Verbeterde Polymerase Chain Reaction-restrictiefragmentlengtepolymorfisme Genotypering van Toxic Pufferfish door vloeistofchromatografie / massaspectrometrie

Het algemene doel van dit experiment is om een snelle en nauwkeurige genotypering van giftige kogelvissen uit te voeren door kleine PCR-amplicons te analyseren. Het eetbare deel van kogelvissen dat wordt gebruikt om het kogelvisgerecht te bereiden varieert met de soort en sommige soorten bevatten over het hele lichaam toxines. Deze spier, de database en masu en vin en geboortehuid van kogelvissen kunnen helpen bij het genotyperen van kogelvissen vanuit het oogpunt van volledige voedselveiligheid voor iedereen en voor onderzoek.

Om DNA-extractie uit te voeren met behulp van een kit, plaatst u eerst 30 tot 50 milligram visweefsel in een microcentrifugebuisje van 0,5 of 1,5 milliliter. Plek het weefsel zonder vin en huid, met behulp van een microlepel. Voeg 180 microliter van de lysisbuffer voor dierlijk weefsel en 40 microliter proteïnase k toe en vortex kort.

Incubeer gedurende twee uur of een nacht op 56 graden Celsius op een blokverwarming. Centrifugeer het monster gedurende vijf minuten bij 13000xg. Na overbrengen van de supernatant naar een nieuw microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter, voegt u 200 microliter van de chaotropische buffer met guanidinehydrochloride uit de kit toe.

Voeg vervolgens 200 microliter van 99,5% ethanol toe en meng door te vortexen. Breng het mengsel, inclusief eventueel precipitaat, over in de spinkolom die in een opvangbuisje van twee milliliter is geplaatst. Na centrifugatie gedurende één minuut bij 13000xg, gooit u de doorloop weg.

Voeg 500 microliter van wasbuffer één toe, die guanidinehydrochloride uit de kit bevat, en centrifugeer zoals eerder. Gooi de doorloop en het opvangbuisje weg. Plaats de spinkolom in een nieuw opvangbuisje van twee milliliter dat bij de kit wordt geleverd.

Voeg 500 microliter van wasbuffer twee toe en centrifugeer gedurende drie minuten bij 20.000xg. Na het weggegooien van de doorloop en het opvangbuisje, brengt u de spinkolom over in een nieuw centrifugebuisje van 1,5 milliliter. Pipetteer 200 microliter van de elutiebuffer naar het midden van de spinkolommembraan.

Na één minuut, centrifugeer gedurende één minuut bij 6000xg. Pipetteer vervolgens 50 microliter van de aluette in een wegwerpbare ultraviolette cuvet. Meet het ultraviolette spectrum van de aluette bij 220 tot 300 nanometer en de absorptie bij 260 nanometer met behulp van een spectrofotometer.

Het gebruik van detergentvrij reagens is cruciaal voor het succes van vloeistofchromatografie omdat reagens inderdaad mogelijk schade aan de analytische kolom kunnen veroorzaken. Werk op een schone werkbank om besmetting te voorkomen en zet een 25 microliter PCR op voor elk geëxtraheerd DNA-monster, een positieve controle en een negatieve controle, op ijs zoals beschreven in het tekstprotocol. Voor gemakkelijke bediening, maak een voldoende hoeveelheid cocktail met alle reagentia zonder sjabloon-DNA en verdeel deze.

Gebruik DNA-polymerase met bewijslezingsactiviteit om de toevoeging van drie prime adenine overhangs aan het PCR-product te voorkomen. Voer PCR-amplificatie uit op een thermische cycler met behulp van het cyclusprogramma zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de enzymatische digestie uit te voeren, voegt u twee microliter van de enzymatische digestiebuffer toe aan de PCR-oplossing.

Voeg één microliter van elk restrictie-enzym toe en meng voorzichtig. Incubeer het monster gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius in de thermische cycler, gevolgd door vijf minuten bij 72 graden Celsius. Filter de reactielop met een centrifugaalfilterapparaat van 0,2 tot 0,5 micron om verstopping te voorkomen en schade aan de analytische kolom te voorkomen.

Breng het filtraat over in een taps toelopende polypropyleenbuis en bewaar het bij 20 graden Celsius tot analyse. Bereid een oplossing van hexafluorisopropanol en triethylamine in een fles van één liter zoals beschreven in het tekstprotocol. Verbind de fles met lijn A van het vloeistofchromatografie-instrument en koel de fles met behulp van een directe koeling draagbare koelkast om verdamping te voorkomen.

Verbind een andere fles gevuld met methanol met lijn B. Verbind de guardkolom en de analytische kolom met het instrument. Laat de initiële mobiele fase stromen om de kolommen te gelijken. Als u een massaspectrometer gebruikt zonder software voor het regelen van de C-Trap-druk, moet u de druk van de C-Trap verlagen door de balk handmatig te regelen.

Trek de knop om te ontgrendelen en draai de knop heel langzaam tegen de klok in om de hoge vacuümdruk tot 1/3 te verlagen. De aangegeven druk zou geleidelijk en met vertraging moeten veranderen. Negeer het waarschuwingsbericht over lage druk.

Druk de knop om te vergrendelen. Nadat u de kalibratiegegevens hebt ingesteld zoals beschreven in het tekstprotocol, beweegt u de verwarmde elektrospray-ionisatie sonde dichter naar de interface van de massaspectrometer op positie B. Verbind met de sonde en een spuit met een buisje. Infundeer de kalibrant constant met een stroomsnelheid van 10 microliter per minuut met behulp van de ingebouwde spuitpomp.

Controleer alleen de zes lagere massa-ionen in de aangepaste kalibratietabel. Ga verder met kalibratiebewerkingen nadat de intensiteit van de signalen is gestabiliseerd. Na de kalibratiebewerkingen, controleert u alleen de zes hogere massa-ionen en gaat u verder met kalibratiebewerkingen.

Vermijd kalibratiebewerkingen met alle ionen tegelijk om mislukking te voorkomen. Verplaats de sonde naar positie D voor een stroomsnelheid van 0,4 milliliter per minuut en verbind deze met het instrument met een inert metalen buisje. Nadat u de parameters hebt ingesteld zoals beschreven in het tekstprotocol, verwijdert u bellen door op de bodems van de buisjes te tikken.

Plaats de monsterbuisjes op de monsterrek en injecteert u één microliter van een monster met behulp van de autosampler om de analyse te starten. Open de ruwe databestanden met een browsersoftware en bevestig dat alle verkrijgingen succesvol zijn afgerond, inclusief de positieve en negatieve controles. Stel een method