Name: Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke Melanoom-Tumor-infiltrerende lymfocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Leer de generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit melanoom-tumor-infiltrerende lymfocyten. Deze methode biedt onbeperkte tumor-specifieke T-cellen voor kankerimmunotherapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken mevrouw Deborah Postiff en mevrouw Jackline Barikdar in de Tissue Procurement Core en Dr. Cindy DeLong in het Pluripotent Stem Cell Core Laboratory aan de Universiteit van Michigan voor haar technische assistentie. Dit onderzoek werd ondersteund door opstartfinanciering van de Universiteit van Michigan en subsidies van de Central Surgical Association, American College of Surgeons, Melanoma Research Alliance en NIH/NCI (1K08CA197966-01) aan F. Ito.

LET OP: Patiënten moeten geïnformeerde toestemming om deel te nemen in de Institutional Review Board en menselijke pluripotente stamcellen zijn goedgekeurd studie geven. 1. Isolatie en cultuur van de TIL <ol><li> Verkrijgen tumor materiaal dat niet nodig is voor histopathologische diagnose van de pathologie dienst / weefselverkrijging kern. Plaats 20-100 g tumor specimens in een 50 ml buis met 30 ml tumor verzamelen media (tabel 1). </li><li> Ontleden solide, stevig, normaal weefsel van de tumor specimen van fragiel en / of bloederig necrotische gebieden met een schaar. Na het verwijderen van het necrotische weefsel Gebruik de schaar om het monster vermalen zo klein mogelijk. </li><li> Distantiëren het gehakte preparaat in een enkele-celsuspensie met een dissociator en tumor dissociatie kit (menselijke) volgens de instructies van de fabrikant. Filter de suspensie met een 70 micrometer cel zeef die is ingesteld op een ml tube 50 en was de zeef 2 maal met2 ml RPMI 1640. </li><li> Centrifugeer bij 200 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 ml T-celmedium (tabel 1). </li><li> Bereid een tweestaps gradiënt oplossing zoals Ficoll (gradiënt oplossing) in een 50 ml buis met een lagere stap van 10 ml 100% gradiënt-oplossing en een middelste stap van 30 ml 75% gradiënt oplossing verdund met fosfaat Dulbecco&#39;s gebufferde saline, geen calcium, magnesium niet (D-PBS (-)). </li><li> Laag de celsuspensie (van stap 1,4) op het verloop oplossing (van stap 1,5). Centrifugeer bij 400 xg bij 20 ° C gedurende 45 minuten. </li><li> Verzamel de laag met het verrijkte TIL&#39;s op het grensvlak tussen de 100% gradiënt oplossing en de 75% gradiënt-oplossing in een 50 ml buis. Verdun de laag van de oplossing met de verrijkte TIL&#39;s door toevoeging van 20-30 ml D-PBS (-). </li><li> Centrifugeer bij 200 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de TIL-verrijkte fractie in 10 mlT cel media. </li><li> Cultuur de fractie (van stap 1,8) met 2 ml van T-celmedium en 6000 IU / ml recombinant humaan (rh) IL-2 in een 6-puts plaat bij 37 ° C, 5% CO2. </li><li> Verander de helft van de media op dag 5 na het kweken initiatie en om de 2-3 dagen daarna. </li><li> Splits de cellen in een verhouding van 1: 2 zonder trypsine na zachtjes suspenderen, verdubbeling van het aantal putten bij het bereiken van 80-90% confluentie. Voeg een half volume (1 ml) vers T-celmedium en rhIL-2 bij 6000 IU / ml. </li></ol> 2. Bereiding van mitomycine-C behandelde SNL Feeder Cell Plate <ol><li> Cultuur SNL voedingscellen in 10 ml SNL feeder celmedium (tabel 1) op een 0,1% gelatine beklede 10 cm schaal tot 80-90% confluentie (3-4 x 10 6 cellen) bereikt. </li><li> Voeg 310 ul van 0,4 mg / ml mitomycine C oplossing onmiddellijk in SNL feeder celkweekschaal en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 2 uur en 15 minuten. Aspireren de media eennd was de cellen tweemaal met 5 ml D-PBS (-). </li><li> Voeg 0,5 ml 0,25% trypsine / 1 mM EDTA en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut om de cellen dissociëren. Voeg 4,5 ml van SNL feeder cel media te neutraliseren en resuspendeer de cellen in een enkele ophanging. </li><li> Breng de cellen in een 15 ml buis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Zuig het medium en de cellen te tellen met een hemocytometer na opnieuw suspenderen in 10 ml SNL feeder celmedium. </li><li> Plaat 1,5 x 10 6 cellen per putje van de SNL voedingscellen op een 10 cm schaal en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2. Gebruik de SNL feeder cellen binnen 3 dagen. </li></ol> 3. Productie van iPSC De Sendai virus (SeV) Vector <ol><li> Oogst de TIL&#39;s (uit stap 1,11) en activeer 5 x 10 5 cellen of TIL met plaatgebonden muis-anti-humaan CD3 (1 ug / ml) en oplosbare muis-anti-humaan CD28 (5 ug / ml), waarbij rhIL-2 (6000 IU / ml) in 2 ml van T cel media in een 6-well plaat bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 5 dagen. </li><li> Oogst de TIL&#39;s (van stap 3,1) in een 15 ml buis met behulp van een pipet en tel het aantal cellen met een hemocytometer. </li><li> Reactiveren 1 x 10 5 cellen of TIL met plaatgebonden muis-anti-humaan CD3 (1 ug / ml) en oplosbare muis-anti-humaan CD28 (5 ug / ml), waarbij rhIL-2 (60 IU / ml) in 500 gl herprogrammering media (tabel 1) per putje in een 24-puts plaat bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 24 uur. Bereid 3 putten voor SeV infectie: Oct3 / 4, SOX2, KLF4, en c-MYC (1 ook); SeV infectie (GFP: green fluorescent protein) (1 ook); en celgetal (1 ook). </li><li> Na 24 uur (in stap 3,3), tel het aantal cellen met een hemocytometer en het bepalen van het volume van elk virus voor diverse (3-20) multipliciteit van infectie (MOI). Verwijder een set van Sendai virus vector buizen uit de -80 ° C opslag. Ontdooi de SeV vectoren snel in een waterbad (37 ° C) en leg ze op ijs. Volume van virus (pl)= MOI (CIU / cel) x aantal cellen / titer van het virus (CIU / ml) x 10-3 (pl / ml) </li><li> Voeg de berekende hoeveelheden van elk van de vier Sendai-virusvector buizen die afzonderlijk uitgevoerde Oct3 / 4, SOX2, KLF4 en c-MYC door toevoeging van een mengsel van SeV vectoren 10-20 MOI in de media, inclusief geactiveerde TIL. </li><li> Om de transductie efficiëntie te bepalen, voeg de berekende volumes van SeV-GFP in een put van geactiveerde TIL. </li><li> Zet de schaal (van stap 3,5 en 3,6 stap) in de incubator bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 24 uur. Na 24 uur, de mogelijke infectie-efficiëntie met behulp TIL geïnfecteerd met SeV-GFP onder fluorescentiemicroscopie. </li><li> Verzamel de cellen (uit stap 3.5) in een 15 ml buis. Centrifugeer bij 200 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 min. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 0,5 ml medium met hESC Primate ES celmedium en basische fibroblast groeifactor (bFGF, 4 ng / ml). </li><li> Breng de suspensie in een 10 cm gerecht dat contains mitomycine-C behandelde SNL voedingscellen in 10 ml van hESC media. Verander de hESC media om de andere dag, totdat de kolonies worden geteeld. </li><li> Rond dag 18 tot 21, verwijder de SNL feeder cellen rond de kolonies onder een microscoop met een 10-ul tip in de schone bench. </li><li> Schraap de kolonies met een 10-ul tip en overbrengen via een 200-gl tip in 100 pl iPSC medium per putje van een 96 putjes weefselkweekplaat. Pipet op en neer 2-3 keer naar de koloniën in kleine groepjes breken met een gemiddelde grootte van 50-100 urn. </li><li> Breng de kleine klonten in 6-well weefselkweek platen met mitomycine-C behandelde SNL voedingscellen (van stap 2) in 2 ml per putje iPSC media met basische fibroblast groeifactor (bFGF, 4 ng / ml). Verander iPSCs media elke dag. </li><li> Breng de iPSCs tot 6-putjes weefselkweekplaten met verse mitomycine-C behandelde SNL voedingscellen met 1 mg / ml collagenase IV elke 5-6 dagen. Bereid 2 waterputten per platen van elke kloon voor IMMUNostaining. </li><li> Bepaal de volledige herprogrammering van elke kloon door immunohistochemische kleuring van pluripotentie markers (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, en Oct3 / 4) 1. LET OP: Voor een verdere evaluatie van pluripotentie potentieel, bevestigen dat volledig geherprogrammeerd iPSC lijnen in drie kiem lagen kunnen onderscheiden door een embryoid formatie lichaam en differentiatie assay of een teratoom formatie assay 16. </li><li> Controleer of volledig geherprogrammeerd iPSC lijnen tonen een normaal karyotype door cytogenetische analyse. </li><li> Voor teratoma formatie injecteren ongedifferentieerd TIL afkomstige iPSC (1 x 10 6) suspensie in 100 pi DMEM dat 10% FCS in het subcutane weefsel van 6-8 weken oude vrouwelijke NOD / SCID-muizen. Vlek teratoma secties met hematoxyline en eosine. </li></ol> 4. immunofluorescentiekleuring van iPSCs voor SSEA3, SSEA4, TRA1-60 en TRA1-81 <ol><li> Wash iPSCs met 1 ml PBS en bevestig de iPSCs met 1 ml van 4% per jaarraformaldehyde oplossing gedurende 10 min. Verwijder de 4% paraformaldehyde oplossing en was de iPSCs met 1 ml PBS 3 keer. LET OP: Wees voorzichtig met paraformaldehyde, want het is giftig. </li><li> Voorbehandelen iPSCs met blokkerende buffer (Tabel 1) gedurende 30 min. Ondertussen, verdunnen de primaire antilichamen (rat anti-humaan SSEA3, muis anti-humaan SSEA4, muis anti-humaan TRA1-60 en muis anti-humaan TRA1-81) 1:50 in 1,5% geit serum verdund met PBS en TritonX -100 (totaal volume: 1 ml). </li><li> Verwijder de blokkerende buffer (Tabel 1). Voeg de verdunde primaire antilichaamoplossing en incubeer 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Ondertussen verdunnen het secundaire antilichaam (anti-muizen IgG en IgM of anti-rat IgM) 1:50 in 1,5% geit serum oplossing. </li><li> Verwijder de verdunde primaire antilichaamoplossing en was de iPSCs met 1 ml PBS 3 maal, telkens 5 min. Voeg de verdunde secundaire antilichaamoplossing en incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur in een donkere kamer. </li&gt; <li> Verwijder de verdunde secundaire antilichaamoplossing en was de iPSCs met 1 ml PBS 3 maal, telkens 5 min. Let op de iPSCs met immunofluorescentie microscopie. </li></ol> 5. immunofluorescentiekleuring van iPSCs voor Oct3 / 4 <ol><li> IPSCs wassen met 1 ml PBS en bevestig de iPSCs met 1 ml 4% paraformaldehyde gedurende 10 min. Verwijder de 4% paraformaldehyde oplossing en was de iPSCs met PBS 3 keer. </li><li> Voeg permeabilisatie buffer (Tabel 1) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Verwijder de permeabilisatie buffer en voeg blokkerende buffer (Tabel 1). </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Ondertussen, verdun het primaire antilichaam (muis anti-humaan Oct3 / 4) 1:50 in blokkeerbuffer. </li><li> Voeg de verdunde primaire antilichaamoplossing en incuberen bij 4 ° C overnacht. </li><li> Verwijder de verdunde primaire antilichaamoplossing en was de iPSCs met 1 ml PBS 3 maal, telkens 5 min. Ondertussen, diluit het secundaire antilichaam (geit anti-muis IgG / IgM) 1: 100 in blokkerende buffer. </li><li> Voeg de verdunde secundaire antilichaamoplossing en incubeer bij kamertemperatuur in een donkere kamer gedurende 45 minuten. </li><li> Verwijder de verdunde secundaire oplossing en was de iPSCs met 1 ml PBS 3 maal, telkens 5 min. Let op de iPSCs onder immunofluorescentie microscopie. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li>
<li>Seki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li>
<li>Staerk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).</li>
<li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).</li>
<li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Human+Tumor+Antigen-Specific+T+Cells+from+iPSCs+Derived+from+Mature+CD8%28%2B%29+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).</li>
<li>Wakao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+functional+human+mucosal-associated+invariant+T+cells+via+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).</li>
<li>Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tumor-infiltrating+lymphocyte+cultures+for+use+in+adoptive+transfer+therapy+for+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients.</a> J Immunother. 26, 332-342 (2003).</li>
<li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+identifies+the+patient-specific+CD8%28%2B%29+tumor-reactive+repertoire+infiltrating+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors.</a> J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).</li>
<li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+Complete+Responses+in+Heavily+Pretreated+Patients+with+Metastatic+Melanoma+Using+T-Cell+Transfer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).</li>
<li>Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+immunotherapy+for+cancer%3A+harnessing+the+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response.</a> Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).</li>
<li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+Melanoma+Tumor-Infiltrating+Lymphocytes+to+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, 11(2016).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Ban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).</li>
<li>Fujie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Type+of+Sendai+Virus+Vector+Provides+Transgene-Free+iPS+Cells+Derived+from+Chimpanzee+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood.</a> PLoS One. 9, e113052(2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Hier hebben we aangetoond een protocol voor het herprogrammeren van melanoom TIL te iPSCs door SeV gemedieerde transductie van de vier transcriptiefactoren Oct3 / 4, SOX2, KLF4, en c-MYC. Deze benadering, met een SeV systeem om T-cellen te herprogrammeren, biedt het voordeel van een niet-integratiemethode 7. Een eerdere studie toonde aan dat SeV herprogrammering systeem is zeer efficiënt en betrouwbaar niet alleen fibroblasten maar ook perifeer bloed T-cellen 7,17 herpr...

Cellulaire herprogrammering technologie die generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) maakt het mogelijk via overexpressie van een gedefinieerde set van transcriptiefactoren houdt grote belofte in het gebied van cel-gebaseerde therapieën 1,2. Deze iPSCs vertonen transcriptie en epigenetische kenmerken en hebben de capaciteit voor zelf-vernieuwing en pluripotentie, net als embryonale stamcellen (SER) 3-5. Opmerkelijke vooruitgang geboekt bij het herprogrammeren technologie de afgelopen tien jaar heeft ons toegelaten om de menselijke iPSCs zelfs van terminaal gedifferentieerde cellen, zoals T-cellen 6-8 te genereren. T-cellen afgeleide iPSCs (TiPSCs) behouden dezelfde herschikte configuratie van T-celreceptor (TCR) ketengenen de oorspronkelijke T-cellen, die regeneratie van antigenspecifieke T-cellen van TiPSCs 9-11 toelaat. Bijna 80% van melanoom infiltrerende lymfocyten (TIL&#39;s) verkregen uit een patiënt de tumor specifieke wijze tumor-geassocieerde antigenen eennd handhaven cytotoxiciteit tegen de oorspronkelijke kankercellen 12. Met name de expressie van geprogrammeerde celdood eiwit-1 (PD-1) op TIL bleek de autologe tumor-reactieve repertoire te identificeren, inclusief gemuteerd neoantigeen-specifieke CD8 + lymfocyten 13. Adoptieve overdracht van ex vivo geëxpandeerde autologe TIL&#39;s in combinatie met preparatieve lymphodepleting regimes en systemische toediening van interleukine-2 (IL-2) kunnen aanzienlijke regressie van metastatische melanoom veroorzaken subgroepen van patiënten 14. Ondanks bemoedigende resultaten in preklinische modellen en patiënten, slechte overleving van T-cellen toegediend en het bestaan ​​van immuunonderdrukkende paden lijken het volledige potentieel van adoptieve T-celtherapie compromitteren. Huidige klinische protocollen vereisen uitgebreide ex vivo manipulatie van autologe T-cellen om grote aantallen te verkrijgen. Dit resulteert in de vorming van terminaal gedifferentieerde T-cellen die slechte overleving, verminderde Proliferative capaciteit en hoge PD-1 15. Deze beperking van adoptieve T-celtherapie kan theoretisch worden overwonnen door iPSCs dat een onbeperkte bron van autologe T-cellen voor immunotherapie kan bieden. We hebben onlangs gemeld herprogrammering van melanoom TIL die hoge niveaus van PD-1 van Sendaivirus (SeV) gemedieerde transductie van de vier transcriptiefactoren, Oct3 / 4, SOX2, KLF4 en c-MYC 16. Hoewel retrovirusvectoren integratie in gastheerchromosomen eisen herprogrammering genen tot expressie, SeV vectoren zijn niet-integrerende en worden uiteindelijk verwijderd uit het cytoplasma. Herprogrammering efficiëntie is veel hoger bij een SeV systeem in vergelijking met lentivirus of retrovirus vectoren 6-8. Bovendien SeV kan herprogrammeren specifiek T-cellen in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC&#39;s), terwijl sommige iPSC klonen gegenereerd door lentivirus of retrovirus vectoren kunnen worden van nonlymphoid lijnen 6-8. Hier hebben we detailde procedures toegepast voor de isolatie en activatie van humane melanoom TIL en voor het genereren van TIL afkomstige iPSCs met een SeV herprogrammering systeem.

<table><tbody><tr><td>gentle MACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentle MACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Tumor Dissociation Kit, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 um Cell Strainer</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>human AB serum</td><td>Life technologies</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine (200mM)</td><td>Life technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol (1000x, 55mM)</td><td>Life technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>gentamicin</td><td>Life technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-)</td><td>Life technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>recombinant human (rh) IL-2</td><td>Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3</td><td>BD</td><td>555329</td><td></td></tr><tr><td>Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28</td><td>BD</td><td>555725</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Cumberland Pharmaceuticals Inc.</td><td>NDC 66220-207-30</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Plates (6-well)</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Plates (24-well)</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Sendai virus vector</td><td>DNAVEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SNL feeder cells</td><td>Cell Biolabs, Inc</td><td>CBA-316</td><td></td></tr><tr><td>mitomycin C</td><td>SIGMA</td><td>M4287</td><td>oplosbaar in water (0,5 mg/ml)</td></tr><tr><td>gelatin</td><td>SIGMA</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>basic fibroblast growth factor (bFGF)</td><td>Life technologies</td><td>PHG0264</td><td></td></tr></tbody></table>

generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke melanoom-tumor-infiltrerende lymfocyten

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptieve overdracht van ex vivo geëxpandeerde autologe tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL&#39;s) kunnen duurzaam en volledige reacties bij belangrijke subgroepen van patiënten met metastatische melanoom bemiddelen. Grootste obstakels van deze aanpak zijn de verminderde levensvatbaarheid van de overgedragen T-cellen, veroorzaakt door telomeerverkorting, en het beperkte aantal van TIL&#39;s verkregen van patiënten. Minder gedifferentieerde T-cellen met lange telomeren zou een ideale T cel subsets voor adoptieve T-celtherapie, maar genereren van grote aantallen van deze minder gedifferentieerde T-cellen is problematisch. Deze beperking van adoptieve T cel therapie kan in theorie worden overwonnen door het gebruik van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs), die zichzelf vernieuwen, te behouden pluripotentie, hebben langwerpige telomeren, en zorgen voor een onbeperkte bron van autologe T-cellen voor immunotherapie. Hier presenteren we een protocol om iPSCs behulp van Sendai-virus vectoren voor de transductie van herprogrammering factoren in TIL te genereren. Dit protocol genererens volledig geherprogrammeerd, vector-vrije klonen. Deze TIL-afgeleide iPSCs zou kunnen minder gedifferentieerde patiënt- en tumor-specifieke T-cellen voor adoptieve T-celtherapie te genereren.

Figuur 1 toont een overzicht van de procedure dat de aanvankelijke groei van melanoom TIL met rhIL-2, gevolgd door activatie met anti-CD3 / CD28 en gentransfer van Oct3 / 4, KLF4, SOX2, en c-MYC om TIL impliceert voor het genereren van iPSCs. Meestal TIL op de cultuur met rhIL-2 start om bolletjes te vormen 21-28 dagen na het begin van de cultuur. Op dit moment TIL gereed zijn geactiveerd met anti-CD3 / CD28. Figuur 2A toont TIL op kweek met rhIL-2 op da...

Het doel van dit protocol is om het protocol te laten zien voor het herprogrammeren van in melanoom geïnfiltreerde tumorlymfocyten in geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke Melanoom-Tumor-infiltrerende lymfocyten

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Het algemene doel van dit experiment is om geïnduceerde pluripotente stamcellen of iPSC's te genereren uit melanoom-infiltrerende lymfocyten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van tumorimmunologie, in het bijzonder voor kankerimmunotherapie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het vermogen om menselijke iPS-cellen te genereren uit tumor-infiltrerende lymfocyten een onbeperkt aantal minder gedifferentieerde tumorspecifieke T-cellen voor immunotherapie zou kunnen opleveren.Deze techniek kan toepassingen hebben voor de behandeling van metastatisch melanoom, aangezien de geringe overleving van T-cellen in een klinische setting momenteel de belangrijkste beperking is van adaptieve T-celtherapie. Deze methode kan ook nuttig zijn bij het onderzoek naar het repertoire van T-celreceptoren in de tumoromgeving. De procedure zal worden gedemonstreerd door dr. Kumiko Iwabuchi, een postdoctoraal onderzoeker uit mijn laboratorium.Select na het verkrijgen van het tumormateriaal vijf tot 20 gram tumorstalen en gebruik een schaar om het normale, solide en stevige weefsel te scheiden van de fragiele en/of bloederige necrotische gebieden van de tumorstalen. Hak de gedissecteerde stalen zo fijn mogelijk en gebruik vervolgens een dissociator en een human tumor dissociation kit om de fijngehakte tumorstukjes te verspreiden tot een enkelcel-suspensie volgens de instructies van de fabrikant. Filter aan het einde van de dissociatie de cellen door een 70 micron zeef in een 50 milliliter buis en was de zeef twee keer met twee milliliters RPMI 1640.Pellet vervolgens de cellen door centrifugatie en resuspendeer de cellen in 10 milliliters vers T-celmedium. Om de cellen via een dichtheidsgradiënt te scheiden, wordt eerst 30 milliliters 75% gradiëntoplossing in een nieuwe 50 milliliter buis gedaan, gevolgd door 10 milliliters 100% gradiëntoplossing in DPBS zonder calcium of magnesium. Plaats vervolgens voorzichtig de cellen bovenop de gradiëntoplossing, waarbij u erop let dat de lagen niet worden verstoord, en centrifugeer het monster.Breng na afloop van de scheiding de verrijkte tumorinfiltrerende lymfocyten (TILs) op de interface tussen de gradiëntoplossingen over naar een nieuwe conische buis van 50 milliliter en was de cellen met 20 tot 30 milliliters verse DPBS. Resuspendeer het pellet in 10 milliliters vers T-celmedium, voeg vervolgens twee milliliters TILs per put toe aan vijf putten van een zes-puts plaat en supplementeer de TIL-culturen met Recombinant Human IL-2 gedurende vijf dagen bij 37 graden Celsius en 5% carbon dioxide. Vervang op dag vijf de helft van het medium in elke put en doe dit daarna elke twee tot drie dagen.Wanneer de culturen een confluentie van 80 tot 90% bereiken, gebruik dan een pipet om de cellen in elke put voorzichtig opnieuw te resuspenderen en splits de culturen in een verhouding van één-op-twee in één milliliter vers T-celmedium aangevuld met Recombinant Human IL-2. Om mitomycine-C-behandelde SNL-feederplaten voor te bereiden, worden SNL-feedercellen eerst gekweekt in 10 milliliter SNL-feedercelmedium in een 10 centimeter petrischaal gecoat met 0,1% gelatine. Wanneer de cellen 80 tot 90% confluent zijn, worden de feeders gedurende twee uur en 15 minuten behandeld met mitomycine C bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide.Was na afloop van de incubatie de cellen twee keer met vijf milliliter DPBS. Detacheer vervolgens de feeders met Trypsin-EDTA op kamertemperatuur. Neutraliseer na één minuut de dissociatiereactie met 4,5 milliliter vers SNL-feeder-medium en breng de single-cel suspensie over in een conische buis van 15 milliliter voor centrifugatie.Resuspendeer de pellet in 10 milliliters vers SNL-feeder-celmedium voor het tellen. Plaats vervolgens 1,5 keer 10^6 SNL-feeder-cellen per put in 10 centimeter schalen en incubeer de culturen bij 37 °C in 5% CO2 gedurende maximaal drie dagen. Om iPSCs te genereren met Sendai-virus, breng dan 5 keer 10^5 TILs per put over naar een nieuwe zes-puts-plaat gecoat met muis anti-humaan CD3 in twee milliliters vers T-celmedium aangevuld met recombinant humaan IL-2 en oplosbaar muis anti-humaan CD28.Activeer de TILs gedurende vijf dagen in de celkweekincubator. Gebruik vervolgens een pipet om de culturen samen te voegen in een conische buis van 15 milliliter voor het tellen. Transfer daarna 1 × 10⁵ TILs per put in een 24-wells plaat die is gecoat met anti-humaan CD3, in 500 microliters herprogrammeringsmedium aangevuld met oplosbaar muis anti-humaan CD28 en recombinant humaan IL-2.Tel na 24 uur in de celkweekincubator de cellen in elke well en bereid verschillende volumes virus voor bij de juiste multipliciteiten van infectie. Voeg vervolgens een mengsel van Sendai-virusvectoren bij 10 tot 20 MOI toe aan het juiste volume medium en voeg het virushoudende medium toe aan elke well met TILs. Voeg voor de bepaling van de transductie-efficiëntie het berekende volume Sendai-virus GFP toe aan een well met geactiveerde TILs en plaats de culturen gedurende 24 uur terug in de incubator.Bekijk de volgende dag de met Sendai-virus GFP geïnfecteerde cellen via fluorescentiemicroscopie om de infectie-efficiëntie van de transductie te schatten. Verzamel de viraal geïnfecteerde cellen uit elke put in een buis van 15 milliliter voor centrifugatie en resuspendeer de pellet in 0,5 milliliter menselijk embryonaal stamcelmedium aangevuld met primaat embryonaal stamcelmedium en basic fibroblast growth factor. Voeg vervolgens 9,5 milliliter vers menselijk embryonaal stamcelmedium toe aan de cellen en breng de suspensie over naar een met mitomycine C behandelde SNL-feedercelplaat.Op deze afbeelding worden TILs op dag 21 van de kweek met recombinant humaan IL-2 getoond die klaar zijn om geactiveerd te worden met anti CD3 en CD28. De TILs kunnen worden getransfecteerd met Sendai-virus bij een multiplicity of infection van 20. Hier wordt een typische pluripotente kloon op SNL-feeder-cellen 18 tot 21 dagen na infectie met Sendai-virus getoond.Zoals waargenomen in dit representatieve karyogram vertonen de uit TIL-afgeleide iPSCs een normaal karyotype. Immunofluorescentiekleuring om de expressie van pluripotentiemarkers in TIL-afgeleide iPSCs te bevestigen, laat zien dat deze cellen de verwachte expressieniveaus van typische pluripotentiemarkers vertonen. Daarnaast zijn iPSCs afgeleid van melanoma-TILs in staat om teratomen te vormen die een verscheidenheid aan cellen uit de drie kiembladlagen bevatten.Verder behielden iPSCs die uit TILs waren afgeleid hun T-celreceptor-rearrangementen, zoals vastgesteld via capillaire elektroforese. Onze eerste ontwikkeling, deze techniek, baant de weg voor onderzoekers in het veld van de oncologie om effectievere kankerimmunotherapieën te verkennen voor patiënten met metastatisch melanoom. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de proliferatie en levensvatbaarheid van de T-cellen te controleren vóór infectie met het Sendai-virus en om de infectie-efficiëntie te evalueren aan de hand van de GFP-expressie.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe menselijke TIL-cellen uit melanoom-TIL's kunnen worden gegenereerd.

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-human-melanoma-tumor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Genereren van T-lymfocyten van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen geeft een alternatieve aanpak van het gebruik van embryonale stamcellen voor T-cel-gebaseerde immunotherapie. De werkwijze blijkt dat door een...

Geregisseerd Differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen naar T lymfocyten

Hier laten we een eenvoudige en effectieve protocol voor het genereren van menselijke iPSCs 3-4 ml van perifeer bloed met een lentivirale vector herprogrammering. Herprogrammering van direct beschikbare bloedcellen belooft om het gebruik van IPSC technologie te versnellen door het toegankelijk voor een breder onderzoeksgemeenschap.

Generatie van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed Met behulp van de STEMCCA lentivirale vector

This video demonstrates an assay to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived CD8αβ+ T Cells. Tumor antigen-specific iPSCs are grown on a stromal cell monolayer and differentiated into hematopoietic progenitor cells (HPCs). The HPCs are differentiated into CD4+ CD8+ double-positive T cells using a differentiation medium. These cells are then stimulated to generate single-positive T cells expressing CD8.

Generating Single Positive CD8 T Cells from Induced Pluripotent Stem Cells

Dit artikel beschrijft de bereiding van vers verkregen melanoomweefsel in primaire celculturen en hoe verontreinigingen van erytrocyten en fibroblasten uit de tumorcellen. Tot slot beschrijven we hoe...

Patiënt Derived Cell Cultuur en isolatie van CD133<sup&gt; +</sup&gt; Vermeende Cancer Stem Cells van Melanoom

Dit manuscript geeft een stapsgewijze procedure voor het verkrijgen en onderhouden van humane keratinocyten uit getrokken haar en de daaropvolgende generatie van integratievrije menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) door middel van episomale vectoren.

Generatie van Integratie-vrije mens geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van Hair-afgeleide keratinocyten

Dit protocol beschrijft hoe geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) kunnen worden gegenereerd uit menselijke perifere T-cellen onder feeder-vrije omstandigheden door gebruik te maken van een combinatie van matrigel en Sendai-virusvectoren die reprogrammeringsfactoren bevatten.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere T-cellen met behulp van Sendai Virus in Feeder gratis Voorwaarden

Dit werk beschrijft een in vitro differentiatie protocol bij gepigmenteerde, volwassen melanocyten uit menselijke pluripotente stamcellen te produceren via een neurale en melanoblast tussenstap met behulp van een feeder-vrij, 25 dagen protocol.

Feeder-vrij Afleiding van melanocyten uit menselijke pluripotente stamcellen

Dit artikel beschrijft een nieuwe methode voor het genereren van tumor antigeen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige Thymus emigants (iTE) door een driedimensionaal (3D) Thymus cultuur systeem. iET zijn een homogene deelverzameling van T-cellen die nauw verwant zijn aan naïeve T-cellen met de capaciteit voor proliferatie, Geheugenvorming en tumor onderdrukking.

Een driedimensionaal Thymic cultuur systeem voor het genereren van Murine geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige tumor antigen-specifieke Thymic emigranten

Dit artikel beschrijft een methode voor het genereren van functionele tumor antigen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide CD8αβ+ enkele positieve T-cellen met behulp van OP9/dll1-co-cultuur systeem.

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het genereren van tumor-antigeen-specifieke T-cellen

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd direct herprogrammeringssysteem voor melanocyten en een zeer efficiënt, geconcentreerd virusverpakkingssysteem dat zorgt voor een soepele directe herprogrammering.

Directe herprogrammering van muisfibroblasten in melanocyten

Hier presenteren we een protocol om van melanoompatiënten afgeleide organoïden te genereren door het kweken van gedissocieerde celsuspensies uit vers melanoomweefsel. Deze organoïden recapituleren getrouw patiëntspecifieke tumoren in vitro en bieden een innovatieve benadering voor het onderzoeken van immunosuppressieve mechanismen van tumoren, screening van geneesmiddelen, mechanismen voor resistentie tegen geneesmiddelen en benaderingen voor kankerbewaking.

Onthulling van therapeutische mogelijkheden met van melanoom patiënt afgeleide organoïde modellen

Leer de generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit melanoom-tumor-infiltrerende lymfocyten. Deze methode biedt onbeperkte tumor-specifieke T-cellen voor kankerimmunotherapie.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke Melanoom-Tumor-infiltrerende lymfocyten

Meer video's verkennen