Implementatie van een permeabel membraan Insert-gebaseerde infectiesysteem: Effecten van uitgescheiden bacteriële toxinen op zoogdiergastheercellen Studie

Het algemene doel van dit infectiesysteem op basis van een doorlaatbaar membraan-insert is om de effecten van uitgescheiden bacteriële toxines op gastheercellen tijdens een infectie te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van gastheer-pathogeeninteracties, zoals de manier waarop specifieke uitgescheiden bacteriële componenten bijdragen aan de respons van de gastheercel tijdens een bacteriële infectie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de studie van uitgescheiden bacteriële componenten mogelijk maakt en een fysiologisch relevante gastheer-pathogeenomgeving in de context van een menselijke infectie nauwkeuriger modelleert.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Rebecca Flaherty, een senior promovendus uit mijn laboratorium. Om isogene wild-type groep A streptokokken, of GAS, en GAS M1T1 5448 mutantstammen voor te bereiden, start u overnight vloeibare culturen door vijf tot 10 milliliters Todd Hewitt-bouillon te inoculeren en 16 uur lang te incuberen bij 37 °C. Centrifugeer de overnight bacteriële culturen en gebruik het oorspronkelijke volume vers bacteriëmedium om het pellet opnieuw te suspenderen.

Normalise vervolgens de bacteriële culturen naar gelijke startconcentraties door de geresuspendeerde culturen te verdunnen in extra medium om tot dezelfde OD600 te komen. Om lysaten te verzamelen voor het uitvoeren van signaleringsanalyses en ATP-bepaalsassays, zaaien HaCaT-cellen in six-well plates uit met een zaaidichtheid van ongeveer drie keer 10⁵ cellen per well, en kweken deze tot 90% confluentie. Om assays voor ethidium-homodimeer membraanpermeabilisatie en lactaatdehydrogenase-vrijgave uit te voeren, zaaien HaCaT-cellen in 24-well plates uit met een zaaidichtheid van ongeveer vijf keer 10⁴ cellen per well, en kweken deze tot 90% confluentie.

Was de cellen direct vóór de behandeling met 1x PBS. Voeg vervolgens twee milliliter vers groeimedium, met of zonder farmacologische behandeling, toe aan de zes-wellplaten, of 0,5 milliliter medium aan de wells van 24-wellplaten. Plaats daarna, onder een laminaire flowkast, met een steriele pincet voorzichtig een steriele permeabele membraaninsert van 0,4 micron in elke well.

Voorzichtige en steriele hantering van de permeabele inserts tijdens de voorbereiding van de infectie is cruciaal om te voorkomen dat het membraan tijdens dit proces beschadigd raakt of besmet wordt. Voeg vers celcultuurmedium toe aan de bovenste kamer van elke well volgens de instructies van de fabrikant. Breng vervolgens een geschikt volume van de genormaliseerde bacteriële culturen aan in de bovenste kamer van het permeabele membraan-insert-systeem, en voeg bacterieel medium toe aan de controle-wells.

Zorgvuldige toevoeging van de bacteriën aan de bovenkamer, evenals een voorzichtig transport van de geïnfecteerde cellen naar de incubator, zijn cruciaal, omdat het essentieel is dat bacteriën de onderkamer niet contamineren tijdens de experimentele opstelling. Om te testen op uitgescheiden gastheerproteïnen, dient het permeabele membraaninsert voorzichtig met steriele pincetten te worden verwijderd. Verzamel vervolgens het medium uit de onderkamer in 1,5-milliliter buisjes, zonder de monoc laag cellen te verstoren.

Centrifugeer de monsters bij 14.000 RCF en vier graden Celsius gedurende 10 minuten om celresten te pelletteren. Verwijder vervolgens alle supernatant behalve 50 µL, breng dit over naar een nieuwe 1,5-ml buis en bewaar bij min 20 graden Celsius, of gebruik het onmiddellijk. Voor de beoordeling van gastheer-cellulysaten dient het medium boven de monolaag voorzichtig te worden geaspireerd zonder de gastheercellen te verstoren.

Spoel de cellen vervolgens één keer met PBS. Aspireer het PBS voorzichtig en voeg direct een volume ijskoud lysisbuffer toe om bijvoorbeeld een eiwitconcentratie van 0,5 tot 1,5 milligram per milliliter te bereiken. Incubeer de monsters daarna 15 minuten op ijs.

Gebruik vervolgens een celschraper om de cellen van het platoppervlak van elke well los te maken en breng de volledige inhoud van elke well over naar een buisje van 1,5 milliliter. Centrifugeer de monsters daarna 20 minuten lang bij 14.000 RCF en vier graden Celsius. Om de oplosbare componenten van het lysaat te beoordelen, brengt u het supernatant over naar een nieuw buisje en bewaart u dit bij min 20 graden Celsius, of gebruikt u het onmiddellijk.

Om nucleaire of andere onoplosbare lysaatcomponenten te beoordelen, dient de pellet te worden bewaard bij -20 °C, of onmiddellijk te worden gebruikt. Voor beoordeling via immunofluorescentie-imaging dient het medium te worden afgezogen en moeten de cellen worden gewassen met 1x koud PBS. Fixeer vervolgens de cellen gedurende de nacht met 4% PFA en PBS.

Voer verdere analyses uit volgens het tekstprotocol. De hier getoonde western blot-gegevens laten een significant verhoogde p38 MAP-kinase-activatie zien in keratinocyten in aanwezigheid van streptolysine S of SLS-producerende gas-stammen, wat aangeeft dat dit systeem kan worden gebruikt om veranderingen in de activatie van contact-onafhankelijke signaleringsproteïnen van de gastheer te beoordelen. In deze figuur wordt de SLS-afhankelijke activatie getoond van de belangrijke inflammatoire mediator nucleair factor-kappa B, die bij activatie vanuit het cytoplasma naar de kern transloceert, wat aantoont dat dit systeem kan worden gebruikt om de effecten van gesecreteerde bacteriële factoren op gastheereiwitreacties te visualiseren middels immunofluorescentiemicroscopische benaderingen.

Hier wordt aangetoond dat er significante toenames zijn in zowel de membraanpermeabilisatie als in de afgifte van LDH uit gastcellen na blootstelling aan SLS-producerende gas-stammen, vergeleken met niet-geïnfecteerde cellen of cellen die zijn blootgesteld aan een SLS-deficiënte stam. Deze resultaten geven aan dat dit systeem in staat is om toxine-afhankelijke veranderingen in gastcytotoxiciteit te beoordelen. In dit experiment werden de ATP-niveaus in keratinocyten en de respons op gas-infectie bepaald.

16 uur na infectie werd een significante afname van ATP waargenomen, waarbij het verlies van ATP sterker was in de aanwezigheid van SLS, wat consistent is met de toxine-afhankelijke toenames in de signalering van de stressrespons van de gastheer en de toxiciteit. Eenmaal vastgesteld, kan deze techniek worden gebruikt om de specifieke responsen van elke uitgescheiden microbiële factor op verschillende soorten gastheercellen te bestuderen. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om gedurende alle stappen van de experimentele opzet steriele technieken toe te passen en de permeabele membraaninserts zorgvuldig te hanteren, zowel tijdens de initiële opzet als tijdens de monstername.

Na deze procedure kunnen methoden zoals western blotting, immunofluorescentie-imaging en membranenpermeabilisatie-assays worden uitgevoerd om te bepalen hoe de bacteriële factor van belang bijdraagt aan veranderingen in signaleringscascades en de algehele cytotoxiciteit tijdens een infectie beïnvloedt. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u gastcelmonsters voorbereidt voor de evaluatie van diverse gastcelresponsen na blootstelling aan een specifieke uitgescheiden bacteriële factor van belang. Vergeet niet dat het hanteren van biohazardous materialen, zoals bacteriële pathogenen, bepaalde veiligheidsoverwegingen vereist.

Het juiste gebruik van veiligheidsbrillen, handschoenen en laboratoriumjassen, samen met het correcte gebruik van een biosafety cabinet, is noodzakelijk om deze experimenten veilig uit te voeren.