Fluorescentie Activated Cell Sorting (FACS) en genexpressie analyse van Fos expressie neuronen van verse en diepgevroren Rat Brain Tissue
27 augustus 2016
Hier presenteren we een Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) protocol om moleculaire veranderingen studeren in Fos-uiting van neuronale ensembles van zowel verse als bevroren hersenweefsel. Het gebruik van bevroren weefsel maakt FACS isoleren van vele hersengebieden over meerdere zittingen aan het gebruik van kostbare proefdieren maximaliseren.
Het algemene doel van deze procedure is om Fos-expresserende neuronen te dissociëren van vers of bevroren volwassen rattenhersenweefsel voor daaropvolgende fluorescentie geactiveerde celsortering, of FACS. Deze methode kan worden gebruikt om neuronale cellen van belang te isoleren om de unieke moleculaire neuroadaptatie van gedragsgeactiveerde neuronen te identificeren. Het grote voordeel van deze techniek is dat het het gebruik van bevroren weefsel toestaat, waardoor het mogelijk wordt om cellen uit meerdere hersengebieden op verschillende dagen te isoleren.
Om dit verse hersenweefsel te verwerken, plaatst u twee of meer voorgekoelde scheermessen in de sleuven van een ijskoud hersenslicematrix om één tot twee millimeter coronale plakken te snijden die de hersengebieden van belang bevatten, en plaats de secties op een gekoelde glazen plaat terwijl ze worden gesneden. Snijd eerst het hersengebied van belang uit, gooi de andere gebieden weg en verwijder het witte hersenweefsel. Om het weefsel in te vriezen, brengt u de monsters over in een microbuisje en dompelt u de buis onder in minus 40 graden Celsius isopentaan gedurende 20 seconden voor opslag bij minus 80 graden Celsius tot verdere verwerking.
Om het weefsel fijn te snijden, laat u de monsters maximaal één minuut ontdooien op een koude glazen plaat voordat u de monsters bedekt met één tot twee druppels Buffer A-oplossing. Houd vervolgens een scheermes volledig verticaal op de plaat en snijdt u het weefsel 100 keer in elke orthogonale richting. Om het weefsel grondig te snijden, is het van cruciaal belang om het weefsel nat te houden met Buffer A en de opgegeven snijdtijden en richting te volgen.
Het is van cruciaal belang om de meerderheid van het witte hersenweefsel te verwijderen tijdens de weefseldassectie en om het weefsel bedekt te houden met Buffer A om de efficiëntie van het snijden te verbeteren en om de gezondheid van de cellen te behouden. Wanneer het weefsel grondig is verwerkt, gebruikt u het scheermes om de stukken over te brengen in een microcentrifugebuisje met één milliliter koude Buffer A en draait u het buisje drie tot vijf keer om alle gesneden weefselstukken in de oplossing onder te dompelen. Om de weefselfragmenten te dissociëren in een single-cel suspensie, pels de monsters door centrifugatie.
Gooi de supernatant weg. Voeg vervolgens langzaam één milliliter koude, vers ontdooid enzymoplossing toe langs de binnenwand van de microbuis. Gebruik een pijp met een groot tipdiameter om onmiddellijk het geheel van elke pellet vier keer op te zuigen en af te geven om de gesneden weefselstukken te verspreiden.
Keer vervolgens snel de microbuis om om te voorkomen dat de pellets aan de bodem van de buis blijven plakken en incubeer het monster met end-over-end mengen gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Aan het einde van de vertering, centrifugeert u de buis opnieuw en voegt u 0,6 milliliter koude Buffer A toe aan de cellen. Gebruik dezelfde pijptip en zuig onmiddellijk de pellets op en geef ze vijf keer af.
Selecteer vervolgens een 1,3 millimeter glazen pijp en gebruik deze om de monsters zachtjes 10 keer te tritureren. Plaats het monster gedurende twee minuten op ijs om het puin en niet-gedissocieerde cellen naar de bodem van de buis te laten zakken. Breng vervolgens de supernatant over naar een nieuwe 15 milliliter buis.
Voeg vervolgens 600 microliter Buffer A-oplossing toe aan het resterende pellet en gebruik een pijp met een diameter van 0,8 millimeter om het monster nog eens 10 keer te tritureren. Laat de weefsels na het zojuist gedemonstreerde proces zakken en verzamel de supernatant met de eerste celsuspensie en voeg nog eens 600 microliter buffer toe aan het pellet. Gebruik vervolgens een pijp met een diameter van 0,4 millimeter om het monster te tritureren en plaats de buis gedurende twee minuten op ijs om de weefsels te laten zakken.
Het volgen van de mechanische trituratie stappen in het protocol is belangrijk voor een succesvolle sortering. Daarna verzamelt u de supernatant met de gedissocieerde cellen. Voeg vervolgens 600 microliter Buffer A toe aan het monster en herhaal de trituratie met een 0,4 millimeter pijp nog drie keer.
Plaats de buizen gedurende twee minuten op ijs om de cellen te laten zakken. Verzamel vervolgens de supernatant in een tweede 15 milliliter buis. Herhaal het trituratieproces nog drie keer, waarbij u de kleinste glazen pijp gebruikt, wat de opbrengst van de cellen voor verdere sortering aanzienlijk verhoogt.
Nadat alle supernatanten zijn verzameld, voegt u 800 microliter negatieve 20 graden Celsius 100%ethanol toe aan vier mirobuizen op ijs. Breng vervolgens 800 microliter cellen van de eerste buis met verzamelde supernatant over in elk van de eerste twee buizen met ethanol en 800 microliter cellen van de tweede buis met supernatant in elk van de laatste twee buizen met ethanol. Keer de buizen om om de monsters te mengen.
Plaats de monsters vervolgens gedurende 15 minuten op ijs, met elke vijf minuten omdraaien. Aan het einde van de incubatie, centrifugeert u de cellen. Gebruik vervolgens een micropipet om alleen de wand van de microbuis aan te raken en verwijder langzaam alle oplosmiddelen behalve de laatste 50 microliter van elk supernatant.
Filter elk van de twee celsuspensies afzonderlijk met behulp van twee verschillende paren celfilters. De cellen zijn dan klaar voor labelen met antilichamen tegen de celmarkers van belang en sortering door middel van flowcytometrie. Analyse van verse en bevroren hersenweefselmonsters toont de aanwezigheid van kleine homogene populaties neuronale cellen met een vergelijkbare grootte en granulariteit.
De kleine homogene populaties kunnen worden gefilterd om eventuele celaggregaten uit te sluiten en de neuronen kunnen worden geïdentificeerd door hun NeuN en DAPI positiviteit. In zowel verse als bevroren weefselmonsters zijn NeuN mRNA niveaus ook significant hoger in de NeuN-positieve populaties dan in de NeuN-negatieve populaties. In tegenstelling daarmee zijn de glië- en oligodendrocytencelmarker mRNA niveaus hoger in de NeuN-negatieve populatie dan in de NeuN-pos
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) om moleculaire veranderingen te analyseren in Fos-expressieve neuronale ensembles uit zowel vers als ingevroren hersenweefsel. De mogelijkheid om ingevroren weefsel te gebruiken verhoogt de efficiëntie van het isoleren van neuronale cellen over meerdere sessies.
Belangrijke componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Neurobiologie
Achtergrond
- Fos-expresserende neuronen zijn belangrijk voor het bestuderen van neuroadaptaties.
- FACS maakt een nauwkeurige isolatie van specifieke neuronale populaties mogelijk.
- Het gebruik van bevroren weefsel kan het gebruik van proefdieren optimaliseren.
- Inzicht in moleculaire veranderingen in deze neuronen kan leiden tot inzichten in het gedrag.
Doel van de studie
- Om Fos-expresserende neuronen te dissociëren uit hersenweefsel.
- Om de studie naar moleculaire neuroadaptaties in geactiveerde neuronen te vergemakkelijken.
- Om de efficiëntie van celisolatie over meerdere sessies te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van vers of bevroren hersenweefsel van volwassen ratten.
- Gebruik van vorgekoelde scheermesjes voor het snijden van hersenweefsel.
- Dissectie van specifieke hersengebieden waarbij ongewenste delen worden verwijderd.
- Bevriezing van weefselmonsters voor langetermijnopslag en verdere verwerking.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle dissociatie van Fos-exprimerende neuronen uit hersenweefsel.
- Aantoonbare haalbaarheid van het gebruik van bevroren weefsel voor FACS.
- Verbeterde mogelijkheid om cellen uit meerdere hersengebieden te isoleren.
- Biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van neuronale moleculaire veranderingen.
Conclusies
- Het FACS-protocol is effectief voor het bestuderen van Fos-expresserende neuronen.
- Het gebruik van bevroren weefsel maximaliseert de benutting van proefdieren.
- Deze methode kan het begrip van neuronale adaptaties bevorderen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Dit protocol stelt biopharma R&D-teams in staat om Fos-expresserende neuronale ensembles te isoleren uit zowel vers als bevroren rattenbreinweefsel, ter ondersteuning van targetvalidatie bij de ontdekking van neuropsychiatrische geneesmiddelen. Door aan te tonen dat de opbrengsten en moleculaire getrouwheid tussen verse en bevroren monsters equivalent zijn, breidt deze methode het nut van waardevolle diermodellen uit die zijn onderworpen aan complexe gedragsparadigma's. Dit faciliteert moleculaire profilering met een hogere doorvoersnelheid van gedragsmatig geactiveerde neuronen, waardoor het voorspellend vertrouwen in studies naar target-engagement en padmodulatie wordt verbeterd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door moleculair gedefinieerde neuronale ensembles te isoleren die gekoppeld zijn aan aangeleerd gedrag.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door fenotypische bevestiging van gesorteerde populaties via de expressie van NeuN, GFAP, Oligo2 en Iba1-markers.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in het target door Fos mRNA-kwantificatie mogelijk te maken in gesorteerde Fos-positieve neuronen, waarbij waargenomen 3-voudige (vers) en 11-voudige (bevroren) stijgingen de transcriptionele specificiteit valideren.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Bereidt gedissocieerde single-cell suspensies voor die geschikt zijn voor antilichaamlabeling en FACS, waardoor gestandaardiseerde isolatie van neuronale en gliale subsets mogelijk wordt.
- Reproduceerbaarheid: Toont consistente gating van homogene neuronale populaties aan op basis van grootte en granulariteit in zowel verse als bevroren weefselcondities.
- Schaalbaarheid: Maakt het mogelijk om supernatanten van meerdere trituratiestappen te poolen om de opbrengst te verhogen, wat downstream moleculaire analyse vanuit beperkte monsterhoeveelheden ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Biedt een ziekterelevant systeem voor het bestuderen van moleculaire neuroadaptaties in geactiveerde neuronen, wat aansluit bij de translationele ontdekking van biomarkers bij neuropsychiatrische aandoeningen.
- Preklinische continuïteit: Maakt het gebruik mogelijk van bevroren weefsel dat tot 21 dagen bij -80°C is bewaard, waardoor batchverwerking van monsters uit uitgebreide gedragsexperimenten mogelijk is.
- Risico-geoptimaliseerde vooruitgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door moleculaire profilering van target-engagement in gedragsmatig gedefinieerde neuronale subsets over experimentele replica's heen toe te staan.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing tot lead-identificatie, waardoor moleculaire profilering van gedragsmatig geactiveerde neuronen mogelijk wordt gemaakt om de selectie van targets en studies naar het werkingsmechanisme te informeren.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden door Fos-expresserende neuronen te isoleren voor downstream genexpressieanalyse van neuronale activatietoestanden.
- Screening: Levert assay-klare celsuspensies met kwantitatieve output via FACS, waardoor vergelijking van de efficiëntie van de verwerking van vers versus bevroren weefsel mogelijk is.
- Analytiek: Genereert meetbare resultaten, waaronder Fos mRNA-niveaus en expressie van lineage-markers (NeuN, GFAP, Oligo2, Iba1), om de zuiverheid van de sortering en de fenotypische identiteit te valideren.
- Translationeel onderzoek: Legt een verbinding met preklinische validatie door moleculaire profilering mogelijk te maken van neuronale ensembles die menselijke neuropsychologische endofenotypen modelleren.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Creëert een herbruikbare capaciteit voor in biobanken bevroren weefsel, waardoor meerdere FACS-sessies bij enkelvoudige proefpersonen mogelijk zijn om de datopbrengst te maximaliseren en het gebruik van dieren te verminderen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van targets door gedragsactivatie te koppelen aan moleculaire signaturen in gedefinieerde neuronale populaties.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie via consistente workflows voor dissociatie en sortering, toepasbaar op zowel verse als bevroren inputs.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door longitudinale bemonstering mogelijk te maken uit complexe gedragsstudies zonder dat onmiddellijke verwerking vereist is.
- Impact op portfolio: Informeert risico-gecorrigeerde prioritering door moleculair bewijs te leveren van targetmodulatie in gedragsrelevant circuits.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in dissociatie van neuraal weefsel, enzymatische digestie en flowcytometrie om de cellevensvatbaarheid en de nauwkeurigheid van de sortering te waarborgen.
- Afhankelijk van toegang tot FACS-instrumentatie, koelruimtefaciliteiten en RNA-conserveermiddelen voor downstream genexpressie-analyse.
- Vereist standaardisatie tussen de neurowetenschappelijke en moleculair-biologische teams voor een consistente weefselverwerking en afstemming van het markerpanel.
- Aanpassing aan menselijk postmortem weefsel wordt ondersteund door het bronmateriaal, hoewel validatie van de epitopeestabiliteit en RNA-integriteit in langdurig ingevroren monsters noodzakelijk is.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van nauwkeurige mechanische trituratie om de opbrengst te maximaliseren en celklontering te voorkomen, zoals benadrukt in het protocol.
Veelgestelde vragen over Biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:43
Tissue Collection and Dissection
2:17
Cell Dissociation, Fixation and Permeabilization
5:52
Results: Representative Flow Cytometric and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Brain Tissue
7:16
Conclusion
