Name: Flow-sortering en Exome Sequencing van de Reed-Sternberg Cellen van Klassieke Hodgkin Lymfoom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Leer hoe u Hodgkin Reed-Sternberg-cellen isoleert uit klassieke Hodgkin-lymfoomtumoren met behulp van flow-sortering en exoomsequencing. Deze methode genereert hoogwaardig tumor-DNA zonder pre-amplificatie voor genetische analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De ontwikkeling van deze projectmethode is gefinancierd door de afdeling pathologie en laboratoriumgeneeskunde van Weill Cornell Medical College. Wij erkennen het Tri-institutionele Opleidingsprogramma in Computational Biology and Medicine voor gedeeltelijke financiering. Wij danken de wetenschappers die hun tijd en kennis met ons hebben gedeeld, vooral Maryke Appel; Dan Burgess; Iwanka Kozarewa; Chad Locklear; En iedereen van de Weill Cornell Medical College Genomics Core Facility, waaronder Jenny Zhang, Xiaobo (Shawn) Liang, Dong Xu, Wei Zhang, Huimin Shang, Tatiana Batson en Tuo Zhang.

<ol><li>Abrams, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Cancer+Institute%27s+Precision+Medicine+Initiatives+for+the+new+National+Clinical+Trials+Network%5BTitle%5D)+AND+%22American+Society+of+Clinical+Oncology+educational+book+%2F+ASCO.+American+Society+of+Clinical+Oncology.+Meeting%22%5BJournal%5D)">National Cancer Institute's Precision Medicine Initiatives for the new National Clinical Trials Network.</a> American Society of Clinical Oncology educational book / ASCO. American Society of Clinical Oncology. Meeting. , 71-76 (2014).</li>
<li>Gagan, J., Van Allen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+to+guide+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+medicine%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing to guide cancer therapy.</a> Genome medicine. 7, 80(2015).</li>
<li>Matsuki, E., Younes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphomagenesis+in+Hodgkin+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cancer+biology%22%5BJournal%5D)">Lymphomagenesis in Hodgkin lymphoma.</a> Seminars in cancer biology. 34, 14-21 (2015).</li>
<li>Fromm, J. R., Kussick, S. J., Wood, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+purification+of+classical+Hodgkin+cells+from+lymph+nodes+by+flow+cytometry+and+flow+cytometric+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Identification and purification of classical Hodgkin cells from lymph nodes by flow cytometry and flow cytometric cell sorting.</a> Am J Clin Pathol. 126 (5), 764-780 (2006).</li>
<li>Fromm, J. R., Thomas, A., Wood, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+can+diagnose+classical+hodgkin+lymphoma+in+lymph+nodes+with+high+sensitivity+and+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry can diagnose classical hodgkin lymphoma in lymph nodes with high sensitivity and specificity.</a> Am J Clin Pathol. 131 (3), 322-332 (2009).</li>
<li>Roshal, M., Wood, B. L., Fromm, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+detection+of+the+classical+hodgkin+lymphoma%3A+clinical+and+research+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+hematology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric detection of the classical hodgkin lymphoma: clinical and research applications.</a> Advances in hematology. 2011, 387034(2011).</li>
<li>Reichel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+sorting+and+exome+sequencing+reveal+the+oncogenome+of+primary+Hodgkin+and+Reed-Sternberg+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Flow sorting and exome sequencing reveal the oncogenome of primary Hodgkin and Reed-Sternberg cells.</a> Blood. 125 (7), 1061-1072 (2015).</li>
<li>Kozarewa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modified+Method+for+Whole+Exome+Resequencing+from+Minimal+Amounts+of+Starting+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Modified Method for Whole Exome Resequencing from Minimal Amounts of Starting DNA.</a> PLoS ONE. 7 (3), e32617(2012).</li>
<li>Brunicardi, F. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrunicardi%2C+FC+%22Schwartz%27s+Principles+of+Surgery%22">Schwartz's Principles of Surgery</a>. , 10th ed, McGraw-Hill Education / Medical. (2014).</li>
<li>Kantor, A. B., Roederer, M. FACS analysis of leukocytes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKantor%2C+AB+%22Handbook+of+Experimental+Immunology%22">Handbook of Experimental Immunology</a>. 2, Blackwell Scientific. (1996).</li>
<li>Sanders, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathways+of+adhesion+in+spontaneous+rosetting+of+T-lymphocytes+to+the+Hodgkin%27s+cell+line+L428%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular pathways of adhesion in spontaneous rosetting of T-lymphocytes to the Hodgkin's cell line L428.</a> Cancer Res. 48 (1), 37-40 (1988).</li>
<li>Biosciences. FACSDiva Software v6.0. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bdbiosciences.com/in/instruments/software/facsdiva/resources/overview.jsp">http://www.bdbiosciences.com/in/instruments/software/facsdiva/resources/overview.jsp</a> (2007).</li>
<li>Biosciences. <a target="_blank" href="https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSAria_II_User_Guide.pdf">FACSAria II User's Guide. Part No. 644832, Revision A</a>. , (2009).</li>
<li>Life Technologies. Qubit 3.0 Fluorometer, Catalog Number Q33216. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33216">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33216</a> (2017).</li>
<li>Roche Nimblegen. <a target="_blank" href="https://shop.roche.com/wcsstore/RASCatalogAssetStore/Articles/SeqCapEZLibrarySR_UGuide_v4p1.pdf">SeqCap EZ Library SR User's Guide ver. 4.1</a>. , (2013).</li>
<li>Illumina. HiSeq High-Throughput Sequencing System. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.illumina.com/systems/hiseq_2500_1500.html">http://www.illumina.com/systems/hiseq_2500_1500.html</a> (2016).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).</li>
<li>Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>The Broad Institute. Picard Tools. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://broadinstitute.github.io/picard/">http://broadinstitute.github.io/picard/</a> (2016).</li>
<li>Saunders, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strelka%3A+accurate+somatic+small-variant+calling+from+sequenced+tumor-normal+sample+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Strelka: accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs.</a> Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).</li>
<li>Cingolani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+program+for+annotating+and+predicting+the+effects+of+single+nucleotide+polymorphisms%2C+SnpEff%3A+SNPs+in+the+genome+of+Drosophila+melanogaster+strain+w1118%3B+iso-2%3B+iso-3%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3.</a> Fly (Austin). 6 (2), 80-92 (2012).</li>
<li>Dobin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer+%28IGV%29%3A+high-performance+genomics+data+visualization+and+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).</li>
<li>DNA copy number data analysis. v.R package version 1.34.0. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://omictools.com/dnacopy-tool">https://omictools.com/dnacopy-tool</a> (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Toekomstige toepassingen of aanwijzingen na het masteren van deze techniek Dit werk laat exome sequencing toe van monsters die tenminste 10 ng DNA bevatten. In de klinische context sluit deze limiet de meeste fijne aspiratiemonsters weg van onvoldoende materiaal, maar bevat ook adequate kernbiopsies en excisie-biopsiemonsters. Dit zal de aanschaf van gegevens van een grotere reeks mogelijke monsters mogelijk maken. Kritieke stappen binnen...

<html> Bevorderingen in kankergenetica als gevolg van volgende generatie sequencing hebben geleid tot significante doorbraken bij de identificatie van therapeutische doelen en in prognosticatie voor veel hematologische en niet-hematologische neoplasma&#39;s. Nieuwe geïndividualiseerde behandelingsstrategieën op basis van specifieke genomische veranderingen worden snel ingevoerd in veel tumortypes (onderzocht in referenties 1 , 2 ). Ondanks de significante vooruitgang in de lymfoom genomics, was het genoom van de neoplastische HRS-cellen in klassiek Hodgkin lymfoom (CHL) onderzocht. De onderzoeken zijn belemmerd door de schaarste van neoplastische HRS-cellen binnen een reactieve microomgeving, waardoor het moeilijk is om gesuiverde HRS-celpopulaties te isoleren 3 . De werkwijze voor het isoleren van levensvatbare HRS-cellen uit primaire tumoren werd ontwikkeld door Fromm et al. 4 ,Ref &quot;&gt; 5 , 6. De methode maakt gebruik van een acht-antilichaamcocktail, bestaande uit CD30, CD15, CD40, CD95, CD45 CD20, CD5 en CD64 om ondubbelzinnig HRS-cellen te identificeren uit een CHL tumor suspensie. Zijn in staat om ten minste 1000 levensvatbare HRS-cellen te isoleren uit verse of bevroren cel suspensies van tumorbiopsies bestaande uit ten minste 10 7 cellen (ongeveer 10 mg weefsel). De zuiverheid is meer dan 90% door middel van flowcytometrische analyse en wordt geschat op Minstens 80% door middel van exome genomische analyse van tien opeenvolgende gevallen. We hebben een flow-cytometrische celisolatie techniek verfijnd die het proces aanzienlijk vergemakkelijkt, waardoor een snelle isolatie van duizenden levensvatbare HRS-cellen uit primaire CHL tumoren 7 mogelijk is . We hebben de techniek gebruikt om te produceren wat wordt aangenomen dat het de eerste hele exome sequentie van de tumorcellen is in primaire gevallen van Hodgkin lymfoom. Onze studies tonen aan datE haalbaarheid van high-throughput, genoom-brede studies van individuele CHL-gevallen en hebben al geleid tot de identificatie van nieuwe genomische veranderingen met het potentieel om aspecten van CHL pathogenese uit te leggen. We hebben verder een pijpleiding ontwikkeld om het geëxtraheerde DNA te gebruiken voor genomische studies met hoge doorvoer. Om betrouwbare resultaten te verkrijgen van zo weinig als 1.000 gesorteerd HRS cellen (het minimum verkregen uit sequentiële gevallen), ontwikkelden we een gewijzigde volgende generatie DNA bibliotheek constructie procedure 8 die ons toestaat om de adapter ligatie efficiëntie te verhogen en DNA fragmenten bibliotheken te genereren Zonder overmatige amplificatie. Deze methode zorgt voor de analyse van routine klinische monsters en de detectie van herhalende mutaties en chromosomale veranderingen 7 .

<table><tbody><tr><td>Petri of Cel Cultuurschaal (steriele)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Media</td><td>Roswell Park Memorial Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foetaal Runderserum (FCS), (hitte geïnactiveerd)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Invriesmedium (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-vers klaarmaken en sterieel houden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI met 2% FCS (vers maken of maximaal 1 maand bewaren)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schelp met vers mesje</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL spuit (zonder naald)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryogene flesjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL kegelvormige centrifugebuizen, met kracht</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td>geschikt voor het hanteren van 50 mL kegelvormige centrifugebuizen en het leveren van 400g</td></tr><tr><td>Hepes buffer(1 M, celcultuurkwaliteit)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluoronic-F68</td><td>Thermo-Fisher</td><td>24040-032</td><td></td></tr><tr><td>DNAase-I</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D4527-10KU</td><td>bewaar als 5 mg/mL in RPMI bij -200 &#176;C</td></tr><tr><td>Rundserum Albumine (BSA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorteer Medium (PBS + 2% BSA + 25 mM HEPES + Pluoronic &ndash;F68 (1x))</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD64-FITC (22)</td><td>Beckman Coulter, Miami, FL</td><td></td><td>20 &mu;L voorgestelde startvolume; Titrering wordt voorgesteld</td></tr><tr><td>CD30-PE (BerH83)</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td>20 &mu;L voorgestelde startvolume; Titrering wordt voorgesteld</td></tr><tr><td>CD5-ECD (BL1a)</td><td>Beckman Coulter, Miami, FL</td><td></td><td>10 &mu;L voorgestelde startvolume; Titrering wordt voorgesteld</td></tr><tr><td>CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10)</td><td>Ebiosciences, San Diego, CA</td><td></td><td>5 &mu;L voorgestelde startvolume; Titrering wordt voorgesteld</td></tr><tr><td>CD20-PC7 (B9E9)</td><td>Beckman Coulter, Miami, FL</td><td></td><td>10 &mu;L voorgestelde startvolume; Titrering wordt voorgesteld</td></tr><tr><td>CD15-APC (HI98)</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td>20 &mu;L voorgestelde startvolume; Titrering wordt voorgesteld</td></tr><tr><td>CD45 APC-H7 (2D1)</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td>Kan worden vervangen door 10 &mu;L voorgesteld volume van CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titrering wordt voorgesteld</td></tr><tr><td>CD95-Pacific Blue (DX2)</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td></td><td>5 &mu;L voorgestelde startvolume; Titrering wordt voorgesteld</td></tr><tr><td>CD2 (5 &mu;g; klon RPA-2.10)</td><td>Biolegend, San Diego, CA</td><td></td><td>Voor optioneel protocol; Titrering wordt voorgesteld</td></tr><tr><td>CD54 (10 &mu;g; klon 84H10)</td><td>Serotec, Oxford, Verenigd Koninkrijk</td><td></td><td>Voor optioneel protocol; Titrering wordt voorgesteld</td></tr><tr><td>CD58 (10 &mu;g; klon TS2/9)</td><td>eBioscience, San Diego, CA</td><td></td><td>Voor optioneel protocol; Titrering wordt voorgesteld</td></tr><tr><td>LFA-1 (12 &mu;g; klon MHM23)</td><td>Novus Biologicals, Littleton, CO</td><td></td><td>Voor optioneel protocol; Titrering wordt voorgesteld</td></tr><tr><td>BD CS&amp;T Beads</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Accudrop Beads</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BC Versa Comp antibody capture beads</td><td>Beckman Coulter, Miami, FL</td><td></td><td>Compensatie Beads</td></tr><tr><td>BD-FACS ARIA speciaal onderzoeksbestellingsinstrument met 5 lasers</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td>elke BD-FACS aria met mogelijkheden om de fluorochromen in het antilichaampandeel te detecteren zou voldoende moeten zijn</td></tr><tr><td>Wizard</td><td>Promega</td><td>A2360</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-Cl buffer</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay kit</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S2 Sonicator</td><td>Covaris, Woburn, MA</td><td></td><td>Alternatieven kunnen worden vervangen</td></tr><tr><td>microTUBE</td><td>Covaris, Woburn, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low-Throughput Library Preparation Kit</td><td>Kapa Biosystems, Wilmington, MA</td><td>KK8221</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Green</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter, Miami, FL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SeqCap EZ Exome v.3.0</td><td>Roche Nimblegen</td><td>6465684001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TruSeq-stijl Universele adapter</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa</td><td></td><td>HPLC-zuivering; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T</td></tr><tr><td>TruSeq-stijl indexadapter</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa</td><td></td><td>HPLC-zuivering; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG</td></tr><tr><td>TruSeq-stijl PCR primer 1</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa</td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGAGA</td></tr><tr><td>TruSeq-stijl PCR primer 2</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa</td><td></td><td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAG</td></tr><tr><td>Nuclease Free Duplex Buffer</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDIVA software</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Tubes</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Flow Tubes</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

flow-sortering en exome sequencing van de reed-sternberg cellen van klassieke hodgkin lymfoom

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

De Hodgkin Reed-Sternberg cellen van klassiek Hodgkin lymfoom zijn gering verdeeld binnen een achtergrond van ontstekingslymfocyten en omvatten gewoonlijk minder dan 1% van de tumormassa. Materiaal afgeleid van bulk tumor bevat tumor inhoud bij een concentratie onvoldoende voor karakterisering. Daarom wordt de fluorescentie geactiveerde celsortering met behulp van acht antilichamen, evenals zij- en voorwaartse verspreiding hier beschreven als een methode om snel met duizend HRS-cellen uit de tumor voor de volgende studie snel te scheiden en te concentreren. Tegelijkertijd, omdat standaardprotocollen voor exome-sequencing meestal 100-1000 ng input-DNA nodig hebben, dat vaak te hoog is, ook bij het sorteren van vloeistoffen, bieden wij ook een geoptimaliseerd, lage invoer bibliotheekconstructieprotocol dat in staat is hoge kwaliteit te produceren Gegevens van zo weinig als 10 ng input DNA. Deze combinatie kan de volgende generatie bibliotheken produceren die geschikt zijn voor hybridisatie-opname van whole-eXome aasjes of meer gerichte gerichte panelen, zoals gewenst. Exome sequencing van de HRS-cellen, in vergelijking met gezonde T-cellen van T-cellen of B, kunnen somatische veranderingen identificeren, waaronder mutaties, invoegingen en deleties, en kopie-nummerveranderingen. Deze bevindingen verduidelijken de moleculaire biologie van HRS-cellen en kunnen routes voor gerichte geneesmiddelen behandelen.

Een bioanalyzer plot moet worden genomen na bibliotheek amplificatie en 0,8x kraal opruimen. Men zou een &quot;normaal&quot; verspreiding van fragmentgroottes moeten zien in het gewenste bereik ( figuur 2a ). Afwijkingen van deze vorm, zoals een zichtbare &quot;schouder&quot; in de kromme, geven de aanwezigheid aan van een artefact met een hoge of lage molecuulgewicht. Bijvoorbeeld , Figuur 2b -2d</stron...

Hier beschrijven we een gecombineerde flow cytometrische celsortering en een laag ingevoerde, volgende generatie bibliotheekconstructieprotocol dat is ontworpen om hoogwaardige, volledige exome data van de Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) cellen van klassiek Hodgkin lymfoom (CHL) te produceren.

Flow-sortering en Exome Sequencing van de Reed-Sternberg Cellen van Klassieke Hodgkin Lymfoom

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Het algemene doel van deze procedure is om levensvatbare Hodgkin Reed-Sternberg of HRS-cellen te scheiden en te concentreren uit inflammatoire lymfatische klassieke Hodgkin-lymfoom of CHL-tumoren voor het genereren en analyseren van hoogwaardige whole exome next generation sequencing data. Deze methode kan cruciale vragen in CHR-biologie beantwoorden, inclusief identificatie van belangrijke drivermutaties, immuno-escape-mutaties, en ook het bekijken van genetische diversiteit binnen de classificatie. Deze techniek levert tumor-afgeleid DNA op dat zeer hoog is in kwaliteit en zuiverheid.Het vergemakkelijken van de generatie van next generation sequencing bibliotheken zonder de noodzaak van een pre-amplificatiestap. Deze techniek kan belangrijke implicaties hebben voor de diagnose van Hodgkin-lymfoom, omdat het kan helpen bij een subclassificatie en prognostisering. Het kan ook een invloed hebben op de keuze van de therapie, aangezien sommige veranderingen gevoeligheid of resistentie voor specifieke geneesmiddelen kunnen aangeven.Jonathan From first kreeg dit idee toen hij ontdekte hoe hij HRS-cellen kon visualiseren door middel van flowcytometrie en de eerste sorteerexperimenten met

flow-sorting-exome-sequencing-reed-sternberg-cells-classical-hodgkin

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

This video describes the separation of acute lymphoblastic leukemia cells from bone marrow stromal cells using gel-type ten cross-linked dextran G-10 columns. This method helps recover the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells generating a "phase dim" tumor cell population.

G-10 Column Based Leukemia Cell Sorting: A Method to Purify Acute Lymphoblastic Leukemia Cells from Bone Marrow Stromal Cells

In this video, we describe a protocol for the flow cytometry-based sorting of naïve B cell, memory B cell, and plasmablast plasma cell subpopulations from human peripheral blood B cells. The different B cell subpopulations can be distinguished based on fluorophore-based antibody binding to the CD19, CD27, and CD38 receptors expressed on the B cell surfaces, followed by cell sorting.

Flow Cytometry-Based Cell Sorting for Different Circulatory B Cell Populations

Hier beschrijven we een protocol voor het isoleren subsets van precursor B-cellen uit navelstrengbloed. Een voldoende hoeveelheid en kwaliteit van nucleïnezuren kunnen worden geëxtraheerd uit de cellen en gebruikt in daaropvolgende testen gebruik DNA of RNA.

Isolatie van Precursor B-cel subsets van navelstrengbloed

Hier beschrijven we een protocol dat paren twee proteomics technieken, namelijk de 2-dimensionale elektroforese (2DE) en massaspectrometrie (MS), te identificeren differentieel tot expressie / post-translationeel gemodificeerde eiwitten tussen twee of meer groepen van primaire monsters. Deze aanpak, in combinatie met functionele experimenten, maakt de identificatie en karakterisering van prognostische markers / therapeutische doelen.

Van een 2DE-Gel Spot aan Protein Functie: Lesson Learned From HS1 in Chronische Lymfatische Leukemie

Kwantificering van donor-afgeleide cellen is vereist voor het controleren van engraftment na stamceltransplantatie bij patiënten met Hemoglobinopathieën. Een combinatie van stroom cytometry gebaseerde cel sorteren, kolonie vorming assay, en na diverse analyses van korte tandem herhalingen kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van de proliferatie en differentiatie van de progenitoren in het compartiment van de erythroid.

Detectie van residuele Donor Erythroid voorlopercellen na hematopoietische stamceltransplantatie voor patiënten met Hemoglobinopathieën

Detectie van minimale of meetbare residuele ziekte (MRD) is een belangrijke voorspellende biomarker voor risico-evaluatie te verfijnen en het voorspellen van herval in acute myeloïde leukemie (AML). Deze uitgebreide richtlijnen en aanbevelingen met de best practices voor consistente en accurate identificatie en opsporing van MRD, kan steun bij het maken van effectieve AML behandelingsbeslissingen.

Uitgebreide Protocol bij monster en proces beenmerg voor het meten van meetbare residuele ziekte en leukemische cellen van de stam in Acute myeloïde leukemie

Duidelijk naar voren komt een protocol voor het detecteren van gelijktijdige uitdrukking van leukemie stamcel merkers op primaire acute myeloïde leukemie cellen door stroom cytometry. We laten zien hoe te kwantificeren drie voorlopercellen populaties en een vermeende LSC bevolking met de toenemende mate van rijping. We hebben bevestigd dat de aanwezigheid van deze populaties in overeenkomstige patiënt-afgeleid-xenografts.

Stroom Cytometry om te schatten leukemie cellen van de stam in primaire Acute myeloïde leukemie en patiënt-afgeleid-xenografts, bij diagnose en Follow Up

Bulk gen expressie metingen wolk individuele cel verschillen in heterogene cel populaties. Hier beschrijven we een protocol voor hoe eencellige gen expressie analyse en index Sorteren door bloeien geactiveerd Cell Sorting (FACS) kan worden gecombineerd om te bakenen heterogeniteit en immunophenotypically karakteriseren moleculair afzonderlijke cel populaties.

Een combinatorische eencellige aanpak te karakteriseren de moleculaire en Immunophenotypic heterogeniteit van menselijke stamcellen en voorlopercellen populaties

We beschrijven een methode die immunomagnetische kralen en fluorescentie-geactiveerde celsortering combineert om gedefinieerde immuuncelsubpopulaties van perifere mononucleaire bloedcellen (monocyten, CD4 + T-cellen, CD8 + T-cellen, B-cellen en natural killer-cellen) te isoleren en te analyseren. Met behulp van deze methode kunnen magnetische en fluorescerend gelabelde cellen worden gezuiverd en geanalyseerd.

Scheiding van immuuncelsubpopulaties in perifere bloedmonsters van kinderen met infectieuze mononucleosis

Hier wordt een op flowcytometrie gebaseerde techniek gepresenteerd die het mogelijk maakt om tegelijkertijd het aantal celdelingen, het fenotype van de oppervlaktecel en de cellulaire verwantschap te meten. Die eigenschappen kunnen statistisch worden getest met behulp van een op permutatie gebaseerd raamwerk.

Gelijktijdige beoordeling van verwantschap, delingsgetal en fenotype via flowcytometrie voor hematopoëtische stam- en voorlopercellen

Leer hoe u Hodgkin Reed-Sternberg-cellen isoleert uit klassieke Hodgkin-lymfoomtumoren met behulp van flow-sortering en exoomsequencing. Deze methode genereert hoogwaardig tumor-DNA zonder pre-amplificatie voor genetische analyse.

Flow-sortering en Exome Sequencing van de Reed-Sternberg Cellen van Klassieke Hodgkin Lymfoom

Meer video's verkennen