Gelaagde Alginaat Constructen: Een platform voor Co-cultuur van heterogene celpopulaties

Het algemene doel van deze procedure is om reproduceerbaar tweekalige alginaat-hydrogel schijven te creëren voor het onderzoeken van de relaties tussen verschillende celpopulaties tijdens 3D-cocultuur. Deze methode vergemakkelijkt de studie van interacties tussen meerdere celpopulaties in ruimtelijk heterogene 3D-culturen, wat kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in tissue engineering en de fysiologie van belastbare weefsels. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige, economische en reproduceerbare manier biedt om met cellen bezette, meerlaagse alginaat-hydrogels te construeren die structureel geschikt zijn voor mechanische stimulatie.

Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Poonam Sharma, een promovendus uit mijn laboratorium. Om de alginaatschijfjes te vormen, stapelt u eerst een stuk dik filterpapier op een eindplaat van drie bij drie inch, gevolgd door een cellen-microsieve-membraan. Gebruik een steriele spatel om het membraan en het filterpapier glad te strijken.

Keer de stapel vervolgens om op een stapel papieren handdoeken en druk de materialen samen om het overtollige calciumchloride-oplossing te verwijderen. Plaats daarna een vorm voor gelvorming met cilindrische putjes bovenop het microsievmembraan en gebruik klemmen om de vorm voorzichtig aan de kopplaat aan de linker- en rechterzijde te bevestigen. Stapel nu een stuk dik filterpapier op een kleine kopplaat, gevolgd door een stuk microsievmembraan, en keer de stapel om om eventueel overtollig calciumchloride te verwijderen, zoals zojuist gedemonstreerd.

Wanneer beide helften van de mal gereed zijn, resuspendeer dan 1 x 10⁶ cellen van belang per milliliter steriel alginaatmedium. Het mengsel zal homogeen troebel lijken wanneer de cellen correct zijn gedispergeerd. Draag vervolgens 130 µL cellen druppelsgewijs over naar individuele putjes van zes millimeter diameter en drie millimeter hoogte in de onderste helft van de malconstructie.

Er zou een licht convexe meniscus zichtbaar moeten zijn boven de rand van elke well. Wanneer alle cellen zijn gezaaid, gebruik dan een steriele spatel om de bovenste helft van de malconstructie voorzichtig glad te strijken. Keer de mal vervolgens om, zodat het microsievenmembraan bovenop de wells ligt, en plaats de mal op de wells, waarbij u er zorg voor draagt dat de wells met de cel- en alginaatmengsels volledig worden afgedekt.

Wanneer de mal op zijn plaats staat, tilt u de geladen malconstructie op en plaatst u, terwijl u stevig op het centrum drukt, binder clips aan de overige twee zijden van de constructie om de boven- en onderhelft van de mal te bevestigen. De cel-alginaatoplossingen moeten stevig in de putjes genesteld zijn. Dompel vervolgens de gehele malconstructie gedurende 90 minuten in een 102 millimolar calciumchloridebad in een celkweekkap bij kamertemperatuur.

Verplaats het construct aan het einde van de incubatie naar een stapel papieren handdoeken en verwijder de twee klemmen die de bovenste eindplaat aan de mal bevestigen. Scheid de twee helften van het construct. De hydrogels die in de putjes zijn gevormd, mogen geen luchtbellen bevatten en moeten de putjes volledig vullen.

Verwijder de resterende twee binderclips en scheid de mal met de hydrogel van de overgebleven eindplaat. Gebruik een spatel om voorzichtig langs de rand van de wells met de hydrogels te gaan om de gels voorzichtig los te maken. Draag de hydrogels vervolgens direct over naar een bad met DPBS met calciumchloride en magnesiumchloride.

Na één tot vijf minuten worden de hydrogels overgebracht naar individuele putjes van een six-well plaat die voldoende basaal groeimedium bevat om de gels volledig onder te dompelen gedurende ten minste één uur bij 37 °C en 5% CO2. Gebruik tijdens de laatste 30 minuten van de incubatie binder clips om de mal met putjes die de helft van de hoogte van de gelvormingsmal hebben, aan de linker- en rechterzijde aan de aluminium eindplaat van 3 bij 3 inch of 3 bij 1,5 inch te bevestigen om een snijmal te creëren. Maak vervolgens de annealingsmal door de mal met putjes die een diameter van 3 mm groter hebben dan de gelvormingsmal, aan de linker- en rechterzijde aan aluminium eindplaten van 3 bij 3 inch te bevestigen.

Breng nu de hydrogels over naar de putjes van de snijmal. Elke gel moet nauwsluitend in het putje passen, waarbij de helft van de gel boven de mal uitsteekt. Gebruik vervolgens een scalpel om langs het oppervlak van de mal te snijden en de hydrogel doormidden te snijden.

Draai de bovenste helft van de gel om en plaats deze in een open malholte. Het gelstuk moet nauw aansluiten in de holte, zodat beide helften nu de hoogte van de mal hebben en het gesneden binnenoppervlak zichtbaar is. Plaats vervolgens een stuk droog cell microsieve membraan over de holtes, waarbij u ervoor zorgt dat het membraan in contact staat met alle gelhelften die moeten worden geanneleerd, en bedek het membraan met een stuk dik filterpapier.

Wanneer de gels volledig bedekt zijn, verzadigt u het filterpapier met natriumcitraat aangevuld met EDTA en incubeert u de gels bij kamertemperatuur. Verwijder na één minuut het cel-microsieve-membraan en het dikke filterpapier, en verwijder de klemmen. Open vervolgens de mal en breng een gelhelft over naar een geprepareerde annealing-mal met het gesneden oppervlak naar boven gericht.

Breng met een spatel een tweede behandelde gelhelft over de eerste gel aan, zodanig dat het gesneden oppervlak in contact staat met het gesneden oppervlak van de eerste gel. Wanneer alle gelen zijn geplaatst, gebruikt u een spatel om de gelen voorzichtig aan te drukken om eventuele luchtbellen te verwijderen, en dompel de annealingsmal voorzichtig onder in het calciumchloridebad. Na 30 minuten plaatst u de annealingsmal op een stapel papieren handdoeken en verwijdert u de klemmen.

Scheid vervolgens de mal van de eindplaat en breng de gels kort over naar een DPBS-bad, gevolgd door onderdompeling in het geschikte celkweekmedium. Voltooide dubbellaagse gels vertonen een totale initiële scheiding van de celpopulaties, zoals waargenomen in deze afbeelding van 293 FT-cellen gelabeld met groene of rode cell tracker-kleurstoffen. De levensvatbaarheid van menselijke mesenchymale stamcellen die na het annealen zijn ingebed is hoog binnen gelaagde hydrogels, vergelijkbaar met de cellevensvatbaarheid waargenomen in bulk-hydrogels.

Na het isoleren van de piekspanning uit elke cyclus gedurende vier uur ongebonden cyclische compressie, vertonen celvrije gelaagde hydrogels een spanningsrespons op de cyclische compressie die significant kleiner is in magnitude vergeleken met bulk niet-gelaagde celvrije hydrogels, hoewel beide typen hydrogel intact blijven na zeven dagen in kweek. Zodra deze techniek, inclusief de bereiding van alle materialen, onder de knie is, kan deze in minder dan vier en een halve uur worden voltooid indien correct uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om bedachtzaam en langzaam te werken om fouten te voorkomen en om het overzicht over de verschillende monsters gemakkelijker te behouden.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals mechanische stimulatie en immunokleuring, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de interacties tussen de verschillende celpopulaties in de extracellulaire matrices die gevormd kunnen worden. Deze techniek stelt onderzoekers in het veld van de mechanobiologie en tissue engineering in staat om de relatie tussen verschillende celpopulaties, zoals mesenchymale stamcellen, chondrocyten en nucleus pulposus-cellen, gemakkelijker te onderzoeken. Vergeet niet dat het werken met scherpe voorwerpen, biologische materialen en met name menselijke cellen extreem gevaarlijk kan zijn, en dat er tijdens het uitvoeren van deze procedure altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.