andere twee werkoplossingen in verschillende sets inserts, waardoor uiteindelijke verdunningen van 1 ug / ml respectievelijk 0,5 ug / ml. </li><li> Incubate de platen die de inzetstukken voor 24 uur bij 37 ° C in een 5% CO 2 vochtige atmosfeer N9 microglia activering met LPS mogelijk voordat de co-kweek-experimenten. </li></ol></li><li> Co-kweken van neuronale PC12 cellen met N9 microglia <ol><li> Bij 7-9 dagen differentiëren PC12 cellen, activeert de N9 microglia na 24 uur van incubatie met LPS door warme N9 behandeling medium en PC12 behandeling medium in een 37 ° C waterbad. </li><li> Voer een totale verandering medium voor N9 microglia zoals in stap 1.3), ter vervanging van het gehele gebruikte medium met 0,1 ml van de N9 behandeling medium. Doe dit voor elke insert.This is noodzakelijk om alle sporen van LPS te verwijderen, waardoor alleen geactiveerd N9 microglia in de inzetstukken. </li><li> Voer een totaal mediumverversing voor neuronale PC12 cellen als in stap 1,4). Breng de inserts in de 24-well platen als in stap 1,5) .Incubate de N9-PC12 co-kweken gedurende 24 uur of 48 uur bij 37 ° C in een 5% CO 2 vochtige atmosfeer. </li><li> na 24uur of 48 uur, verzamel de supernatant en / of cellen voor cytotoxiciteit, enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA), Western blot of andere assays. </li></ol></li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De meest kritische stap van een insert co-kweeksysteem experiment eigenlijk woont in het kiezen van de juiste insert te gebruiken. Poriegrootte en membraanmateriaal moet rekening gehouden worden grondig, zonder te vergeten het type cellen die worden gezaaid en het doel van het experiment onderzocht. Bijvoorbeeld kan chemotaxische assays hetzelfde type membraan gebruikt dan cel co-culturen celgedrag modulaties geïnduceerd door oplosbare factoren uitgescheiden bij afwezigheid van cel-cel contact te analyseren. Echter, bei...

Het onderzoek van weefsels, organen of systemen in vitro is een poging om de complexe relaties die bestaan ​​tussen de verschillende cellulaire subtypen die meercellige organismen omvatten vereenvoudigen. Inderdaad, in vitro studies maken het mogelijk een gedetailleerd inzicht cel populaties te verkrijgen. Er zijn twee belangrijke voordelen van het uitvoeren van in vitro experimenten: 1) verminderde cellulaire interacties, en 2) het vermogen om eenvoudig te manipuleren cellulaire omgeving. Vandaar dat deze twee voordelen toegestaan ​​wetenschappers om het gedrag van specifieke celtypen in vivo te voorspellen, waardoor het vermogen om resultaten van extrinsieke invloeden gehele organismen te reguleren. In die zin, in vitro celkweek werkt vaak als een brug tussen fundamenteel en toegepast life sciences. Toch zijn er ook een aantal nadelen van het werken in vitro, het belangrijkste is dat een bepaalde reservering kan wonen in de fysiologischeal relevantie van de waargenomen fenotypes. Inderdaad, als een enkel type cel wordt gekweekt in een vat, de cultuur verliest, een verschillende mate, de cel-cel verbindingen met andere celtypen, zijn bijdrage aan de humorale milieu uit het weefsel en het organisme van herkomst, en de ankers binnen het weefsel dat het nodig om een ​​bepaalde driedimensionale structuur soms cruciaal voor celfunctie te handhaven. De kwestie van cel-cel verhoudingen is aangepakt door de ontwikkeling van gemengde kweektechnieken. In deze werkwijze worden twee of meer celpopulaties vergroeid in dezelfde kweekvat. Echter, deze gemengde culturen dragen belangrijk ongemakken. Aan de ene kant, sommige cel subtypes niet fysiek met elkaar in het weefsel van herkomst en alleen vertrouwen op paracriene communicatie ondersteund door afgescheiden oplosbare factoren en de nabijgelegen receptoren. Dit geldt voor verschillende inflammatoire processen die afhankelijk proximale cytokine signaling. In gemengde cultures, fysische interacties onvermijdelijk en het onmogelijk maken om paracriene communicatie in de afwezigheid van cel-cel contacten die veranderde resultaten kan opleveren bestuderen. Anderzijds, bereiken celspecifieke interpretaties binnen een gemengde populatie wordt haalbaar zonder het gebruik van agressieve scheidingstechnieken die significante resultaten kunnen beïnvloeden. Om deze belangrijke kwesties op te lossen is het gebruik van geconditioneerde media ontwikkeld als een techniek waardoor gecompartimenteerd culturen en de studie van paracrienen. Deze methode vereist de overdracht van het supernatant van een celtype, waardoor een genoemde geconditioneerd medium aan putjes met een celpopulatie. Nog een belangrijk nadeel is dat kortstondige moleculen niet lang genoeg overleven in het geconditioneerde medium worden overgebracht naar de putjes van de tweede populatie cellen. Zelfs langlevende moleculen zal sterk worden verdund na verloop van tijd als gevolg van diffusie. Voorts beide cellijnenpopulaties alleen deelnemen aan één richting paracriene communicatie in plaats van in actieve bi-directionele communicatie. Dit leidt tot het ontbreken van feedback signalering die essentieel herscheppen nauwkeurig meercellige verhoudingen zoals deze in vivo. Bijgevolg en gedreven door de behoefte aan een betere simulatie van de oorspronkelijke in vivo omstandigheden in de in vitro cellulaire omgeving zijn verschillende ontwikkelingen in celkweek technieken resultaten van het jaar. Eén van de belangrijkste verbeteringen is het gebruik van doorlaatbare dragers met microporeuze membranen voor compartimentering celculturen voor het eerst Grobstein is in 1953 1. Dergelijke doorlaatbare dragers zijn afgestemd op de jaren vele celtypen te vangen en te gebruiken in verschillende toepassingen. Tegenwoordig zijn deze dragers bestaan ​​als holle inzetstukken die zijn ontworpen in putten uit te rusten van een multiwell weefselkweek plaat of in circuLAR gerechten. In een co-kweeksysteem, het inzetstuk bevat één celtype dat de put of schaal bevat andere celpopulatie, waardoor de bijdrage van twee verschillende populaties van cellen te bestuderen hun humorale milieu (figuur 1). Hierdoor wordt cellulaire polariteit (basolaterale vs apicale uitscheiding of signaalontvangst) bewaard, en daarmee in insert co-kweeksystemen een belangrijk voordeel ten opzichte van gemengde kweken en geconditioneerd medium technieken. Verschillende soorten membraanmaterialen zijn, de meest voorkomende zijn polyester (PET), polycarbonaat (PC) of met collageen beklede polytetrafluorethyleen (PTFE), en deze in verscheidene poriëngrootte variërend van 0,4 urn tot 12,0 urn. Deze soorten materialen en poriegroottes bieden een spectrum inzetstukken uitoefenen variabele kenmerken aan optische eigenschappen, membraandikte en celhechting die hen praktisch gedifferentieerd naar de volgende te vormen van gebruik niet beperkt tot: -Studieceldifferentiatie, embryonale ontwikkeling, tumor metastase en wondheling door chemotaxische testen door middel doorlaatbare membranen; -Evaluatie drug penetratie door de beoordeling van hun transport door epitheliale of endotheliale monolagen gekweekt op doorlatende steunen, en; -performing cel co-culturen celgedrag modulaties geïnduceerd door oplosbare factoren uitgescheiden bij afwezigheid van cel-cel contact te analyseren. Het doel van dit artikel is het algemene methodologische richtlijnen beschrijven de derde functie hierboven vermeld, dat wil cellulaire veranderingen gemedieerd door oplosbare factoren uitgescheiden bij afwezigheid van cel-cel contact met een insert co-kweeksysteem evalueren vervullen. Er zijn verschillende gebieden van het onderzoek gebruik maken van insert co-cultuur systemen om vragen aan het effect van de afgescheiden oplosbare factoren op populaties van cellen relevant te beantwoorden. Inderdaad, paracrienen die celgedrag moduleert op verschillende niveaus relevant is in alle weefselsen systemen, die insert co-cultuur systemen maakt onmisbaar voor de vooruitgang op deze gebieden te waarborgen. Omgekeerd, het gebruik van inzetstukken die signaaltransductie bevestigen is door direct contact cel-cel en niet van uitgescheiden factoren. Een van de belangrijkste toepassingen van inserts in ontsteking 2-14 studies waarbij het ​​effect van uitgescheiden cytokinen wordt geëvalueerd in verschillende cellulaire spelers van immuniteit. In het bijzonder is de studie van een ontsteking in het centrale zenuwstelsel (CNS) sterk profiteerde van insert co-cultuur studies, die hebben toegestaan ​​om beter te definiëren de verschillende paracriene rollen van neuronen en de microglia in het besturen neuroinflammatie 15-21. Deze systemen werden ontwikkeld om de anti-inflammatoire potentieel van moleculen die is gebaseerd op hun vermogen te verminderen of remmen de secretie van pro-inflammatoire factoren 22-26 bestuderen. Onderzoek met betrekking tot kanker 27-31, in het bijzonder de mechanismen die ten grondslag liggen aan angiogenese 32-34 en inflammatiop 35-42 in het ontstaan ​​van tumoren, profiteert ook van insert co-cultuur systemen. Bovendien zijn oplosbare factoren zijn van groot belang in de processen die rijden differentiatie en verschillende studies hebben inserts gebruikt om te vragen op dat gebied 43-50 te beantwoorden. In het CZS, aangezien neuraal weefsel heeft een zeer beperkte vernieuwend vermogen, de studie van neurotrophism en neuroprotectie is fundamenteel en is algemeen gewaarborgd door het gebruik van stamcellen in co-kweeksystemen 51-56. Daarnaast worden inserts ook gebruikt in diverse gebieden als nefrologie 57,58, endotheliale interacties en 59-62 angiogenese, apoptose signalering 63-65, ontsteking in obesitas en metabool syndroom 22,23,66-67, binnenoor beschermen haarcellen 68,69, en zelfs in schimmels virulentie 70,71 en parasitologie 72,73. Dit artikel biedt algemene methodologische richtlijnen met het oog op het opzetten van een experiment gezien evalueren cellulaire veranderingen gemedieerd door oplosbare factoren afgescheiden middels een insert co-kweeksysteem. In het bijzonder zullen we onze aandacht richten op zenuwcel co-culturen en hun toepassingen in het bestuderen van neuro-inflammatoire proces. Gezien de zeer grote spectrum van experimenten die inserts mogelijk maken om piloot, het is ondraaglijk om elk aspect van deze celkweek techniek te dekken. Als voorbeeld, een specifiek protocol voor het meten van de effecten van cytokinen uitgescheiden door lipopolysaccharide (LPS) N9 geactiveerde microglia op neuronale PC12 cellen worden gedetailleerd, met een concreet inzicht insert co-kweek methode.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>Sigma</td><td>R8755</td><td>Opwarmen in 37 &deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle&rsquo;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td><td>Sigma</td><td>D6421</td><td>Opwarmen in 37 &deg;C waterbad voor gebruik, moet worden aangevuld met 0,365 gm/L L-glutamine</td></tr><tr><td>Paarden serum</td><td>ATCC</td><td>30-2040</td><td>Opwarmen in 37 &deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>MultiCell</td><td>80350</td><td>Opwarmen in 37 &deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>Nerve Growth Factor-7S van muis submaxillaire klier</td><td>Sigma</td><td>N0513</td><td>Reconstitueer het gelyofiliseerd poeder in een oplossing van gebufferd zoutoplossing of weefselkweekmedium bevattend 0,1&ndash;1,0% bovien serumalbumine of 1-10% serum</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA oplossing</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>Opwarmen in 37 &deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>Lipopolysacchariden van&nbsp;Escherichia coli&nbsp;055:B5</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td>Toxisch</td></tr><tr><td>Celcultuur inserts voor gebruik met 24-well platen</td><td>BD Falcon</td><td>353095</td><td>0,4 &mu;m poriën</td></tr><tr><td>24-well platen</td><td>TrueLine</td><td>TR5002</td><td>Bekleed met collageen voor gebruik</td></tr><tr><td>Routine PC12 celcultuur medium</td><td></td><td></td><td>Routine N9 celcultuur medium</td></tr><tr><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 85% RPMI medium</td><td></td><td></td><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 90% DMEM-F12 medium</td></tr><tr><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 10% verhit ingeactiveerd paarden serum</td><td></td><td></td><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 10% verhit ingeactiveerd paarden serum</td></tr><tr><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 5% verhit ingeactiveerd fetaal bovien serum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC12 differentiatie medium</td><td></td><td></td><td>N9 behandelingsmedium</td></tr><tr><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 99% RPMI medium</td><td></td><td></td><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 99% DMEM-F12 medium</td></tr><tr><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 1% verhit ingeactiveerd fetaal bovien serum</td><td></td><td></td><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 1% verhit ingeactiveerd fetaal bovien serum</td></tr><tr><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 50 ng/mL zenuwgroeifactor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC12 behandelingsmedium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 99% RPMI medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 1% verhit ingeactiveerd fetaal bovien serum</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van een insert co-cultuur systeem van twee mobiele soorten in de afwezigheid van cel-cel contact

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

De rol van uitgescheiden oplosbare factoren bij het modificeren van cellulaire reacties is een terugkerend thema in de studie van alle weefsels en systemen. In een poging om de zeer complexe relaties tussen de verschillende cellulaire subtypen die meercellige organismen samenstellen, duidelijk te maken, zijn in vitro technieken ontwikkeld om onderzoekers te helpen een gedetailleerd begrip van enkele celpopulaties te verkrijgen. Een van deze technieken maakt gebruik van inserts met een permeabele membraan die het mogelijk maakt dat uitgescheiden oplosbare factoren diffunderen. Zo kan een populatie cellen die in inserts wordt gekweekt, worden gecocultiveerd in een putje of schaaltje dat een ander celtype bevat voor het evalueren van cellulaire veranderingen na paracriene signalering in afwezigheid van cel-celcontact. Dergelijke insertcocultuursystemen bieden verschillende voordelen boven andere cocultuurtechnieken, namelijk bidirectionele signalering, geconserveerde celpolariteit en populatiespecifieke detectie van cellulaire veranderingen. Naast het gebruik in het veld van ontsteking, kanker, angiogenesis en differentiatie, zijn deze cocultuursystemen van primair belang in de studie van de complexe relaties die bestaan tussen de verschillende cellulaire subtypen die aanwezig zijn in het centrale zenuwstelsel, met name in de context van neuro-ontsteking. Dit artikel biedt algemene methodologische richtlijnen om een experiment op te zetten voor het evalueren van cellulaire veranderingen gemedieerd door uitgescheiden oplosbare factoren met behulp van een insertcocultuursysteem. Bovendien zal een specifiek protocol worden beschreven om de neuro-inflammatoire effecten van cytokinen gemeten door lipopolysaccharide-geactiveerde N9 microglia op neuronale PC12-cellen te meten, wat een concreet begrip van de insertcocultuurmethodologie biedt.

Het gebruik van co-insert kweeksystemen een bijzonder belang in de studie van neuro-inflammatoire processen die paracriene relatie tussen verschillende cellulaire spelers van het CZS demonstreren. Immuniteit in het CZS wordt voornamelijk bereikt door resident microglia cellen genaamd hun omgeving in hun vertakte rustende toestand (figuur 2A) volgen en kunnen sensing verstoringen die kunnen problemen de kostbare homeostase vlot te neuronale functie 76-78. Micro...

Bij meercellige organismen veroorzaken uitgescheiden oplosbare factoren reacties van verschillende celtypen als gevolg van paracriene signalering. Co-cultuursystemen bieden een eenvoudige manier om de veranderingen aan te brengen die worden veroorzaakt door uitgescheiden oplosbare factoren in de afwezigheid van cel-celcontact.

Ontwikkeling van een Insert Co-cultuur systeem van twee mobiele soorten in de afwezigheid van cel-cel Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van een cellulair co-cultuursysteem van twee celtypen met behulp van inserts met een permeabel membraan, waardoor de diffusie van uitgescheiden oplosbare factoren mogelijk is. Dit wordt bereikt via een reeks stappen waarbij inserts met één celtype nauwkeurig worden geplaatst in een multi-well weefselkweekplaat die een tweede celtype bevat. We beginnen met het uitzaaien van celtype nummer één in inserts en het uitzaaien van celtype nummer twee in een multi-well weefselkweekplaat.De tweede stap is het overbrengen van de inserts naar de putjes van de plaat die celtype nummer twee bevat. Hiermee wordt uiteindelijk de mogelijkheid gecreëerd om beide celtypen en de respectievelijke supernatanten te oogsten. Daardoor is het mogelijk om het effect van uitgescheiden oplosbare factoren op het celtype van belang te evalueren.In meercellige organismen lokken uitgescheiden oplosbare factoren responsen uit bij verschillende celtypen als gevolg van paracrine signalering. Bijgevolg ligt de waarde van een insert co-culturesysteem in het vermogen om een oorspronkelijke manier te bieden om veranderingen in cellulaire parameters te beoordelen die worden gemedieerd door uitgescheiden oplosbare factoren in afwezigheid van cel-celcontact. Insert co-culturesystemen bieden diverse voordelen ten opzichte van andere co-culturetechnieken, zoals: één, directionele signalering; twee, behoud van celpolariteit; en drie, populatiespecifieke detectie van cellulaire veranderingen.Hierna wordt een specifiek protocol gedetailleerd om de toxische effecten van cytokinen, uitgescheiden door lipopolysacharide-geactiveerde N9-microglia op neuronale PC12-cellen, te meten, waardoor een concreet begrip van de insert-cocultuurmethode wordt verschaft. Begin met het uitpakken van de 24-well weefselkweekplaat en de 0,4 micron poreuze polytetrafluoroethyleen-inserts. Plaats vervolgens de inserts in de lege wells van de weefselkweekplaat door de bovenrand van de insert met steriele pincetten vast te pakken.Vul vervolgens de inserts met routine N9-medium tot het membraan volledig is bedekt. Incubeer de inserts gedurende ten minste één uur, of overnight, om het vermogen van de cellen om te hechten te verbeteren. Zodra de inserts gereed zijn, worden de N9-microglia bij een confluentie van 80 tot 90% gesplitst met routine N9-medium om een cel-suspensie te verkrijgen die wordt gebruikt om de inserts te zaaien.Verwijder vervolgens het routinemedium uit de inserts, waarbij u erop let dat u het membraan niet met de micropipetpunt перforeert. Zaai daarna elk insert vervolgens met 60.000 cellen per vierkante centimeter met 50 microliter van de celsuspensie, of volgens het protocol van de fabrikant van het insert. Zorg er tijdens het verdelen van de celsuspensie voor dat deze homogeen blijft door de buis af en toe om te keren.Wanneer alle inserts zijn ingezaaid, schud dan de plaat voorzichtig heen en weer, en vervolgens van links naar rechts, om de cellen gelijkmatig te verspreiden. Vermijd cirkelvormige bewegingen, omdat dit ertoe zal leiden dat de cellen zich in het centrum van de insert ophopen. Incubeer vervolgens de plaat met de inserts gedurende 24 uur voordat u doorgaat met de N9 microglia-activatie.Begin met het wegen van 10 milligram lipopolysaccharide en bewaar dit in een 1,5 milliliter Eppendorf Tube voor later gebruik. Aangezien lipopolysaccharide een krachtig pro-inflammatoir endotoxine is en specifieke veiligheidsvoorschriften vereist, worden een veiligheidsbril, handschoenen en een partikelrespirator sterk aanbevolen. Maak vervolgens een reeks seriële verdunningen van lipopolysaccharide met warm N9 behandelmedium om werkoplossingen van vier, twee en één microgram per milliliter te verkrijgen.Verwijder ten slotte de helft van het kweekmedium uit de inserts, waarbij u er zorg voor draagt de cellen niet te storen. Voeg vervolgens voorzichtig 25 microliters van de werkoplossingen van lipopolysacharide toe aan de inserts om uiteindelijke verdunningen van twee, één of 0,5 microgram per milliliter te verkrijgen. Incubeer de plaat nogmaals 24 uur voordat u voortgaat met de co-kweekexperimenten.Voor deze stap zijn PC12-cellen nodig die zijn uitgeplaat op 30 000 cellen per vierkante centimeter als gedifferentieerde interneuronen, en N9-microglia die gedurende 24 uur zijn geactiveerd met lipopolysacharide, zoals beschreven in de vorige sectie. Begin met het voorzichtig verwijderen van al het medium uit de inserts en vervang dit door 50 µL vers, warm N9-behandelingsmedium. Dit is noodzakelijk om alle sporen van lipopolysacharide te verwijderen, zodat alleen geactiveerde N9-microglia overblijven.Houd er rekening mee dat de inserts los in de putjes van de weefkweekplaat liggen en kunnen verschuiven als de tip te hard tegen de wand wordt gedrukt. Deze stap moet per insert worden uitgevoerd om te voorkomen dat de cellen uitdrogen door langdurig contact met de lucht. Verwijder vervolgens het medium voor de neuronale PC12-cellen volledig en vervang dit door 0,6 milliliters vers, warm PC12-behandelmedium.Doe dit één voor één om te voorkomen dat de cellen uitdrogen. Pak met een pincet de bovenste rand van een insert vast en plaats deze voorzichtig in de well met neurale PC12-cellen. Wanneer alle inserts zijn overgeplaatst, dient men te controleren op de aanwezigheid van luchtbellen onder de membranen van de inserts.Luchtbellen zullen elke uitwisseling over het membraan van de insert voorkomen en kunnen het gehele experiment in gevaar brengen. Verwijder alle luchtbellen door de insert zeer voorzichtig met een pincet uit de well te tillen en deze terug in het celcultuurmedium te plaatsen; deze handeling zou de meeste bellen moeten verwijderen. Bij hardnekkige bellen kan men proberen de insert voorzichtig onder een hoek terug in het celcultuurmedium te dippen.Klop niet tegen de inserts en roer deze niet, omdat dit ertoe kan leiden dat hechtende cellen loslaten. Controleer vervolgens de volumes medium in zowel de inserts als de wells; de vloeistof in beide compartimenten moet ongeveer op hetzelfde niveau staan. Wanneer alle luchtbellen zijn verwijderd en de mediumvolumes correct zijn, kan de plaat worden geïncubeerd.De cellen, het cultuurmedium of beide kunnen vervolgens worden geoogst om de effecten van paracriene signalering tussen de N9-microglia en de neuronale PC12-cellen te meten. Enzyme-linked immunosorbent assays werden uitgevoerd op het celcultuurmedium van het onderste compartiment om pro-inflammatoire cytokinen te kwantificeren. De resultaten laten zien dat 24 uur na de activatieperiode N9-microglia behandeld met twee microgram per milliliter lipopolysaccharide significant meer pro-inflammatoire cytokinen secretieerden, zoals interleukine-6, tumornecrosefactor-alfa en interferon gamma, in vergelijking met microglia die niet waren behandeld.Daarnaast scheidden N9-microglia die behandeld waren met 1 µg/mL lipopolysacharide na 24 uur aanzienlijk meer interferon-gamma uit, terwijl het 48 uur duurde voordat er een significante stijging in de concentraties interleukine-6 en tumornecrosefactor-alfa in het celmedium zichtbaar was. In contrast hiermee slaagde de conditie van 0,5 µg/mL er niet in om de cytokinenexpressie in N9-microglia te verhogen, zowel 24 als 48 uur na de activatieperiode. Bovendien suggereren de gegevens na 24 uur in de groep van 2 µg/mL dat er sprake was van microgliose, een toename van de microgliapopulatie.Pas na 48 uur was het aantal cellen echter significant toegenomen. Ten slotte werd de cytotoxiciteit in de gecocultureerde neuronale PC12-cellen beoordeeld om de gevolgen van microgliële activatie, die leidt tot verhoogde cytokinesecretie en microgliose, vast te stellen. Door de spiegels van extracellulair lactaatdehydrogenase te meten, dat door beschadigde cellen wordt vrijgegeven, bleek dat de neuronale PC12-cellen meer celdood vertoonden naarmate de concentratie lipopolysaccharide op de N9-cellen toenam.Hierdoor tonen deze resultaten aan dat uitgescheiden oplosbare factoren in staat zijn om het membraan van de co-culture-inserts te passeren en cytotoxische schade kunnen veroorzaken aan neuronale PC12-cellen in afwezigheid van cel-celcontact. Hoewel hier slechts één scenario van insert-co-culture is gepresenteerd, is dit een zeer flexibele techniek. In dit protocol werd één celtype voorbehandeld met het molecuul dat verantwoordelijk is voor het verminderen van de secretie van oplosbare factoren die, na het overplaatsen van de insert naar de put, het gedrag van het tweede celtype beïnvloeden.Het is echter mogelijk om beide celtypen samen in een co-culturesysteem te incuberen om de toegenomen gevoeligheid, of resistentie, van één of beide celpopulaties voor een latere behandeling vast te stellen. Deze techniek kan eenvoudig gebruikmaken van twee celpopulaties die samen worden geïncubeerd zonder enige behandeling, om bijvoorbeeld de basale paracriene wederzijdse signalering te beoordelen. Naast de waarde op het gebied van neuro-inflammatie, zoals hier wordt aangetoond, kunnen co-culturesystemen worden gebruikt om een breed scala aan vragen te beantwoorden met betrekking tot tumorregeneratie, neurolathyrisma, apoptose-signalering of elk ander onderwerp met een component van paracriene signalering.Na het bekijken van deze video heeft u nu een goed inzicht in hoe insert-cocultuursystemen een eenvoudige manier bieden om veranderingen te beoordelen die worden gemedieerd door gesecreteerde oplosbare factoren. We hopen u te hebben overtuigd van het grote potentieel van deze insert-cocultuursystemen bij de studie van multicellulaire paracriene signalering in afwezigheid van cel-celcontact.

development-an-insert-co-culture-system-two-cellular-types-absence

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In this video, we develop a proximal co-culture model of ovarian cancer cells and primary human mesothelial cells. This physiologically relevant model allows the study of paracrine signaling, where the localized concentrations of the secreted factors are maintained while preventing direct cellular contact.

Proximal Culture System: An In Vitro Culture Technique to  Study Paracrine Signaling Between Cells

This video demonstrates a technique for establishing a co-culture of interneurons with perivascular endothelial cells. The cells are added to a one-well insert placed inside a culture dish. After the cells adhere to the dish, the insert is removed, allowing the cells to proliferate and interact and form a co-culture.

Establishing a Co-Culture of Interneurons with Periventricular Endothelial Cells

We hebben een permeabele microporeuze membraaninzet aangepast om het tumormicro-omgeving (TME) te imiteren. Het model bestaat uit een gemengde celcultuur, maakt een vereenvoudigde generatie van sterk verrijkte individuele celpopulaties mogelijk zonder het gebruik van fluorescente markering of celsortering, en maakt het mogelijk om intercellulaire communicatie binnen het TME te bestuderen onder normale of stressomstandigheden.

Een Mimic van de tumor micro: Een eenvoudige methode voor het genereren van verrijkte celpopulaties en Onderzoeken intercellulaire communicatie

Hier presenteren we een protocol bij de menselijke cultuur-enteroid of colonoid monolayers moeten intact barrièrefunctie gastheer epitheliale-microbiota interacties op het cellulaire en biochemisch niveau studeren.

Menselijke Colonoid Monolayers studie van interacties tussen ziekteverwekkers, Commensals en Host intestinaal epitheel

In dit artikel wordt een nieuw ontworpen 3D-geprinte insert gepresenteerd als een model van co-cultuur en gevalideerd door de studie van de paracriene intercellulaire communicatie tussen endotheelcellen en keratinocyten.

Een innovatief 3D-geprint inzetstuk dat is ontworpen om eenvoudige 2D- en 3D-celculturen mogelijk te maken

Het protocol toont een nieuw in vitro experimenteel model dat de biologie van twee soorten aanhangende cellijnen kan samenvatten met een driedimensionale (3D)-geprinte steiger. De constructie van dit model en de operationele procedures, van celvoorbereiding en celcultuur tot analyse en evaluatie, worden beschreven.

Co-cultuurmodel met behulp van twee soorten hechtende cellijnen

Hier laten we zien hoe epitheelcellen gekweekt met fibroblasten in het nanovezelige membraangebaseerde tweelaagse systeem stabiel kunnen hechten aan en groeien op het membraan.

Het opzetten van een driedimensionale cocultuurmodule van epitheelcellen met behulp van nanovezelmembranen

Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol met de belangrijkste stappen om de 3D Flipwell-engineering en -gebruik te begeleiden. We beschrijven en laten zien hoe de co-cultuur insert stacks kunnen worden samengesteld en gebruikt voor het co-kweken van gelaagde lagen darmbacteriën, darmepitheel, en macrofagen om de darmslijmvliesomgeving te modelleren.

3D Flipwell-engineering voor het ontwikkelen van asynchrone systemen voor toxicologische en immunomodulerende therapieën in bacteriële, darm- en immuuncellen

De studie presenteert een methode voor in vitro onderzoek van bacteriële infecties met behulp van intestinale organoïden afkomstig van weefselstamcellen. Het protocol beschrijft hoe organoïden in twee dimensies kunnen worden gekweekt en onderscheiden, geïnfecteerd met adherent-invasieve Escherichia coli, en belangrijke metingen worden beoordeeld, waaronder het doorbreken van de epitheliale barrière, infectiebeeldvorming en de repitheliale RNA-respons.

Een tweedimensionale organoïde cultuur op invasine of basement membraanextract om gastheer-bacteriën interacties te bestuderen

Dit artikel beschrijft een nieuw protocol en reagensset ontworpen voor de gevoelige meting van de neurotoxische effecten van verbindingen en behandelingen op co-culturen van neuronen en astrocyten met behulp van hoge inhoudsanalyse. Resultaten tonen aan dat de hoge inhoudelijke analyse een spannende nieuwe technologie voor neurotoxiciteit assessment vertegenwoordigt.

Een Neuronale en astrocyte co-cultuur assay voor High Content Analysis van neurotoxiciteit

Leer een insert co-cultuur methode voor het bestuderen van paracrine signalering tussen twee celtypen zonder direct cel-cel contact. Dit systeem maakt analyse van opgeloste factoren en hun effecten op doelcellen mogelijk.

Ontwikkeling van een Insert Co-cultuur systeem van twee mobiele soorten in de afwezigheid van cel-cel Contact

Meer video's verkennen