Ontwikkeling van een Insert Co-cultuur systeem van twee mobiele soorten in de afwezigheid van cel-cel Contact

Het algemene doel van deze procedure is om een cellulaire co-cultuur systeem van twee celtypen te creëren met behulp van inserts met een doorlaatbare membraan, waardoor diffusie van uitgescheiden oplosbare factoren mogelijk is. Dit wordt bereikt met een reeks stappen die inserts met één celtype in een multi-well tissue cultuurplaat met een tweede celtype nauwkeurig plaatsen. We beginnen met het zaaien van celtype nummer één in de inserts en celtype nummer twee in een multi-well tissue cultuurplaat.

De tweede stap is het overbrengen van de inserts in de putjes van de plaat met celtype nummer twee. Uiteindelijk geeft dit de mogelijkheid om de twee celtypen te oogsten, evenals de respectieve supernatanten. Daarom is het mogelijk om het effect van uitgescheiden oplosbare factoren op het celtype van belang te evalueren.

In meercellige organismen zorgen uitgescheiden oplosbare factoren voor reacties van verschillende celtypen als gevolg van paracriene signalering. De waarde van een insert co-cultuur systeem ligt dus in zijn vermogen om een originele manier te bieden om de veranderingen van cellulaire parameters gemedieerd door uitgescheiden oplosbare factoren te beoordelen in de afwezigheid van cel-cel contact. Insert co-cultuur systemen bieden verschillende voordelen boven andere co-cultuurtechnieken, zoals: één door directioneel signaal; twee geconserveerde celpolariteit; en drie populatie specifieke detectie van cellulaire veranderingen.

Een specifiek protocol om de toxische effecten van cytokinen die worden uitgescheiden door lipopolysaccharide geactiveerde N9 microglia op neuronale PC12 cellen te meten, zal hierna worden beschreven, waardoor een concreet begrip van insert co-cultuur methodologie wordt geboden. Om te beginnen, pak de 24-well tissue cultuurplaat en de 0.4 micron por polytetrafluorethyleen inserts uit hun verpakking. Plaats vervolgens de inserts in de lege putjes van de tissue cultuurplaat door de bovenste rand van de insert met steriele pincetten vast te grijpen.

Vervolgens vult u de inserts met routine N9 medium totdat de membraan volledig bedekt is. Incubeer de inserts gedurende ten minste een uur, of overnacht, om de hechting van de cellen te verbeteren. Zodra de inserts klaar zijn, splitst u de N9 microglia bij 80 tot 90% confluëntie met routine N9 medium om een celsuspensie te verkrijgen die zal worden gebruikt om de inserts te zaaien.

Vervolgens verwijdert u het routine medium uit de inserts, zorg ervoor dat u de membraan niet perforeert met de micropipettip. Zaai vervolgens elke insert bij 60.000 cellen per vierkante centimeter met 50 microliter van de celsuspensie, of volgens het protocol van de insertfabrikant. Zorg er tijdens het verdelen van de celsuspensie voor dat deze homogeen blijft door de buis af en toe om te draaien.

Wanneer alle inserts zijn gezaaid, wiegt u de plaat voorzichtig heen en weer, dan links naar rechts, om de cellen gelijkmatig te verdelen. Vermijd cirkelvormige bewegingen omdat dit ervoor zorgt dat de cellen zich in het midden van de insert ophopen. Daarna incubeert u de plaat met de inserts gedurende 24 uur voordat u doorgaat met N9 microglia activering.

Begin door 10 milligram lipopolysaccharide af te wegen en dit in een 1,5 milliliter Eppendorfbuisje op te slaan voor later gebruik. Aangezien lipopolysaccharide een krachtige pro-inflammatoire endotoxine is en specifieke veiligheidsmaatregelen vereist, worden bril, handschoenen en een deeltjenademhalingsbescherming sterk aanbevolen. Maak vervolgens een reeks seriële verdunningen van lipopolysaccharide met warm N9 behandelingsmedium om werkoplossingen van vier, twee en één microgram per milliliter te verkrijgen.

Verwijder vervolgens de helft van het kweekmedium uit de inserts, zorg ervoor dat u de cellen niet verstoort. Voeg vervolgens voorzichtig 25 microliter van de werkoplossingen van lipopolysaccharide toe aan de inserts om eindverdunningen van twee, één of 0,5 microgram per milliliter te verkrijgen. Incubeer de plaat nog eens 24 uur voordat u doorgaat met de co-cultuur experimenten.

Deze stap vereist PC12 cellen die geplaatst zijn op 30.000 cellen per vierkante centimeter gedifferentieerde interneuronen, en N9 microglia geactiveerd met lipopolysaccharide gedurende 24 uur zoals beschreven in de vorige sectie. Begin met voorzichtig alle medium uit de inserts te verwijderen en vervang het door 50 microliter vers, warm N9 behandelingsmedium. Dit is noodzakelijk om alle sporen van lipopolysaccharide te verwijderen, waardoor alleen geactiveerde N9 microglia overblijft.

Houd er rekening mee dat de inserts los zitten in de putjes van de tissue cultuurplaat en zich kunnen verplaatsen als de tip te hard op de wand wordt gedrukt. Deze stap moet één insert tegelijk worden uitgevoerd om te voorkomen dat de cellen uitdrogen door langdurig contact met de lucht. Vervolgens verwijdert u het neuronale PC12 celmedium volledig en vervangt u het door 0,6 milliliter vers, warm PC12 behandelingsmedium.

Doe dit één putje per keer om ervoor te zorgen dat de cellen niet uitdrogen. Grijp met behulp van pincetten de bovenste rand van een insert en plaats het voorzichtig in het putje met neuronale PC12 cellen. Wanneer alle inserts zijn overgebracht, controleert u op het voorkomen van luchtbellen onder de membranen van de inserts.

Luchtbellen zullen elke uitwisseling over de membraan van het insert voorkomen en kunnen het hele experiment in gevaar brengen. Verwijder eventuele luchtbellen door de insert heel voorzichtig uit het putje te tillen met behulp van pincetten en deze terug in het celkweekmedium te plaatsen, deze actie zou de meeste bellen moeten verwijderen. Probeer echter voor aanhoudende bellen de insert voorzichtig in een hoek in het celkweekmedium te dompelen.

Sla of roer de inserts niet, omdat dit de neiging heeft om de dissociatie van aderente cellen te veroorzaken. Controleer daarna de volumes van media in zowel de inserts als de putjes, de vloeistof in beide compartimenten zou ongeveer op hetzelfde niveau moeten zijn. Wanneer alle luchtbellen zijn verwijderd en de mediavolumes geschikt zijn, incubeer de plaat.

De cellen, het kweekmedium of beide kunnen vervolgens worden geoogst om de effecten van paracriene signalering tussen de N9 microglia en de neuronale PC12 cellen te meten. Enzym-gekoppelde immunosorbent assays werden uitgevoerd op het celkweekmedium van het onderste compartiment om pro-inflammatoire cytokinen te kwantificeren.