Fluorescentie Activated Cell Sorting (FACS) en genexpressie analyse van Fos expressie neuronen van verse en diepgevroren Rat Brain Tissue

Het algemene doel van deze procedure is om Fos-expresserende neuronen te dissociëren uit vers of bevroren hersenweefsel van volwassen ratten voor daaropvolgende fluorescentie-geactiveerde cel sortering, of FACS. Deze methode kan worden gebruikt om neuronale cellen van belang te isoleren om de unieke moleculaire neuroadaptatie van gedragsmatig geactiveerde neuronen te identificeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gebruik van bevroren weefsel mogelijk maakt, wat de isolatie van cellen uit meerdere hersengebieden op verschillende dagen vergemakkelijkt.

Om dit verse hersenweefsel te verwerken, plaatst u twee of meer vooraf gekoelde scheermesjes in de sleuven van een ijskoude hersensnijmatrix om coronale coupes van één tot twee millimeter te snijden die de hersengebieden van belang bevatten, waarbij de secties tijdens het snijden op een gekoelde glasplaat worden gelegd. Dissecteer eerst het hersengebied van belang, gooi de overige gebieden weg en verwijder de witte stof. Om het weefsel te bevriezen, brengt u de monsters over in een microbuisje en dompelt u het buisje gedurende 20 seconden onder in isopentaan van -40 °C voor bewaring bij -80 °C tot verdere verwerking.

Om het weefsel fijn te hakken, laat u de monsters maximaal één minuut ontdooien op een koude glasplaat voordat u de monsters bedekt met één tot twee druppels Buffer A-oplossing. Houd vervolgens een scheermesje volledig verticaal ten opzichte van de plaat en hak het weefsel 100 keer in elke orthogonale richting. Om het weefsel grondig fijn te hakken, is het essentieel om het weefsel nat te houden met Buffer A en de gespecificeerde haktijden en -richtingen te volgen.

Het is essentieel om tijdens de dissectie het grootste deel van de witte stof te verwijderen en het weefsel bedekt te houden met Buffer A om de efficiëntie van het fijnmalen te verbeteren en de levensvatbaarheid van de cellen te behouden. Wanneer het weefsel grondig is verwerkt, gebruik dan het scheermesje om de stukjes over te brengen naar een microcentrifugebuisje met één milliliter koude Buffer A, en keer het buisje drie tot vijf keer om zodat al het fijngemalen weefsel in de oplossing is ondergedompeld. Om de weefselfragmenten te dissociëren tot een enkelcellige suspensie, worden de monsters door centrifugatie gepellet.

Verwijder het supernatant. Voeg vervolgens langzaam één milliliter koude, vers ontdooide enzymoplossing toe langs de binnenwand van de microbuis. Gebruik een pipet met een grote tipdiameter om het gehele pellet onmiddellijk vier keer op te zuigen en weer uit te stoten om de fijngehakte weefselstukjes te verspreiden.

Keer de microbuis vervolgens snel om om te voorkomen dat de pellets aan de bodem van de buis blijven plakken, en incubeer het monster gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius met end-over-end menging. Centrifugeer de buis aan het einde van de digestie opnieuw en voeg 0,6 milliliters koude Buffer A toe aan de cellen. Aspireer en dispenseer de pellets onmiddellijk vijf keer met dezelfde pipetpunt.

Select vervolgens een glazen pipet van 1,3 millimeter en gebruik deze om de monsters voorzichtig 10 keer te tritureren. Plaats het monster gedurende twee minuten op ijs, zodat het debris en de niet-gedissocieerde cellen naar de bodem van de buis kunnen zakken. Draag daarna het supernatant over naar een nieuwe buis van 15 milliliter.

Voeg vervolgens 600 µL Buffer A-oplossing toe aan het resterende pellet en gebruik een pipet met een diameter van 0,8 mm om het monster nogmaals 10 keer te tritureren. Laat de weefsels bezinken zoals zojuist gedemonstreerd, voeg het supernatant samen met de eerste celsuspensie en voeg nog eens 600 µL buffer toe aan het pellet. Gebruik daarna een pipet van 0,4 mm om het monster te tritureren en plaats de buis gedurende twee minuten op ijs om de weefsels te laten bezinken.

Het volgen van de mechanische trituratiestappen in het protocol is belangrijk voor een succesvolle sortering. Voeg vervolgens het supernatant samen met de gedissocieerde cellen. Voeg daarna 600 µL Buffer A toe aan het monster en herhaal de trituratie met de 0,4 mm pipet nog drie keer.

Plaats de buisjes twee minuten op ijs om de cellen te laten bezinken. Voeg vervolgens het supernatant samen in een tweede buisje van 15 milliliter. Herhaal het trituratieproces nog drie keer met de kleinste glazen pipet; dit verhoogt de opbrengst van de cellen voor de daaropvolgende sortering aanzienlijk.

Nadat alle supernatanten zijn verzameld, voegt u 800 µL van 100% ethanol bij -20 °C toe aan vier mirotubes op ijs. Draag vervolgens 800 µL cellen uit de eerste buis met verzamelde supernatant over naar elk van de eerste twee buizen met ethanol, en 800 µL cellen uit de tweede buis met supernatant naar elk van de laatste twee buizen met ethanol. Keer de buizen om om de monsters te mengen.

Plaats de monsters vervolgens gedurende 15 minuten op ijs, waarbij elke vijf minuten wordt gemengd door inversie. Centrifugeer de cellen aan het einde van de incubatie. Gebruik daarna een micropipet om, door enkel de wand van de microbuis aan te raken, langzaam alle supernatant te verwijderen, behalve de laatste 50 µL.

Filter elk van de twee cel-suspensies afzonderlijk met twee verschillende paren celzeven. De cellen zijn vervolgens klaar voor markering met antilichamen tegen de gewenste celmarkers en sortering via flowcytometrie. Analyse van vers en bevroren hersenweefselmonsters onthult de aanwezigheid van kleine, homogene populaties neuronale cellen met een vergelijkbare grootte en granulariteit.

De kleine homogene populaties kunnen worden gegated om celaggregaten uit te sluiten, en de neuronen kunnen worden geïdentificeerd aan de hand van hun NeuN- en DAPI-positiviteit. In zowel verse als bevroren weefselmonsters zijn de NeuN mRNA-niveaus aanzienlijk hoger in de NeuN-positieve populaties dan in de NeuN-negatieve populaties. Daarentegen zijn de mRNA-niveaus van de glia- en oligodendrocytenmarkers hoger in de NeuN-negatieve populatie dan in de NeuN-positieve populatie.

Een vergelijkbare trend van hogere mRNA-niveaus van microgliacelmarkers wordt waargenomen in de NeuN-negatieve populatie, hoewel dit niet statistisch significant was. Verder zijn de Fos mRNA-niveaus hoger in de Fos-positieve neuronen dan in de Fos-negatieve neuronen, met een drievoudige toename van Fos mRNA in de Fos-positieve neuronen uit vers weefsel, en een elfvoudige toename van Fos mRNA in Fos-positieve neuronen uit bevroren weefsel, wat de validiteit van de methode bevestigt voor het identificeren van specifieke genen van belang uit flow-gesorteerde cellen onder zowel verse als bevroren weefselcondities. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de kritische stappen ter voorkoming van cellyse te volgen.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals fluorescentie-geactiveerde cel sortering, worden uitgevoerd om de relevante cel-subsets te isoleren voor verdere downstream moleculaire analyse. Het gebruik van bevroren weefsel maakt het mogelijk om de monsters op verschillende dagen te sorteren, wat cruciaal is voor experimenten die langdurige en complexe procedures voor weefselwinning en -preparatie omvatten. Deze techniek kan ook worden gebruikt om postmortaal bevroren menselijke hersenmonsters, die gedurende enkele maanden of jaren zijn bewaard, voor te bereiden voor sortering via flowcytometrie.

Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het vakgebied van de neurowetenschappen om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan het gedrag van Fos-expresserende neuronen of andere immunogelabelde wild-type cellen van belang. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe cellen uit vers of bevroren rattenhersenweefsel kunnen worden gedissocieerd voor fluorescentie-geactiveerde celsortering van neuronen of cellen van belang.