High-throughput Identificatie van bacteriën Repellent Polymers for Medical Devices

Het algemene doel van deze polymeer-microarraytechniek is het identificeren van synthetische polymeren die in staat zijn de aanhechting van bacteriën aan abiotische oppervlakken te moduleren. Deze methode kan helpen de voortgang te versnellen bij de ontdekking van eenvoudige, kosteneffectieve biomaterialen die bacteriële aanhechting aan medische hulpmiddelen remmen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van conventioneel biomateriaalonderzoek, waarbij één materiaal tegelijk wordt getest, is het vermogen om honderden polymeren gelijktijdig in één assay te screenen.

Begin met het bereiden van de polymeeroplossingen en voeg deze toe aan de wells van een 384-wells plaat, volgens het tekstprotocol. Maak een routine om polymeren in quadruplicaat te printen, bestaande uit 1536 spots, gerangschikt in 48 rijen en 32 kolommen, waarbij telkens 32 polymeeroplossingen worden geprint zodat de printer na elk gedeelte kan worden gestopt om de pins te reinigen. Plaats nu de agarose-gecoate slides op het platform en zorg voor een goede vacuümafdichting om de slides op hun plaats te houden.

Om de printkop zo af te stellen dat alle pinnen op dezelfde hoogte staan, laat u de kop handmatig op een glazen objectglas zakken en controleert u of de pinnen gelijktijdig omhoog bewegen. Plaats de wellplaat op de plaanhouder met well A1 rechtsboven in de houder en zorg ervoor dat de wellplaat stevig is vastgezet. Bevestig wanneer u daarom wordt gevraagd dat het objectglas en de wellplaat in positie zijn.

Print één sectie tegelijk, zodat de pinnen tussen de secties door gereinigd kunnen worden. Gebruik vervolgens een papieren handdoek gedoopt in aceton om de pinnen grondig te reinigen. Gebruik daarna droog vloeipapier om te garanderen dat de pinnen volledig droog zijn.

Wanneer de microarrays volledig zijn geprint, worden ze in een objectglashouder geplaatst en overgebracht naar een vacuümoven, ingesteld op 40 degrees celsius om te drogen, om de N&P in de polymeerstippen te verwijderen. Gebruik vervolgens UV-licht om de platen 30 minuten lang te steriliseren. Voordat de objectglazen met bacteriën worden geïnoculeerd, wordt de achtergrondfluorescentie gemeten volgens het tekstprotocol.

Nadat de inocula voor de microarrays zijn gekweekt en voorbereid volgens het tekstprotocol, worden de UV-gesteriliseerde polymeermicroarrays in rechthoekige platen met vier putjes geplaatst en worden zes milliliters gemengde bacteriële culturen toegevoegd. Incubeer de platen gedurende vijf dagen bij 37 graden celsius onder zachte agitatie. Spoel de microarrays na de incubatie twee keer voorzichtig af met PBS.

Voeg vervolgens één microgram per milliliter DAPI in PBS toe en incubeer gedurende 30 minuten. Verplaats de microarrays daarna naar een nieuwe vier-wells plaat, bedek de microarrays met PBS en zwenk voorzichtig. Vervang vervolgens eenmaal de PBS en herhaal de wasstap.

Droog de microarrays na het spoelen onder een luchtstroom, breng vervolgens sealingfilm aan en bevestig glazen dekglasjes op de microarray-slides. Wanneer de lijm droog is, steriliseert u het buitenste oppervlak met 70% ethanol. Leg met een fluorescentiemicroscoop, uitgerust met een 20x objectief, enkelvoudige beelden vast voor elke polymeerspot in helderveld en strappy-kanalen.

Om dekglasjes met polymeren te coaten, bereid oplossingen van HIT-polymeren in tetrahydrofuran of een ander geschikt oplosmiddel. Gebruik een spincoater om ronde glazen dekglasjes van passende grootte te coaten met de polymeeroplossingen bij 2000 RPM gedurende tien seconden. Droog de gecoate dekglasjes overnacht in een convectieoven bij 40 degrees celsius.

Gebruik UV-licht om de dekglasjes 30 minuten te steriliseren vóór het inoculeren met bacteriën. Plaats de UV-gesteriliseerde dekglasjes in een standaard 12- of 24-wellplaat en incubeer deze met bacteriën zoals eerder in deze video is aangetoond. Gebruik na de incubatie 0,1 molair cacodylaatbuffer om de gecoate dekglasjes twee keer te wassen en fixeer de monsters vervolgens gedurende twee uur met 2,5% w/v glutaraldehyde en 0,1 molair cacodylaatbuffer.

Fixeer de dekglasjes nabehandeld met 1% osmiumtetroxide gedurende één uur bij kamertemperatuur. Dehydrateer ze vervolgens in een ethanolserie gedurende 30 minuten bij elke concentratie. Coat de monsters daarna met een sputtercoater en een mengsel van een goud-platinumlegering (60% tot 40%) met een stroom van 30 milliampère en een vacuüm van 0,75 torr.

Vergelijk na het maken van beelden met SEM visueel de beelden van de onbehandelde dekglasplaatjes met die welke zijn gecoat met agarose of de HIT-polymeren om de bacteriële bindings- of afstotingscapaciteiten van de polymeren te bevestigen. Om diverse oplosmiddelen te evalueren op hun compatibiliteit met het uiteinde van de catheter, alsovel als hun vermogen om het HIT-polymeer op te lossen, dompel de catheterstukken onder in de oplosmiddelen en incubeer deze 12 uur voordat de integriteit van de catheter en de helderheid van het oplosmiddel visueel worden beoordeeld. Bereid voor de SEM-analyse van bacteriële aanhechting aan catheters een 10% polymeeroplossing in aceton.

Druk een 200 microliter micropipetpunt in het middelste gedeelte van het afgesneden stukje katheter om het vast te houden en dompel het stukje gedurende ongeveer 30 seconden in de polymeeroplossing. Laat het gecoate stukje 30 minuten drogen onder omgevingscondities en breng vervolgens een tweede laag aan door het katheterstuk opnieuw in de polymeeroplossing te dompelen; laat dit vervolgens een nacht drogen onder omgevingscondities. Nadat de gecoate en ongecoate katheterstukjes zijn geïncubeerd in geïnoculeerd LB, volgens het tekstprotocol, wordt één milliliter PBS gebruikt om de katheters te wassen.

Gebruik vervolgens 10% paraformaldehyde in PBS om de bacteriën 30 minuten lang te fixeren. Na een wasstap met PBS wordt DAPI gebruikt om de bacteriën op de katheterstukjes gedurende 20 minuten te kleuren. Was daarna met één milliliter PBS.

Observeer de schikking van de monsters in de kamer. Maak met de volgende instellingen confocale beelden van de catheterstukken. Voltooi de confocale beeldvorming door 50 beelden in een z-stack te nemen over een lengte van 100 micrometer van de catheter.

Na de UV-behandeling en incubatie met bacteriën worden de stukken twee keer gewassen met één milliliter PBS en vervolgens gedurende 30 minuten overgebracht naar 48-wells platen die 10% formaldehyde in PBS bevatten. Na het fixeren van de monsters volgt een volgende wasbeurt met PBS, waarna ze gedurende de nacht bij kamertemperatuur worden gedroogd. Monteer ze daarna op stubs met geleidende koolstofschijven en gebruik een sputter coater voor het goudcoaten.

Voor beeldbestaking met een scanning elektronenmicroscoop. Deze figuur toont bacteriële aanhechting aan verschillende polymeren, zoals bepaald door microarray-analyse. Spots die zonder polymeer zijn geprint, dienen als negatieve controle, aangezien agarose bacteriële binding sterk tegenstaat en de fluorescentie daardoor zeer laag is.

De getoonde polymeren vertonen een binding aan de legering, hoewel de afstotende eigenschappen van een polymeer in de meeste gevallen aanzienlijk variëren tussen de geteste bacteriële soorten. Dit weerspiegelt de grote verschillen in aanhechtingsmechanismen tussen verschillende soorten. De polymeren met een lage binding zijn eenvoudig te identificeren door vergelijking met agarose.

Polymeren met een hoge bindingscapaciteit worden waarschijnlijk in een array geïdentificeerd en kunnen als positieve controles voor daaropvolgende experimenten worden gebruikt. Voor polymeren die geen autofluorescentie vertonen in het DAPI-kanaal, kan een kwalitatieve vergelijking van de spot-afbeeldingen visueel worden uitgevoerd. Om de bacteriële afstotende eigenschappen van 22 geïdentificeerde geschikte polymeren te bevestigen, zijn experimenten op grotere schaal uitgevoerd om het coaten van grotere oppervlakken te testen.

Hier worden de best presterende monsters getoond die zijn gebruikt om glazen dekglasplaatjes te coaten, zoals geanalyseerd via SEM. Deze figuren tonen katheterdoorsneden geanalyseerd via confocale microscopie en SEM. Beide microscopische methoden hebben het voordeel dat ze directe celtellingen op het oppervlak mogelijk maken, wat ondubbelzinnige gegevens oplevert aangezien een afname in celadhesie eenvoudig zichtbaar is.

Na deze procedure kunnen serum- of bloedcomponenten worden getest om hun effect op de bacteriële binding te bepalen. Er kan een diermodel worden gebruikt om het potentieel van de polymeercoatings voor klinisch gebruik te beoordelen. Vergeet niet dat het werken met chemicaliën en pathogene organismen gevaarlijk kan zijn.

En er moeten de nodige beheersmaatregelen worden genomen tijdens de hantering en afvoer om persoonlijke en milieu-risico's te beperken.