Externe excitatie van neuronen Met behulp van elektrische en magnetische velden in een-en twee-dimensionale culturen

Het algemene doel van dit protocol voor elektrische en magnetische stimulatie van eendimensionale en tweedimonsionale culturen is om neuronale culturen efficiënt te gebruiken als een gereduceerd model voor hersenstimulatie waaruit we inzicht en belangrijke parameters kunnen halen. Het gebruik van ons elektrische stimulatieprotocol met eendimensionale culturen stelt ons in staat om specifieke parameters te meten die gerelateerd zijn aan neurale excitatie, bijvoorbeeld chronaxie en rheobase in verschillende compartimenten van de neuron. De magnetische stimulatietechniek stelt ons in staat om het effect van magnetische versus elektrische velden op neuronale culturen te vergelijken.

Dit model stelt ons ook in staat om hersenaandoeningen beter te diagnosticeren en te behandelen. We stellen een effectieve en gemakkelijke methode voor om neuronale netwerken in elk ontwerppatroon te kweken, zelfs eendimensionale netwerken. We kunnen dan elektrische en tijdsafhankelijke magnetische velden richten ten opzichte van deze netwerken om bijdragen van verschillende compartimenten van de neuron te scheiden en waar te nemen.

Het grote voordeel van deze techniek is dat het geen menselijke proefpersonen of diermodellen vereist, waardoor een uitgebreide en grondige zoektocht naar de juiste parameters voor neuronale stimulatie mogelijk is. Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Yuri Burnishev, een technicus uit mijn laboratorium en Ami Eisen, een PhD-student in het laboratorium. Om te beginnen, bereid gepaterde neuronale culturen voor door neurale cellen op glazen dekpotten te zaaien die gedeeltelijk vooraf gecoat zijn met een biorejectielaag.

Om dit te doen, maak 25 millimeter dekpotten schoon. En gebruik een Sputtering Machine om het dekpotje te coaten met een biorejectielaag. Pas de parameters voor het afzettingsproces aan om een laag te creëren die bestaat uit een dunne chroomfilm van zes tot 10 angstroms, die zorgt voor stabiliteit van de coating en een 30 angstrom dikke goudlaag die de coating thiol-reactiviteit biedt.

Eenmaal het proces voltooid is, verwijder het dekpotje van de Sputtering Machine en onderzoek de verkregen coating. Vervolgens assembleer een gemodificeerd penplottersysteem door een inkttip van een plotterpen te vervangen door een scherpe metalen etsnaald. Plaats een rubberen blad, geplakt op een stijve plaat, in de plotter zodat er een stevige en hoog-frictieoppervlak tijdens het etsen wordt gegarandeerd.

Vervolgens past u de positie van het blad aan door op de knoppen op de plotter te drukken. Zodra het rubberen blad op zijn plaats is, pipet een kleine druppel water op het oppervlak en plaats het vooraf gecoate dekpotje over de druppel. Vervolgens gebruikt u de plotter om door de metalen lagen te etsen door herhaaldelijk te krabben en lijnen van 200 micrometer dik te genereren om de gewenste patronen te creëren.

Voorafgaand aan een elektrische stimulatie, plaats het gezaaide dekpotje in een beeldvormingskamer. Om de cellen te stimuleren met een elektrisch veld van constante richting, gebruikt u twee parallelle elektroden gescheiden door 11 millimeter en gelegen aan tegenoverliggende kanten van de cultuur geplateerd op de 13 millimeter dekpotten. Vervolgens monteert u de beeldvormingskamer en de bijbehorende elektrodehouder zodanig dat de draadelektroden in de extracellulaire media zijn gedompeld en een millimeter boven de cultuur zijn gepositioneerd.

Vervolgens sluit u het enkele elektrodenpaar aan op de operationele versterker die het signaal van de generator versterkt. Pas een enkele puls van bipolaire vierkante golf toe met een cyclus van 50% en een amplitude van 22 volt. Gebruik een bipolaire golf zonder DC-component om elektrolyse te voorkomen die kan optreden bij de elektroden.

Breng de puls aan die duurt van 10 microseconden tot vier milliseconden om een effectieve stimulatie te garanderen maar celschade te voorkomen. Om de cellen te stimuleren met elektrische velden van veranderende richting, gebruikt u twee loodrechte paren elektroden. Zorg ervoor dat de twee paar elektroden evenals hun voedings- en bewakingsterminals volledig elektrisch geïsoleerd zijn van elkaar en zweven van de aarde.

Om de oriëntatie van het elektrische veld te veranderen, varieert u de amplitude van de spanning die op de twee elektrodenparen wordt toegepast. Bepaal vervolgens de intensiteit en de richting van het resulterende veld door vectoriële optelling. Om een draaiend veld met vaste amplitude te genereren, brengt u een sinusgolf toe op één elektrodenpaar terwijl u het andere paar voedt met een cosinusgolf.

Om magnetische stimulatie te beginnen, plaatst u een neuronale cultuur, gekweekt in een cirkelvormig patroon, onder de microscoop. Stimuleer de cultuur met behulp van een standaard cirkelvormige magnetische stimulatiespoel en een ondersteunende stimulator die commercieel verkrijgbaar zijn. Om de culturen met niet-standaard magnetische veldintensities te stimuleren, verbindt u een op maat gemaakte magnetische stimulatiespoel met de op maat gebouwde stimulator.

Vervolgens, met behulp van een laserpointer, lijnt u het centrum van de cultuur uit met het centrum van de spoel om een succesvolle stimulatie te garanderen. Pas de spoelposities aan zodat deze ongeveer vijf millimeter boven het centrum van de cultuur blijft. Zodra de stimulatiespoel correct is gepositioneerd, laadt u de stimulator naar een potentiaal van maximaal vijf kilovolt.

Vervolgens, met behulp van een hoog stroom, hoogspanningsschakelaar, ontlaadt u de hoge voltage stroom door de stimulatiespoel om een magnetische puls te genereren die de activiteit van de gekweekte neuronen stimuleert. Monteer ten slotte een pick-up spoel op dezelfde positie als de neuronale cultuur en meet de intensiteit van het gegenereerde magnetische veld. Dit schema laat zien dat door het toepassen van verschillende amplituden van spanningspulsen op de twee paren elektroden, de elektrische velden naar elke hoek kunnen worden georiënteerd zonder dat de cultuur handmatig hoeft te worden gedraaid.

Hier zijn de voorbeeldopnames van calciumtransienten met elektrische stimulatie bij verschillende toegepaste spanningen. Bij het toepassen van een constante duur van het elektrische veld, toont het aantal neuronen dat vuur en reageert op het elektrische veld een cumulatieve Gaussiaanse verdeling als functie van de amplitude van de spanning. En dit is een voorbeeld van een sterkte-duurcurve verkregen bij het toepassen van dit protocol.

Voor de ringculturen die reageren op het magnetische veld, neemt de succesratio van stimulatie toe met de cultuurradius