Implementatie van een permeabel membraan Insert-gebaseerde infectiesysteem: Effecten van uitgescheiden bacteriële toxinen op zoogdiergastheercellen Studie

Het algemene doel van dit op een permeabele membraaninvoeging gebaseerde infectiesysteem is om de effecten van uitgescheiden bacteriële toxinen op gastheercellen tijdens infectie te bestuderen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van gastheer-pathogeen interacties te beantwoorden, zoals hoe specifieke uitgescheiden bacteriële componenten bijdragen aan gastheercelreacties tijdens bacteriële infectie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de studie van uitgescheiden bacteriële componenten mogelijk maakt en een fysiologisch relevante gastheer-pathogeen omgeving in de context van menselijke infectie nauwer modelleert.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Rebecca Flaherty, een senior afgestudeerde student uit mijn laboratorium. Om isogene wildtype groep A streptococcus, of GAS, en GAS M1T1 5448 mutante stammen voor te bereiden, start u overnacht vloeibare culturen door vijf tot 10 milliliter Todd Hewitt bouillon te inoculeren en 16 uur te incuberen bij 37 graden Celsius. Centrifugeer de overnachtse bacterieculturen en gebruik het originele volume vers bacteriemedium om het pellet op te schrijven.

Normaliseer vervolgens de bacterieculturen tot gelijke startconcentraties door de opgeschorte culturen te verdunnen in aanvullend medium om tot dezelfde OD600 te komen. Om lysaten te verzamelen voor het uitvoeren van signaalanalyse en ATP-bepaling assays, plateer HaCaT-cellen in zes-well plates met een zitdichtheid van ongeveer drie keer 10 tot de vijfde cellen per well, en kweek tot 90%confluence. Om ethidium homodimeer membraanpermeabilisatie en lactate dehydrogenase release assays uit te voeren, plateer HaCaT-cellen in 24-well plates met een zitdichtheid van ongeveer vijf keer 10 tot de vierde cellen per well, en laat groeien tot 90%confluence.

Onmiddellijk voorafgaand aan de behandeling, gebruik 1x PBS om de cellen te wassen. Breng vervolgens twee milliliter vers groeimedium met of zonder farmacologisch behandeling aan in de zes-well plates, of 0,5 milliliter medium in de wells van 24-well plates. Plaats vervolgens, onder een laminaire stromingshaak, met steriele forceps voorzichtig een steriele 0,4 micron permeabele membraaninvoeging in elke well.

Voorzichtig en sterieel handelen van de permeabele invoegingen tijdens de infectievoorbereiding is cruciaal om te voorkomen dat het membraan tijdens dit proces wordt aangetast of besmet. Breng vers cellencultuurmedium aan op de bovenste kamer van elke well volgens de instructies van de fabrikant. Breng vervolgens een geschikt volume van de genormaliseerde bacterieculturen aan op de bovenste kamer van het permeabele membraaninvoeging systeem, en breng bacteriemedium aan op de controle wells.

Voorzichtige toevoeging van de bacteriën aan de bovenste kamer, evenals voorzichtig transport van de geïnfecteerde cellen naar de incubator, zijn cruciaal, omdat het essentieel is dat bacteriën de onderste kamer niet besmetten tijdens de experimentele opstelling. Om uitgescheiden gastheerproteïnen te beoordelen, gebruik steriele forceps om voorzichtig de permeabele membraaninvoeging te verwijderen. Verzamel vervolgens, zonder de monolaag van cellen te verstoren, het medium van de onderste kamer in 1,5-milliliter buisjes.

Centrifugeer de monsters bij 14.000 RCF en vier graden Celsius gedurende 10 minuten om cellulaire deeltjes te pelletten. Verwijder vervolgens alles behalve 50 microliter van de supernatant, breng over naar een verse 1,5-milliliter buis en bewaar bij min 20 graden Celsius, of gebruik onmiddellijk. Voor beoordeling van gastheercel lysaten, zuig voorzichtig het medium boven de monolaag af zonder de gastheercellen te verstoren.

Gebruik vervolgens PBS om de cellen eenmaal te spoelen. Zuig voorzichtig het PBS af, en breng onmiddellijk een volume ijskoud lyseerbuffer aan om, bijvoorbeeld, een eiwitconcentratie van 0,5 tot 1,5 milligram per milliliter te bereiken. Bewaar vervolgens de monsters gedurende 15 minuten op ijs.

Gebruik vervolgens een cellenkrabber om de cellen los te maken van het plaatoppervlak van elke well, en breng de volledige inhoud van elke well over naar een 1,5-milliliter buis. Centrifugeer vervolgens de monsters bij 14.000 RCF en vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Om oplosbare lystaat componenten te beoordelen, breng de supernatant over naar een verse buis en bewaar bij min 20 graden Celsius, of gebruik onmiddellijk.

Om nucleaire of andere onoplosbare lysaten componenten te beoordelen, bewaar het pellet en bewaar bij min 20 graden Celsius, of gebruik onmiddellijk. Voor beoordeling door immunofluorescentie beeldvorming, zuig het medium af en gebruik 1x koud PBS om de cellen te wassen. Fixeer vervolgens de cellen met 4%PFA en PBS gedurende de nacht.

Voer verdere analyses uit volgens het tekstprotocol. De western blot data die hier wordt getoond, demonstreert significant verbeterde p38 MAP kinase activering en keratinocyten in de aanwezigheid van streptolysine S of SLS-producerende gas stammen, wat aangeeft dat dit systeem kan worden gebruikt om veranderingen in de activering van contact-onafhankelijke gastheer signaal eiwitten te beoordelen. In deze figuur wordt de SLS-afhankelijke activering van de belangrijke inflammatoire mediator nucleair factor-kappa B getoond, die vanuit het cytoplasma naar de kern transloceert bij activering, wat aangeeft dat dit systeem kan worden gebruikt om de effecten van uitgescheiden bacteriële factoren op gastheer eiwitresponsen te visualiseren met behulp van immunofluorescentie microscopie benaderingen.

Hier worden significante toenames in zowel membraanpermeabilisatie als in de afgifte van LDH van gastheercellen gedemonstreerd na blootstelling aan SLS-producerende gas stammen, vergeleken met niet-geïnfecteerde cellen of cellen blootgesteld aan een SLS-deficiënte stam. Deze resultaten geven aan dat dit systeem toxine-afhankelijke veranderingen in gastheercytotoxiciteit kan beoordelen. In dit experiment werden de niveaus van ATP in keratinocyten en respons op gasinfectie bepaald.

16 uur na infectie werd een significante vermindering in ATP waargenomen, en de verlies van ATP was duidelijker in de aanwezigheid van SLS, consistent met de toxine-afhankelijke toenames in gastheer stressrespons signaal en