Affiniteit Labeling Detectie van endogene receptoren van zebravis embryo's
31 augustus 2016
Een nieuwe techniek voor de detectie van lage abundantie endogeen receptoren aanwezig in zebravis embryo's wordt beschreven. We hebben het AFLIP genoemd omdat het bestaat uit affiniteitslabeling van de receptor door zijn ligand gekoppeld aan immunoprecipitatie.
Het algemene doel van deze procedure is om receptoren voor groeifactoren met een lage abundantie in zebravis-embryo's te detecteren door de selectiviteit en gevoeligheid van affiniteitslabeling van de gekozen receptor door zijn radioactieve ligand te combineren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen op het gebied van ontwikkelingsbiologie, zoals de expressieniveaus van receptoren en hun biochemische eigenschappen. Deze methode, die we AFLIP hebben genoemd, breidt de krachtige beschrijvende eigenschappen van affiniteitslabeling, een goed gevestigde celbiologietechniek, uit naar ontwikkelingsstudies van zebravissen.
Om deze procedure te starten, verzamel 100 tot 200 embryo's voor elke conditie en plaats ze in petrischalen met viswater. Dechorioneer vervolgens de embryo's handmatig met behulp van pincetten met een fijne punt en vermijd het gebruik van pronase of enige andere protease gedurende het hele protocol, omdat dit de beoogde receptoren kan verteren. Plaats vervolgens de embryo's in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter en was ze twee keer met 1X PBS.
Voeg vervolgens 500 microliter deyolkbuffer toe. Laat het grootste deel van het dooier los door de embryo's in de oplossing zachtjes omhoog en omlaag te pipetteren, ongeveer 30 tot 40 keer. Gebruik voor embryo's van 72 HPF en 48 HPF respectievelijk blauwe en gele pipettentips.
Gele tips moeten mogelijk lichtjes worden doorgesneden om te voorkomen dat de embryo's worden vernietigd. Een succesvolle dooiervrijlating kan worden gecontroleerd door de embryo's onder de microscoop te observeren. Verwijdering van het dooier moet zo compleet mogelijk zijn, omdat dooierlipiden en -eiwitten kunnen interfereren met volgende ligand- of antilichaambindingsstappen.
Verzamel vervolgens de embryo's door centrifugatie bij 600 x g gedurende 15 seconden. Gooi voorzichtig het supernatant weg met behulp van een pipet. Was vervolgens de embryo's twee keer met 500 microliter wasbuffer door ze voorzichtig te vortexen op de laagste snelheid.
Verzamel vervolgens de embryo's door centrifugatie bij 600 x g gedurende 15 seconden. Vanaf hier gaat het vervolg van de procedure bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant voorzichtig weg met behulp van een pipet.
Daarna suspenderen we de embryo's in 350 microliter lysisbuffer en homogeniseren ze met behulp van een plastic stamper. Incubeer vervolgens de gelyseerde embryo's gedurende 30 minuten met agiteren op een testbuisrokker bij vier graden Celsius. Centrifugeer vervolgens de gelyseerde embryo's bij 11.000 x g gedurende 15 minuten om de onoplosbare deeltjes te verwijderen.
Breng vervolgens het verdunde supernatant over naar een verse buis. Bepaal het totale eiwit met behulp van de Bradford-eiwittest en stel een calibratiecurve op. Plaats in deze stap 400 tot 500 microgram totaal embryo-eiwit in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter en verdun het tot één microgram per microliter met buffer 1.
Voeg vervolgens Iodine-125-label TGF-beta II-stock toe om een eindconcentratie van 150 picomolair te bereiken en incubeer met agiteren op een testbuisrokker gedurende twee uur bij vier graden Celsius. Voeg vervolgens onverdund antilichaam tegen de belangrijke receptor toe om een 1:100 verdunning te bereiken. Vervolgens de incubatie gedurende nog eens twee uur of een nacht voortzetten bij vier graden Celsius.
Na incubatie voegt u 50 microliter geschikte immunoglobuline-bindingsbead toe en incubeert u gedurende 50 minuten met agiteren op een testbuisrokker bij vier graden Celsius. Herwin vervolgens de beadjes door microcentrifugatie bij 11.000 x g gedurende 20 seconden en gooi het supernatant weg in een geschikte radioactieve afvalcontainer. Was vervolgens de IP-beadjes drie keer met één milliliter IP-washbuffer door voor elke keer 20 seconden te vortexen en microcentrifugeren bij 11.000 x g.
Suspendeer vervolgens de IP-beadjes opnieuw in 250 microliter IP-washbuffer. Bereid verse DSS-oplossing voor en voeg 1,5 microliter hiervan toe aan het monster. Incubeer vervolgens het monster gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius met agiteren.
Om de cross-linkingreactie te onderdrukken, voegt u 500 microliter IP-washbuffer toe die is aangevuld met voldoende trystchloridestock bij pH 7,4 om 25 millimolair trystchloride te bereiken. Centrifugeer vervolgens bij 11.000 x g gedurende 20 seconden om IP-beadjes te verzamelen. Gooi vervolgens het supernatant weg en suspendeer de IP-beadjes opnieuw in 30 microliter reducerende laemmlibuffer.
Kook vervolgens het monster gedurende vijf minuten bij 94 graden Celsius voordat u het onderwerpt aan SDS-PAGE-gelelektroforese en analyseer vervolgens de gedroogde gels in een fosforimeter of door conventionele autoradiografie. Deze figuur toont de representatieve resultaten die zijn verkregen met AFLIP. Totaal eiwit geëxtraheerd uit de embryo's bij 72 hpf en 48 hpf werd onderworpen aan Iodine-125 TGF-beta II affiniteitslabeling, gevolgd door IP met konijnenanti-zebravis BG of konijnenanti-rat BG als controle.
In de autoradiografie kan BG worden gedetecteerd zonder GAG of als een glycosaminoglycaan-gemodificeerd BG. Deze figuur toont hoe AFLIP kan worden gebruikt om de expressieniveaus van een bepaalde receptor in embryo's te meten die zijn onderworpen aan een experimentele manipulatie, in dit geval de afname van betaglycan naar de morpholino-injectie. Baan een toont het niveau van TGF beta-receptor III in een wildtype-embryo van 72 hpf, terwijl baan twee het effect laat zien van het toedienen van zeven nanogram van een morpholino gericht op de exon 2-intron 2-grens van het ZFPG-primaire transcript. Merk op dat de BG-downregulatie die is verkregen met deze morpholino niet wordt gereproduceerd door de mismatchcontrole.
Deze resultaten bevestigden dat het fenotype dat is verkregen met deze morpholino specifiek was voor het knockdown van de TGF beta-receptor III zoals eerder beschreven. Het succes van AFLIP voor het detecteren van een groeifactor of cytokinereceptor hangt af van de beschikbaarheid van een radioactief gelabelde ligand die kan worden gebonden en gekruisverbonden met zijn receptor. Een goed antilichaam voor immuno
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een nieuwe techniek genaamd AFLIP voor het detecteren van groeifactorreceptoren met een lage abundantie in zebravissenembryo's. De methode combineert affiniteitslabeling met immunoprecipitatie om de gevoeligheid en selectiviteit te verhogen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Ontwikkelingsbiologie
- Celbiologie
Achtergrond
- De detectie van receptoren met een lage abundantie is uitdagend.
- AFLIP maakt gebruik van radioactieve liganden voor de labeling van receptoren.
- De techniek is toepasbaar op ontwikkelingsstudies bij zebravis.
- Affiniteitslabeling is een goed gevestigde methode in de celbiologie.
Doel van de studie
- Om groeifactorreceptoren in zebravissenembryo's te detecteren.
- Om receptorexpressieniveaus en biochemische eigenschappen te onderzoeken.
- Om affiniteitslabelingtechnieken uit te breiden naar de ontwikkelingsbiologie.
Gebruikte methoden
- Verzamel 100 tot 200 zebravisembryo's voor elke conditie.
- Dechoreioneer de embryo's handmatig met behulp van fijne pincetten.
- Vermijd proteasen om digestie van de receptor te voorkomen.
- Was de embryo's met 1X PBS voordat u doorgaat met de assay.
Belangrijkste resultaten
- AFLIP verbetert de detectie van receptoren met een lage abundantie.
- De methode biedt inzicht in de expressieniveaus van receptoren.
- Het demonstreert de toepasbaarheid van affiniteitslabeling in zebravisstudies.
Conclusies
- AFLIP is een waardevolle tool voor het bestuderen van receptordynamiek in embryo's.
- Deze techniek kan het onderzoek in de ontwikkelingsbiologie bevorderen.
- Toekomstige studies kunnen de toepassing ervan uitbreiden naar andere biologische systemen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het detecteren van receptoren met een lage abundantie in vroege ontwikkelingsmodellen ondersteunt de validatie van targets door de aanwezigheid van receptoren en de expressiedynamiek te bevestigen. AFLIP verhoogt de sensitiviteit voor receptoren die moeilijk te detecteren zijn via conventionele methoden, wat helpt bij het mechanistisch reduceren van risico's in groeifactor-signaleringsroutes. Dit maakt een meer zekere targetselectie mogelijk in preklinisch onderzoek, in het bijzonder voor targets van de TGF-β superfamilie zoals betaglycan.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Bevestigt de expressie van receptoren met een lage abundantie, zoals TGFBR3 in zebravissenembryo's, wat het testen van target-hypothesen ondersteunt.
- Operationele waarde: Maakt de detectie mogelijk van receptoren die bij een Western blot over het hoofd kunnen worden gezien door een gebrekkige transfer van zwaar geglycosyleerde eiwitten.
- Voorspellende waarde: Levert direct bewijs voor receptor-ligandinteractie, waardoor ambiguïteit in studies naar target-engagement wordt verminderd.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Genereert kwantificeerbare, covalent gelabelde receptorcomplexen die geschikt zijn voor downstream-analyse via SDS-PAGE en autoradiografie.
- Reproduceerbaarheid: Maakt gebruik van gestandaardiseerde stappen, waaronder lyse, immunoprecipitatie en cross-linking, om variabiliteit te minimaliseren.
- Schaalbaarheid: Verwerkt 100–200 embryo's per conditie, wat validatie met een gemiddelde doorvoersnelheid in discovery-settings ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Zebravisembryo's dienen als een ziekterelevant systeem voor het bestuderen van geconserveerde signaleringsroutes zoals TGF-β.
- Translationele continuïteit: AFLIP-resultaten kunnen morpholino-gebaseerde knockdown-studies informeren, waarbij doelwitmodulatie wordt gekoppeld aan fenotypische uitkomsten.
- Mechanische risicoreductie: Valideert de specificiteit van de receptor-knockdown door aan te tonen dat signaalverlies alleen optreedt bij de juiste morpholino en niet bij mismatched controls.
Integratie van Pipeline & Workflow
AFLIP past binnen het continuüm van vroege ontdekking en ondersteunt de validatie van targets voorafgaand aan de identificatie van leads door biochemische bevestiging van receptorexpressie en ligandbinding te verschaffen.
- Ontdekkingsbiologie: Test therapeutische hypothesen door receptor-expressie te detecteren in intacte embryonale systemen.
- Screening: Bereidt gevalideerde receptor-ligandcomplexen voor op kwantitatieve detectie, waardoor vergelijking tussen experimentele condities mogelijk wordt.
- Analytiek: Genereert autoradiografische resultaten die een semi-kwantitatieve beoordeling van receptorwaarden onder verschillende verstoringen mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt modulatie van moleculaire targets met fenotypische resultaten in zebravissen, wat de preklinische continuïteit ondersteunt.
- Herbruikbaarheid in de sector: Kan worden aangepast aan andere receptoren, mits er een radiogestempeld ligand en een specifiek antilichaam beschikbaar zijn, waardoor het een herbruikbaar platform is voor de validatie van groeifactor-/cytokine-targets.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in target-validatie door het detecteren van glycosyleerde receptoren met een lage abundantie die door standaardmethoden worden gemist.
- Operationele waarde: Vermijdt transferstappen van Western blots, waardoor de detectie van moeilijk te vangen targets zoals proteoglycanen wordt verbeterd.
- Strategische waarde: Vermindert fout-negatieven bij target-screening, wat leidt tot betere go/no-go-beslissingen in de vroege ontdekkingsfase.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door de aanwezigheid van targets te bevestigen voordat er wordt geïnvesteerd in de ontwikkeling van modulatoren.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de omgang met radiolabels, immunoprecipitatie en de manipulatie van zebravissenembryo's.
- Toegang tot een radiogestempeld ligand (bijv. Iodine-125 TGF-β2) en een specifiek antilichaam tegen de doelreceptor is noodzakelijk.
- Vereist een infrastructuur voor radioactieve veiligheid en naleving van de protocollen voor het gebruik van isotopen.
- Aanpassing aan andere systemen is afhankelijk van de beschikbaarheid van het ligand en de specificiteit van het antilichaam.
- Praktische beperking: Niet geschikt voor high-throughput screening vanwege de handmatige stappen en de omgang met radioactiviteit.
