Flow-sortering en Exome Sequencing van de Reed-Sternberg Cellen van Klassieke Hodgkin Lymfoom
10 juni 2017
Hier beschrijven we een gecombineerde flow cytometrische celsortering en een laag ingevoerde, volgende generatie bibliotheekconstructieprotocol dat is ontworpen om hoogwaardige, volledige exome data van de Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) cellen van klassiek Hodgkin lymfoom (CHL) te produceren.
Het algemene doel van deze procedure is om levensvatbare Hodgkin Reed-Sternberg of HRS-cellen te scheiden en te concentreren uit inflammatoire lymfatische klassieke Hodgkin-lymfoom of CHL-tumoren voor het genereren en analyseren van hoogwaardige whole exome next generation sequencing data. Deze methode kan cruciale vragen in CHR-biologie beantwoorden, inclusief identificatie van belangrijke drivermutaties, immuno-escape-mutaties, en ook het bekijken van genetische diversiteit binnen de classificatie. Deze techniek levert tumor-afgeleid DNA op dat zeer hoog is in kwaliteit en zuiverheid.
Het vergemakkelijken van de generatie van next generation sequencing bibliotheken zonder de noodzaak van een pre-amplificatiestap. Deze techniek kan belangrijke implicaties hebben voor de diagnose van Hodgkin-lymfoom, omdat het kan helpen bij een subclassificatie en prognostisering. Het kan ook een invloed hebben op de keuze van de therapie, aangezien sommige veranderingen gevoeligheid of resistentie voor specifieke geneesmiddelen kunnen aangeven.
Jonathan From first kreeg dit idee toen hij ontdekte hoe hij HRS-cellen kon visualiseren door middel van flowcytometrie en de eerste sorteerexperimenten met deze cellen kon uitvoeren. Voordat u de cellen voorbereidt, meng de vooraf getitreerde antilichamen in een donker glazen buisje. Voeg vervolgens PBS en BSA toe om het antilichaamcocktail op een volume van 100 microliter te brengen.
En breng het buisje van vloeibare stikstof over naar een ijskoude emmer of droog ijs. Ontdooi vervolgens snel de cellen van belang in een waterbad van 37 graden Celsius. Wanneer er nog maar een klein bevroren deel over is, giet de cellen in een 50 milliliter kegelbuisje met 45 milliliter ontdooimedium van 37 graden Celsius, en spoel het cryogeen buisje twee keer met een milliliter vers ontdooimedium.
Laat de cellen na het samenvoegen van beide spoelingen 15 minuten bij kamertemperatuur rusten. Wanneer de cellen opnieuw in evenwicht zijn, verzamel ze door centrifugatie. Aspireer alle oplossing behalve de laatste 200 microliter van de supernatant.
Re-suspendeer de cellen in de resterende ontdooimedium en laat de cellen nog twee tot drie minuten rusten. Bewaar vervolgens de cellen in 100 microliter van het antilichaamcocktail gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, was de cellen in drie milliliter sorteermedium, waarbij het pellet opnieuw wordt opgehangen in een milliliter vers sorteermedium.
Filter vervolgens de cellen door een vijf milliliter flow tube top strainer. Spoel de buis en de strainer met een extra milliliter sorteermedium en houd de cellen op ijs. Voordat u begint met het sorteren van cellen, selecteert u in de flowcytometer software onder het experimentmenu een nieuw experiment en opent u het instrumentstatusvenster.
In het parameterstab, verwijder alle ongebruikte parameters. Open vervolgens het experimenttab opnieuw en selecteer de compensatie-instelling om de compensatiecontroles te maken. Klik in het browservenster op het plusteken om de compensatiecontrole specimen uit te vouwen en voer de compensatiecontrolebuizen uit zonder de gegevens op te nemen.
Pas de detectorspanningen indien nodig aan, zodat de positief gekleurde parelpopulaties voor elke flora chrome tussen de 10.000 en 100.000 kanaal liggen. En van de helderste in hun primaire detectiekanaal. Noteer de spanningen die nodig zijn voor elke parameter voor elke buis.
Klik vervolgens onder de compensatiecontrole specimen met de linkermuisknop om de ongeverfde controlebuis te markeren en laad de ongeverfde controlebuis op het monsterplatform. Klik in het verwervingscontrolevenster op laden en voer de individuele compensatiecontroles in de detectorspanningsvelden voor alle parameters in om de bepaalde spanningen handmatig in te voeren. Klik op opnemen om de ongeverfde controlegegevens te verkrijgen.
Voer vervolgens alle resterende compensatiecontroles uit, waarbij de gegevens worden opgenomen zonder enige van de detectorinstellingen te wijzigen. Wanneer alle controles zijn geanalyseerd, voert u een buis met steriele gedeïoniseerde water gedurende vijf minuten uit om het instrument van alle resterende materialen te ontdoen voordat u verder gaat. Om de cellen voor HRS-sortering te gaten, laadt u de experimentele buis en neemt u minimaal 100.000 gebeurtenissen op terwijl u de stroomsnelheid aanpast om 3.000 tot 4.000 gebeurtenissen per seconde te verzamelen.
Zorg ervoor dat u voldoende gebeurtenissen registreert om een populatie te visualiseren die zo weinig als één op 1.000 cellen kan zijn. Om de somatische B- en T-celcontroles te identificeren, gate op de CD20 en respectievelijk CD5 positieve cellen. Wanneer alle gates zijn ingesteld, sorteer de cellen in voorgekoelde 15 milliliter kegelbuizen met zeven tot acht milliliter verzamelmedium.
Aan het einde van de sorteer bewerking, breng de geïsoleerde celpopulaties over in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes. En pellet de cellen door centrifugatie. Was vervolgens de cellen in een milliliter vers PBS en verwijder de supernatanten uit elke buis, zorg ervoor dat de kleine pellets niet worden verstoord.
Na bibliotheekversterking en punt 8X kralenopruiming, zou een normale lichtverdeling van fragmentgrootten in het gewenste bereik moeten worden waargenomen. Bibliotheken die afwijkingen vertonen van deze vorm, geven de aanwezigheid van een hoog of laag moleculair gewicht artefact aan, en zouden idealiter niet moeten worden gesequenced. Bijvoorbeeld, en adapter dimer kan soms overgaan via de eerste puntige X kralenopruiming, verschijnend als een scherpe piek gecentreerd rond 125 tot 130 basenparen.
In dit geval moet een aanvullende puntige X kralenopruiming worden uitgevoerd, gevolgd door een herhaalde visualisatie van de grootteverdeling om de succesvolle verwijdering van de dimer te waarborgen. Na multiplexing sequencing van vier monsters per spoor, is een mediane dekkingsdiepte van 50 tot 100 X over het doel haalbaar. Hoewel kopieernummerplots gegenereerd uit een bibliotheek van één nanogram leiden tot spuugnkopienummerwinsten en -verliezen.
Ongeveer 70%van de gevallen van klassiek Hodgkin-lymfoom dragen B2M en 820 mutaties, en of deleties die klonaal lijken te zijn, en die kunnen worden gebruikt om de relatieve
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het isoleren van Hodgkin Reed-Sternberg (HRS)-cellen uit tumoren van het klassieke Hodgkinlymfoom (CHL), wat hoogwaardige whole-exome sequencing mogelijk maakt. De methode richt zich op het genereren van tumor-afgeleid DNA dat geschikt is voor next-generation sequencing zonder voorafgaande amplificatie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Genomica
Achtergrond
- HRS-cellen zijn cruciaal voor het begrijpen van het klassieke Hodgkinlymfoom.
- Het identificeren van mutaties kan helpen bij de diagnose en behandelingsbeslissingen.
- DNA van hoge kwaliteit is essentieel voor nauwkeurige sequencingresultaten.
- Huidige methoden leveren mogelijk onvoldoende kwalitatief DNA op voor analyse.
Doel van de studie
- Om levensvatbare HRS-cellen te isoleren uit CHL-tumoren.
- Om hoogwaardige whole-exome sequencing-gegevens te genereren.
- Om belangrijke driver-mutaties en immuno-escape-mutaties te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Flowcytometrische cel sortering om HRS-cellen te isoleren.
- Protocol voor de constructie van next-generation libraries met lage input.
- Analyse van de kwaliteit en zuiverheid van tumorafgeleid DNA.
- Sequencing om genetische alteraties in CHL te identificeren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van hoogwaardig DNA uit HRS-cellen.
- Identificatie van sleutelmutaties die relevant zijn voor de biologie van CHL.
- Potentiële implicaties voor diagnostische en therapeutische strategieën.
- Aangetoonde effectiviteit van de methode zonder voorafgaande amplificatie.
Conclusies
- Het protocol verbetert het begrip van CHL op genetisch niveau.
- Het kan therapeutische beslissingen beïnvloeden op basis van genetische bevindingen.
- Deze aanpak kan leiden tot verbeterde patiëntresultaten door een betere classificatie en prognostiek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het isoleren van zeldzame tumor-subpopulaties, zoals Hodgkin Reed-Sternberg-cellen, maakt nauwkeurige moleculaire profilering mogelijk voor target-validatie bij hematologische maligniteiten. Deze benadering ondersteunt mechanistische risicoreductie door somatische alteraties te koppelen aan de therapeutische respons, wat bijdraagt aan de selectie van preklinische modellen en de biomarkerstrategie. Celisolatie met een hoge zuiverheid in combinatie met low-input sequencing vergroot de haalbaarheid van genomische analyse in celtypen met een lage abundantie, waardoor het voorspellend vertrouwen in vroege discovery-fasen wordt verbeterd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door maligne HRS-cellen te isoleren van inflammatoire achtergronden voor somatische mutatieanalyse.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare methode om levensvatbare tumorcellen te concentreren voor downstream genomische toepassingen.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door identificatie van clonale drivermutaties en kopie-aantalvariaties in HRS-cellen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert hoogwaardig DNA dat geschikt is voor hybridisatie-capture van whole-exome of targeted panels, waardoor betrouwbare variantdetectie mogelijk wordt.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van een geoptimaliseerd protocol voor libraries met een lage input waarbij slechts 10 ng DNA nodig is, wat de reagentiaverbruik vermindert en de doorvoer verhoogt.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert vergelijking met gezonde intratumorale T- of B-cellen om somatische alteraties te onderscheiden van kiemlijnvariatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Identificeert mutaties geassocieerd met immuunontwijking en geneesmiddelresistentie, wat bijdraagt aan de selectie van targets en de ratio voor combinatietherapie.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale monitoring van clonale evolutie en tumorinhoud mogelijk via B2M- en CIITA-alteraties als biomarkers.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de afstemming van preklinische modellen door het genomische landschap van primaire HRS-cellen te karakteriseren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert flow-sortering en sequencing met een lage input om vroege tumoranalyse te verbinden met functionele genomica, wat hypothese-gestuurde targetidentificatie en -validatie ondersteunt.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt isolatie van levensvatbare HRS-cellen mogelijk om pathogene mechanismen te testen en signaleringsafhankelijkheden bij het klassiek Hodgkinlymfoom te verduidelijken.
- Screening: Produceert sequencing-klare bibliotheken met een mediane dekking van 50–100X, wat kwantitatieve vergelijking van mutationele last en structurele varianten mogelijk maakt.
- Analytiek: Levert gegevens over somatische mutaties, indels en kopie-aantallen die helpen bij het prioriteren van targets op basis van recurrentie en functionele impact.
- Translationeel onderzoek: Verbindt genomische bevindingen met immuno-oncologie targets en resistentiemechanismen, ter ondersteuning van biomarker-gestuurde preklinische vooruitgang.
- Bedrijfbrede hergebruik: Vestigt een gestandaardiseerde workflow voor genomische analyse van zeldzame cellen, toepasbaar op andere tumorpopulaties met een lage frequentie.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van targets door ruis van stromale en immuuncontaminanten in bulk-tumoranalyse te verminderen.
- Operationele waarde: Combineert fluorescence-activated cell sorting met low-input library prep om de opbrengst uit beperkt monstermateriaal te maximaliseren.
- Strategische waarde: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door klonale mutaties en het potentieel van neoantigenen vroegtijdig in de target-beoordeling te onthullen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van somatische alteratieprofielen en pathway-verrijking.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in flowcytometrie, optimalisatie van antilichaampanels en steriele celverwerking om levensvatbaarheid en zuiverheid te waarborgen.
- Afhankelijk van toegang tot een cel-sorter met geschikte fluorescentiedetectie en apparatuur voor library-preparatie met een lage input.
- Vereist gestandaardiseerde sorting gates en compensatiecontroles om reproduceerbaarheid tussen verschillende operators en locaties te garanderen.
- Vereist validatie van de DNA-kwaliteit en de fragmentgrootteverdeling na de cleanup om sequencing-artefacten zoals adapter-dimeren te voorkomen.
- Beperkt door de zeldzaamheid van HRS-cellen (<1% van de tumor), wat voldoende startmateriaal noodzakelijk maakt voor een betekenisvol celherstel.
