Name: Betrouwbaar en High Efficiency Winning van Kidney immuuncellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Leer een betrouwbare methode voor het isoleren van nierimmuuncellen voor multicolor flowcytometrie. Deze techniek is efficiënt en kosteneffectief in vergelijking met collageenasedigestie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door een onderzoekssubsidie van Dialysis Clinics Inc. en van de University of Missouri Research Board Grant.

Alle protocol stappen uitgevoerd werden beoordeeld en door de Universiteit van Missouri Animal Care en gebruik Comite (ACUC) goedgekeurd. Voor dit protocol werden mannelijke C57BL / 6 muizen 15 weken oud gebruikt hoewel theoretisch geen knaagdieren op elke leeftijd kan worden gebruikt voor experimenten. Aangezien dit een niet-survival operatie wordt euthanasie bereikt door verbloeding en bilaterale pneumothorax. 1. perfusie van de nieren Opmerking: perfusie van organen zoals hart, lever en nieren verwijdert het bloed die kunnen interfereren met de interpretatie van gegevens. Dus als we perfuseren mogelijk altijd de organen. <ol><li> Plaats de muis per isofluraan (3 ml / min) inductie kamer tot hij onbeweeglijk. Verwijder vervolgens de muis uit de kamer, leg het dorsaal op de snijtafel en plaats de isofluraan kegel op de muis neus en duw isofluraan met een snelheid van 1,5 ml / min door de toezichthouder. </li><li> Controleer de teen knijpen response met een pincet te beoordelen of het dier een chirurgische vlak van anesthesie is bereikt. Maak de ventrale buik met een zoutoplossing en opengesneden de buik met een schaar en duw de buikorganen (uit het chirurgische veld) aan de linkerkant van de muis. </li><li> Verzamelen bloed uit de vena cava inferior met een 25 gauge naald bevestigd aan een 1 cc injectiespuit toevoegen aan een 1,5 ml microcentrifugebuis met 10 gl 0,5 M EDTA. Let op: De inzameling van bloed is optioneel. Plasma kan worden gebruikt voor biochemische metingen. Leukocyten kunnen worden gebruikt voor flowcytometrie assays. </li><li> Met een schaar, een kleine snee in de rechter atria te laten uit het mengsel van bloed en PBS uit de volgende stap. </li><li> Neem een ​​50 cc spuit en vul met ijskoude PBS (20-30 cc). Maak vervolgens een 21-25 G op de spuit, doorboren de linker ventrikel op de top (terwijl het hart voorzichtig tussen forceps) en langzaam perfuseren de linker hartkamer met fosfaat gebufferde zoutoplossing pH 7,4 (PBS) in de loop1-2 min. Opmerking: Het hart blanches onmiddellijk na de eerste paar milliliters perfusie. Let op de lever voor het blancheren, omdat dit aangeeft dat de perfusie wordt het aftappen van bloed uit de lever via veneuze terugkeer door de vena cava. Bovendien, zorg ervoor dat de longen niet zijn uit te breiden tijdens de infusie, omdat dit aangeeft punctie van de rechter hartkamer. Als de longen waren om uit te breiden, in te trekken van de naald enigszins terug in de linker hartkamer en voortzetting van de perfusie. De duur van de eerste incisie tot euthanasie wordt bereikt minder dan 2 minuten </li></ol> 2. Dissectie van Nieren <ol><li> Na perfusie is voltooid, gebruik dan een schaar en een tang om de rechter nier van haar bijlagen (bloedvaten, vet en bijnieren) en accijnzen ontleden. </li><li> Verwijder voorzichtig de capsule die de nier door het snijden en ontleden met een pincet. Weeg de nier. Let op: Wegen van de nier is optioneel. Sommige experimentenkan leiden tot een verandering in nier afmeting / gewicht dat kan worden gebruikt om mobiele opbrengst per gram weefsel normaliseren. </li><li> Na weging van de nier, plaats het in 1 ml RPMI-1640 bevattende 0,5% FBS of flowcytometrie kleuring bufferoplossing (50 ml conische schroefdop tube) en plaats de buis op ijs tot verder gebruik. Opmerking: Voor het gemak van beschrijving, zullen de rest van de isolatie van immuuncellen in de flowcytometrie kleuring bufferoplossing beschrijven. Daarnaast zullen we de isolatie van immuuncellen beschrijven van een nier, hoewel beide nieren of 1 + 1/3 e van de nieren kan worden gebruikt afhankelijk van de stroomafwaartse experimenten (optioneel). 1/3 van de nier kan worden ingevroren voor eiwit / RNA experimenten en 1/3 rd kunnen buffers voor immunohistochemie of transmissie-elektronenmicroscopie worden geplaatst. </li></ol> 3. homogenisering van Nieren <ol><li> Label een 5-80 ml homogenisering zak met het monster identificatie-informatie,Verwijder de binnenkant zeef (STR) en gooi deze weg. Vul de zak met 5 ml ijskoude flowcytometrie vlekken buffer bevat en hevel nier aan de buffer. Herhaal dit proces voor een tweede monster of meer monsters die verwerking nodig. </li><li> Vouw de homogenisering zak in tweeën, zodat één helft heeft de nier ondergedompeld in de flowcytometrie Staining Bufferoplossing en de andere helft is gewoon omgevouwen is. </li><li> Zet het weefsel homogenisator en zet deze op een snelle (instelling) rpm. Plaats de gevouwen homogeniseren zak met de nieren tegenover de peddel, nabij de onderrand maar zorg ervoor dat het ondereinde van de zakken niet schuiven onder de onderrand van de schoepen. <ol><li> Verwerk de tweede monster tegelijk want er zijn 2 peddels. Selecteer tijd 120 sec. Observeer de schoepen heen en weer te schuiven om de nieren homogeniseren. Opmerking: Ondertussen kan deze downtime worden gebruikt om 2 meer nier (of ander weefsel) bereid monsters tijdens de eerste twee verwerken. </li></ol&gt; </li><li> Na het voltooien van de eerste set van homogenisering, de overdracht van de zakken om ijs en plaats het weefsel homogenisator met de volgende set van monsters en ga zo maar door. Visueel ervoor te zorgen dat de nieren voldoende gehomogeniseerd en er geen grote brokken zichtbaar zijn. Opmerking: In het algemeen, 2 min in weefselhomogenisator bij hoge rpm is voldoende voor de nier. </li><li> Plaats een 100 urn cel zeef in de 50 ml conische buis op ijs. Vervolgens pipet het homogenaat volledig aan de cel zeef. Stel een vloer centrifuge bij 50 xg gedurende 1 min bij 4 ° C en de samples in de centrifuge. Opmerking: Centrifugeren zal ervoor zorgen dat alle homogenaat (bevattende cellen) door de cel zeef is gepasseerd. </li><li> Verwijder de buizen uit de centrifuge en weer terugplaatsen op ijs. Gooi de cel zeven en houden het homogenaat. Voeg gelijk volume (~ 6 ml) 1x RBC lysis buffer om de celpellet / supernatant en de pipet op en neer meerdere keren een uniforme celsuspensie te maken. Visually, observeren enkele van de rode kleur in de suspensie daling onmiddellijk. Laat de buizen op ijs gedurende 5 min maximaal RBC lysis te bereiken. Let op: de RBC lysis stap kan worden overgeslagen als de onderzoeker heeft er alle vertrouwen van de nier perfusie en minder celmanipulatie gewenst is. We hebben een aanzienlijke toename niercellijn opbrengst waargenomen door niet onderwerpen van de celsuspensie RBC lysis. </li><li> Draai de buizen in de centrifuge die is ingesteld op 500 xg, 4 ° C gedurende 5 minuten om een ​​celpellet te vormen. Opmerking: Tijdens stappen 3.6 en 3.7, voor te bereiden op colloïdaal silica (Percoll) op basis van dichtheidsgradiënt centrifugeren. <ol><li> Neem 10 ml ronde bodem polypropyleen buizen en label ze met de bijbehorende aantallen monsters en leg ze in een buis rek. Opmerking: Het volgende beschrijft hoe voldoende dichtheidsgradiënt reagentia te maken voor 4 niermonsters. </li><li> Neem 7 ml van flowcytometrie vlekken buffer oplossing en pipet het in een 15 ml conische buis. Voeg 1 ml van 2 M sucrose totbereiden 0,25 M sucrose. </li><li> Vervolgens neemt 7,2 ml dichtheidsgradiënt reagens en pipet in een andere 15 ml conische buis. Voeg 1,55 ml flowcytometrie vlekken buffer-oplossing en 1,25 ml van 2 M sucrose voorbereiden 72% dichtheidsgradiënt reagens en 0,25 M sucrose. </li><li> Pipetteer 1 ml van 72% dichtheidsgradiënt reagens in een ronde bodem polypropyleen buis voor elk monster. </li></ol></li></ol> 4. gradiëntcentrifugering <ol><li> Na stap 3.7, nemen de buizen uit en voorzichtig decanteren van de bovenstaande vloeistof in een vloeiende beweging en ook decanteren de volgende druppel vloeistof die zich vormt, terwijl de buis ondersteboven wordt gehouden. Opmerking: Deze stap is belangrijk omdat het achterlaten van overtollige vloeistof kan de dichtheidsgradiënt genoeg variatie in de opbrengst te creëren. Wanneer de buis weer rechtop is ingesteld, ~ 200-300 ul van vloeistof blijft bij de cel pellet. </li><li> Pipetteer 1 ml van 0,25 M sucrose op de celpellet en voorzichtig maar krachtig pipet op en neer om brinG de cellen om een ​​uniforme suspensie. Voeg vervolgens de celsuspensie aan 1 ml 72% dichtheidsgradiënt reagens (3.7.4) en opnieuw krachtig pipet om de cellen te mengen met een 36% dichtheidsgradiënt reagens te vormen. </li><li> Neem 1 ml van de 72% dichtheidsgradiënt reagens in een polypropyleen Pasteur (transfer) pipet. Met gelijkmatige druk op de bol (houdt de kolom vloeistof in de punt en voorkomt belvorming), plaatst de Pasteur pipet op de bodem van de celsuspensie (36% dichtheidsgradiënt reagens) voorzichtig en verwijder een 72% dichtheidsgradiënt reagens onder vorming van een verschillende zwaarder laag. </li><li> Zoek het monsterbuizen voorzichtig en plaats in de centrifuge, die bij kamertemperatuur gedurende deze stap. Spin gedurende 20-30 min bij 500 x g. </li><li> Ondertussen bereiden nog twee sets van polypropyleen ronde bodem centrifugebuizen met de bijbehorende sample identifiers. </li><li> Na stap 4.4 is voltooid, verwijdert u het monster met polypropyleen buizen voorzichtig, met een minimum aan schudden en zet het neerop de buis rek. </li><li> Pak de eerste monsterbuis en de bijbehorende lege tube. Met een polypropyleen Pasteur pipet, grondig, maar voorzichtig met gemeten zuiging, verwijder de bovenste &quot;junk layer&quot; of &quot;kleverige materiaal&quot; en zet hem in de lege ronde bodem centrifugebuis. <ol><li> Gaat het verwijderen van het bovenste deel van de gradiënt tot de &quot;buffy coat&quot; wordt bereikt (verschijnen gebroken wit met een roodachtige tint [rode bloedcellen]). Stop met het afzuigen als een hoogte van ~ 3 mm is bereikbaar vanaf de &quot;buffy coat&quot;. Opmerking: Zorg ervoor dat dit soort dingen helemaal is verdwenen uit het bovenste gedeelte van de helling alvorens verder te zuigen. </li></ol></li><li> Neem een ​​frisse Pasteur pipet en een nieuwe ronde bodem centrifugebuis en verwijder voorzichtig de buffy coat. Blijven zuigen 3-5 mm onder de bufferlaag, zodat de meeste van de cellen verzameld en toegevoegd aan de 2e nieuwe ronde bodem buis met geschikte monsteridentificator. </li><li> Voeg 1-2 ml of Flowcytometrie kleuring Bufferoplossing de 2e buis en meng goed door en neer te pipetteren. </li><li> Spin down de cellen bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Een 2 e wasstap met flowcytometrie kleuring Buffer oplossing is optioneel. Resuspendeer in 500 pi van flowcytometrie vlekken buffer oplossing en ga aan de cellen te tellen met behulp van een hemocytometer. </li></ol> 5. Optioneel (Cell Labeling) <ol><li> Aliqout elk monster voor hetzelfde aantal cellen. Voeg het blokkerende antilichaam bij een verdunning van 0,5 g per 10 6 cellen (anti-CD16 / CD32 FcR) en incubeer op ijs gedurende 15 min. </li><li> Voeg de gewenste cocktail van primaire antilichamen (geconjugeerd met de geschikte fluoroforen) die bepaald goed met elkaar door de onderzoeker vóór het eigenlijke experimenten. Incubeer op ijs gedurende 30 min. Was de cellen met PBS. Opmerking: Voor de demonstratie van de nieren immuuncel labeling voor dit manuscript, gebruikten we een T-lymphocyte en een macrofaag / dendritische cel panel. De T-lymfocyten panel bestond uit opgelapt levensvatbaarheid Stain FVS510, anti-CD45 (kloon: 30-F11) BV421, Anti-Foxp3 (Clone: ​​FJK-16) APC, Anti-CD127 (Clone: ​​A7R34) PE / Cy7, anti- CD44 (Kloon: IM7) PerCP / Cy5.5, anti-CD4 (kloon: RM4-5) APC-Cy7, anti-CD8 (kloon: 53-6,7) BV785. De macrofaag panel bestond uit opgelapt levensvatbaarheid Stain FVS510, anti-CD45 (kloon: 30-F11) BV421, Anti-Ly6G (Clone: ​​1A8) FITC, anti-CD11b (Clone: ​​M1 / ​​70) PerCP-Cy5.5, Anti- F4 / 80 (Clone: ​​BM8) APC, Anti-CD 11 c (Clone: ​​N418) BV785. </li><li> Voeg de opgelapt levensvatbaarheid Stain en laat op de bank-top gedurende 5 minuten. Was de cellen met flowcytometrie kleuring Buffer oplossing voor overschrijding van de opgelapt levensvatbaarheid Stain verwijderen. </li><li> Voeg Fixatie / permeabiliseringsreagens en incubeer overnacht bij 4 ºC. Wassen in permeabilisatie oplossing. </li><li> Voor intracellulaire kleuring blok opnieuw met anti-CD16 / 32 FcR voor 10min. Voeg de intracellulaire vlekken en incubeer gedurende 20-30 min. Wash 2x in permeabilization oplossing. </li><li> Resuspendeer in Flowcytometrie vlekken buffer oplossing en run monsters door middel van FACS-machine 3,9. </li></ol>

<ol><li>Ascon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+characterization+of+kidney-infiltrating+lymphocytes+in+renal+ischemia+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury.</a> J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).</li>
<li>Ascon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+ischemia-reperfusion+leads+to+long+term+infiltration+of+activated+and+effector-memory+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Renal ischemia-reperfusion leads to long term infiltration of activated and effector-memory T lymphocytes.</a> Kidney Int. 75 (5), 526-535 (2009).</li>
<li>Belliere, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+macrophage+subtypes+influence+the+progression+of+rhabdomyolysis-induced+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagenase+digestion+down-regulates+the+density+of+CD27+on+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes.</a> J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).</li>
<li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+dendritic+cells+are+the+predominant+TNF-secreting+cell+in+early+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury.</a> Kidney Int. 71 (7), 619-628 (2007).</li>
<li>Hickey, F. B., Martin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+kidney+disease+and+immune+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Diabetic kidney disease and immune modulation.</a> Curr. Opin. Pharmacol. , (2013).</li>
<li>Kawakami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+renal+mononuclear+phagocytes+comprise+five+discrete+populations+with+distinct+phenotypes+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Resident renal mononuclear phagocytes comprise five discrete populations with distinct phenotypes and functions.</a> J. Immunol. 191 (6), 3358-3372 (2013).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+glomeruli+from+mice%3A+A+practical+approach+for+beginners%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Ther.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners.</a> Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).</li>
<li>Picot, J., Guerin, C. L., Le Van, K. C., Boulanger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+retrospective%2C+fundamentals+and+recent+instrumentation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation.</a> Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).</li>
<li>Ricardo, S. D., van, G. H., Eddy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+diversity+in+renal+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophage diversity in renal injury and repair.</a> J. Clin. Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).</li>
<li>Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Herrera-Acosta, J., Johnson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+immunocompetent+cells+in+nonimmune+renal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Role of immunocompetent cells in nonimmune renal diseases.</a> Kidney Int. 59 (5), 1626-1640 (2001).</li>
<li>Vielhauer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+renal+recruitment+of+macrophages+and+T+cells+in+mice+lacking+the+duffy+antigen%2Freceptor+for+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Efficient renal recruitment of macrophages and T cells in mice lacking the duffy antigen/receptor for chemokines.</a> Am. J. Pathol. 175 (1), 119-131 (2009).</li>
<li>Weisheit, C. K., Engel, D. R., Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Cells+and+Macrophages%3A+Sentinels+in+the+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Dendritic Cells and Macrophages: Sentinels in the Kidney.</a> Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , (2015).</li>
<li>Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagenase+lot+selection+and+purification+for+adipose+tissue+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion.</a> Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).</li>
<li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterioration+and+variability+of+highly+purified+collagenase+blends+used+in+clinical+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation.</a> Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).</li>
<li>Zhou, J., Nagarkatti, P., Zhong, Y., Nagarkatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+modulation+by+chondroitin+sulfate+and+its+degraded+disaccharide+product+in+the+development+of+an+experimental+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Immune modulation by chondroitin sulfate and its degraded disaccharide product in the development of an experimental model of multiple sclerosis.</a> J. Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We hebben hier voorgesteld een methode om immune cellen van de nier op betrouwbare en efficiënte wijze te verkrijgen. De belangrijkste wijziging van de veelgebruikte collagenase digestie stap (mechanische verbreking van weefsel) bespaart ongeveer 30 min en de isolatie van een groot aantal levensvatbare immuuncellen duurt minder dan twee uur 4 niermonsters. Bovendien, afhankelijk van onze vraagstelling we nu met een enkele nier (de andere nier kan worden gebruikt voor eiwitanalyse door Western blots, immunohistochemie en...

Immuunsysteem activeringssysteem voorkomt in meerdere nierziekten en pathofysiologische processen 6,10,11,13. Potentiële gebieden actief onderzoek omvatten de verschillende triggers voor activering van het immuunsysteem, verschillende celtypen betrokken, het cytokine / chemokine patroon in een bepaalde instelling ziekte modulatie van alle bovengenoemde processen een bepaald geneesmiddel etc. Om illustreren, ischemie-reperfusie verwonding (een model voor acuut nierfalen), er een toename in immune cellen of beenmerg afgeleide hematopoietische cellen of CD45 + cellen binnen enkele uren, die wordt ondersteund door de periode van herstel of fibrose (6 weken later) 5, 12. Deze immuunsysteem cellen scheiden zowel pro-inflammatoire en anti-inflammatoire cytokines en chemokines het herstelproces 5,12 orkestreren. Momenteel is de mogelijkheid om meerdere fluoroforen gelijktijdig om celpopulaties label in een enkele celsuspensie toe met de advertentievent van moderne machines met flowcytometrie 04:56 lasers. Dit heeft een aanzienlijke bijdrage aan de mogelijkheid om de celpopulaties op basis van de functionele status 3,7 discrimineren. Bijvoorbeeld, om nauwkeurig te etiketteren een macrofaag als F4 / 80 laag CD11b hoge Ly6b hoge CD206 laag, ten minste 3 meer fluoroforen nodig zou zijn in hetzelfde monster volume gate voor levende cellen, CD45 + (leukocyten) en Ly6G- (neutrofielen) en dit is zeer goed mogelijk met de nieuwere flowcytometers 3. De stroomafwaartse testen voor cytokine secretie, celproliferatie, cytotoxiciteit, macrofaagactivering en kwantificering van aantallen verschillende subsets van lymfocyten en monocyten moet niet alleen goede kwaliteit (levende cellen, singlets) maar voldoende aantallen cellen. Het immuunsysteem in de nier is opgebouwd uit zowel adaptieve en aangeboren componenten en meerdere celtypen 1,7,13. Bijvoorbeeld, bij muizen de twee kidneys elkaar worden gerapporteerd aan 2-17% bevatten (28,000-266,000) CD45 + cellen van het totale nier immuuncellen geïsoleerd (1,4 x 10 6 cellen) en ongeveer 5-15% (1,400-4,200) van deze CD4 + -cellen 1 , 5,12. Een klein percentage (5-15%, 70-630) van deze CD4 + cellen Foxp3 + cellen (figuur 1) 1. Door deze trapsgewijze verlaging percentages cellen soms celpopulatie (in dit geval CD45 + CD4 + Foxp3 + cellen) wordt voorgesteld met slechts ~ 100 cellen. Het kleine aantal CD45 + CD4 + Foxp3 + cellen maakt het noodzakelijk dat een groot aantal totale cellen worden geïsoleerd en de cellen zijn van goede kwaliteit voor downstream studies zoals cytokine secretie assays. Bovendien kan het nodig zijn nieren combineren 2-3 muizen aangezien de subpopulaties niet hoog genoeg getallen worden kwantificeerbare assays. Dus betrouwbare en efficiënte isolatie van nier mononucleaire celpopulaties is wenselijk om study de immunologische spectrum geassocieerd met nierziekten. Traditioneel, voor het isoleren van mononucleaire cellen nieren, onderzoekers hebben verschillende enzymatische digesties zoals collagenase 1A of II zoals DNase 1 1,5,12 gebruikt. Het is bekend dat collagenasen hebben enzymatische activiteit die varieert met lotnummers en bedrijf van vervaardiging, noodzakelijk titratie de optimale concentratie en de incubatie 4,14,15. Daarnaast digestie met collagenase voegt tijd voor hakken de nier in kleine stukjes, noodzakelijk incubatie van de nier stukken in een verwarmde (37 ° C) bad en extra tijd voor incubatie in EDTA voor het stoppen van de reactie. Bovendien kunnen minder steriliteit worden bereikt voor bepaalde stroomafwaartse procedures nodig celkweek. Belangrijker is afhankelijk van de onderzoeker en alle variabelen betrokken, leidt de variabiliteit van de gegevens en interpretatie in laboratoria. Onlangs heeft deontwikkeling van mechanische weefsel verstoorders / homogenisatoren 16, wordt de collagenase digestie stap volledig worden vermeden en vervangen door een eenvoudige mechanische verbreking van de nieren 2. Hierin tonen we een eenvoudige maar efficiënte methode voor het isoleren van de nier immuuncellen voor dagelijks immuuncel extracties. Belangrijk Deze techniek kan worden aangepast aan andere zachte en non-vezelige weefsels zoals de lever en hersenen 16.

<table><tbody><tr><td>Stomacher 80 Biomaster lab system</td><td>Seward</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 Classic bags</td><td>Seward</td><td>BA6040/STR</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XFR Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Of gelijkwaardige apparatuur&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63514-11</td><td></td></tr><tr><td>Analytische flowcytometer</td><td>BD LSR-X20 Fortessa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1644</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s fosfaat gebufferde zoutoplossing 1x (DPBS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Polypropyleen buizen, geen dop</td><td>Becton Dickinson</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>Fixeerbare levensvatbaarheidskleurstof</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>FVS510,&nbsp; 564406</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 (Clone: 93)</td><td>EBioscience</td><td>14-0161</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (clone: 30-F11)&nbsp; BV421&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>103133/4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC</td><td>EBioscience</td><td>17-5773</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>135013/4</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>103031/2</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>100413/4</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785</td><td>Biolegend</td><td>100749/50</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC</td><td>Biolegend</td><td>127605/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>101227/8</td><td></td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC</td><td>Biolegend</td><td>123115/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11c (Clone: N418) BV785</td><td>Biolegend</td><td>117335/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>145705/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE</td><td>Biolegend</td><td>137803/4</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu;m filter&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tubes 50 ml</td><td>Fisher</td><td></td><td>Of gelijkwaardige apparatuur&nbsp;</td></tr><tr><td>Fisherbrand Tubes 15 ml</td><td>Fisher</td><td></td><td>Of gelijkwaardige apparatuur&nbsp;</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher chemical</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipet met fijne punt</td><td>Samco Scientific</td><td>232</td><td>Of gelijkwaardige apparatuur&nbsp;</td></tr><tr><td>Flow Cytometry Kleurstofbufferoplossing</td><td>EBioscience</td><td>00-4222-26</td><td>Of gelijkwaardige apparatuur&nbsp;</td></tr><tr><td>1x RBC Lysis Buffer</td><td>EBioscience</td><td>00-4333-57</td><td>Of gelijkwaardige apparatuur&nbsp;</td></tr></tbody></table>

betrouwbaar en high efficiency winning van kidney immuuncellen



Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Activering van het immuunsysteem komt voor bij meerdere nierziekten en pathofysiologische processen. Het immuunsysteem bestaat uit zowel adaptieve als aangeboren componenten en meerdere celtypen. Soms is het celtype van belang aanwezig in zeer lage aantallen tussen de grote aantallen van de totale cellen die uit de nier zijn geïsoleerd. Daarom is betrouwbare en efficiënte isolatie van mononucleaire niercelpopulaties belangrijk om de immunologische problemen geassocieerd met nierziekten te bestuderen. Traditioneel werd weefselisolatie van mononucleaire niercellen uitgevoerd via enzymatische verteringen met behulp van verschillende variëteiten en sterktes van collagenasen/DNAsen, wat variërende aantallen levensvatbare immuuncellen opleverde. Recentelijk, met de ontwikkeling van de mechanische weefseldissociatiemiddelen voor isolatie van enkele cellen, is de collagenase verteringsstap vermeden en vervangen door een eenvoudige mechanische dissipatie van de nieren na extractie uit de muis. Hierin demonstreren we een eenvoudige maar efficiënte methode voor de isolatie van mononucleaire niercellen voor dagelijkse immuuncelextracties. We demonstreren verder een voorbeeld van subsetanalyse van immuuncellen in de nier. Belangrijk is dat deze techniek kan worden aangepast aan andere zachte en niet-fibrose weefsels zoals de lever en hersenen.

Het aantal panelen kan worden uitgevoerd afhankelijk van het aantal immuuncellen die betrouwbaar uit de nieren kan worden gewonnen. Hierin tonen we de mogelijkheid om panelen 2, een voor T-lymfocyten en voor macrofagen / dendritische cellen in werking. Op de T-lymfocyten panel, moeten we eerst kijken naar de voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) patroon en de afbakening van de populatie van belang, zoals weergegeven in figuur 1 (linksboven puntd...

Technieken die betrouwbaar en efficiënt zijn voor het isoleren van immuuncellen in de nieren zijn nodig voor downstream-toepassingen. Dit vereist oppervlakte-antilichaammarkering van een klein aantal immuuncellen in de nieren. Hierin beschrijven we een beknopte methode voor het isoleren van immuuncellen in de nieren die schijnbaar dit doel bereikt.

Betrouwbaar en High Efficiency Winning van Kidney immuuncellen

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

Het algemene doel van dit protocol voor de isolatie van immuuncellen uit de nier is het extraheren van levensvatbare enkelcel-suspensies van niereimmuuncellen in voldoende aantallen voor verdere analyse middels multicolor flowcytometrie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek, in vergelijking met collagenase-digestie, is de mogelijkheid om op een betrouwbare en goedkope manier een groot aantal niereimmuuncellen te isoleren voor verdere experimentele analyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de nierimmunobiologie.Bijvoorbeeld, welke subset van immuuncellen in de nier de secretie van cytokinen of chemokinen reguleert bij een specifieke nierziekte. Deze methode wordt gedemonstreerd voor de isolatie van immuuncellen uit de nier. Desalniettemin kan deze eenvoudig worden aangepast om cellen te isoleren uit andere systemen, zoals de lever of de hersenen.Vandaag demonstren we een procedure voor het verzamelen van immuuncellen uit de nieren. De procedure zal worden gedemonstreerd door Alex Meuth, een onderzoeksspecialist uit mijn laboratorium. Nadat is bevestigd dat er geen reactie is op een knijpje in de teen, gebruikt u 70% ethanol

reliable-and-high-efficiency-extraction-of-kidney-immune-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In this video, we describe the procedure for kidney extraction from the retroperitoneal space of the mouse. The extracted kidney can further be microdissected to obtain an intact kidney without a renal capsule and the surrounding fat layer.

Extracting Intact Kidney from Mouse: A Technique to Obtain Kidney Without Renal Capsule from Murine Models

DNabT cellen zijn zeldzaam onder perifere T-cellen; maar ze zijn er in overvloed in bepaalde niet-lymfoïde weefsels. Moeilijkheid van het isoleren van DN T-cellen van niet-lymfeweefsel belemmert hun functionele analyse Ondanks toenemende erkend pathofysiologische betekenis. We beschrijven een nieuw protocol voor isolatie van hooggezuiverde DN T-cellen van muizen nier.

Isolatie van Double Negative αβ T-cellen uit de nier

Dit protocol beschrijft de decellularisatie van Sprague Dawley rattennieren door antegrade perfusie van detergenten door het vaatstelsel, waardoor acellulaire nier extracellulaire matrices ontstaan die dienen als sjablonen voor herbevolking met menselijke nier epitheliale cellen. Recellularisatie en het gebruik van de resazurin perfusie assay om groei te monitoren wordt uitgevoerd binnen speciaal ontworpen perfusie bioreactoren.

Epitheelcellen Herbevolking en voorbereiding van knaagdieren extracellulaire matrix Stellingen voor nierweefsel Development

Hier presenteren we een nieuwe klinische rang isolatie en cultuur methode voor nieren gerelateerde stromale cellen (kPSCs) op basis van hele orgel perfusie met spijsverteringsenzymen en NG2-cel verrijking. Met deze methode is het mogelijk om het verwerven van voldoende cel nummers voor cellulaire therapie.

Een nieuwe klinische Grade isolatie methode voor menselijke nieren gerelateerde stromale cellen

De belangrijkste focus van dit protocol is efficiënt isoleren levensvatbare primaire glomeruli culturen met minimale contaminanten voor gebruik in een verscheidenheid van downstream toepassingen. De geïsoleerde glomeruli structurele relaties tussen component celtypes behouden en kunnen gekweekte ex vivo voor een korte tijd.

Een efficiënte zeven methode te isoleren Intact Glomeruli van de nier van volwassen ratten

De combinatie van antilichaam etikettering, optische clearing en geavanceerde Lichtmicroscopie maakt een driedimensionale analyse van complete structuren of organen mogelijk. Hier beschreven is een eenvoudige methode om immunolabeling van dikke nierschijfjes te combineren, optische clearing met ethyl CINNAMAAT, en confocale beeldvorming die visualisatie en kwantificering van driedimensionale nierstructuren mogelijk maakt.

Optische clearing en beeldvorming van Immunolabeled nierweefsel

microRNA's zijn betrokken bij de pathogenese van IgA-nefropathie. We hebben een betrouwbare methode ontwikkeld voor het detecteren van microRNA-expressieniveaus in de nieren van een IgA-nefropathiemuismodel (HIGA-muizen). Deze nieuwe methode zal het gemakkelijker maken om te controleren op betrokkenheid van miRNA's bij IgA-nefropathie.

Detectie van microRNA-expressie in de nieren van immunoglobuline A nefropathische muizen

Na virale infectie, nier herbergt een relatief groot aantal CD8+ T cellen en biedt een kans om niet-mucosale TRM cellen te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol om muisnierlymfocyten te isoleren voor stromingscytometrieanalyse.

Isolatie van Mouse Kidney-Resident CD8+ T cellen voor Flow Cytometry Analysis

Hier presenteren we een protocol om hoogwaardige kernen uit bevroren muizennieren te isoleren die de representatie van medullaire nierceltypen verbeteren en de genexpressieartefacten van enzymatische weefseldissociatie vermijden.

Nuclei-isolatie van volwassen muizennier voor single-nucleus RNA-sequencing

Hier wordt een protocol gerapporteerd voor de selectieve ablatie van renale macrofagen om hun regeneratie te bestuderen met behulp van de menselijke CD59/intermedialysine-celablatietool. Deze methode is ook toepasbaar voor het bestuderen van de functie en regeneratie van de andere celpopulaties in de nieren, lever en vetweefsel.

Snelle uitputting van niermacrofagen met behulp van menselijke CD59/Intermedilysin Cell Ablation Tool

Deze studie ontwikkelde een geoptimaliseerd protocol voor de isolatie van muizen mesangiale cellen (MC's) en hun ex vivo celcultuur. Deze cellen kunnen meerdere keren worden gepasseerd, ingevroren, nieuw leven ingeblazen en gekweekt zonder de celgroei of eiwitexpressie in gevaar te brengen.

Optimalisatie van isolatie en zuivering van muriene glomerulaire mesangiale cellen

Leer een betrouwbare methode voor het isoleren van nierimmuuncellen voor multicolor flowcytometrie. Deze techniek is efficiënt en kosteneffectief in vergelijking met collageenasedigestie.

Betrouwbaar en High Efficiency Winning van Kidney immuuncellen

Meer video's verkennen