High-throughput Identificatie van bacteriën Repellent Polymers for Medical Devices
5 november 2016
Er wordt een high-throughput microarray-methode beschreven voor de identificatie van polymeren die bacteriële oppervlaktebinding op medische apparaten verminderen.
Het algemene doel van deze polymeermicroarray-techniek is om synthetische polymeren te identificeren die in staat zijn om de hechting van bacteriën aan abiotische oppervlakken te moduleren. Deze methode kan helpen om de voortgang te versnellen bij de ontdekking van eenvoudige, kosteneffectieve biomaterialen die de hechting van bacteriën aan medische apparaten remmen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek in vergelijking met conventioneel biomateriaalonderzoek van het testen van één materiaal per keer, is de mogelijkheid om honderden polymeren tegelijkertijd in één keer te screenen.
Om te beginnen, bereid polymeeroplossingen voor en voeg ze toe aan de putjes van een 384-wellsplaat, volgens het tekstprotocol. Maak een routine om polymeren in viervoud te printen bestaande uit 1536 stippen, gerangschikt als 48 rijen en 32 kolommen, 32 polymeeroplossingen tegelijk afdrukken zodat de printer kan worden gestopt na het afdrukken van elke sectie om de pennen te kunnen schoonmaken. Plaats nu de met agarose beklede slides op het platform en zorg voor een goede vacuümafdichting om de slides in positie te houden.
Om de printkop aan te passen zodat alle pennen op dezelfde hoogte staan, laat de kop handmatig zakken op een glazen slide en bevestig dat de pennen tegelijkertijd omhoog bewegen. Plaats de putjesplaat op de houder met putje A1 rechtsboven op de houder en zorg ervoor dat de putjesplaat stevig is bevestigd. Bevestig dat de slide en de putjesplaat op de juiste plaats staan wanneer daarom wordt gevraagd.
Druk één sectie tegelijk af, waarbij de pennen tussen de secties kunnen worden schoongemaakt. Gebruik vervolgens een papieren handdoek gedrenkt in aceton om de pennen grondig te reinigen. Gevolgd door droog tissue om ervoor te zorgen dat de pennen volledig droog zijn.
Wanneer de microarrays volledig zijn afgedrukt, plaats ze dan in een slidesteun en breng ze over in een vacuümoven, ingesteld op 40 graden Celsius om te drogen, om de N&P in de polymeerstippen te verwijderen. Gebruik vervolgens UV-licht om de platen 30 minuten te steriliseren. Voordat u slides met bacteriën inoculeert, neemt u een meting van achtergrondfluorescentie volgens het tekstprotocol.
Na het kweken en voorbereiden van inocula voor de microarrays, volgens het tekstprotocol, plaatst u de UV gesteriliseerde polymeermicroarrays in rechthoekige vier-wellsplaten en voegt u zes milliliter gemengde bacterieculturen toe. Bewaar de platen bij 37 graden Celsius met zachte agitatie gedurende vijf dagen. Na de incubatie, gebruikt u PBS om de microarrays twee keer zachtjes te spoelen.
Voeg vervolgens één microgram per milliliter van DAPI in PBS toe en incubeer gedurende 30 minuten. Breng vervolgens de microarrays over naar een verse vier-wellsplaat, bedek de microarrays met PBS en draai dan zachtjes. Vervolgens ververst u de PBS eenmaal en herhaalt u de wassing.
Na het spoelen, droogt u de microarrays onder een stroom lucht en brengt u afdichtingsfolie aan en bevestigt u glazen deksels op de microarrayslides. Wanneer de lijm droog is, gebruikt u 70% ethanol om de buitenoppervlakte te steriliseren. Gebruik een fluorescentiemicroscoop, uitgerust met een 20x subjectief, om enkele beelden voor elke polymeerstip te maken in helder veld en strappy kanalen.
Om de deksels te coaten met polymeren, bereid oplossingen van HIT-polymeren in tetrahydrofuran of een ander geschikt oplosmiddel. Gebruik een spincoater om ronde glazen deksels van geschikte grootte te coaten met de polymeeroplossingen bij 2000 RPM gedurende tien seconden. Droog de gecoate deksels in een convectieoven bij 40 graden Celsius overnacht.
En gebruik UV-licht om de deksels 30 minuten te steriliseren voordat u ze met bacteriën inoculeert. Plaats de UV gesteriliseerde deksels in een standaard 12 of 24 wellsplaat en incubeer met bacteriën zoals eerder in deze video is gedemonstreerd. Na de incubatie, gebruikt u 0,1 molair cacodylaatbuffer om de gecoate deksels twee keer te wassen en vervolgens met 2,5% gewicht per volume glutaraldehyde en 0,1 molair cacodylaatbuffer, fixeert u de monsters gedurende twee uur.
Post-fixeer de deksels met 1% osmiumtetroxide gedurende een uur bij kamertemperatuur. Voordat u ze in een ethanolreeks gedurende 30 minuten bij elke concentratie dehydrateert. Bedek vervolgens de monsters met een sputtercoater en een 60 tot 40% goud tot platina legeringsmengsel met een stroom van 30 milliampère en een vacuüm van 0,75 torr.
Na het maken van afbeeldingen met SEM vergelijkt u visueel afbeeldingen van de ongecoate deksels en degenen die zijn gecoat met agarose of de HIT-polymeren om de bacteriële binding of afstotende capaciteiten van de polymeren te bevestigen. Om verschillende oplosmiddelen te evalueren voor de compatibiliteit met het uiteinde van de katheter, evenals hun vermogen om het HIT-polymeer op te lossen, dompelt u de katheterstukken in de oplosmiddelen en incubeert u gedurende 12 uur voordat u visueel de integriteit van de katheter en de helderheid van het oplosmiddel evalueert. Om bacteriële hechting op katheters door SEM te analyseren, bereidt u een 10% polymeeroplossing in aceton voor.
Druk een 200 microliter micropipettip in het middengedeelte van het gesneden stuk van de katheter om het vast te houden en steek het stuk gedurende ongeveer 30 seconden in de polymeeroplossing. Droog het gecoate stuk in omgevingsomstandigheden gedurende 30 minuten en breng een tweede coating aan door het katheterstuk opnieuw in de polymeeroplossing te dompelen en 's nachts onder omgevingsomstandigheden te drogen. Na het incuberen van gecoate en ongecoate katheterstukken in geïnoculeerd LB, volgens het tekstprotocol, gebruikt u één milliliter PBS om de katheters te wassen.
Gebruik vervolgens 10% paraformaldehyde in PBS om de bacteriën gedurende 30 minuten te fixeren. Na een wassing met PBS, gebruikt u DAPI om de bacteriën op de katheterstukken gedurende 20 minuten te kleuren. Voordat u met één milliliter PBS wast.
Bekijk
Overzicht
Dit artikel beschrijft een high-throughput microarray-methode voor het identificeren van synthetische polymeren die bacteriële aanhechting aan medische apparaten kunnen verminderen. De techniek maakt de gelijktijdige screening van honderden polymeren mogelijk, wat de ontdekking van effectieve biomaterialen versnelt.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Biomedische Technologie
- Microbiologie
- Materiaalkunde
Achtergrond
- Bacterieel aanhechting aan medische apparaten kan tot infecties leiden.
- Traditionele methoden testen één materiaal per keer, wat tijdrovend is.
- High-throughput technieken kunnen de efficiëntie van biomateriaalonderzoek verbeteren.
- Het identificeren van effectieve polymeren kan de resultaten voor patiënten verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het screenen van polymeren die bacteriële binding remmen.
- Om een kosteneffectieve aanpak te bieden voor biomateriaalonderzoek.
- Om de identificatie van polymeren voor medische toepassingen te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Bereiding van polymeeroplossingen en microarray-printen op agarose-gecoate slides.
- Incubatie van microarrays met gemengde bacteriële culturen.
- Fluorescentiemicroscopie voor het beeldvormen van bacteriële aanhechting.
- Scanning elektronenmicroscopie (SEM) voor visuele vergelijking van gecoate en ongecoate oppervlakken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van polymeren die bacteriële aanhechting verminderen.
- Demonstratie van de effectiviteit van high-throughput screening.
- Inzichten geboden in de interactie tussen bacteriën en polymeeroppervlakken.
- De methode gevalideerd door middel van verschillende beeldvormingstechnieken.
Conclusies
- De microarray-techniek is een krachtig hulpmiddel voor biomateriaalontdekking.
- Geïdentificeerde polymeren hebben potentiële toepassingen in medische apparaatdesign.
- Toekomstige studies kunnen deze methode uitbreiden om extra materialen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-throughput polymer microarray screening enables rapid identification of bacteria-repellent coatings, directly addressing the challenge of device-associated infections in clinical settings. This approach enhances predictive confidence in material selection and supports risk-adjusted advancement of medical device candidates. Integrating such screening early in the pipeline can reduce late-stage biological risk and streamline portfolio prioritization for infection-resistant devices.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of polymer-bacteria interactions to clarify anti-attachment mechanisms.
- Supports biological de-risking by identifying polymers with broad-spectrum repellent properties across clinically relevant species.
- Facilitates predictive confidence in material selection for downstream device development.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, quantitative microarray platforms for high-throughput assessment of bacterial binding.
- Standardizes assay conditions to ensure reproducibility and comparability across polymer candidates.
- Enables scalable screening workflows, supporting rapid triage and prioritization of lead polymers.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro anti-attachment data with preclinical device coating studies for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by confirming performance on clinically relevant substrates.
- Provides mechanistic de-risking for infection prevention strategies in device development.
Pipeline & Workflow Integration
This high-throughput screening method fits at the interface of early discovery and lead identification, bridging material selection with preclinical device validation.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of polymer anti-attachment properties and clarifies species-specific binding mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for comparing polymer performance under standardized conditions.
- Analytics: Generates fluorescence and SEM-based measurements to support robust statistical analysis of bacterial attachment.
- Translational Research: Facilitates continuity from in vitro screening to device coating and preclinical evaluation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for ongoing material discovery and cross-project application.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in material selection.
- Operational Value: Standardizes and scales screening workflows for efficient lead identification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by de-risking biological performance early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of device candidates with infection-resistant coatings.
Implementation Considerations
- Requires expertise in polymer chemistry, microbiology, and imaging analysis.
- Demands access to microarray printers, fluorescence microscopes, and SEM instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of assay protocols and data analysis workflows.
- Adaptation may be needed for different device substrates or bacterial species.
- Potential limitations include species-specific binding variability and solvent compatibility with device materials.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:39
Printing Polymer Microarrays Using a Contact Printer
2:34
Inoculation of Polymer Microarrays with Bacteria and Imaging and Analysis
3:58
Coating of Cover Slips for 'Hit' Validation
4:37
Attachment and Analysis of Cover Slips Using Scanning Electron Microscopy
5:51
Selection of Solvent for Coating Catheters and Analysis of Bacterial Attachment by Confocal Microscopy
7:38
Analysis of Bacterial Attachment on Catheters by Scanning Electron Microscopy
8:21
Results: High Throughput Identification of Bacterial Repellant Polymers
10:00
Conclusion
