Name: Affiniteit Labeling Detectie van endogene receptoren van zebravis embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Leer de AFLIP-techniek voor het detecteren van groeifactorreceptoren in zebraviseieren met behulp van affiniteitslabeling en immunoprecipitatie. Deze methode biedt verhoogde gevoeligheid voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Gilberto Morales voor de verzorging en het onderhoud van de vissen, en Drs. Claudia Rivera en Hector Malagòn (IFC-UNAM Animal Facility) voor hun hulp bij de immunisatie van konijnen. Dit werk werd ondersteund door subsidies van CONACYT 131226 en PAPIIT-DGAPA-UNAM IN204916.

Alle experimenten uitgevoerd bij dieren uitgevoerd werden goedgekeurd door het Comité voor Laboratory Animal Care en gebruik van de Autonome Nationale Universiteit van Mexico (UNAM), in het kader van de CICUAL-protocol nummer: FLC40-14. (CICUAL: &quot;Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de fisiologia Celular, Universidad Nacional Autònoma de México&quot;). 1. Bereiding van Embryo Protein Extract <ol><li> Verzamel 100-200 embryo&#39;s voor elke voorwaarde om te vergelijken (morphants vs. wild-type) op de gewenste stadium, bijvoorbeeld 72 uur na de bevruchting (HPF). </li><li> Plaats embryo&#39;s in Petri gerechten met vis water (zie tabel 1) en handmatig dechorionate embryo&#39;s met behulp van fijne punt tang. Gebruik geen pronase tijdens deze stap (of een ander protease gehele protocol) omdat de beoogde receptor kunnen verteren. </li><li> Plaats embryo in een 1,5 ml microfugebuis en was embryo twijs met 1x fosfaatbufferoplossing (PBS) (zie tabel 1). </li><li> Voeg 500 pl deyolk buffer (zie tabel 1). </li><li> Vrijgeven meeste dooier door zachtjes en neer te pipetteren (ongeveer 30-40 keer) de embryo&#39;s in de oplossing. Voor 72 HPF en 48 HPF embryo&#39;s te gebruiken blauw en geel pipetpunten, respectievelijk. Gele tips kan nodig zijn om iets te snijden om te voorkomen dat het vernietigen van embryo&#39;s. De succesvolle dooier vrijlating kan worden gecontroleerd door het observeren van embryo&#39;s onder de microscoop. </li><li> Verzamel embryo door centrifugatie bij 600 g gedurende 15 sec. </li><li> Gooi supernatant voorzichtig met een pipet. </li><li> Wassen embryo tweemaal met 500 ui wasbuffer (zie tabel 1) door voorzichtig vortexen op de laagste snelheid. </li><li> Verzamel embryo door centrifugatie bij 600 g gedurende 15 sec. </li><li> Vanaf hier, blijven de procedure bij 4 ° C. </li><li> Gooi supernatant voorzichtig met een pipet. </li><li> Resuspendeer embryo&#39;s in 350 ul lysisbuffer (zie tabel 1) en homogeniseer met een plastic stamper. </li><li> Incubeer 30 min gelyseerd embryo onder schudden op een reageerbuis rocker bij 4 ° C. </li><li> Centrifugeer gelyseerd embryo bij 11.000 g gedurende 15 minuten om onoplosbare resten te verwijderen. </li><li> Overdracht heldere supernatant met een pipet naar een nieuwe buis. </li><li> Vaststellen van totaal eiwit door Bradford eiwittest 4 of een andere geschikte procedure. Als Bradford assay wordt gebruikt, voert de ijkcurve in aanwezigheid van equivalente concentraties van detergentia in de lysisbuffer mocht een onderschatting van de eiwitstandaard 4 veroorzaken. </li></ol> 2. Detectie van endogene Receptor Protein <ol><li> Affiniteit Labeling en Immunoprecipitatie (al deze stappen bij 4 ° C) <ol><li> Place 400-500 ug totaal eiwit embryo in een 1,5 ml microfugebuis en verdun tot 1 ug / ul met buffer 1 (zie tabel 1). Let op: Met het oog op het verkrijgen van 500 ug totaal embryo eiwit, ongeveer 100-200 embryo&#39;s moeten in eerste instantie worden verwerkt. 72 HPF embryo routinematig op ~ 5 ug totaal eiwit embryo, wat voldoende is voor betaglycan detectie. </li><li> Voeg voldoende hoeveelheid gelabeld TGF-β2 voorraad tot een eindconcentratie van 150 pM bereiken en incubeer onder schudden op een reageerbuis rocker 2 uur bij 4 ° C. TGF-β2 moeten worden geëtiketteerd voordat AFLIP wordt gestart met 125 I de chlooramine T methode, beschreven Cheifetz et al. 5. LET OP: Gebruik afscherming om blootstelling te minimaliseren tijdens het hanteren van 125 ik gemerkt ligand. </li><li> Voeg voldoende volume onverdunde antilichaam tegen de receptor van belang om ook in een 1: 100 verdunning en verder incubatie gedurende nog 2 uur bij 4 ° C (incubatie kan O / N). Dit is de optimale verdunning van antiserum # 31, die in deze studie en elders 3, maar afhankelijk van de kwaliteit van eentibody, een grotere of kleinere verdunning optimaal zijn. </li><li> Voeg 50 ul van geschikte immunoglobuline bindende kralen (bijvoorbeeld G-eiwit-Sepharose, die voorheen TNTE werd geëquilibreerd en opnieuw gesuspendeerd 1: 5 van het oorspronkelijke volume in TNTE) en incubeer gedurende 50 min onder roeren op een reageerbuis rocker bij 4 ° C. </li><li> Herstel de kralen door microcentrifugatie bij 11.000 xg gedurende 20 sec. </li><li> Gooi supernatant in een geschikt radioactief afval container. </li><li> Was de IP-parels driemaal met 1 ml van IP wasbuffer (zie Tabel 1), door wervelen en microcentrifugatie bij 11.000 xg gedurende 20 seconden per keer. </li><li> Resuspendeer IP-kralen in 250 ul IP wasbuffer. </li><li> Voeg 1,5 pl disuccinimidylsuberaat (DSS, opgelost in DMSO bij 10 mg / ml). Bereid de DSS oplossing vlak voor het gebruik ervan in deze stap. </li><li> Incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C onder roeren. </li><li> Teneinde de verknopingsreactie te blussen, voeg 500 ul of IP wasbuffer, aangevuld met voldoende Tris-Cl pH 7,4 voorraad tot 25 mm Tris-Cl te bereiken. De vrije amino-groepen in Tris vangen ongereageerd DSS. </li><li> Centrifugeer bij 11.000 xg gedurende 20 seconden aan IP-kralen te verzamelen en gooi supernatant. </li><li> Resuspendeer IP-kralen in 30 ul reducerende Laemmli buffer. </li><li> Kook monsters 5 min bij 94 ° C. </li><li> Eventueel analyseren monsters in een gammateller behulp protocol van de fabrikant. </li></ol></li><li> monsteranalyse <ol><li> Onderworpen monsters denaturerende SDS-PAGE. Gebruik polyacrylamide op het juiste percentage van de massa van de receptor en werking gel onder standaardprocedure. </li><li> Dompel gel in fixatief (zie tabel 1) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de gel met gedestilleerd water gedurende 15 min. </li><li> Plaats de gel in eerder gehydrateerd filter papier en dek af met saran wrap film. </li><li> Droge gel bij 80 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Expose gel op een witte fosforimager screen bij RT O / N. </li><li> Scan blootgesteld scherm met behulp van een fosforimager met behulp van het protocol van de fabrikant. </li></ol></li></ol>

<ol><li>López-Casillas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+expression+of+the+membrane+proteoglycan+betaglycan%2C+a+component+of+the+TGF-%CE%B2+receptor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system.</a> Cell. 67 (4), 785-795 (1991).</li>
<li>Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transforming+growth+factor-beta+receptor+type+III+is+a+membrane+proteoglycan.+Domain+structure+of+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor.</a> J. Biol. Chem. 263 (32), 16984-16991 (1988).</li>
<li>Kamaid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaglycan+knock-down+causes+embryonic+angiogenesis+defects+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Betaglycan knock-down causes embryonic angiogenesis defects in zebrafish.</a> Genesis. 53, 583-603 (2015).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+and+Sensitive+Method+for+the+Quantitation+of+Microgram+Quantities+of+Protein+Utilizing+the+Principle+of+Protein-Dye+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Cheifetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+transforming+growth+factor-b+receptor+subsets+as+determinants+of+cellular+responsiveness+to+three+TGF-b+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Distinct transforming growth factor-b receptor subsets as determinants of cellular responsiveness to three TGF-b isoforms.</a> J. Biol. Chem. 265, 20533-20538 (1990).</li>
<li>López-Casillas, F., Wrana, J. L., Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaglycan+presents+ligand+to+the+TGF%CE%B2+signaling+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Betaglycan presents ligand to the TGFβ signaling receptor.</a> Cell. 73 (7), 1435-1444 (1993).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> PNAS USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Maccari, F., Volpi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+specific+recognition+of+glycosaminoglycans+by+antibodies+after+their+separation+by+agarose+gel+electrophoresis+and+blotting+on+cetylpyridinium+chloride-treated+nitrocellulose+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Direct and specific recognition of glycosaminoglycans by antibodies after their separation by agarose gel electrophoresis and blotting on cetylpyridinium chloride-treated nitrocellulose membranes.</a> Electrophoresis. 24 (9), 1347-1352 (2003).</li>
<li>Volpi, N., Maccari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosaminoglycan+blotting+and+detection+after+electrophoresis+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Glycosaminoglycan blotting and detection after electrophoresis separation.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1312, 119-127 (2015).</li>
<li>Guesdon, J. L., Ternynck, T., Avrameas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+avidin-biotin+interaction+in+immunoenzymatic+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques.</a> J Histochem Cytochem. 27 (8), 1131-1139 (1979).</li>
<li>Bratthauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avidin-biotin+complex+%28ABC%29+method+and+other+avidin-biotin+binding+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">The avidin-biotin complex (ABC) method and other avidin-biotin binding methods.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 588, 257-270 (2010).</li>
<li>Heimer, R., Molinaro, L., Sampson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+by+125I-cationized+cytochrome+c+of+proteoglycans+and+glycosaminoglycans+immobilized+on+unmodified+and+on+positively+charged+Nylon+66%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Detection by 125I-cationized cytochrome c of proteoglycans and glycosaminoglycans immobilized on unmodified and on positively charged Nylon 66.</a> Anal. Biochem. 165 (2), 448-455 (1987).</li>
<li>Das, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+radiolabeling+of+a+cell+surface+receptor+for+epidermal+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Specific radiolabeling of a cell surface receptor for epidermal growth factor.</a> PNAS USA. 74 (7), 2790-2794 (1977).</li>
<li>Massague, J., Guillette, B., Czech, M., Morgan, C., Bradshaw, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+nerve+growth+factor+receptor+protein+in+sympathetic+ganglia+membranes+by+affinity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a nerve growth factor receptor protein in sympathetic ganglia membranes by affinity labeling.</a> J. Biol. Chem. 256 (18), 9419-9424 (1981).</li>
<li>Massague, J., Pilch, P. F., Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+resolution+of+three+major+insulin+receptor+structures+with+unique+subunit+stoichiometries%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic resolution of three major insulin receptor structures with unique subunit stoichiometries.</a> PNAS USA. 77 (12), 7137-7141 (1980).</li>
<li>Hoosein, N. M., Gurd, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Glucagon+Receptors+in+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of Glucagon Receptors in Rat Brain.</a> PNAS USA. 81, 4368-4372 (1984).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het gebruik van Western blots met een specifiek antilichaam tegen een eiwit van belang een waardevol instrument zijn expressie 7 bestuderen tijdens embryogenese. Echter, immunoblotting van sterk geglycosyleerde eiwitten niet erg succesvol geweest vanwege hun inefficiënte overdracht en zwakke binding aan nitrocellulose of PVDF-membranen 8,9. Proteoglycanen zijn een goed voorbeeld van deze tekortkoming, vanwege hun covalent gehecht glycosaminoglycan ketens (GAG), die nega...

Specifieke detectie van eiwitten die tot expressie worden gebracht tijdens de embryonale ontwikkeling is vereist om expressieprofielen te valideren die zijn verkregen door hun cognate mRNA's te meten met RT-PCR of in situ hybridisatie (ISH). Dit wordt meestal bereikt door een western blot van embryo-extracten gevolgd door detectie met specifieke antilichamen. Deze benadering is echter moeilijk toe te passen op eiwitten die in zeer lage abundantie voorkomen, of die eigenschappen hebben die hun kwantitatieve overdracht tijdens het blotting belemmeren. Betaglycan, ook bekend als de type III transformatorgroeifactor β (TGF-β) receptor (TGFBR3), is een voorbeeld van deze moeilijkheden. TGFBR3 is een deeltijds membraan-proteoglycaan dat TGF-β bindt via zijn kernproteïne1, met een opmerkelijk hogere affiniteit voor de isovorm TGF-β2, een eigenschap die het onderscheidt van alle andere TGF-β-bindende eiwitten2. TGFBR3 in de zebravis wordt tot expressie gebracht vanaf 8 hpf, met een maximum bij 72 hpf, zoals gedetecteerd door RT-PCR van zijn mRNA3.
Ondanks de beschikbaarheid van een zeer specifiek antilichaam3, was elke poging om zijn vertaalde product door middel van western blot te detecteren, niet succesvol. Uitgaande van het feit dat de proteoglycaan-aard van TGFBR3, evenals de veronderstelde lage abundantie, verantwoordelijk kunnen zijn voor dit falen, werd een detectiemethode, AFLIP, bedacht die gebruik maakt van de hoge affiniteit van TGFBR3 voor TGF-β2. In deze methode wordt een eiwitextract van gepoolde embryo's toegestaan ​​om specifiek te binden aan 125I-gelabelde TGF-β2 en de receptor-ligandencomplexen worden gezuiverd door immunoprecipitatie en gekruist voordat ze worden gescheiden door SDS-PAGE. De migratiepatronen die werden waargenomen door autorradiografie van de gels onthulden de aanwezigheid en de aard van de gelabelde receptorspecies. Deze aanpak combineert de ligandspecificiteit van affiniteitslabeling met immunoprecipitatie door specifieke antilichamen, waardoor het detectiebereik wordt vergroot en de inefficiënte overdracht van TGFBR3 wordt vermeden. Vanwege zijn inherente eigenschappen is de AFLIP-test geen kwantitatieve test, maar kan deze worden gebruikt om met vertrouwen relatieve experimentele verschillen in de geanalyseerde receptor te meten.

<table><tbody><tr><td>Disuccinimidyl suberaat (DSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21555</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0618-01</td><td></td></tr><tr><td>Gel Dryer Model 583&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1651745</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9400</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>63-0055-78</td><td></td></tr><tr><td>Cobra II Auto gammateller</td><td>Packard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Exposure Cassette</td><td>Molecular Dynamics</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3624</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3040</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3828</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3246</td><td></td></tr><tr><td>CH3OH</td><td>J.T. Baker</td><td>9070</td><td></td></tr><tr><td>CH3COOH</td><td>J.T. Baker</td><td>9508</td><td></td></tr><tr><td>HCHO</td><td>J.T. Baker</td><td>2106</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Sea Marine Mix</td><td>Marine Enterprises International</td><td>http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix</td><td></td></tr></tbody></table>

affiniteit labeling detectie van endogene receptoren van zebravis embryo&#39;s

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Door de krachten van Affiniteit Labeling en Immunoprecipitatie (AFLIP) te combineren, is een techniek voor de detectie van receptoren met lage abundantie in zebravis-embryo's geïmplementeerd. Deze techniek maakt gebruik van de selectiviteit en gevoeligheid die wordt geboden door affiniteitslabeling van een bepaalde receptor door zijn ligand met de specificiteit van de immunoprecipitatie. We hebben AFLIP gebruikt om de type III TGF-β-receptor (TGFBR3), ook bekend als betaglycan, te detecteren tijdens de vroege ontwikkeling van zebravissen. AFLIP was cruciaal bij het valideren van de werkzaamheid van een TGFBR3-morfant zebravis-fenotype. In de eerste stap worden eiwitextracten van embryo's bereid en gebruikt om 125I-TGF-β2-TGFBR3-complexen te genereren die worden gezuiverd door immunoprecipitatie. Later worden deze complexen covalent gekruisverband en onthuld met behulp van SDS-PAGE-scheiding en autoradiografiedetectie. Deze techniek vereist de beschikbaarheid van een gelabeld ligand voor, en een specifiek antilichaam tegen, de te detecteren receptor, en kan eenvoudig worden aangepast om elke groeifactor- of cytokine-receptor te identificeren die aan deze vereisten voldoet.

Figuur 1 toont een representatief resultaat verkregen met AFLIP. Signalen in baan 1 uit de 125I-ligand covalent gebonden aan ofwel de zebravis betaglycan kerneiwit (BG kern onder de 150 kDa marker) of BG kern die aan zijn proteoglycan vorm verwerkt door bevestiging van glycosaminoglycanen (GAG, uitstrijkje variërend van 170 kDa tot de bovenkant van de gel). Het migratiepatroon, een scherpe kerneiwit en een besmeurd proteoglycan (door heterogeniteit in de lengt...

Een nieuwe techniek voor de detectie van lage abundantie endogeen receptoren aanwezig in zebravis embryo's wordt beschreven. We hebben het AFLIP genoemd omdat het bestaat uit affiniteitslabeling van de receptor door zijn ligand gekoppeld aan immunoprecipitatie.

Affiniteit Labeling Detectie van endogene receptoren van zebravis embryo&#39;s

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren van laag abundante groeifactorreceptoren in zebravissenembryo's door de selectiviteit en gevoeligheid van affiniteitslabeling van de gekozen receptor door zijn radioactieve ligand te combineren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen binnen velden van de ontwikkelingsbiologie, zoals receptor-expressieniveaus en hun biochemische eigenschappen. Deze methode, die wij AFLIP hebben genoemd, breidt de krachtige beschrijvende kwaliteiten van affiniteitslabeling, een goed gevestigde celbiologische techniek, uit naar ontwikkelingsstudies bij zebravissen.Om deze procedure te starten, verzamelt u 100 tot 200 embryo's per conditie en plaatst u deze in petrischalen met viswater. Dechorioneer vervolgens de embryo's handmatig met fijne pincetten en vermijd het gebruik van pronase of enig ander protease gedurende het protocol, aangezien dit de beoogde receptoren kan afbreken. Plaats de embryo's daarna in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter en was ze twee keer met 1X PBS.Voeg vervolgens 500 µL deyolking-buffer toe. Verwijder het grootste deel van de dooier door de embryo's in de oplossing voorzichtig zo'n 30 tot 40 keer op en neer te pipetteren. Gebruik voor embryo's van 72 HPF en 48 HPF respectievelijk blauwe en gele pipetpunten.De gele uiteinden moeten mogelijk enigszins worden ingekort om beschadiging van de embryo's te voorkomen. Een succesvolle vrijgave van de dooier kan worden gecontroleerd door de embryo's onder de microscoop te observeren. De verwijdering van de dooier moet zo volledig mogelijk zijn, aangezien dooierlipiden en -eiwitten kunnen interfereren met daaropvolgende bindingstappen van liganden of antilichamen.Verzamel daarna de embryo's door centrifugatie bij 600 x g gedurende 15 seconden. Verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet. Was vervolgens de embryo's tweemaal met 500 µL wasbuffer door ze voorzichtig te vortexen op de laagste snelheid.Verzamel vervolgens de embryo's door centrifugering bij 600 x g gedurende 15 seconden. Voer de procedure vanaf dit punt verder uit bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant voorzichtig met een pipet.Vervolgens suspenderen we de embryo's in 350 µL lysisbuffer en homogeniseren we deze met een plastic stamper. Incubeer daarna de gelyseerde embryo's gedurende 30 minuten onder agitatie op een reageerbuisrotator bij 4 °C. Centrifugeer vervolgens de gelyseerde embryo's 15 minuten bij 11.000 x g om het onoplosbare debris te verwijderen.Breng vervolgens de geklaarde supernatant over naar een nieuwe buis. Bepaal de totale eiwitconcentratie met de Bradford-eiwitassay en een kalibratiecurve. Plaats in deze stap 400 tot 500 micrograms totaal embryo-eiwit in een 1,5 milliliter microcentrifugeebuis en verdun dit tot één microgram per microliter met buffer 1.Voeg vervolgens de Iodine-125 gemarkeerde TGF-beta II stockoplossing toe tot een eindconcentratie van 150 picomolar en incubeer dit onder agitatie op een buizenrocker gedurende twee uur bij vier graden Celsius. Voeg daarna onverdunde antilichamen tegen de betreffende receptor toe om een verdunning van 1:100 te bereiken. Zet de incubatie vervolgens voort bij vier graden Celsius voor nog eens twee uur of gedurende de nacht.Voeg na incubatie 50 µL geschikte immunoglobuline-bindende beads toe en incubeer gedurende 50 minuten onder agitatie op een buisjesrooster bij 4 °C. Herstel vervolgens de beads door microcentrifugatie bij 11.000 x g gedurende 20 seconden en gooi het supernatant weg in een geschikte container voor radioactief afval. Was de IP-beads aansluitend drie keer met 1 mL IP-wasbuffer door vortexen en microcentrifugatie bij 11.000 x g gedurende telkens 20 seconden.Resuspendeer vervolgens de IP-beads in 250 µL IP-wasbuffer. Bereid een verse DSS-oplossing en voeg 1,5 µL hiervan toe aan het monster. Incubeer het monster daarna 15 minuten bij 4 °C onder agitatie.Om de cross-linkingreactie te stoppen, voegt u 500 µL IP-wasbuffer toe, aangevuld met voldoende trystchloride-stockoplossing bij pH 7,4 om een concentratie van 25 mM trystchloride te bereiken. Centrifugeer vervolgens 20 seconden bij 11.000 ×g om de IP-beads te pelletteren. Verwijder daarna het supernatant en resuspendeer de IP-beads in 30 µL reducerende Laemmli-buffer.Kook vervolgens het monster vijf minuten bij 94 °C vóór SDS-PAGE gelelektroforese en analyseer daarna de gedroogde gels in een fosforimeter of via conventionele autoradiografie. Deze figuur toont de representatieve resultaten verkregen met AFLIP. Totaaleiwit geëxtraheerd uit de embryo's bij 72 hpf en 48 hpf werd onderworpen aan Iodine-125 TGF-beta II affiniteitslabeling, gevolgd door IP met konijn anti-zebravis BG of konijn anti-rat BG als controle.Bij de autoradiografie kan BG worden gedetecteerd zonder GAG of als een glycosaminoglycaan-gemodificeerd BG. Deze figuur laat zien hoe AFLIP kan worden gebruikt om de expressieniveaus van een bepaalde receptor te bepalen in embryo's die zijn onderworpen aan een experimentele manipulatie, in dit geval de afname van betaglycan door morpholino-injectie. Baan één toont het niveau van TGF bèta receptor III in een 72 hpf wild-type embryo, terwijl baan twee het effect laat zien van het toedienen van zeven nanogram van een morpholino gericht op de grens tussen exon 2 en intron 2 van het ZFPG-primaire transcript. Let op dat de downregulatie van BG die met dit morpholino is verkregen, niet wordt gereproduceerd door de bijbehorende mismatched-controle.Deze resultaten bevestigden dat het fenotype dat met dit morpholino werd verkregen, specifiek was voor de knockdown van de TGF beta receptor III zoals eerder beschreven. Het succes van AFLIP voor het detecteren van groeifactor- of cytokinereceptoren hangt af van de beschikbaarheid van een radiogemarkeerd ligand dat kan binden en crosslinken aan zijn receptor. Ook is een geschikt antilichaam voor immunoprecipitatie vereist.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee dagen worden uitgevoerd mits deze correct wordt uitgevoerd. Omdat AFLIP de transferstap van de western blot vermijdt, maakt het een verbeterde detectie van sterk geglycosyleerde receptoren mogelijk. Dit hebben we hier gezien voor het proteoglycaan betaglycaan, dat zeer inefficiënt transfereert in een western blot. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals enzymatische digestie, worden uitgevoerd om aanvullende posttranslationele modificaties te beschrijven, zolang deze onthuld worden door elektroforetische technieken.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe AFLIP u kan helpen bij het detecteren van receptoren met een lage abundantie in verschillende visembryo's via affiniteitslabeling gekoppeld aan immunoprecipitatie. Vergeet tot slot niet dat het werken met Jodium-125 met zorg en adequate bescherming moet gebeuren. Veel succes met uw experimenten.

affinity-labeling-detection-endogenous-receptors-from-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

De sleutel tot het begrijpen van de morfogenetische processen die de vroege embryo vorm is de mogelijkheid om beeld-cellen met een hoge resolutie. We beschrijven hier een techniek voor het etiketteren van enkele cellen of kleine clusters van cellen in zijn geheel zebravis embryo's met membraan-gerichte Green Fluorescent Protein.

Etikettering en Imaging Cellen in de zebravis achterhersenen

Dit protocol schetst een manier om de label en sporen het lot van kleine groepjes cellen zebravis embryo's met behulp van UV-uncaging van gekooide fluoresceïne, gevolgd door een hele berg immunokleuring om het signaal van de Uncaged fluoresceïne versterken.

Lineage Labeling van de zebravis Cellen met Laser Uncagable Fluoresceïne Dextran

Een methode wordt beschreven om enkele cellen met een gekooide fluorescerend eiwit met behulp van twee-foton absorptie van een Ti photoactivate: Sapphire femtoseconde laser oscillator. Het lot kaart brengen van de gefotoactiveerd cel, wordt immunohistochemie gebruikt. Deze techniek kan worden toegepast op elk celtype.

Single Cell Fate Mapping in de zebravis

This video demonstrates an antibody uptake assay to image Notch/DeltaD signaling in zebrafish radial glia progenitors. It involves mounting agarose-embedded dechorionated zebrafish embryos, injecting a dye solution targeting DeltaD ligands on RGPs, and imaging under a fluorescence microscope for asymmetric cell division confirming Notch/DeltaD signaling activation.

An Antibody Uptake Assay for Imaging Notch/DeltaD Signaling in Zebrafish Radial Glia Progenitors

Hier beschreven is een protocol voor de semi-geautomatiseerde beeldvorming van weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's.

Semi-geautomatiseerde beeldvorming van Tissue-specifieke fluorescentie in zebravis embryo&#39;s

De zebravis embryo is een uitstekend model voor ontwikkelingsbiologie onderzoek. Tijdens de embryogenese, zebravissen ontwikkelen met een dooier massa, die driedimensionale uitdagingen voor monster observatie en analyse presenteert. Dit protocol beschrijft hoe twee-dimensionale platte mount voorbereidingen van ganse berg in situ (WISH) gekleurd zebravis embryo exemplaren maken.

Flat Mount Voorbereiding voor observatie en analyse van de zebravis embryo Exemplaren gekleurd door Whole Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Cilia ontwikkeling is essentieel voor goede organogenese. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om te etiketteren en ciliated cellen van de zebravis visualiseren.

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie

Dit protocol toont sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op cryosecties van in het beginstadium zebravis-embryo's die precieze colokalisatie analyses in specifieke celpopulaties mogelijk maken.

Sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op Gecryode zebravis-embryo's

Dit protocol beschrijft hoe beelden kunnen worden verkregen door in situ hybridisatie en immunohistochemie van embryonale secties van zebravissen te combineren. In situ hybridisatie werd uitgevoerd voorafgaand aan cryosectie, gevolgd door antilichaamkleuring. Het is nuttig om de expressiepatronen van twee genen in zebravissen te detecteren als er een tekort aan antilichamen is.

Ter plaatse Hybridisatie gecombineerd met immunohistochemie in cryosectie zebravisembryo's

Dit werk ontwikkelt een antilichaamopnametest voor beeldvorming intra-lineage Notch / DeltaD-signalering bij delende radiale glia-voorlopers van de embryonale zebravishersenen.

Antilichaamopnametest voor het volgen van notch / delta-endocytose tijdens de asymmetrische deling van radiale glia-voorlopers van zebravissen

Hier presenteren we een protocol om eiwitten te labelen met een fluorescentie-eiwitlabel in zebravislarven, een nieuw ontwikkeld en aangepast in vivo systeem dat vooral nuttig is voor het visualiseren van eiwitten met een lage abundantie in zebravissen.

Fluorescentielabeling om eiwitten met een lage expressie in zebravissen te visualiseren

Leer de AFLIP-techniek voor het detecteren van groeifactorreceptoren in zebraviseieren met behulp van affiniteitslabeling en immunoprecipitatie. Deze methode biedt verhoogde gevoeligheid voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

Affiniteit Labeling Detectie van endogene receptoren van zebravis embryo's

Meer video's verkennen