Verbeterde Polymerase Chain Reaction-restrictiefragmentlengtepolymorfisme Genotypering van Toxic Pufferfish door vloeistofchromatografie / massaspectrometrie

Het algemene doel van dit experiment is om een snelle en nauwkeurige genotypering van giftige kogelvissen uit te voeren door kleine PCR-amplicons te analyseren. Het eetbare deel van kogelvissen dat wordt gebruikt voor het bereiden van kogelvisgerechten varieert per soort en sommige soorten bevatten gifstoffen in het hele lichaam. Deze spier, de database, masu en vin en de huid van kogelvissen kunnen helpen bij de genotypering van kogelvissen vanuit het oogpunt van voedselveiligheid voor iedereen en voor onderzoek.

Om DNA-extractie met een kit uit te voeren, plaatst u eerst 30 tot 50 milligram visweefsel in een microcentrifugebuis van 0,5 of 1,5 milliliter. Prak het weefsel zonder vin en huid fijn met een microspatel. Voeg 180 microliter animal tissue lysis buffer en 40 microliter proteinase k toe en vortex kort.

Incubeer gedurende twee uur of overnacht bij 56 °C op een blockheater. Centrifugeer het monster gedurende vijf minuten bij 13000xg. Breng de supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 mL en voeg 200 µL van de chaotrope buffer met guanidinehydrochloride uit de kit toe.

Voeg vervolgens 200 µL 99,5% ethanol toe en meng door middel van vortexen. Breng het mengsel, inclusief eventuele neerslag, over in de spincolumn die in een opvangbuis van 2 mL is geplaatst. Centrifugeer één minuut lang bij 13000xg en gooi daarna het doorstroomvolume weg.

Voeg 500 µL wasbuffer één toe, die guanidine hydrochloride uit de kit bevat, en centrifugeer zoals voorheen. Verwijder het doorstroomvloeistof en de opvangbuis. Plaats de spincolumn in een nieuwe opvangbuis van 2 mL die bij de kit wordt geleverd.

Voeg 500 µL wasbuffer twee toe en centrifugeer gedurende drie minuten bij 20.000xg. Gooi na het verwijderen van het filtraat en de opvangbuis de spincolumn over naar een nieuwe centrifugebuis van 1,5 mL. Pipetteer 200 µL elutiebuffer in het midden van het membraan van de spincolumn.

Centrifugeer na één minuut gedurende één minuut bij 6000xg. Pipetteer vervolgens 50 µL van het eluaat in een wegwerp-ultraviolette cuvet. Meet het ultraviolette spectrum van het eluaat tussen 220 en 300 nm en de absorbentie bij 260 nm met behulp van een spectrofotometer.

Het gebruik van detergentvrije reagentia is essentieel voor het succes van vloeistofchromatografie, omdat reagentia namelijk schade kunnen toebrengen aan de analytische kolom. Werk op een clean bench om contaminatie te voorkomen en stel, zoals beschreven in het tekstprotocol, een PCR van 25 µL op ijs op voor elk geëxtraheerd DNA-monster, een positieve controle en een negatieve controle. Voor een eenvoudige uitvoering kan een voldoende hoeveelheid cocktail worden gemaakt die alle reagentia bevat zonder template-DNA, om deze vervolgens te dispenseren.

Gebruik een DNA-polymerase met proofreading-activiteit om de toevoeging van 3'-adenine-overhangs aan het PCR-product te voorkomen. Voer de PCR-amplificatie uit op een thermocycler met behulp van het cyclusprogramma dat in het tekstprotocol wordt beschreven. Voeg voor de enzymatische digestie twee microliter enzymatische digestiebuffer toe aan de PCR-oplossing.

Voeg één µL van elk restrictie-enzym toe en meng voorzichtig. Incubeer het monster gedurende 30 minuten bij 37 °C in de thermocycler, gevolgd door vijf minuten bij 72 °C. Filtreer de reactieoplossing met een centrifugale filterunit van 0,2 tot 0,5 µm om verstoppingen te voorkomen en beschadiging van de analytische kolom te vermijden.

Hanteer het filtraat naar een taps toelopend polypropyleen buisje en bewaar dit bij 20 °C tot aan de analyse. Bereid een oplossing van hexafluorisopropanol en triethylamine in een fles van één liter voor, zoals beschreven in het tekstprotocol. Verbind de fles met lijn A van het vloeistofchromatografie-instrument en koel de fles met een draagbare directe koelkast om verdamping te voorkomen.

Sluit een andere fles gevuld met methanol aan op lijn B. Verbind de bewaak kolom en de analytische kolom met het instrument. Start de stroming van de initiële mobiele fase om de kolommen te equilibreren. Als u een massaspectrometer gebruikt zonder software voor het regelen van de C-Trap-druk, dient u de druk van de C-Trap te verlagen door de bar handmatig te regelen.

Trek hiervoor aan de knop om deze te ontgrendelen en draai de knop zeer langzaam tegen de klok in om de hoogvacuümdruk tot 1/3 te verminderen. De aangegeven druk moet geleidelijk en met vertraging veranderen. Negeer de waarschuwingsmelding over lage druk.

Druk op de knop om te vergrendelen. Nadat de kalibratie is voorbereid zoals beschreven in het tekstprotocol, wordt de verwarmde electrospray-ionisatieprobe dichter bij de interface van de massaspectrometer op positie B verplaatst. Verbind de probe via een slangetje met een spuit. Infuseer het kalibrant constant met een stroomsnelheid van 10 microliters per minuut met behulp van de ingebouwde spuitpomp.

Controleer alleen de zes ionen met de laagste massa in de aangepaste kalibratietabel. Ga verder met de kalibratie zodra de signaalintensiteit is gestabiliseerd. Controleer na de kalibratie alleen de zes ionen met de hoogste massa en ga verder met de kalibratie.

Voorkom dat u alle ionen tegelijkertijd kalibreert om fouten te vermijden. Verplaats de probe naar positie D voor een stroomsnelheid van 0,4 milliliters per minuut en sluit deze aan op het instrument met een inerte metalen buis. Nadat de parameters zijn ingesteld zoals beschreven in het tekstprotocol, verwijdert u luchtbellen door tegen de bodem van de vials te tikken.

Plaats de monsterbuisjes in het monsterrek en injecteer één microliter van een monster met behulp van de autosampler om de analyse te starten. Open de ruwe databestanden met software voor browsen en bevestig dat alle acquisities succesvol zijn voltooid, inclusief de positieve en negatieve controles. Stel een methode in zoals beschreven in het tekstprotocol en klik vervolgens op de run-knop in het tabblad 'run cue' om de deconvolutiesoftware te starten.

Nadat de wachtrij is voltooid, selecteert u een rij en klikt u in het bovenste bijschrift op 'open result' om de resultaten van de deconvolutie te verkrijgen. Hier ziet u een typisch totaal ionenstroomchromatogram verkregen van een negatieve controle en een kogelvismonster. Elke piek vertegenwoordigt een DNA-duplex die gescheiden is op basis van de lengte.

In dit voorbeeld worden drie pieken waargenomen in het monster van de kogelvis. Deze pieken zijn het resultaat van de amplicon-digestie met behulp van twee endonucleasen. In het monster van de negatieve controle worden geen pieken waargenomen.

Elke piek vertegenwoordigt een massaspectrum dat bestaat uit meervoudig geladen ionen. Door het massaspectrum te vergroten, worden tientallen isotopisch opgeloste pieken zichtbaar. Deze resolutie is vereist voor het bepalen van de monoisotopische massa en is alleen mogelijk met een massaspectrometer met hoge resolutie.

In dit voorbeeld zijn de monoisotopische massa's van de derde piek 16296,7656 en 16468,6616 Daltons. Rekening houdend met een massatolerantie van drie ppm, zijn de gemeten waarden identiek aan de theoretische waarden van takifugu rubripes, zoals hier wordt getoond. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in één dag worden uitgevoerd met behulp van gangbare instrumenten en apparatuur.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe kleine ampliconen via vloeistofchromatografie met hoge resolutie massaspectrometrie kunnen worden geanalyseerd voor genotypering. Deze techniek kan worden toegepast bij het analyseren van andere DNA-polymorfismen, mits de sequentievariatie wordt weerspiegeld in de te analyseren kleine ampliconen. Deze techniek identificeert echter alleen basecomposities; basesubstituties binnen dezelfde massa kunnen niet van elkaar worden onderscheiden.