Name: Genetische manipulatie van een onconventionele Gist voor duurzame biobrandstoffen en biochemische Production (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Leer een efficiënte methode voor genetische transformatie en gerichte gendeletie in Yarrowia lipolytica Po1g. Deze techniek verbetert homologe recombinatie via KU70-deletie voor duurzame biobrandstoffen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij dankbaar erkennen de financiële steun van de National Environment Agency van Singapore (ETRP 1.201.102), de Competitive Research Program van de National Research Foundation van Singapore (NRF-CRP5-2009-03), het Agentschap voor Wetenschap, Technologie en Onderzoek van Singapore ( 1324004108), Global R &amp; D Project Program, het ministerie van kenniseconomie, de Republiek Korea (N0000677), het Defense Threat Reduction Agency (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) en de Synthetische Biologie initiatief van de National University of Singapore ( DPRT / 943/09/14).

1. Generatie van de Y. lipolytica Ku70 Schrapping Strain <ol><li> Constructie van de onderbrekingscassette Opmerking: Zie tabel 1 voor alle primers gebruikt in polymerase kettingreactie (PCR) amplificatie. <ol><li> Ontwerp primers 20 PCR amplificeren het LEU2 expressiecassette (zie tabel 1) van een Y. lipolytica expressievector en introduceren loxP plaatsen in de 5 &#39;en 3&#39; uiteinden van het LEU2 cassette met een lange voorwaartse primer (# 1, Tabel 1) en trapt reverse primer (# 2, tabel 1), respectievelijk. Om een extra restrictieplaats voor daaropvolgende stappen van het klonen introduceren, voeg een BamHI-restrictieplaats in primer # 1. </li><li> PCR uitvoeren met behulp van een high-fidelity DNA polymerase zoals beschreven in tabel 2. </li><li> Zuiver het PCR product LoxP-promoter-LEU2-terminator-cassette LoxP met een PCR purification kit volgens instructies van de fabrikant. Add 3&#39;-A overhang aan de gezuiverde PCR-product volgens de instructies van de fabrikant 21. Gebruik T4 DNA ligase aan de A-staart PCR product ligeren in een TA-kloneringsvector van het plasmide T-LEU2 werd verkregen volgens tabel 3. </li><li> PCR amplificeren van het 1 kb 5 &#39;stroomopwaartse sequentie van het gen Ku70 gebruikmaking van primers # 3 / # 4 van Y. lipolytica Po1g genomisch DNA 22 volgens tabel 2. Zuiver het PCR product met een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. <ol><li> Dubbel digest zowel het gezuiverde PCR-product en T-LEU2 plasmide met SacII en BamHI enzymen volgens Tabel 4. Zuiver het digestiemengsel behulp van een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Gebruik T4 DNA ligase aan het ligeren gezuiverde en gedigereerde PCR product aan het SacII / BamHI-plaatsen van T-LEU2 het leverenplasmide T-LEU2-5E volgens Tabel 3. </li></ol></li><li> PCR amplificeren van het 1 kb 3 &#39;stroomafwaartse sequentie van het gen Ku70 gebruik van primers # 5 / # 6 van Y. lipolytica Po1g genomisch DNA 22 volgens tabel 2. Zuiver het PCR product met een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Dubbel digest zowel het gezuiverde PCR-product en T-LEU2-5E plasmide met NotI en NdeI enzymen volgens Tabel 4. <ol><li> Zuiver het digestiemengsel behulp van een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Vervolgens ligeren gezuiverde en gedigereerde PCR product aan de NotI / NdeI-plaatsen van T-LEU2-5E het plasmide T-KO met T4 DNA ligase zoals in Tabel 3 verkregen. </li></ol></li><li> Digest het plasmide T-KO met SacII en NdeI enzymen volgens tabel 4 de onderbrekingscassette produceren (Figuur 1 </strong&gt;). Zuiver het gedigereerde DNA-fragmenten onder toepassing van een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. </li></ol></li><li> Bevoegde voorbereiding en transformatie van Y. cel lipolytica Po1g stam <ol><li> Bevoegde celpreparaat <ol><li> Inoculeer een kolonie van Y. lipolytica Po1g soort uit verse gistextract-pepton-dextrose (YPD) plaat in 10 ml YPD-medium (1% gistextract, 2% pepton, 2% glucose en 50 mM citraatbuffer pH 4,0) in een 100 ml kolf. Incubeer in een 30 ° C incubator schudden bij 225 rpm gedurende 20 uur tot verzadiging (een OD 600 van ongeveer 15, gemeten met een spectrofotometer). </li><li> Pellet de cellen door centrifugeren gedurende 5 min bij 5000 xg bij kamertemperatuur. Was de cellen met 20 ml Tris-EDTA (TE) -buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5), en de pellet cellen zoals beschreven in stap 1.2.1.2. Resuspendeer de cellen in 1 ml 0,1 M lithium acetaat (pH 6,0, aangepast met azijnzuur) en incubeer gedurende 10 minuten bij kamer- tempetuur. </li><li> Aliquot de competente cellen (100 pl) in steriele 1,5 ml buizen. Overgaan tot de transformatie onderstaande stappen direct of voeg glycerol tot een uiteindelijke concentratie van 25% (v / v) en bewaar bij -80 ° C voor langdurige opslag. </li></ol></li><li> transformatie <ol><li> Meng 10 pi gedenatureerd zalmsperma-DNA (10 mg / ml) en 1-5 ug van het gezuiverde onderbrekingscassette met 100 pi competente cellen en incubeer bij 30 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Voeg 700 ul van 40% polyethyleenglycol (PEG) -4000 (opgelost in 0,1 M lithium acetaat pH 6,0), mengen en incuberen in een 30 ° C incubator schudden bij 225 rpm gedurende 60 min. Opmerking: Het is belangrijk om PEG te gebruiken met een gemiddeld molecuulgewicht van 4000 in plaats van PEG-3350 (standaard gebruikt in de transformatie van conventionele gist). </li><li> Hitteschok het transformatiemengsel door het plaatsen van de buis in een 39 ° C waterbad gedurende 60 minuten. </li><li> Voeg 1 ml YPD medium enherstellen gedurende 2 uur bij 30 ° C en 225 rpm. Centrifugeer bij 9000 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 ml TE-buffer. </li><li> Repellet de cellen door centrifugeren bij 9000 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur en gooi het supernatant. Resuspendeer de pellet in 100 ui TE buffer en plaat op selectieve platen (bijvoorbeeld leucine-deficiënte platen), en incuberen bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen. </li><li> Pick 4-10 enkele kolonies en te enten afzonderlijk in 2 ml YPD medium. Incubeer overnacht in een 30 ° C incubator schudden bij 225 rpm. Positieve kolonies te identificeren door PCR-analyse van genomisch DNA van de transformanten 22 volgens Tabel 5 met twee sets van primers # 55 / # 56 en # 56 / # 57, respectievelijk. Opmerking: De Niet lineair I pYLEX1 vector wordt getransformeerd in Y. lipolytica Po1g competente cellen om de transformatie-efficiëntie te bepalen door het tellen van het aantalkolonievormende eenheden (cfu) per ug plasmide DNA dat 23. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Marker Rescue <ol><li> De bouw van het Cre-expressieplasmide <ol><li> De bouw van pYLEX1-CRE en pYLEX1-HPH <ol><li> Ontwerp primers 20 PCR versterken de open reading frames van CRE en HPH. Voeg een extra adenine nucleotide stroomopwaarts van de start codons in de voorwaartse primers # 82 en # 84, en plaatst KpnI restrictieplaatsen stroomafwaarts van de stopcodons in omgekeerde primers # 83 en # 85 PCR amplificeren van het open reading frames van cre en HPH van pSH69 (toegangsnummer HQ412578) 24 volgens tabel 2. </li><li> Zuiver zowel cre HPH en fragmenten onder toepassing van een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Digest zowel de gezuiverde cre en HPH fragmenten met Kpn I enzym als per Table 4. Double verteren de pYLEX1 plasmide met Pml en KpnI enzymen volgens Tabel 4. Zuiver het digestiemengsel behulp van een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. </li><li> Gebruik T4 DNA ligase volgens tabel 3 de gezuiverde en gedigereerde cre HPH en fragmenten Pml I / KpnI-plaatsen van de Y. ligeren lipolytica expressie vector, waarbij pYLEX1-CRE en pYLEX1-HPH respectievelijk. </li></ol></li><li> De bouw van pSL16-CRE-HPH <ol><li> PCR amplificeren van de promoter-gen-terminator cassette cre van pYLEX1-CRE behulp van primers # 86 / # 87 aan weerszijden van de SalI / PstI restrictieplaatsen zoals in tabel 2. Zuiver het PCR product met een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant . <ol><li> Dubbele verteren zowel de gezuiverde PCR-product en pSL16-CEN1-1 (227) 25 plasmide met SalI enPstI enzymen volgens Tabel 4. Zuiver het digestiemengsel behulp van een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Vervolgens ligeren gezuiverde en gedigereerde PCR product in pSL16-CEN1-1 (227) aan de overeenkomstige plaatsen met pSL16-CRE maken met T4 DNA ligase zoals in Tabel 3. </li></ol></li><li> PCR amplificeren van de promoter-gen-terminator cassette HPH van pYLEX1-HPH behulp van primers # 88 / # 89 aan weerszijden van de XhoI / BglII restrictieplaatsen zoals in tabel 2. Zuiver het PCR product met een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant . <ol><li> Dubbel digest zowel het gezuiverde PCR-product en pSL16 CRE-plasmide met XhoI en BglII enzymen volgens Tabel 4. Zuiver het digestiemengsel behulp van een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Vervolgens ligeren gezuiverde en gedigereerde PCR product in pSL16-CRE tegen de desbetreffendesites pSL16-CRE-HPH genereren met T4 DNA ligase zoals in Tabel 3. Opmerking: De resulterende Cre-expressieplasmide, pSL16-CRE-HPH, herbergt een selecteerbare marker en hygromycine B is een centromeer en episomaal replicerende vector (Figuur 2). </li></ol></li><li> Controleer alle constructen door digestie met geschikte restrictie-enzymen (bijvoorbeeld SalI / PstI, de insertie van de vector uitsnijden) volgens Tabel 4. </li></ol></li></ol></li><li> Cre-recombinase gemedieerde marker rescue <ol><li> Transformeer pSL16-CRE-HPH in competente cellen van de Ku70 knock-out stam na de transformatie protocol in paragraaf 1.2 hierboven beschreven. Plaat getransformeerde cellen op YPD plus hygromycine B (YPDH) platen (bevattende 400 ug / ml hygromycine B) en incubeer bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen. </li><li> Voer kolonie PCR volgens Tabel 5 met behulp van primers # 84 / # 85 te identificeren positiefkolonies die pSL16-CRE-HPH plasmide na transformatie. Opmerking: De voorwaartse primer # 84 en de reverse primer # 85 bevinden zich in het coderende gebied van HPH gen (tabel 1). Alleen positieve klonen met een specifiek PCR-product in de PCR reactie. </li><li> Kies een positieve kloon en te enten in 2 ml YPDH medium, en incubeer in een 30 ° C incubator schudden bij 225 rpm overnacht tot verzadiging. Meet de cel OD 600 met een spectrofotometer. Oogst de cellen bij een OD 600 van ~ 15. Centrifugeer bij 5000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, en eenmaal wassen met 2 ml steriel water. </li><li> Beënten cellen in 2 ml YPD-medium met een initiële OD 600 van 0,1 en laat de cellen gedurende de nacht groeien in een 30 ° C incubator schudden bij 225 rpm. Streak de nachtelijke celkweek op YPD platen om enkele kolonies 23 isoleren. Replica plaat kolonies op YPD, YPDH en leucine-deficiënte platen 23 </sup&gt;. Opmerking: Kolonies die zowel LEU2-merker hebben verloren en pSL16-CRE-HPH plasmide alleen groeien op YPD platen (figuur 3). </li></ol></li></ol> 3. Schrapping van alcoholdehydrogenase en Alcohol oxidase Genes <ol><li> Voer een zoekopdracht uit op de Y. lipolytica genoom database met behulp van de Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) om het gen kandidaten te identificeren voor verwijdering 26. Voer de eiwitsequentie van S. cerevisiae alcohol dehydrogenase I in BLAST onderzoekshulpmiddel (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&amp;db=yli&amp;seqid=aa). Opmerking: De BLAST onderzoekshulpmiddel retourneert de meest gelijkende eiwitsequenties in Y. lipolytica genoomdatabank. </li><li> Construct de verwijdering cassettes door PCR met primers # 7 tot # 56 (tabel 1), en het uitvoeren van restrictie-enzym vertering en ligatiereacties met behulp van dezelfde methoden zoals beschreven in paragraaf 1.1 hierboven. </li><li> Prepzijn competente cellen van de Ku70 knockout stam voeren transformaties en uitvoeren PCR positieve kolonies identificeren met primers # 55, # 58 tot # 81 (Tabel 1) volgens de in paragraaf 1.2 hierboven beschreven protocol. Opmerking: Als voorbeeld wordt de procedure voor de YALI0E17787g gendeletie beschreven in figuren 4 en 5. De effecten van 1 kb en 2 kb lange homologe gebied op homologe recombinatie rate worden gerapporteerd. </li></ol>

<ol><li>Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJim%C3%A9nez-Bremont%2C+JF+%22Development+and+dimorphism+of+the+yeast+Yarrowia+lipolytica.+Dimorphic+fungi%3A+Their+importance+as+models+for+differentiation+and+fungal+pathogenesis%22">Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis</a>. J, R. uiz-H. errera , 58-66 (2012).</li>
<li>Coelho, M., Amaral, P., Belo, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoelho%2C+M+%22Yarrowia+lipolytica%3A+an+industrial+workhorse.+Current+research%2C+technology+and+education+topics+in+applied+microbiology+and+microbial+biotechnology%22">Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology</a>. Méndez-Vilas, A. , 930-940 (2010).</li>
<li>Martinez-Vazquez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+transcription+factor+Znc1p%2C+which+regulates+the+yeast-to-hypha+transition+in+the+dimorphic+yeast+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica.</a> Plos One. 8 (6), e66790(2013).</li>
<li>Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagging+morphogenetic+genes+by+insertional+mutagenesis+in+the+yeast+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica.</a> J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).</li>
<li>Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dimorphic+yeast+Yarrowia+lipolytica+possesses+an+atypical+phosphofructokinase%3A+characterization+of+the+enzyme+and+its+encoding+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene.</a> Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).</li>
<li>Domìnguez, Á, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-conventional+yeasts+as+hosts+for+heterologous+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production.</a> Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).</li>
<li>Zinjarde, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food-related+applications+of+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Food-related applications of Yarrowia lipolytica.</a> Food Chem. 152, 1-10 (2014).</li>
<li>Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+acid+production+by+the+yeast+Yarrowia+lipolytica%3A+a+review+of+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Biochem.+Micro%2B%22%5BJournal%5D)">Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects.</a> Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).</li>
<li>Groguenin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+the+%CE%B2-oxidation+pathway+in+the+yeast+Yarrowia+lipolytica+to+increase+the+production+of+aroma+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Catal.+B-Enzym%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds.</a> J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiesel+production+from+oleaginous+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Renew.+Energ%22%5BJournal%5D)">Biodiesel production from oleaginous microorganisms.</a> Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).</li>
<li>Papanikolaou, S., Aggelis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+production+by+Yarrowia+lipolytica+growing+on+industrial+glycerol+in+a+single-stage+continuous+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technol%22%5BJournal%5D)">Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture.</a> Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).</li>
<li>Tai, M., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+push+and+pull+of+lipid+biosynthesis+in+oleaginous+yeast+Yarrowia+lipolytica+for+biofuel+production%5BTitle%5D)+AND+%22Metab.+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production.</a> Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).</li>
<li>Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotechnological+applications+of+Yarrowia+lipolytica%3A+Past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future.</a> Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).</li>
<li>Liu, L., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Draft+genome+sequence+of+the+oleaginous+yeast+Yarrowia+lipolytica+PO1f%2C+a+commonly+used+metabolic+engineering+host%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announc%22%5BJournal%5D)">Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host.</a> Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).</li>
<li>Dujon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+evolution+in+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome evolution in yeasts.</a> Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).</li>
<li>Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+transformation+of+the+dimorphic+yeast+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbial.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica.</a> Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).</li>
<li>Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+by+electroporation+of+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica.</a> J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).</li>
<li>Matsuoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+regions+essential+for+the+function+of+chromosomal+replicator+sequences+from+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica.</a> Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).</li>
<li>Kretzschmar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+homologous+integration+frequency+in+Yarrowia+lipolytica+strains+defective+in+non-homologous+end-joining%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining.</a> Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+Chain+Reaction%3A+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Kobs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+blunt-end+DNA+fragments+into+the+pGEM-T+Vector+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Promega+Notes%22%5BJournal%5D)">Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems.</a> Promega Notes. 62, 15-18 (1997).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Isolating Nucleic Acids from Yeast. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast">http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast</a> (2016).</li>
<li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+laboratory+techniques%3A+plating+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> J. Vis. Exp. (63), e3064(2012).</li>
<li>Hegemann, J. H., Heick, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delete+and+repeat%3A+a+comprehensive+toolkit+for+sequential+gene+knockout+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).</li>
<li>Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+centromeric+DNA+from+yeast+Yarrowia+lipolytica+and+identification+of+protein-binding+site+required+for+plasmid+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission.</a> J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).</li>
<li>McGinnis, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAST%3A+at+the+core+of+a+powerful+and+diverse+set+of+sequence+analysis+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools.</a> Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).</li>
<li>Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+hybrid+promoters+and+integrative+expression%2Fsecretion+vectors+for+quasi-constitutive+expression+of+heterologous+proteins+in+the+yeast+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica.</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).</li>
<li>Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yarrowia+lipolytica%2C+a+yeast+model+for+the+genetic+studies+of+hydroxy+fatty+acids+biotransformation+into+lactones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Catal.+B-Enzym%22%5BJournal%5D)">Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones.</a> J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De doelstelling van dit onderzoek is om snel en efficiënt genereren van gerichte gen knockouts schakelen in de Y. lipolytica Po1g stam. Verschillende overwegingen moeten worden aangepakt om dit te bereiken. Eerst wordt een hoge transformatie-efficiëntie nodig. Aldus wordt een efficiënte en geschikte chemische transformatie protocol voor Y. lipolytica Po1g stam werd beschreven in deze studie. Het gebruik van PEG-4000 is een kritische factor voor de succesvolle transformatie van deze stam. Geen ...

Unlike Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, een onconventionele gist kan groeien in de vorm van gist of mycelium in reactie op veranderingen in de omgevingscondities 1,2. Aldus kan deze dimorfe gist gebruikt als een goed model voor de studie van schimmels differentiatie, morfogenese en taxonomie 3,4,5. Het wordt algemeen beschouwd als veilig (GRAS) gistsoort, die op grote schaal wordt gebruikt om een verscheidenheid van additieven producten zoals organische zuren, polyalcoholen, aroma stoffen, emulgatoren en oppervlakteactieve 6,7,8,9. Het is een obligaat aërobe en bekende oliehoudende gist kan natuurlijk accumuleren lipiden in grote hoeveelheden, dat wil zeggen tot 70% van de cel drooggewicht 10. Het kan ook gebruik maken van een breed spectrum van koolstofbronnen voor groei, met inbegrip van verschillende soorten vervuiling in afgewerkte middelen als voedingsstoffen 11,12,13. Al deze unieke functies maken Y. lipolytica zeer aantrekkelijkdiverse biotechnologische toepassingen. Hoewel de gehele genoomsequentie van de Y. lipolytica is gepubliceerd 14,15, genetische manipulatie van deze onconventionele gist is complexer dan andere gistsoorten. Eerste, transformatie van deze gistsoorten veel minder efficiënt door het ontbreken van een stabiele en efficiënte genetische transformatie systeem 16,17. Ten tweede, is bewerkelijk genomische integratie van lineaire expressiecassettes gebruikt voor de expressie van genen van belang geen natuurlijke episomaal plasmide systeem is in deze gist 18. Ten derde, generatie van genetische knock-outs en knock-ins zijn beperkt, omdat de gene targeting efficiency via nauwkeurige homologe recombinatie in deze gist is laag en de meeste integratie evenementen plaatsvinden via niet-homologe end-joining (NHEJ) 19. In deze studie, melden wij een geoptimaliseerd transformatie protocol voor de Y. lipolytica </em&gt; Po1g stam, die gemakkelijk, snel, efficiënt en reproduceerbaar. Om de frequentie van homologe recombinatie precieze, verwijderd we Ku70 gen, dat een sleutelenzym in de route NHEJ codeert. Met de geoptimaliseerde transformatieprotocol en transformeren van een lineaire knockout cassette die flankerende gebieden van homologie 1 kb, de Ku70 gen van Y. lipolytica Po1g werd succesvol verwijderd. De robuustheid van dit gen deletie methodiek werd vervolgens aangetoond door zich te richten alcohol dehydrogenase en alcohol oxidase genen in de Po1g Ku70 Δ stam. Waargenomen werd dat de Ku70 deletie stam vertoonde een aanzienlijk hogere efficiëntie van homologe recombinatie bemiddelde gerichte mutagenese dan die van de wildtype stam Po1g. Bovendien, een replicatief Cre expressie plasmide dat het hygromycine B resistentie marker werd geconstrueerd om marker rescue voeren. De marker rescue faciliteert meerdere ronden van gen-targeting in the verkregen gen deletiemutanten. Naast gendeletie, kan ons protocol voor genetische transformatie en gendeletie beschreven worden toegepast om genen op specifieke loci voegen, en plaatsspecifieke mutaties te introduceren in de Y. lipolytica genoom.

<table><tbody><tr><td>Reagens/Materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotide primers</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>25 nmole DNA oligo's</td></tr><tr><td>Y. lipolytica stam Po1g</td><td>Yeastern Biotech</td><td></td><td>leucine auxotrofe afgeleide van de wild-type stam W29 (ATCC 20460)</td></tr><tr><td>Vector pYLEX1</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYY203-5MG</td><td>Y. lipolytica expressievector</td></tr><tr><td>E. coli TOP10</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Voor het klonen en vermeerderen van plasmiden</td></tr><tr><td>pGEM-T vector&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td>TA klonering vector</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Voor plasmide isolatie</td></tr><tr><td>Wizard SV Gel en PCR Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>DNA fragmenten uit agarose gels extraheren en PCR producten uit een amplificatie reactie zuiveren</td></tr><tr><td>De iProof hoge-fideliteit DNA polymerase</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5302</td><td>Hoge-fideliteit DNA polymerase</td></tr><tr><td>BamHI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td>Beperkingsenzym</td></tr><tr><td>BglII&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144L</td><td>Beperkingsenzym</td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0142S</td><td>Beperkingsenzym</td></tr><tr><td>NdeI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td>Beperkingsenzym</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189L</td><td>Beperkingsenzym</td></tr><tr><td>PmlI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0532S</td><td>Beperkingsenzym</td></tr><tr><td>PstI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0140S</td><td>Beperkingsenzym</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td>Beperkingsenzym</td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138S</td><td>Beperkingsenzym</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>Beperkingsenzym</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11593-027</td><td>Antibiotica</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>PAA</td><td>P21-014</td><td>Antibiotica</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNA ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0312</td><td>1 kb DNA ladder</td></tr><tr><td>PEG4000</td><td>Sigma</td><td>95904-F</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0729</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15-632-011</td><td></td></tr><tr><td>Lithium Acetaat</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glaskralen (425-600 &micro;m)</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>DNA Loading Dye</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Yeast Extract</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>1st Base</td><td>BIO-1101</td><td></td></tr><tr><td>YNB zonder aminozuren</td><td>Sigma</td><td>Y0626</td><td></td></tr><tr><td>DO Supplement-Leu</td><td>Clontech</td><td>630414</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB Broth</td><td>BD</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB Agar</td><td>BD</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Utrusting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Biorad</td><td>T100 Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Memmert</td><td>WNB 14</td><td></td></tr><tr><td>Stationaire/schuddende incubator</td><td>Yihder</td><td>LM-570RD</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-shaker</td><td>Allsheng</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>Micro centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>BioPhotometer plus</td><td></td></tr><tr><td>Gel imager</td><td>GE</td><td>Amersham Imager 600</td><td></td></tr></tbody></table>

genetische manipulatie van een onconventionele gist voor duurzame biobrandstoffen en biochemische production

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Yarrowia lipolytica is een niet-pathogeen, dimorphe en strikt aerobe gistsoorten. Door zijn onderscheidende fysiologische functies en metabole eigenschappen, onconventionele gist niet alleen een goed model voor de studie van het fundamentele karakter van schimmel differentiatie, maar ook een veelbelovende microbiële platform voor biochemische productie en diverse biotechnologische toepassingen, die een uitgebreide genetische manipulaties vereisen. Echter, genetische manipulaties Y. lipolytica zijn beperkt door het ontbreken van een efficiënte en stabiele genetische transformatie systeem en zeer hoge niet-homologe recombinatie die hoofdzakelijk kan worden toegeschreven aan de Ku70 gen. Hier melden wij een gemakkelijke en snelle protocol voor de efficiënte genetische transformatie en voor gen-deletie in Y. lipolytica Po1g. Ten eerste, een protocol voor de efficiënte transformatie van exogeen DNA in Y. lipolytica Po1g werd opgericht. Second, de verbeterde double-crossover homologe recombinatie rate te bereiken voor verdere verwijdering van target-genen, werd de Ku70 gen verwijderd door het transformeren van een verstoring cassette uitvoeren 1 kb homologie armen. Ten derde, de verbeterde gendeletie efficiency met weglating van de Ku70 gen aan te tonen, we individueel verwijderd 11 doelwit genen die coderen voor alcohol dehydrogenase en alcohol oxidase met dezelfde procedures op het Ku70 knockout platform stam. Waargenomen werd dat de snelheid van precieze homologe recombinatie aanzienlijk gestegen van minder dan 0,5% voor verwijdering van de Ku70 gen in Po1g tot 33% -71% van de enkel gen schrapping van de 11 target genen in Po1g Ku70 Δ. Een replicatieve plasmide dat het hygromycine B resistentie marker en het Cre / LoxP systeem werd gebouwd, en de selectie marker-gen in de gist knockout stammen werd uiteindelijk verwijderd door expressie van Cre recombinase om meerdere rondes van targe vergemakkelijkented genetische manipulaties. De resulterende single-gen deletiemutanten hebben potentiële toepassingen in biobrandstoffen en biochemische productie.

De gelineariseerde Y. lipolytica expressie vector werd ingebracht in de pBR docking platform in het genoom van Y. lipolytica Po1g stam door het uitvoeren van een enkele crossover recombinatie 27. Met de snelle chemische transformatiewerkwijze in dit onderzoek vastgesteld, de gelineariseerde Y. lipolytica expressievector werd met succes getransformeerd in de wild-type stam Po1g in een transformatie-efficiëntie van&gt; 100 cfu / ug DNA. Een knockout ge...

Wij rapporteren hier methoden over de moleculair-genetische manipulatie van de Yarrowia lipolytica Po1g stam voor verbeterde gendeletie-efficiëntie. De resulterende gemanipuleerde Y. lipolytica stammen hebben potentiële toepassingen in biobrandstof en biochemische productie.

Genetische manipulatie van een onconventionele Gist voor duurzame biobrandstoffen en biochemische Production

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van effectieve genetische modificatiemethoden voor een onconventionele gistsoort, inclusief de constructie van transformerend DNA, DNA-transformatie, selectie van transformanten en gerichte gen deletie via homologe recombinatie. We hebben een zeer visuele gen deletietechniek ontwikkeld in de Yarrowia lipolytica PO1G-stam met potentiële toepassingen in de productie van biobrandstoffen en biochemische stoffen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals PCR-gemedieerde gen disruptie, is dat er grote hoeveelheden gen deletie-constructen en een breed scala aan selecteerbare markers beschikbaar zijn.In deze studie beschrijven we een genetisch transformatieprotocol voor de Yarrowia lipolytica PO1G-stam dat efficiënt, eenvoudig, erkend en reproduceerbaar is. De in deze studie geconstrueerde Yarrowia lipolytica PO1G KU70-deletiestam vertoont een zeer efficiënte homologe recombinatiefrequentie, wat snellere en eenvoudigere screening van gerichte gen-deleties mogelijk maakt. De eerste stap in deze procedure is het amplificeren van de LEU2-expressiecassette uit een Y. lipolytica-expressievector

genetic-engineering-an-unconventional-yeast-for-renewable-biofuel

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

De Green Monster methode kan de snelle montage van meerdere deleties gemarkeerd met een reportergen codeert groen fluorescent eiwit. Deze methode is gebaseerd op een giststammen door herhaalde cycli van seksuele assortiment van deleties en fluorescentie gebaseerde verrijking van cellen die meer deleties.

The Green Monster Werkwijze voor de generatie van giststammen dragen Meerdere gendeleties

Hier voorgesteld is een enkelvoudige beschrijving van technieken die kunnen worden gebruikt voor het ontwikkelen, veranderen, beheren en testen heterologe eiwitexpressie van de probiotische gist Saccharomyces boulardii.

Transformatie van probiotische gist en hun herstel van gastro-intestinale Immune Tissues Na orale sondevoeding in Muizen

We presenteren een gedetailleerd protocol om mutantenbibliotheken te construeren en te screenen voor gerichte evolutiecampagnes in Saccharomyces cerevisiae.

Geregisseerd Evolution Method in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliotheek Creatie en Screening

Adaptieve evolutie en isolatietechnieken worden beschreven en aangetoond dat derivaten van Scheffersomyces stipitis stam NRRL Y-7124 die in staat zijn om snel te consumeren hexose en pentose gemengde suikers in enzym versuikerd undetoxified hydrolysaten en te accumuleren meer dan 40 g / l ethanol opleveren.

Technieken voor de evolutie van de Robuuste Pentose hoge gisting Gist voor Bioconversie van omzetting van lignocellulose Ethanol

Een knelpunt in de 'design-build-test' cyclus van microbiële engineering is de snelheid waarmee we functionele schermen van stammen kunnen uitvoeren. We beschrijven een high-throughput methode voor stam screening toegepast op honderden tot duizenden gistcellen per experiment dat droplet-gebaseerde RNA sequencing gebruikt.

Hoge doorvoer Gist Stam Federtyping met Droplet-Based RNA Sequencing

Optogenetische controle van microbieel metabolisme biedt flexibele dynamische controle over fermentatieprocessen. Het protocol hier laat zien hoe blauw licht-gereguleerde fermentaties voor chemische en eiwitproductie op verschillende volumetrische schalen kunnen worden opgezet.

Lichtgestuurde fermentaties voor microbiële chemische en eiwitproductie

Dit protocol maakt gebruik van een bioluminescente reporter, waardoor metingen van transcriptionele activiteit in Saccharomyces eubayanus mogelijk zijn om de overgang van glucose naar maltose te volgen, waardoor real-time analyse van metabole aanpassingen mogelijk is en stamoptimalisatie voor industriële fermentatie onder diverse omstandigheden wordt ondersteund.

In vivo Monitoring van transcriptionele activiteit tijdens metabole overgang met behulp van een bioluminescente reporter in gist

Een high-throughput, geautomatiseerde, tabak protoplast productie en transformatie methode is beschreven. Het robotsysteem maakt massively parallel genexpressie en ontdekking in het model BY-2 systeem dat vertaalbaar naar niet-model gewassen zou moeten zijn.

Een Robotic Platform voor High-throughput protoplastisola- en Transformatie

Methoden voor het opwekken van grootschalige gRNA bibliotheken moet eenvoudig, efficiënt en kosteneffectief zijn. Beschrijven we een protocol voor de productie van gRNA bibliotheken gebaseerd op enzymatische spijsvertering van DNA van het doel. Deze methode, CORALINA (uitgebreide gRNA bibliotheek generatie via gecontroleerde nuclease activiteit) presenteert een alternatief voor dure aangepaste oligonucleotide synthese.

Een universeel Protocol voor grootschalige gRNA bibliotheek productie uit elke bron van DNA

In dit protocol is baculovirus geproduceerd door voorbijgaande transfectie van baculovirus plasmide in Sf9 cellen en versterkt in een serumvrij schorsing cultuur. De bovendrijvende substantie is gezuiverd door de chromatografie van de affiniteit van heparine en verder geconcentreerd door ultracentrifugatie. Dit protocol is handig voor de productie en zuivering van baculovirus voor gen-therapie-toepassing.

Productie en zuivering van Baculovirus voor toepassing van de gentherapie

Leer een efficiënte methode voor genetische transformatie en gerichte gendeletie in Yarrowia lipolytica Po1g. Deze techniek verbetert homologe recombinatie via KU70-deletie voor duurzame biobrandstoffen.

Genetische manipulatie van een onconventionele Gist voor duurzame biobrandstoffen en biochemische Production

Meer video's verkennen