Isolatie van Cognate RNA-eiwitcomplexen van cellen met behulp van oligonucleotide-gerichte Elution
16 januari 2017
Dit manuscript beschrijft een aanpak om selectieve cognate RNP's te isoleren die in eukaryote cellen worden gevormd via een specifieke oligonucleotide-gestuurde verrijking. We tonen de toepasbaarheid van deze aanpak door een cognate RNP te isoleren die gebonden is aan het retrovirale 5' niet-vertaalde gebied dat is samengesteld uit DHX9/RNA-helicase A.
Het algemene doel van deze RNA immunoprecipitatietechniek is om selectief endogene RNA-eiwitcomplexen te isoleren en te karakteriseren die in eukaryotische cellen worden gevormd via een specifiek oligonucleotide-gestuurde verrijking. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van post-transcriptionele controle, zoals de samenstelling van RNA-bindende eiwitten die de vijf prime UTR van een retroviraal transcript definiëren om zijn genexpressie te reguleren. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een onderzoeker in staat stelt om selectief een specifiek RNA-eiwitcomplex van interesse te isoleren en te karakteriseren, terwijl de mogelijkheid behouden blijft om een meer globale analyse van de RNP downstream uit te voeren.
Nou, de implicaties van deze techniek strekken zich uit tot een fundamenteel begrip van virale infecties en talrijke cellulaire ziekten. En biedt belangrijke inzichten in de mechanismen van post-transcriptionele controle van genexpressie. Dat zou nieuwe haalbare doelwitten voor geneesmiddelen kunnen betekenen.
Na het kweken van cellen en het uitvoeren van immunoprecipitatie van een FLAG-getagd eiwit volgens het tekstprotocol, brengt u 60 microliters per IP van pro-TG magnetische bead slurry over naar een 1,7 milliliter microcentrifugebuisje. Plaats de buis op een magnetisch rek en verwijder de opslagoplossing door voorzichtig te pipetteren. Verwijder vervolgens de buis van het rek.
Voeg 600 microliters 1x wasbuffer toe. En plaats de buis op een eind over eind rotator bij kamertemperatuur gedurende drie minuten, om de beads te wassen en te gelijken. Plaats de buis op het magnetisch rek en verwijder de wasbuffer.
Voeg vervolgens 10 volumes verse 1x wasbuffer toe. Voeg immunoprecipiterend FLAG-antilichaam toe aan de geëquilibreerde pro-TG magnetische beads. En draai vervolgens de buis bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten, om het immunoprecipiterende antilichaam te binden.
Plaats de buis op de magneet en verwijder het supernatant. Verwijder vervolgens de buis van de magneet en voeg 1x wasbuffer toe aan de beads en draai gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Herhaal de wasstap twee keer en verwijder de laatste buffer.
Verwijder het kweekmedium van de cellen door aspiratie en gebruik 1,5 milliliter ijskoud PBS om de cellen twee keer te wassen. Met een celkrabber ontdoet u de natte, adherente cellen. Pipetteer de celsuspensie in verse buisjes en centrifugeert u de kweek bij 226 keer G in vier graden Celsius gedurende vier minuten.
Voeg 375 microliters ijskoud lage zoutbuffer toe aan het celpellet en incubeer het monster op ijs gedurende vijf minuten om zwelling mogelijk te maken. Het is belangrijk om voorzichtig te zijn bij het toevoegen en opnieuw suspenderen van het celpellet in de lage zout lysebuffer, om volledige onderdompeling en zwelling te garanderen zonder voortijdige mechanische verstoring. Om het cytoplasmatische cellysaat te verzamelen, voegt u 125 microliters ijskoud lysebuffer toe en gebruik vervolgens een voorgekoelde Dounce homogenisator om tien slagen uit te voeren.
Homogeniseer met voldoende kracht om lysis van het plasmamembraan en contaminanten van het vrijgekomen cytoplasmatische lysaat mogelijk te maken. Maar wees voorzichtig om de mechanische verstoring niet te overdrijven en risico op nucleaire besmetting, verstoring van RNA-eiwitcomplex of verlies van vrijgekomen Spin het homogenaat in een microfuge bij top snelheid gedurende één minuut. Breng vervolgens het supernatant over naar een nieuwe 1,7 milliliter buis die op ijs heeft gestaan.
Bepaal de totale eiwitconcentratie. Reserveer 10%voor western blot-analyse, om te worden gebruikt als inputcontrole. Om immunoprecipitatie uit te voeren, voegt u het gewenste volume van geoogst cellysaat toe aan de doelantilichaam geconjugeerde beads.
Gebruik 1x wasbuffer om het totale volume op 600 microliters te brengen en draai het monster bij kamertemperatuur. Na 90 minuten incubatie, plaats de IP-buis op de magneetrek om de beads te verzamelen. Verzamel vervolgens het supernatant en bewaar het als doorstroming.
Voeg vervolgens 10 volumes ijskoud NETN 150 wasbuffer toe aan de RNP-gebonden, antilichaam geconjugeerde beads en draai het monster gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Na het opnieuw suspenderen van de geïmmobiliseerde RNP-complexen in 1x bindingsbuffer volgens het tekstprotocol, pas het resterende volume aan in 100 microliters ijskoud 1x bindingsbuffer. En verwarm de buis gedurende drie minuten op 70 graden Celsius.
Om cognate RNA-eiwitcomplexen te isoleren, voegt u een ongeveer 30 nucleotide DNA-oligo toe, complementair aan de drie prime sequentiegrens van de RNA van belang. En incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met zacht schommelen. Voeg vijf tot tien eenheden of RNase H toe aan de buis en incubeer het monster gedurende één uur bij kamertemperatuur om de RNA van het RNA DNA hybride te kleden.
Breng vervolgens het supernatant dat de gevangen RNP-complexen van belang bevat, over naar een steriele 1,7 milliliter microcentrifugebuis. Om het immunoprecipiteerde RNA te verzamelen, suspendeert u de helft van het totale monster van gevangen RNA-complexen opnieuw in 750 microliters zuur guanidiniumthiocyanaat reagens. Voeg 200 microliters chloroform toe aan de buis, schud krachtig gedurende 10 seconden en incubeer gedurende drie minuten bij kamertemperatuur.
Na centrifugatie verzamelt u de waterige fase in een verse buis en voegt u een gelijk volume isopropanol toe. Meng goed en incubeer het monster gedurende ten minste tien minuten bij kamertemperatuur. Voeg één microliter glycolblauw toe aan het monster en bewaar het bij minuus 20 graden Celsius voor efficiënte precipitatie of verwerking op een later tijdstip.
Centrifugeer de buis gedurende tien minuten bij 16.000 keer G in vier graden Celsius. Gebruik vervolgens een P200 micropipet om voorzichtig het supernatant te verzamelen en weg te gooien, zodat de RNA-pellet niet wordt verstoord. Voeg 500 microliters 75% ethanol toe aan elke buis.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript beschrijft een RNA immunoprecipitatie-techniek om selectief endogene RNA-eiwitcomplexen in eukaryote cellen te isoleren en te karakteriseren. De methode richt zich op het retrovirale 5' onvertaalde gebied en benadrukt de rol van DHX9/RNA helicase A.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- RNA-biologie
- Post-transcriptionele controle
- Virale genexpressie
Achtergrond
- RNA-eiwitcomplexen spelen een cruciale rol in genregulering.
- Het begrijpen van deze complexen kan inzicht geven in virale infecties.
- Post-transcriptionele controle is essentieel voor regulatie van genexpressie.
- Het vijf prime UTR is belangrijk in retrovirale transcripten.
Doel van de studie
- Specifieke RNA-eiwitcomplexen isoleren met behulp van oligonukleotidegeleidde verrijking.
- De samenstelling van RNA-bindende eiwitten in retrovirale transcripten karakteriseren.
- Implicaties voor virale infecties en cellulaire ziekten onderzoeken.
Gebruikte methoden
- RNA immunoprecipitatie-techniek.
- Oligonukleotidegeleidde verrijking.
- Karakterisering van RNA-bindende eiwitten.
- Analyse van RNA-eiwitinteracties.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van cognate RNP's gebonden aan retrovirale transcripten.
- Identificatie van DHX9/RNA helicase A in de geïsoleerde complexen.
- Inzichten in de mechanismen van post-transcriptionele controle.
- Mogelijke identificatie van nieuwe doelwitten voor geneesmiddelen bij virale infecties.
Conclusies
- De techniek verbetert het begrip van RNA-eiwitinteracties.
- Het biedt een raamwerk voor het bestuderen van post-transcriptionele regulatie.
- De bevindingen kunnen leiden tot nieuwe therapeutische strategieën tegen virale ziekten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables selective isolation of specific RNA-protein complexes from eukaryotic cells, supporting target validation in post-transcriptional gene regulation. By enriching cognate RNPs at the 5' UTR of retroviral transcripts, it provides mechanistic insights into viral translation control and cellular stress response pathways. The approach aids in de-risking target hypotheses by defining RNP composition relevant to antiviral and disease-modifying strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by defining RNA binding protein composition at specific RNA elements.
- Operational Value: Supports biological de-risking through functional validation of RNA-protein interactions in disease-relevant contexts.
- Predictive Value: Enhances confidence in target selection by linking RNP complexes to translational control of viral and stress-response genes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated RNP complexes for downstream proteomic and biochemical analysis.
- Operational Value: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for assay standardization and screening readiness.
- Platform Value: Enables scalable isolation of cognate complexes for reliable compound evaluation in follow-up workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational continuity by linking discovery-phase RNP identification to preclinical validation of gene regulation mechanisms.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions through mechanistic de-risking of post-transcriptional targets.
- Predictive Value: Aligns with biomarker development by identifying RNP components associated with pathogenic gene expression.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for RNA-mediated mechanisms of gene expression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating specific RNP complexes from cellular lysates.
- Screening: Enables assay readiness through standardized isolation of RNA-protein complexes with defined composition.
- Analytics: Generates protein and RNA readouts that allow comparative analysis of RNP composition under varying conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing mechanistic insight into viral and cellular gene expression control.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for probing RNA-protein interactions across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in RNA-regulated pathways.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility in RNP isolation across laboratories and projects.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early de-risking of targets involved in post-transcriptional control.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antiviral and cellular stress-response programs based on RNP composition data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, immunoprecipitation, and RNA handling techniques.
- Depends on access to magnetic bead systems, centrifuges, and RNase-free laboratory equipment.
- Necessitates cross-team standardization of oligonucleotide design and RNase H digestion protocols.
- Involves adaptation considerations when applying to different RNA targets or cell types.
- Includes practical limitations such as the need for careful handling to preserve RNP integrity during lysis and elution steps.
