Name: Gelaagde Alginaat Constructen: Een platform voor Co-cultuur van heterogene celpopulaties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Leer hoe u gelaagde alginaathydrogels maakt voor 3D co-cultuur van heterogene celpopulaties. Deze reproduceerbare methode ondersteunt onderzoek naar weefselengineering en mechanobiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de National Science Foundation (CBET 0845754, AHH).

1. Voorbereiding voor de vorming van Alginate Discs <ol><li> Bereid een 4% (w / v) alginaat oplossing 1 x Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder toevoeging van calciumchloride of magnesiumchloride en in een 37 ° C waterbad. Concentraties van de alginaatoplossing kan variëren, maar 1-4% (w / v) alginaat oplossingen aanbevolen. </li><li> Meng de alginaatoplossing in een verhouding van 1: 1 met warm celkweekmedium base (bijvoorbeeld Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium.) Voor het gewenste celtype. De alginaatconcentratie nu de helft van de oorspronkelijke concentratie, bijv., 2% (w / v). Steriliseren alginaat / media oplossing met behulp van een steriele 0,2 um nylon spuit filters. </li><li> Bereid een bad van steriele 102 mM calciumchloride dihydraat in steriel water met voldoende oplossing vormen dompelen (~ 200-300 ml). </li><li> Verzamel de steriele &quot;gelvorming mal&quot; (6 mm diameter x 3 mm lange cilindrische putten in een 3 x 3 in aluminium plaat, zie <strong&gt; Figuur 1) en eindplaten (Bottom: een 3 in x 3 in aluminium plaat, Top: een 1,5 in x 3 in aluminium plaat) en de voorbereiding van mallen als volgt: <ol><li> Snijd dik filtreerpapier (blotter filtreerpapier) en de cel microzeef membraan (10 pm poriegrootte) aan de afmetingen van de bovenste en onderste eindplaten en plaats ze in het calciumchloridebad tot verzadiging, ongeveer 1 min. Indien gewenst, gesteriliseerd dik filtreerpapier en de microzeef membraan via autoclaaf of ultraviolet licht gedurende 30 minuten voor gebruik. </li><li> Set-up de helft (de onderste helft) van de mal construct. <ol><li> Plaats de volgende punten op dezelfde positie in deze volgorde en glad met een steriele spatel: grote eindplaat (3 cm x 3 inch), dik filtreerpapier, waarna de microzeef membraan. </li><li> Omkeren en druk de matrijs op een stapel papieren zakdoekjes om verlies van overgewicht calciumchlorideoplossing waarborgen. </li><li> Leg het &quot;gelvorming mold&quot; met de cilindrische putten bovenop de cell microzeef membraan en voorzichtig draai de mal samen aan twee kanten met behulp van bindmiddel clips aan de linker- en rechterkant. Zorg ervoor dat je genoeg ruimte voor de top eindplaat te verlaten (1,5 in x 3 inch) aan de putjes volledig later te dekken. </li></ol></li><li> Set-up van de tweede helft (de bovenste helft) van de mal construct. <ol><li> Plaats de volgende punten op dezelfde positie in deze volgorde en glad: kleine eindplaat, dik filtreerpapier microzeef membraan. </li><li> Omkeren en druk op deze helft van de mal op een stapel papieren zakdoekjes om verlies van overgewicht calciumchlorideoplossing waarborgen. Doe dit de helft van de mal met behulp van bindmiddel clips op dit moment niet vast. </li></ol></li></ol></li><li> Kweekcellen zoals aanbevolen instructies van de fabrikant. Oogst de gewenste cellen te verankeren in de gelaagde alginaat hydrogels. De aanbevolen celdichtheid 1-2 x 10 6 cellen / ml, maar dit kan worden gevarieerd afhankelijk van de gewenste experimenten. Opmerking: Bij gebruik van deze methodevoor het maken van lagen met verschillende celtypen, zorg ervoor dat cultuur twee celtypen in parallel voor gelaagdheid. Mesenchymale stamcellen (MSC&#39;s) uitgezaaid met een celdichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml wordt gebruikt als een voorbeeld voor volgende protocol. Celaantal en CD-nummer kan worden opgeschaald voor experimenten nodig. <ol><li> Een tot twee weken voorafgaand aan inbedding, zaad mesenchymale stamcellen bij een celdichtheid van 3000 - 5000 cellen / cm2 in 10 ml basale kweekmedium (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium, 10% foetaal runderserum, 2% L-Glutamine, 1 % niet-essentiële aminozuren, 1% penicilline / streptomycine) in T-75 kolven. </li><li> Verwijder verbruikte media elke 2-3 dagen vervangen en 10 ml basale kweekmedium totdat de cellen 80-90% confluent. </li><li> Om cellen te oogsten, te verwijderen besteed media en pipet 3 ml 1x Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder toegevoegde calciumchloride of magnesiumchloride om cellen te spoelen. Verwijder deze oplossing pipet 3 ml 0,25% Trypsin-EDTA op cellen groeien in T-75 kolven en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Na de cellen van het hechtoppervlak hebben opgeheven, voeg 6-9 ml van basale groei media. </li><li> Centrifugeer MSC&#39;s bij 600 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, zuig de supernatant en resuspendeer in 1-5 ml basale kweekmedium. Tel de cellen met een hemocytometer behulp instructies apparaat. </li><li> Verwijder 1 x 10 6 cellen van de totale cel resuspensie centrifuge onder dezelfde omstandigheden, en zuig de supernatant. </li></ol></li></ol> 2. Vorming van de Cel Seeded Alginate Discs <ol><li> Resuspendeer de celpellet met 1 ml van de steriele alginaat / media oplossing tot een celdichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml bereiken. De cel-alginaat mengsel wordt homogeen troebel in uiterlijk wanneer de cellen worden gemengd in geschikte wijze. </li><li> Pipetteer 130 ul van de cel-alginaat mengsel in zes 6 mm diameter x 3 mm lang putten in de onderste helft van de matrijsconstruct druppelsgewijs, zodat er geen eventuele luchtbellen creëren. Een lichte convexe meniscus moet goed zichtbaar boven de rand van elk van hen. </li><li> glad voorzichtig de bovenste helft van de mal construct met een steriele spatel en omdraaien, zodat de cel microzeef membraan bovenop de putjes. Los de vormen construct bovenop de putjes en let op de putjes die de cel en alginaat mengsel volledig omsluit. </li><li> Til de matrijs geladen construct en terwijl stevig in te drukken op het midden, bindmiddel clip de overige twee zijden (boven en onder) aan de bovenste en onderste helften van de mal construct vast. De cel-alginaat oplossingen moeten stevig genesteld in de putjes op dit moment. </li><li> Dompel de mal bevestigd construct in de 102 mm calciumchloride bad, om ervoor te zorgen dat de hele constructie wordt ondergedompeld. Incubeer in de celkweek kap bij kamertemperatuur gedurende 90 min. </li><li> Aan het einde van de 90 minuten, verwijder de mal construct van 102 mM calciumchloridebad en leg ze op een stapel papieren handdoekjes in de celkweek kap. Verwijder alle vier bindmiddel clips en scheiden de twee helften van de mal construct. Hydrogelen gevormd in de putjes geen luchtbellen en moeten de wells volledig vullen. </li><li> Met een spatel voorzichtig sporen de rand van de putjes die de hydrogels zorgvuldig losmaken en vastklemmen van de hydrogelen. Na verwijdering van de hydrogelen uit de vorm construct, laat de hydrogels direct in een bad van 1 x Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde zoutoplossing met calcium en magnesiumchloride. Bedek de gels volledig de overmaat calciumchloride-oplossing af te wassen voor 1-5 min. </li><li> Breng de hydrogels in basale kweekmedium oplossing gewenste schaal (bijv., 6 putjes) die volledig bedekt hydrogels. Incubeer gedurende ten minste 1 uur in de celkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 te gaan naar de stap lagen. Noot: Hydrogels bevattende cellen kunnen worden bewaardde celkweek incubator oneindig momenteel tot lagen van gels met een andere celpopulatie gewenst, mits de verandering van medium elke 2 voltooid - 3 dagen. </li></ol> 3. gelaagdheid van Alginate Discs <ol><li> Tijdens het laatste half uur van de 1 uur incubatie, te verzamelen en voor te bereiden steriele matrijzen en oplossing voor het uitgloeien van de gels. <ol><li> Bereid de &quot;cutting mold&quot; door het bevestigen van een schimmel die putjes helft van de hoogte van de &quot;gelvorming mold&quot; heeft (6 mm diameter x 1,5 mm lang putjes in een 3 cm x 3 in aluminiumplaat) een eindplaat (3 in x 3 in aluminium plaat) met behulp van bindmiddel clips aan de linker- en rechterkant. </li><li> Bereid de &quot;gloeien mal&quot; door het bevestigen van een schimmel die is 3 mm groter in diameter dan de &quot;gel formatie mold&quot; (9 mm diameter x 3 mm lang putten in een 3 in x 3 in aluminiumplaat) een eindplaat (3 in x 3 in aluminium plaat) met behulp van bindmiddel clips aan de linker- en rechterkant. </li><li> Bereid een oplossing van100 mM natriumcitraat / 30 mM EDTA (natriumcitraat dihydraat, ethyleendiaminetetra-azijnzuur tetranatriumzout dihydraat) in steriel water. </li></ol></li><li> Verwijderen gels gewenste cel populaties (in dit voorbeeld beide schotels hMSCs) vanaf het medium in de schaal, en plaats in de &quot;cutting mold&quot; putten. Elke gel moet goed passen in de putjes met de helft van de gel uitsteekt boven de mal. </li><li> Met behulp van een scalpel, snijd de gel aan het oppervlak van de mal (dit zal de hydrogel gehalveerd). Draai de bovenste helft van de gel en plaats deze in een open vorm ook. De helft van de gel moet ook goed passen in de mal goed, maar nu zowel de helft van gels zou de hoogte van de mal met de cut binnenkant zichtbaar zijn. Herhaal dit met de tweede gel. Let op: Let op: Alleen de binnenste snijvlakken zullen gelaagde schijven vormen. Met de buitenvlakken leidt tot de helften scheiden. Vermoed wordt dat de structuur van de microzeef membraan overgebracht op het gel oppervlak te voorkomenHet succes van het gloeien proces. </li><li> Leg een stuk droge cel Microzeef membraan op de top van de putten, zorg ervoor dat de microzeef membraan in contact met alle van de gel helften te worden gekoppeld en ze te bedekken geheel. Plaats dik filterpapier bovenop de microzeef membraan, en zorg ervoor dat de gels volledig te bedekken. </li><li> Pipetteer een oplossing van 100 mM natriumcitraat / 30 mM EDTA (Natriumcitraatdihydraat, Ethyleendeniaminetetraacetaat tetranatriumzout dihydraat) op de dikke filterpapier totdat deze verzadigd is. Ongeveer 750 gl voldoende vier putten. </li><li> Incubeer de gels gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de cel microzeef membraan en dik filter papier en gooi ze weg. Verwijder de bindmiddel clips en open de mal. </li><li> Voor elke gegloeid gel, overdragen één natriumcitraat /-EDTA behandelde helft van de hydrogel op de voorbereide &quot;gloeien mal&quot; met het snijvlak naar boven. Dit zal de helft van de ontlaten const wordenruct. </li><li> Met behulp van een spatel, een lift en plaats een tweede natriumcitraat /-EDTA behandelde helft-gel (kan bevatten een ander type cel) op de gel al in het &quot;gloeien mal&quot;, flippen deze tweede helft-gel, zodat het snijvlak is in contact met het uiteinde van het gel reeds in het &quot;annealing mold&quot;. </li><li> Druk voorzichtig neer op de twee gels met behulp van een spatel om eventuele luchtbellen tussen de twee gels te verwijderen. Ook de positie van de gels als nodig is om ervoor te zorgen dat ze rechtstreeks op de top van elkaar. </li><li> Til de &quot;gloeien mal&quot; en dompel het in de 102 mm calciumchloride bad gedurende 30 min. Bedek de putten met een eindplaat. </li><li> Na de 30 min incubatie, verwijder de &quot;gloeien mal&quot; en plaats deze op keukenpapier. Verwijder de bindmiddel clips en haal de mal van de eindplaat. </li><li> Met behulp van een spatel, laat het ontlaten gels en plaats ze in een 1 x Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde zoutoplossing met calcium chloride en magnesium chloride bad om de gels te wassen. Vervolgens overdracht gehybridiseerd hydrogels te celkweekmedium in een gewenste schaal (bijv., 6-well plaat) cultuur. </li></ol>

<ol><li>Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Basic+Science+of+Articular+Cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Health%22%5BJournal%5D)">The Basic Science of Articular Cartilage.</a> Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).</li>
<li>Neidlinger-Wilke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+loading+of+the+intervertebral+disc%3A+from+the+macroscopic+to+the+cellular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Spine+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical loading of the intervertebral disc: from the macroscopic to the cellular level.</a> Eur. Spine J. 23 (3), 333-343 (2013).</li>
<li>Klein, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+stratified+articular+cartilage+from+chondrocyte+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarth.+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of stratified articular cartilage from chondrocyte subpopulations.</a> Osteoarth. Cartilage. 11 (8), 595-602 (2003).</li>
<li>Han, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+Grafts+for+Articular+Cartilage+Defects%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+R%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free Grafts for Articular Cartilage Defects.</a> Clin. Orthop. Relat. R. 466 (8), 1912-1920 (2008).</li>
<li>Ng, K. W., Ateshian, G. A., Hung, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zonal+chondrocytes+seeded+in+a+layered+agarose+hydrogel+create+engineered+cartilage+with+depth-dependent+cellular+and+mechanical+inhomogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+A%22%5BJournal%5D)">Zonal chondrocytes seeded in a layered agarose hydrogel create engineered cartilage with depth-dependent cellular and mechanical inhomogeneity.</a> Tissue Eng. A. 15 (9), 2315-2324 (2009).</li>
<li>Ng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+layered+agarose+approach+to+fabricate+depth-dependent+inhomogeneity+in+chondrocyte-seeded+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">A layered agarose approach to fabricate depth-dependent inhomogeneity in chondrocyte-seeded constructs.</a> J. Orthop. Res. 23 (1), 134-141 (2005).</li>
<li>Nguyen, L. H., Kudva, A. K., Saxena, N. S., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+articular+cartilage+with+spatially-varying+matrix+composition+and+mechanical+properties+from+a+single+stem+cell+population+using+a+multi-layered+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineering articular cartilage with spatially-varying matrix composition and mechanical properties from a single stem cell population using a multi-layered hydrogel.</a> Biomaterials. 32 (29), 6946-6952 (2011).</li>
<li>Leone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+multilayered+composite+hydrogel+as+osteochondral+substitute%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Continuous multilayered composite hydrogel as osteochondral substitute.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 103 (8), 2521-2530 (2015).</li>
<li>Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+catalyze+cartilage+formation+by+neonatal+articular+chondrocytes+in+3D+biomimetic+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels.</a> Sci. Rep. 3, (2013).</li>
<li>Vigfúsdòttir, ÁT., Pasrija, C., Thakore, P. I., Schmidt, R. B., Hsieh, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Pericellular+Matrix+in+Mesenchymal+Stem+Cell+Deformation+during+Chondrogenic+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Role of Pericellular Matrix in Mesenchymal Stem Cell Deformation during Chondrogenic Differentiation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 3 (4), 387-397 (2010).</li>
<li>Lee, C. S. D., Gleghorn, J. P., Won Choi, N., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+layered+chondrocyte-seeded+alginate+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Integration of layered chondrocyte-seeded alginate hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 28 (19), 2987-2993 (2007).</li>
<li>Gleghorn, J. P., Lee, C. S. D., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGleghorn%2C+JP+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22">J. Biomed. Mater. Res. A</a>. 85 (3), 611-618 (2008).</li>
<li>Gharravi, A. M., Orazizadeh, M., Ansari-Asl, K., Banoni, S., Izadi, S., Hashemitabar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Fabrication+of+Anatomical+Bioreactor+Systems+Containing+Alginate+Scaffolds+for+Cartilage+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Avicenna+J.+Med.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Design and Fabrication of Anatomical Bioreactor Systems Containing Alginate Scaffolds for Cartilage Tissue Engineering.</a> Avicenna J. Med. Biotechnol. 4 (2), 65-74 (2012).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Three-Dimensional+Alginate+Gels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+A%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells in Three-Dimensional Alginate Gels.</a> Tissue Eng. A. 14 (5), 667-680 (2008).</li>
<li>Yeatts, A. B., Gordon, C. N., Fisher, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+an+aggregated+alginate+construct+in+a+tubular+perfusion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Formation of an aggregated alginate construct in a tubular perfusion system.</a> Tissue Eng. C, Methods. 17 (12), 1171-1178 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We beschrijven hier een protocol voor het vormen van gelaagde alginaat hydrogel schijven voor de co-kweken van meerdere celpopulaties, zoals in fysiologisch gelaagde weefsels, bijvoorbeeld kraakbeen. Gelaagde structuren, zoals beschreven cultuur platform kan gebruikt worden om de interactie tussen twee verschillende celpopulaties aan dezelfde cultuuromgeving of onder belasting onderzocht. Alginaat een anionisch lineair polysaccharide dat is gevonden biocompatibel te zijn en is met s...

Drukbelasting dragende weefsels zoals kraakbeen of tussenwervelschijven bestaan ​​uit heterogene weefsel gebieden die van cruciaal belang voor zowel de biomechanische functie en passende mechanisch-transductie in het weefsel zijn. Niet alleen is de cellulaire organisatie en werking verschillend in verschillende gebieden, maar de extracellulaire matrix (ECM) zijn daarbij elk samenstelling en organisatie. Bijvoorbeeld gewrichtskraakbeen bestaat uit drie primaire zones met verschillende celmorfologie, mechanische functie en ECM. Verschillen in hun ECM leiden tot differentiële dragende verantwoordelijkheden; de oppervlakkige laag is voornamelijk betrokken bij trek reactie te laden, terwijl het midden en diepe zones zijn voornamelijk verantwoordelijk voor het antwoord op de compressie 1. Ook in de tussenwervelschijf, een gelachtige nucleus pulposus is omgeven door een lamellaire annulus fibrosis en de cellen in deze twee verschillende gebieden onder verschillende categorieën biofysische stimuli2. In dit soort weefsels, cellen en extracellulaire matrices binnen de weefsellagen met elkaar als het weefsel ondergaat en reageert op mechanische krachten. Recapitulatie van dergelijke heterogene weefselstructuren blijft een uitdaging in tissue engineering en regeneratieve geneeskunde, en ons begrip van hun biologische betekenis is beperkt. Er is behoefte aan het kweken platforms voor het analyseren gelaagde weefsels en co-culturen van verschillende populaties van cellen in één construct. In gewrichtskraakbeen weefselmanipulatie, zijn scaffold-less gelaagde constructies geconstrueerd door gebruik te maken van het vermogen van chondrocyten zonale gevarieerde ECM afzetten van de verschillende lagen van dit weefsel 3,4 nabootsen. Echter, gelaagde hydrogel constructen gelegenheid voor het onderzoeken van de interactie van diverse soorten celpopulaties die het vermogen om een ​​robuust weefsel vormen onafhankelijk missen. Bijvoorbeeld verschillende populations van mesenchymale stamcellen kunnen worden samen gekweekt binnen gelaagde constructies. Dergelijke gelaagde steigers zijn gebruikt zowel chondrocyten differentiëren mesenchymale stamcellen verbeterde weefselmanipulatie 5. Niet alleen kunnen verschillende celpopulaties tezamen worden gekweekt in vergelijkbare hydrogel lagen, maar een enkel type cel kan worden gekweekt in lagen die zijn gemanipuleerd om variërende stijfheid of biochemische inhoud verschillende reacties van cellen 6,7 wekken hebben. Veel verschillende biomateriaal hydrogels zijn gebruikt om celpopulaties kraakbeen tissue engineering laag zoals gebruikt polyethyleenglycol of polyvinylalcohol basen 7-9. Echter, alginaat hydrogelen een van de eenvoudigste biomaterialen om gelaagde scaffolds te creëren voor het bestuderen heterogene celpopulaties in co-cultuur. Terwijl agarose hydrogels zijn ook gemakkelijk gevormd, alginaat hydrogels hebben het extra voordeel van het toestaan ​​van eenvoudig isolation van cellen van de 3-D construct voor analyse van individuele cellen als eerder 10 beschreven. In vorige studies hebben bi-lagen alginaat hydrogelen gevormd in dunne platen en van deze platen, werden secties gesneden (bv. Met behulp van een biopsie punch) voor bepaalde toepassingen zoals voor het analyseren van biochemische inhoud of raakvlak afschuifeigenschappen 11,12. Een andere werkwijze voor het vormen van dunne platen alginaat is beschreven met een mogelijke vakken met meerdere lagen, maar zou wijziging van de hydrogel voor gebruik in mechanische testen 13 vereisen. Hier presenteren we een werkwijze voor het reproduceerbaar maken van bi-lagen alginaat hydrogel schijven voor gebruik in co-kweken van verschillende populaties van cellen. Dit alginaat disc platform bezit een aantal voordelen. In de eerste plaats, de reproduceerbare vorm en de geringe afmetingen is bevorderlijk voor de mechanische stimulatie van de ingebedde cellen zonder dat een biopsie punch of andere fysieke verandering aan de hydrogel voor vele toepassingen. Bovendien cellevensvatbaarheid blijft hoog tijdens de gelaagdheid proces en na gelvorming een duidelijke scheiding van de twee celpopulaties in de gel zichtbaar zonder initiële overlappingsgebied.

<table><tbody><tr><td>Alginic Acid sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1112</td><td>Oplossing gemaakt in wt% met DPBS (-/-)</td></tr><tr><td>1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-/-)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (+/+)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>11965</td><td>Voorbeeld. Gebruik gewenste mediumtype</td></tr><tr><td>Syringe Filters (0.02 &#956;m Nylon)</td><td>FisherBrand</td><td>0979C</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP510</td><td>Bereid oplossing in steriel water</td></tr><tr><td>Criterion Blotter Filter Paper</td><td>Biorad</td><td>1704085</td><td>Snij tot de grootte van de eindplaten voor malformatie</td></tr><tr><td>Cell Microsieve Membrane (10 &#956;m pore size)</td><td>Biodesign Inc of New York</td><td>N10R</td><td>Snij tot de grootte van de eindplaten voor malformatie</td></tr><tr><td>Sodium citrate dihydrate</td><td>FisherScience</td><td>S93364</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA)</td><td>FisherBioreagent</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&nbsp;</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>26140</td><td>Gebruikt in voorbeeld mesotheliale stamcel basale groeimedia</td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>15140</td><td>Gebruikt in voorbeeld mesotheliale stamcel basale groeimedia</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>25030081</td><td>Gebruikt in voorbeeld mesotheliale stamcel basale groeimedia</td></tr><tr><td>Non-essential Amino Acids (100x)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>11140050</td><td>Gebruikt in voorbeeld mesotheliale stamcel basale groeimedia</td></tr></tbody></table>

gelaagde alginaat constructen: een platform voor co-cultuur van heterogene celpopulaties

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Veel dragende weefsels bezitten structureel en functioneel verschillende regio's, meestal vergezeld van verschillende celfenotypen met differentiële mechanosensing-kenmerken. Het ontwerpen en analyseren van deze weefseltypes blijft een uitdaging. Gelaagde hydrogelconstructen bieden een mogelijkheid om de interacties tussen meerdere celpopulaties binnen enkele constructen te onderzoeken. Alginaathydrogels zijn zowel biocompatibel als ze laten gemakkelijke isolatie van cellen na experimenteren toe. Hier beschrijven we een methode voor de ontwikkeling van kleinschalige dubbelgelaagde alginaathydrogeldiskken. Dit proces handhaaft een hoge celviabiliteit van menselijke mesenchymale stamcellen tijdens het vormingsproces en deze gelaagde schijven kunnen onbeperkte cyclische compressie weerstaan, die gewoonlijk wordt gebruikt voor stimulatie van hMSC's die chondrogenese ondergaan. Deze gelaagde constructen kunnen potentieel worden opgeschaald om extra niveaus te omvatten, en ook worden gebruikt om celpopulaties aanvankelijk na het gelaagd worden te scheiden. Dit dubbelgelaagde alginaathydrogelde kweekplatform kan voor veel verschillende toepassingen worden gebruikt, inclusief het ontwerpen en analyseren van cellen van dragende weefsels en co-cultures van andere celtypen.

Figuur 1 toont de vorming en de gelaagdheid van het alginaat hydrogels. Afgesloten bi-gelaagde gels vertonen een volledige initiële scheiding van celpopulaties zoals in figuur 2. Cel levensvatbaarheid van menselijke mesenchymale stamcellen) ingebed in deze hydrogelen en gelaagd hoog en vergelijkbaar met de bulk hydrogels zoals getoond in figuur 3. Levensvatbaarheid werd bepaald na gloeien, snijden de gels verticaal om het centrum en kleu...

Engineering en analyse van dragende weefsels met heterogene celpopulaties is nog steeds een uitdaging. Hier beschrijven we een methode voor het maken van bi-gelaagde alginaat-hydrogelschijven als platform voor co-cultuur van diverse celpopulaties binnen één constructie.

Gelaagde Alginaat Constructen: Een platform voor Co-cultuur van heterogene celpopulaties

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Het algemene doel van deze procedure is om reproduceerbaar tweekalige alginaat-hydrogel schijven te creëren voor het onderzoeken van de relaties tussen verschillende celpopulaties tijdens 3D-cocultuur. Deze methode vergemakkelijkt de studie van interacties tussen meerdere celpopulaties in ruimtelijk heterogene 3D-culturen, wat kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in tissue engineering en de fysiologie van belastbare weefsels. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige, economische en reproduceerbare manier biedt om met cellen bezette, meerlaagse alginaat-hydrogels te construeren die structureel geschikt zijn voor mechanische stimulatie.Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Poonam Sharma, een promovendus uit mijn laboratorium. Om de alginaatschijfjes te vormen, stapelt u eerst een stuk dik filterpapier op een eindplaat van drie bij drie inch, gevolgd door een cellen-microsieve-membraan. Gebruik een steriele spatel om het membraan en het filterpapier glad te strijken.Keer de stapel vervolgens om op een stapel papieren handdoeken en druk de materialen samen om het overtollige calciumchloride-oplossing te verwijderen. Plaats daarna een vorm voor gelvorming met cilindrische putjes bovenop het microsievmembraan en gebruik klemmen om de vorm voorzichtig aan de kopplaat aan de linker- en rechterzijde te bevestigen. Stapel nu een stuk dik filterpapier op een kleine kopplaat, gevolgd door een stuk microsievmembraan, en keer de stapel om om eventueel overtollig calciumchloride te verwijderen, zoals zojuist gedemonstreerd.Wanneer beide helften van de mal gereed zijn, resuspendeer dan 1 x 10⁶ cellen van belang per milliliter steriel alginaatmedium. Het mengsel zal homogeen troebel lijken wanneer de cellen correct zijn gedispergeerd. Draag vervolgens 130 µL cellen druppelsgewijs over naar individuele putjes van zes millimeter diameter en drie millimeter hoogte in de onderste helft van de malconstructie.Er zou een licht convexe meniscus zichtbaar moeten zijn boven de rand van elke well. Wanneer alle cellen zijn gezaaid, gebruik dan een steriele spatel om de bovenste helft van de malconstructie voorzichtig glad te strijken. Keer de mal vervolgens om, zodat het microsievenmembraan bovenop de wells ligt, en plaats de mal op de wells, waarbij u er zorg voor draagt dat de wells met de cel- en alginaatmengsels volledig worden afgedekt.Wanneer de mal op zijn plaats staat, tilt u de geladen malconstructie op en plaatst u, terwijl u stevig op het centrum drukt, binder clips aan de overige twee zijden van de constructie om de boven- en onderhelft van de mal te bevestigen. De cel-alginaatoplossingen moeten stevig in de putjes genesteld zijn. Dompel vervolgens de gehele malconstructie gedurende 90 minuten in een 102 millimolar calciumchloridebad in een celkweekkap bij kamertemperatuur.Verplaats het construct aan het einde van de incubatie naar een stapel papieren handdoeken en verwijder de twee klemmen die de bovenste eindplaat aan de mal bevestigen. Scheid de twee helften van het construct. De hydrogels die in de putjes zijn gevormd, mogen geen luchtbellen bevatten en moeten de putjes volledig vullen.Verwijder de resterende twee binderclips en scheid de mal met de hydrogel van de overgebleven eindplaat. Gebruik een spatel om voorzichtig langs de rand van de wells met de hydrogels te gaan om de gels voorzichtig los te maken. Draag de hydrogels vervolgens direct over naar een bad met DPBS met calciumchloride en magnesiumchloride.Na één tot vijf minuten worden de hydrogels overgebracht naar individuele putjes van een six-well plaat die voldoende basaal groeimedium bevat om de gels volledig onder te dompelen gedurende ten minste één uur bij 37 °C en 5% CO2. Gebruik tijdens de laatste 30 minuten van de incubatie binder clips om de mal met putjes die de helft van de hoogte van de gelvormingsmal hebben, aan de linker- en rechterzijde aan de aluminium eindplaat van 3 bij 3 inch of 3 bij 1,5 inch te bevestigen om een snijmal te creëren. Maak vervolgens de annealingsmal door de mal met putjes die een diameter van 3 mm groter hebben dan de gelvormingsmal, aan de linker- en rechterzijde aan aluminium eindplaten van 3 bij 3 inch te bevestigen.Breng nu de hydrogels over naar de putjes van de snijmal. Elke gel moet nauwsluitend in het putje passen, waarbij de helft van de gel boven de mal uitsteekt. Gebruik vervolgens een scalpel om langs het oppervlak van de mal te snijden en de hydrogel doormidden te snijden.Draai de bovenste helft van de gel om en plaats deze in een open malholte. Het gelstuk moet nauw aansluiten in de holte, zodat beide helften nu de hoogte van de mal hebben en het gesneden binnenoppervlak zichtbaar is. Plaats vervolgens een stuk droog cell microsieve membraan over de holtes, waarbij u ervoor zorgt dat het membraan in contact staat met alle gelhelften die moeten worden geanneleerd, en bedek het membraan met een stuk dik filterpapier.Wanneer de gels volledig bedekt zijn, verzadigt u het filterpapier met natriumcitraat aangevuld met EDTA en incubeert u de gels bij kamertemperatuur. Verwijder na één minuut het cel-microsieve-membraan en het dikke filterpapier, en verwijder de klemmen. Open vervolgens de mal en breng een gelhelft over naar een geprepareerde annealing-mal met het gesneden oppervlak naar boven gericht.Breng met een spatel een tweede behandelde gelhelft over de eerste gel aan, zodanig dat het gesneden oppervlak in contact staat met het gesneden oppervlak van de eerste gel. Wanneer alle gelen zijn geplaatst, gebruikt u een spatel om de gelen voorzichtig aan te drukken om eventuele luchtbellen te verwijderen, en dompel de annealingsmal voorzichtig onder in het calciumchloridebad. Na 30 minuten plaatst u de annealingsmal op een stapel papieren handdoeken en verwijdert u de klemmen.Scheid vervolgens de mal van de eindplaat en breng de gels kort over naar een DPBS-bad, gevolgd door onderdompeling in het geschikte celkweekmedium. Voltooide dubbellaagse gels vertonen een totale initiële scheiding van de celpopulaties, zoals waargenomen in deze afbeelding van 293 FT-cellen gelabeld met groene of rode cell tracker-kleurstoffen. De levensvatbaarheid van menselijke mesenchymale stamcellen die na het annealen zijn ingebed is hoog binnen gelaagde hydrogels, vergelijkbaar met de cellevensvatbaarheid waargenomen in bulk-hydrogels.Na het isoleren van de piekspanning uit elke cyclus gedurende vier uur ongebonden cyclische compressie, vertonen celvrije gelaagde hydrogels een spanningsrespons op de cyclische compressie die significant kleiner is in magnitude vergeleken met bulk niet-gelaagde celvrije hydrogels, hoewel beide typen hydrogel intact blijven na zeven dagen in kweek. Zodra deze techniek, inclusief de bereiding van alle materialen, onder de knie is, kan deze in minder dan vier en een halve uur worden voltooid indien correct uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om bedachtzaam en langzaam te werken om fouten te voorkomen en om het overzicht over de verschillende monsters gemakkelijker te behouden.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals mechanische stimulatie en immunokleuring, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de interacties tussen de verschillende celpopulaties in de extracellulaire matrices die gevormd kunnen worden. Deze techniek stelt onderzoekers in het veld van de mechanobiologie en tissue engineering in staat om de relatie tussen verschillende celpopulaties, zoals mesenchymale stamcellen, chondrocyten en nucleus pulposus-cellen, gemakkelijker te onderzoeken. Vergeet niet dat het werken met scherpe voorwerpen, biologische materialen en met name menselijke cellen extreem gevaarlijk kan zijn, en dat er tijdens het uitvoeren van deze procedure altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.

layered-alginate-constructs-platform-for-co-culture-heterogeneous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In dit protocol, tonen we de fabricage van een Microactuator reeks van verticaal verschoven berichten op de technologie gebaseerd is, en hoe deze basistechnologie kunnen worden gewijzigd om high-throughput mechanisch dynamische celkweek te voeren in zowel twee-dimensionale en drie-dimensionale cultuur paradigma's.

Microfabricated Platforms voor Mechanisch Dynamic Cel Cultuur

Cultuur van normale cellen in hun drie-dimensionale context is een alternatieve methode voor vroege gebeurtenissen die nodig is voor cellulaire transformatie en tumorvorming te bestuderen. Deze methode wordt gebruikt om de normale eierstokken en oviductal cellen groeien naar vroege gebeurtenissen bij eierstokkanker vorming te bestuderen.

Alginaat Hydrogelen voor Three-Dimensional orgelcultuur van de eierstokken en eileiders

In de volgende paragrafen beschrijven we procedures voor de bereiding van alginaat die voor toepassing in biomedische toepassingen. We specifiek illustreren een techniek voor het maken van meerdere lagen alginaat microsferen voor het tweeledige doel van de cel en eiwitten inkapseling als een potentiële behandeling voor diabetes type 1.

Genereren van alginaat Microspheres voor biomedische toepassingen

Waterige tweefasensysteem systemen werden gebruikt om gelijktijdig meerdere patroon populaties van cellen. Deze snelle en gemakkelijke methode voor patroonvorming cel maakt gebruik van de fasenscheiding van waterige oplossingen van dextran en polyethyleenglycol en de grensvlakspanning die tussen de twee polymeeroplossingen.

Cell Co-cultuur Patterning gebruiken waterige tweefasensysteem Systems

We hebben een methode ontwikkeld om pluripotente stamcellen (PS-cellen) in alginaathydrogeelkapsels te inkapselen met behulp van een coaxiale mondstuk. Dit voorkomt dat cellen zich overmatig bundelen en beperkt de schuifspanning die cellen in suspensiecultuur ervaren. De techniek is toepasbaar op de massaproductie van PS-cellen evenals op onderzoek naar stamcelniches.

Alginaat inkapseling van pluripotente stamcellen Met behulp van een co-axiale Nozzle

Het volgende protocol beschrijft de procedure om sandwich-achtige culturen te assembleren die kunnen worden gebruikt als een tussenstadium tussen bi-dimensionele (2D) en driedimensionale (3D) cellulaire omgevingen. De ontworpen systemen kunnen toepassingen hebben in microscopie, biomechanica, biochemie en celbiologie assays.

Sandwich-achtige microenvironments Harness Cell / Material Interactions

We beschrijven de fabricage van microgepatternde hydrogelvellen met behulp van een eenvoudig proces, dat kan worden geassembleerd en gemanipuleerd in een zelfstandige vorm. Met behulp van deze modulaire hydrogelvellen kan een eenvoudig macro-geschaald 3D-celkweeksysteem worden gegenereerd met een gecontroleerde cellulaire micro-omgeving.

Bouw van modulaire Hydrogel Sheets voor micropatterned Macro-schaal 3D Cellular Architecture

Driedriedimensionaal kweeksel in alginaatbolletjes, vanwege zijn eenvoud en reproduceerbaarheid, werd gekozen om de adenoomcellen van de hypofyse te onderhouden. De procedures omvatten een initiële enzymatische vertering en mechanische dissociatie van het tumorweefsel, en de daaropvolgende celsuspensie werd ingekapseld in alginaatbolletjes.

Driedimensionale alginaat-bead cultuur van de mens hypofyseadenoom Cells

Actuele modellen van de cultuur van de dubbelgelaagde toegestaan niet voor functionele in vitro studies die in vivo microenvironments na te bootsen. Met behulp van polyethyleenglycol en een methode van zinkoxide templating, beschrijft dit protocol de ontwikkeling van een uiterst dunne biomimetische kelder membraan met afstembare stijfheid, porositeit en biochemische samenstelling die nauw samen van de Nabootsers van in vivo extracellulaire matrices.

Uiterst dunne Porated elastisch Hydrogels als biomimetische kelder membraan voor Dual cel cultuur

Dit werk beschrijft een protocol voor de vrije vorm ingebed 3D-printen van neurale stamcellen in zelfherstellende gloeibare deeltjes-extracellulaire matrixcomposieten. Het protocol maakt het mogelijk om met hoge getrouwheid patronen te maken van onderling verbonden menselijke neurale weefselconstructies.

Microgel-extracellulaire matrixcomposietondersteuning voor het ingebed 3D-printen van menselijke neurale constructies

Het protocol toont een nieuw in vitro experimenteel model dat de biologie van twee soorten aanhangende cellijnen kan samenvatten met een driedimensionale (3D)-geprinte steiger. De constructie van dit model en de operationele procedures, van celvoorbereiding en celcultuur tot analyse en evaluatie, worden beschreven.

Co-cultuurmodel met behulp van twee soorten hechtende cellijnen

Leer hoe u gelaagde alginaathydrogels maakt voor 3D co-cultuur van heterogene celpopulaties. Deze reproduceerbare methode ondersteunt onderzoek naar weefselengineering en mechanobiologie.

Gelaagde Alginaat Constructen: Een platform voor Co-cultuur van heterogene celpopulaties

Meer video's verkennen