Ontwikkeling van een Insert Co-cultuur systeem van twee mobiele soorten in de afwezigheid van cel-cel Contact

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van een cellulair co-cultuursysteem van twee celtypen met behulp van inserts met een permeabel membraan, waardoor de diffusie van uitgescheiden oplosbare factoren mogelijk is. Dit wordt bereikt via een reeks stappen waarbij inserts met één celtype nauwkeurig worden geplaatst in een multi-well weefselkweekplaat die een tweede celtype bevat. We beginnen met het uitzaaien van celtype nummer één in inserts en het uitzaaien van celtype nummer twee in een multi-well weefselkweekplaat.

De tweede stap is het overbrengen van de inserts naar de putjes van de plaat die celtype nummer twee bevat. Hiermee wordt uiteindelijk de mogelijkheid gecreëerd om beide celtypen en de respectievelijke supernatanten te oogsten. Daardoor is het mogelijk om het effect van uitgescheiden oplosbare factoren op het celtype van belang te evalueren.

In meercellige organismen lokken uitgescheiden oplosbare factoren responsen uit bij verschillende celtypen als gevolg van paracrine signalering. Bijgevolg ligt de waarde van een insert co-culturesysteem in het vermogen om een oorspronkelijke manier te bieden om veranderingen in cellulaire parameters te beoordelen die worden gemedieerd door uitgescheiden oplosbare factoren in afwezigheid van cel-celcontact. Insert co-culturesystemen bieden diverse voordelen ten opzichte van andere co-culturetechnieken, zoals: één, directionele signalering; twee, behoud van celpolariteit; en drie, populatiespecifieke detectie van cellulaire veranderingen.

Hierna wordt een specifiek protocol gedetailleerd om de toxische effecten van cytokinen, uitgescheiden door lipopolysacharide-geactiveerde N9-microglia op neuronale PC12-cellen, te meten, waardoor een concreet begrip van de insert-cocultuurmethode wordt verschaft. Begin met het uitpakken van de 24-well weefselkweekplaat en de 0,4 micron poreuze polytetrafluoroethyleen-inserts. Plaats vervolgens de inserts in de lege wells van de weefselkweekplaat door de bovenrand van de insert met steriele pincetten vast te pakken.

Vul vervolgens de inserts met routine N9-medium tot het membraan volledig is bedekt. Incubeer de inserts gedurende ten minste één uur, of overnight, om het vermogen van de cellen om te hechten te verbeteren. Zodra de inserts gereed zijn, worden de N9-microglia bij een confluentie van 80 tot 90% gesplitst met routine N9-medium om een cel-suspensie te verkrijgen die wordt gebruikt om de inserts te zaaien.

Verwijder vervolgens het routinemedium uit de inserts, waarbij u erop let dat u het membraan niet met de micropipetpunt перforeert. Zaai daarna elk insert vervolgens met 60.000 cellen per vierkante centimeter met 50 microliter van de celsuspensie, of volgens het protocol van de fabrikant van het insert. Zorg er tijdens het verdelen van de celsuspensie voor dat deze homogeen blijft door de buis af en toe om te keren.

Wanneer alle inserts zijn ingezaaid, schud dan de plaat voorzichtig heen en weer, en vervolgens van links naar rechts, om de cellen gelijkmatig te verspreiden. Vermijd cirkelvormige bewegingen, omdat dit ertoe zal leiden dat de cellen zich in het centrum van de insert ophopen. Incubeer vervolgens de plaat met de inserts gedurende 24 uur voordat u doorgaat met de N9 microglia-activatie.

Begin met het wegen van 10 milligram lipopolysaccharide en bewaar dit in een 1,5 milliliter Eppendorf Tube voor later gebruik. Aangezien lipopolysaccharide een krachtig pro-inflammatoir endotoxine is en specifieke veiligheidsvoorschriften vereist, worden een veiligheidsbril, handschoenen en een partikelrespirator sterk aanbevolen. Maak vervolgens een reeks seriële verdunningen van lipopolysaccharide met warm N9 behandelmedium om werkoplossingen van vier, twee en één microgram per milliliter te verkrijgen.

Verwijder ten slotte de helft van het kweekmedium uit de inserts, waarbij u er zorg voor draagt de cellen niet te storen. Voeg vervolgens voorzichtig 25 microliters van de werkoplossingen van lipopolysacharide toe aan de inserts om uiteindelijke verdunningen van twee, één of 0,5 microgram per milliliter te verkrijgen. Incubeer de plaat nogmaals 24 uur voordat u voortgaat met de co-kweekexperimenten.

Voor deze stap zijn PC12-cellen nodig die zijn uitgeplaat op 30 000 cellen per vierkante centimeter als gedifferentieerde interneuronen, en N9-microglia die gedurende 24 uur zijn geactiveerd met lipopolysacharide, zoals beschreven in de vorige sectie. Begin met het voorzichtig verwijderen van al het medium uit de inserts en vervang dit door 50 µL vers, warm N9-behandelingsmedium. Dit is noodzakelijk om alle sporen van lipopolysacharide te verwijderen, zodat alleen geactiveerde N9-microglia overblijven.

Houd er rekening mee dat de inserts los in de putjes van de weefkweekplaat liggen en kunnen verschuiven als de tip te hard tegen de wand wordt gedrukt. Deze stap moet per insert worden uitgevoerd om te voorkomen dat de cellen uitdrogen door langdurig contact met de lucht. Verwijder vervolgens het medium voor de neuronale PC12-cellen volledig en vervang dit door 0,6 milliliters vers, warm PC12-behandelmedium.

Doe dit één voor één om te voorkomen dat de cellen uitdrogen. Pak met een pincet de bovenste rand van een insert vast en plaats deze voorzichtig in de well met neurale PC12-cellen. Wanneer alle inserts zijn overgeplaatst, dient men te controleren op de aanwezigheid van luchtbellen onder de membranen van de inserts.

Luchtbellen zullen elke uitwisseling over het membraan van de insert voorkomen en kunnen het gehele experiment in gevaar brengen. Verwijder alle luchtbellen door de insert zeer voorzichtig met een pincet uit de well te tillen en deze terug in het celcultuurmedium te plaatsen; deze handeling zou de meeste bellen moeten verwijderen. Bij hardnekkige bellen kan men proberen de insert voorzichtig onder een hoek terug in het celcultuurmedium te dippen.

Klop niet tegen de inserts en roer deze niet, omdat dit ertoe kan leiden dat hechtende cellen loslaten. Controleer vervolgens de volumes medium in zowel de inserts als de wells; de vloeistof in beide compartimenten moet ongeveer op hetzelfde niveau staan. Wanneer alle luchtbellen zijn verwijderd en de mediumvolumes correct zijn, kan de plaat worden geïncubeerd.

De cellen, het cultuurmedium of beide kunnen vervolgens worden geoogst om de effecten van paracriene signalering tussen de N9-microglia en de neuronale PC12-cellen te meten. Enzyme-linked immunosorbent assays werden uitgevoerd op het celcultuurmedium van het onderste compartiment om pro-inflammatoire cytokinen te kwantificeren. De resultaten laten zien dat 24 uur na de activatieperiode N9-microglia behandeld met twee microgram per milliliter lipopolysaccharide significant meer pro-inflammatoire cytokinen secretieerden, zoals interleukine-6, tumornecrosefactor-alfa en interferon gamma, in vergelijking met microglia die niet waren behandeld.

Daarnaast scheidden N9-microglia die behandeld waren met 1 µg/mL lipopolysacharide na 24 uur aanzienlijk meer interferon-gamma uit, terwijl het 48 uur duurde voordat er een significante stijging in de concentraties interleukine-6 en tumornecrosefactor-alfa in het celmedium zichtbaar was. In contrast hiermee slaagde de conditie van 0,5 µg/mL er niet in om de cytokinenexpressie in N9-microglia te verhogen, zowel 24 als 48 uur na de activatieperiode. Bovendien suggereren de gegevens na 24 uur in de groep van 2 µg/mL dat er sprake was van microgliose, een toename van de microgliapopulatie.

Pas na 48 uur was het aantal cellen echter significant toegenomen. Ten slotte werd de cytotoxiciteit in de gecocultureerde neuronale PC12-cellen beoordeeld om de gevolgen van microgliële activatie, die leidt tot verhoogde cytokinesecretie en microgliose, vast te stellen. Door de spiegels van extracellulair lactaatdehydrogenase te meten, dat door beschadigde cellen wordt vrijgegeven, bleek dat de neuronale PC12-cellen meer celdood vertoonden naarmate de concentratie lipopolysaccharide op de N9-cellen toenam.

Hierdoor tonen deze resultaten aan dat uitgescheiden oplosbare factoren in staat zijn om het membraan van de co-culture-inserts te passeren en cytotoxische schade kunnen veroorzaken aan neuronale PC12-cellen in afwezigheid van cel-celcontact. Hoewel hier slechts één scenario van insert-co-culture is gepresenteerd, is dit een zeer flexibele techniek. In dit protocol werd één celtype voorbehandeld met het molecuul dat verantwoordelijk is voor het verminderen van de secretie van oplosbare factoren die, na het overplaatsen van de insert naar de put, het gedrag van het tweede celtype beïnvloeden.

Het is echter mogelijk om beide celtypen samen in een co-culturesysteem te incuberen om de toegenomen gevoeligheid, of resistentie, van één of beide celpopulaties voor een latere behandeling vast te stellen. Deze techniek kan eenvoudig gebruikmaken van twee celpopulaties die samen worden geïncubeerd zonder enige behandeling, om bijvoorbeeld de basale paracriene wederzijdse signalering te beoordelen. Naast de waarde op het gebied van neuro-inflammatie, zoals hier wordt aangetoond, kunnen co-culturesystemen worden gebruikt om een breed scala aan vragen te beantwoorden met betrekking tot tumorregeneratie, neurolathyrisma, apoptose-signalering of elk ander onderwerp met een component van paracriene signalering.

Na het bekijken van deze video heeft u nu een goed inzicht in hoe insert-cocultuursystemen een eenvoudige manier bieden om veranderingen te beoordelen die worden gemedieerd door gesecreteerde oplosbare factoren. We hopen u te hebben overtuigd van het grote potentieel van deze insert-cocultuursystemen bij de studie van multicellulaire paracriene signalering in afwezigheid van cel-celcontact.