Name: Implementatie van een permeabel membraan Insert-gebaseerde infectiesysteem: Effecten van uitgescheiden bacteriële toxinen op zoogdiergastheercellen Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Leer een permeabel membraan insert-gebaseerd infectiesysteem om de effecten van uitgescheiden bacteriële toxinen op zoogdiergastheercellen te bestuderen. Deze methode modelleert gastheer-pathogeen interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We danken onze collega's van het Lee Lab, die waardevolle inzichten en expertise hebben geboden die dit onderzoek enorm hebben geholpen. Dit werk werd ondersteund door de Young Innovator Award van het National Institute of Health, toegekend aan S.W. Lee (NIH-1DP2OD008468-01). R.A. Flaherty wordt ondersteund door de Albertus Magnus Fellowship, verstrekt door Dr. Robert C. Boguslaski, en een onderwijsassistentschap via het Eck Institute for Global Health aan de Universiteit van Notre Dame.

1. bacteriekweek <ol><li> Genereren isogene mutante stammen worden gebruikt voor de studie van de specifieke afgegeven factor van belang 21. Opmerking: De GASM1T1 5448 stammen gebruikt voor deze experimenten opgenomen WT GAS &#39;, een Saga Δ kat SLS-deficiënte mutant (afgekort in tekst als Δ Saga), en een Saga aangevuld stam (afgekort in tekst als Δ Saga + Saga) 21. </li><li> Bereid overnacht vloeibare culturen van bacteriestammen van belang. Groeien GAS M1T1 5448 stammen -10 ml Todd-Hewitt bouillon bij 37 ° C gedurende 16-20 uur vóór infecteren humane cellen. </li><li> Centrifuge overnacht bacterieculturen (2400 RCF gedurende 10 min) en resuspendeer in verse bacteriële medium. Opmerking: Resuspension in hetzelfde volume als de overnacht kweken in (5-10 ml) werden gekweekt algemeen produceert een gewenste initiële optische dichtheid. </li><li> Normaliseren bacterieculturen aangelijke uitgangspunt concentraties door verdunning van de geresuspendeerde kweken in toegevoegde bacteriële medium tot dezelfde optische dichtheid bij 600 nm (OD 600) wordt verkregen voor alle stammen te testen (OD600 van ongeveer 1,0 aanbevolen wordt genoemd). Opmerking: In deze studies werden stationaire fase bacterieculturen gebruikt om gastheercellen te infecteren onmiddellijk na normalisering. Echter, zoals sommige bacteriestammen exit stationaire fase nonsynchronously kan het beter zijn om te beginnen gastheer infecties met log-fase culturen als dit wordt gevonden om het geval voor de stammen van belang zijn. </li><li> Voordat er verdere analyse uitvoeren van een kolonie tellen bepaling om de kolonievormende eenheden (CFU) per milliliter in de startcultures vastleggen, zodat de multipliciteit van infectie (MOI) of verhouding van bacteriën per gastheercel, kan worden bepaald. <ol><li> Bereid 1 ml seriële verdunningen van bacterieculturen die zijn genormaliseerd naar de gewenste optische verbty in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of geschikte bacteriële groeimedium (Todd-Hewitt bouillon werd gebruikt in deze studies). Bereid verdunningen variërend van 10 tot 10 -1 -6 tenminste één set agarplaten met telbare kolonies (30-300 kolonies) produceren. Voer alle verdunningen in drievoud. </li><li> Breng 100 pi van elke seriële verdunning op een agarplaat met passende medium voor de bacteriële soorten worden geanalyseerd. Opmerking: Todd-Hewitt agar werd gebruikt in deze studies. </li><li> Gebruik een glazen of plastic bacteriële spreader gelijkmatig over het gehele oppervlak van de agarplaat distribueren 100 pl monster, en verder verspreiden totdat de vloeistof in de agar geabsorbeerd. Presteren onder vlam met steriele techniek. </li><li> Incubeer de agar platen bij 37 ° C geïncubeerd of totdat telbare kolonies verschijnen. </li><li> De kolonies die groeien op elke plaat en bereken de CFU / ml in de oorspronkelijke cultuur door formula: aantal kolonies x inverse van de seriële verdunning / cultuur volume verzilverd in milliliters. bijvoorbeeld (200 kolonies x 1/10 -5 verdunning) / 0,1 ml uitgeplaat = 2,0 x 10 8 CFU / ml </li></ol></li></ol> 2. Host Cell Culture <ol><li> Verkrijg een geschikte gastheer cellijn voor de gewenste analyses. Opmerking: HaCaT menselijke epitheliale keratinocyten 29, een vriendelijke gift van V. Nizet werden gebruikt voor deze studies. <ol><li> Handhaven HaCaT cellen in 100 mm kweekschalen in Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS). Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2. </li></ol></li></ol> 3. Host Cell Infectie met permeabel membraan Insert System <ol><li> Plaat cellen in de juiste weefselkweek gerechten en hen in staat stellen om te groeien tot ze 90% confluentie bereiken. Opmerking: De HaCaT cellen die in deze studies gewoonlijk bereikt binnen 2-3 confluentie degen na plateren. <ol><li> Voor lysaat inzameling (bijv signalering analyse en adenosine trifosfaat (ATP) bepaling assays), plaat HaCaT cellen in 6 putjes bij een seeding dichtheid van ongeveer 3 x 10 5 cellen / putje. </li><li> Voor immunofluorescentie imaging experimenten, plaat cellen op steriele dekglaasjes binnen 6 putjes bij een seeding dichtheid van ongeveer 3 x 10 5 cellen / putje. </li><li> Voor ethidiumhomodimeer membraan permeabilisatie en lactaat dehydrogenase (LDH) vrijgave assays, plaat HaCaT cellen in 24 putjes bij een seeding dichtheid van ongeveer 5 x 10 4 cellen / putje. </li></ol></li><li> Onmiddellijk voorafgaand aan behandeling, was cellen met 1x steriele PBS. </li><li> Solliciteer vers groeimedium aan cellen. Voor de hier beschreven voorwaarden van toepassing 2 ml medium per putje voor 6 well platen of 0,5 ml medium per putje voor 24 well platen. Als farmacologische behandelingen worden getest, mengen met vers medium en toe te passen in deze step. Opmerking: Sommige tests kunnen alternatieve media vereisen. Bijvoorbeeld zoals fenolrood en hoge serumconcentraties interfereren met de LDH-afgifte assay, fenolrood-vrij DMEM aangevuld met 1% runderserumalbumine (BSA) (w / v), 2 mM L-glutamine en 1 mM natriumpyruvaat was gebruikt voor deze experimenten. </li><li> Na vers medium is aangebracht, plaatst u voorzichtig een steriel 0,4 urn permeabel membraan insert in elk putje. Voer deze stap in een laminaire stroming kap, en het gebruik van een steriel pincet om het doorlaatbare membraan insert te zetten in elk putje. </li><li> Toepassen vers celcultuurmedium om de bovenste kamer van elk putje volgens de instructies van de fabrikant. Voor de hier beschreven voorwaarden van toepassing 1 ml medium per putje voor 6 well platen of 0,1 ml medium per putje voor 24 well platen. </li><li> Breng een geschikt volume van genormaliseerde bacterieculturen (zie punt 1) om de bovenste kamer van de permeabel membraan insert systeem. Gebruik bacteriële medium voor niet-geïnfecteerde control behandelingen. Voor de hier beschreven resultaten, voeg 25 ul van de genormaliseerde culturen per kamer gedurende 24 putjesplaten en voeg 100 ul van de culturen per kamer voor 6 well platen. Opmerking: In deze studies, wild-type of mutant GAS aangebracht aan gastheercellen bij een MOI van 10. MOI werd berekend op basis van de uiteindelijke eukaryotische cel aantallen (bv 2 x 10 6 cellen / putje), zodanig dat 10 keer zoveel bacteriën per gastheercel werden bij het ​​begin van de infectie periode (bijvoorbeeld 2 x 10 7 CFU per putje). Geschikte MOI zal variëren met verschillende bacteriële soorten en de gewenste follow-up analyses. Opmerking: Naast het gebruik van bacteriële medium voor geïnfecteerde controles andere nuttige besturingen voor bepaalde toepassingen van deze techniek kunnen hitte gedode bacteriën of verbruikte bacterieel medium voor vergelijking. </li><li> Incubeer geïnfecteerde cellen bij 37 ° C met 5% CO2. </li></ol> 4. Sample Collection &lt;ol&gt; <li> Om celkweekmedium, gastheercellysaten of dekglaasjes verzamelen met intacte cellen voor de follow-up analyses, te beginnen door het zorgvuldig verwijderen van de permeabel membraan insert met een steriel pincet. </li><li> Voor de beoordeling van uitgescheiden Host protiens: <ol><li> Verzamel het medium uit de onderste kamer in 1,5 ml buizen. Vermijd de monolaag te storen tijdens het verzamelen. </li><li> Centrifugeer monsters bij 14.000 RCF gedurende 10 minuten bij 4 ° C om celresten te verwijderen. </li><li> Verwijder alles behalve 50 pi van het supernatant naar een nieuwe 1,5 ml buisje en bewaar bij -20 ° C of onmiddellijk gebruik. </li></ol></li><li> Voor de beoordeling van Host Cell Lystates: <ol><li> Zuig het medium boven de monolaag van gastheercellen. Vermijd het verstoren van de monolaag, omdat dit kan leiden tot een monster verlies. </li><li> Spoel cellen eenmaal met 1x PBS. </li><li> Zuig PBS. Onmiddellijk breng een geschikt volume ijskoude lysis buffer tot de gewenste eiwitconcentratie bereiken, en incubeer demonsters op ijs gedurende 15 min. Toepassing tussen 200 pl en 350 pl lysisbuffer per putje van elke plaat met 6 putjes bij proteïneconcentraties tussen 0,5 en 1,5 mg / ml te bereiken. Opmerking: De lysis buffer gebruikt in deze studie bestond uit gedeïoniseerd water, 1% (v / v) Nonidet P40 plaatsvervanger, een fosfatase-inhibitor cocktail en een cocktail van proteaseremmers. Specifieke reagentia zijn vermeld in de sectie materialen en apparatuur. </li><li> Gebruik een celschraper om de cellen los te maken van het plaatoppervlak van elk putje en pipet de volledige inhoud van elk putje in een 1,5 ml buis. </li><li> Centrifugeer monsters bij 14.000 RCF gedurende 20 minuten bij 4 ° C. </li><li> Oplosbare lysaat onderdelen te beoordelen, verwijder het supernatant naar een nieuwe buis en bewaar bij -20 ° C of onmiddellijk te gebruiken. </li><li> Nucleaire of andere onoplosbare lysaat componenten te evalueren, behouden de pellet en bewaar bij -20 ° C of onmiddellijk te gebruiken. </li></ol></li><li> Voor Beoordeling door Immunofluorescentie Imaging: <ol><li> Alspiraat medium en was cellen in 1x koude PBS. </li><li> Fix cellen overnacht in 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS-oplossing (w / v). Noot: In deze studies, 1 ml PFA werd toegevoegd per putje van elke plaat met 6 putjes. </li></ol></li></ol> 5. Aanbevolen toepassingen <ol><li> Host signaaltransductie analyse door SDS-PAGE en Western Blotting <ol><li> Verzamel gastheercellysaten zoals beschreven in paragraaf 4.3. </li><li> Bepaal de eiwitconcentratie van elk monster lysaat van bicinchoninezuur (BCA) assay of gelijkwaardige behulp eiwitstandaarden 30. </li><li> Normaliseren eiwit concentraties van de monsters voorafgaand aan het laden en draaien van de monsters op een 4-15% polyacrylamidegel of passende alternatieve 31. <ol><li> Normaliseren monster concentraties door pipetteren hetzelfde eiwit hoeveelheid van elk monster (bijvoorbeeld 20 ug) in een nieuwe 1,5 ml buis en het toevoegen van variabele volumes van lysis buffer (buffer volume = totaal volume - monstervolumetoegevoegd) aan elke buis tot het totale volume (bijvoorbeeld 50 pi) en uiteindelijke eiwitconcentratie in gelijke monsters te maken. </li></ol></li><li> Doorvoermonsters een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan (of gelijkwaardig). Voor de hier beschreven resultaten, doorvoermonsters bij 25 volt gedurende 2 uur voor het verhogen van de spanning tot 70 volt gedurende nog 45 min. Gebruik overdracht buffer bestaat uit 200 mM Tris-base, 1,5 M glycine en 20% methanol (v / v) in gedemineraliseerd water. </li><li> Blok membranen in 5% BSA + 0,1% Tween 20 in Tris gebufferde zoutoplossing (TBS). Dienovereenkomstig aan te passen gebaseerd op aanbevelingen van de fabrikant voor het antilichaam te gebruiken. </li><li> Incubeer membranen met primaire antilichamen gedurende de nacht bij 4 ° C. Gebruik bij de fabrikant aanbevolen verdunning. </li><li> Was membranen voor 1,5 uur in TBS + 0,1% Tween 20; refresh buffer elke 10-15 min. </li><li> Incubeer met mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd secundair antilichaam in een verdunning van 1: 5000 gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur temperature. </li><li> Was membranen voor 1,5 uur in TBS + 0,1% Tween 20; refresh buffer elke 10 - 15 min. </li><li> Incubeer membranen chemiluminescentie detectie reagens voorafgaand aan ontwikkeling op film volgens de instructies van de fabrikant. Andere detectiewerkwijzen kunnen naar wens worden gebruikt. </li></ol></li><li> Gastheercel immunofluorescentiekleuring en Imaging <ol><li> Fix dekglaasjes met gastheercellen zoals beschreven in paragraaf 4.4. </li><li> Verwijderen PFA oplossing en wassen dekglaasjes met behandelde cellen tweemaal in PBS, opzuigen tussen wasbeurten. Let op: PFA is zeer giftig en moet worden afgevoerd naar behoren. </li><li> Blokkeer de dekglaasjes gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in PBS met 1% (w / v) normaal geit serum, 2% (v / v) Triton X-100 en 0,5% (v / v) Tween 20. </li><li> Was dekglaasjes met PBS gedurende 30 min, het vernieuwen van de buffer elke 10 min. </li><li> Incubeer de dekglaasjes met primair antilichaam in een 01:50 verhouding (of zoals aanbevolen door de fabrikant) in het blokkeren van solution overnacht bij 4 ° C. </li><li> Was de dekglaasjes gedurende 1,5 uur in PBS, het vernieuwen van de buffer elke 30 min. </li><li> Incubeer de dekglaasjes gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in secundair antilichaam (geit anti-konijn IgG AlexaFluor488 werd gebruikt voor deze studies) met een 1: 200 verhouding van antilichaam tegen blokkeeroplossing. </li><li> Wash coverslips gedurende 1 uur, het vernieuwen van de buffer elke 20 min. </li><li> Solliciteer gewenste vlekken. Let op: Deze studies gebruikt DAPI (nucleaire vlek) en rhodamine-phalloidin (actine kleuring) bij verhoudingen van 1: 1000 in het blokkeren van oplossing. </li><li> Incubeer dekglaasjes nucleaire actine en vlekken gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Wassen dekglaasjes in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, het vernieuwen van de buffer elke 10 min. </li><li> Monteer de dekglaasjes op glasplaatjes met behulp van montage medium. </li><li> Laat dekglaasjes in te stellen op de dia&#39;s &#39;s nachts voorafgaand aan het afdichten en beeldvorming. Voor de hier beschreven resultaten, afbeeldingen te verzamelen over een fluorescentiemicroscoop using een standaard 20x doelstelling. Gebruik ImageJ en microscoop imaging software om de vastgelegde beelden te verwerken. </li></ol></li><li> Ethidiumhomodimeer Dood van de Cel Assay <ol><li> Zuig medium uit elk putje en was cellen tweemaal met steriele PBS. </li><li> Toepassen 4 uM ethidium homodimeer-1 in PBS. </li><li> Incubeer cellen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker. </li><li> Bepaal het niveau van fluorescentie met behulp van een plaat lezer ingesteld op 528 nm excitatie en 617 nm emissie met een cut-off waarde van 590 nm. </li><li> Voeg 0,1% (w / v) Saponine aan elk putje na de beginstand en laat de platen incuberen gedurende nog 20 minuten bij kamertemperatuur (met schommelende) voeren voordat de plaat een tweede keer bij dezelfde instellingen. </li><li> Bepaal procent membraan permeabilisatie afzonderlijk voor elk putje door het verdelen van de eerste fluorescentie lezen (post-behandeling) door de tweede fluorescentie lezing (post-Saponine). </li></ol></li><li> ATP Bepaling Assay <ol><li&gt; Verzamel lysaten zoals beschreven in paragraaf 4.3. </li><li> Normaliseren eiwitgehalten in de lysaten via BCA-test of iets dergelijks 30. </li><li> Bepaal cellulaire ATP niveaus met een op luminescentie gebaseerde ATP bepaling kit of gelijkwaardig volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Normaliseren behandelde waarden voor de overeenkomstige niet-geïnfecteerde controlemonsters. </li></ol></li><li> LDH afgifte assay <ol><li> Na infectie, verzamel supernatanten zoals beschreven in paragraaf 4.3. </li><li> Evalueer LDH afgifte met een cytotoxiciteit detectiekit voor LDH afgifte volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wiles, T. J., Dhakal, B. K., Eto, D. S., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+host+Akt%2Fprotein+kinase+B+signaling+by+bacterial+pore-forming+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Inactivation of host Akt/protein kinase B signaling by bacterial pore-forming toxins.</a> Mol Biol Cell. 19 (4), 1427-1438 (2008).</li>
<li>Kao, C. Y., Los, F. C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+functional+analyses+of+cellular+responses+to+pore-forming+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Global functional analyses of cellular responses to pore-forming toxins.</a> PLoS Pathog. 7 (3), e1001314(2011).</li>
<li>Ma, X., Chang, W., Zhang, C., Zhou, X., Yu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+Panton-Valentine+Leukocidin+Induces+Pro-Inflammatory+Cytokine+Production+and+Nuclear+Factor-Kappa+B+Activation+in+Neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal Panton-Valentine Leukocidin Induces Pro-Inflammatory Cytokine Production and Nuclear Factor-Kappa B Activation in Neutrophils.</a> PLoS ONE. 7 (4), e34970(2012).</li>
<li>Sumitomo, T., Nakata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptolysin+S+contributes+to+group+A+streptococcal+translocation+across+an+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Streptolysin S contributes to group A streptococcal translocation across an epithelial barrier.</a> J Biol Chem. 286 (4), 2750-2761 (2011).</li>
<li>Miyoshi-Akiyama, T., Takamatsu, D., Koyanagi, M., Zhao, J., Imanishi, K., Uchiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytocidal+effect+of+Streptococcus+pyogenes+on+mouse+neutrophils+in+vivo+and+the+critical+role+of+streptolysin+S%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Cytocidal effect of Streptococcus pyogenes on mouse neutrophils in vivo and the critical role of streptolysin S.</a> J Infect Dis. 192 (1), 107-116 (2005).</li>
<li>Goldmann, O., Sastalla, I., Wos-oxley, M., Rohde, M., Medina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pyogenes+induces+oncosis+in+macrophages+through+the+activation+of+an+inflammatory+programmed+cell+death+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pyogenes induces oncosis in macrophages through the activation of an inflammatory programmed cell death pathway.</a> Cell Microbiol. 11 (1), 138-155 (2009).</li>
<li>Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptolysin+S+inhibits+neutrophil+recruitment+during+the+early+stages+of+Streptococcus+pyogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection.</a> Infect Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).</li>
<li>Ratner, A. J., Hippe, K. R., Aguilar, J. L., Bender, M. H., Nelson, A. L., Weiser, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cells+are+sensitive+detectors+of+bacterial+pore-forming+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Epithelial cells are sensitive detectors of bacterial pore-forming toxins.</a> J Biol Chem. 281 (18), 12994-12998 (2006).</li>
<li>Stassen, M., Müller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+streptococcal+exotoxin+streptolysin+O+activates+mast+cells+to+produce+tumor+necrosis+factor+alpha+by+p38+mitogen-activated+protein+kinase-+and+protein+kinase+C-dependent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The streptococcal exotoxin streptolysin O activates mast cells to produce tumor necrosis factor alpha by p38 mitogen-activated protein kinase- and protein kinase C-dependent pathways.</a> Infect Immun. 71 (11), 6171-6177 (2003).</li>
<li>Porta, H., Cancino-Rodezno, A., Soberón, M., Bravo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+MAPK+p38+in+the+cellular+responses+to+pore-forming+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Role of MAPK p38 in the cellular responses to pore-forming toxins.</a> Peptides. 32 (3), 601-606 (2011).</li>
<li>Walker, M. J., Barnett, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+manifestations+and+pathogenic+mechanisms+of+group+a+Streptococcus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Disease manifestations and pathogenic mechanisms of group a Streptococcus.</a> Clin Microbiol Rev. 27 (2), 264-301 (2014).</li>
<li>Carapetis, J. R., Steer, A. C., Mulholland, E. K., Weber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+group+A+streptococcal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The global burden of group A streptococcal diseases.</a> Lancet Infect Dis. 5 (11), 685-694 (2005).</li>
<li>Cunningham, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+group+A+streptococcal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of group A streptococcal infections.</a> Clin Microbiol Rev. 13 (3), 470-511 (2000).</li>
<li>Molloy, E. M., Cotter, P. D., Hill, C., Mitchell, D. A., Ross, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptolysin+S-like+virulence+factors%3A+the+continuing+sagA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Streptolysin S-like virulence factors: the continuing sagA.</a> Nature Rev Microbiol. 9 (9), 670-681 (2011).</li>
<li>Datta, V., Myskowski, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+group+A+streptococcal+operon+encoding+streptolysin+S+and+its+virulence+role+in+invasive+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the group A streptococcal operon encoding streptolysin S and its virulence role in invasive infection.</a> Mol Microbiol. 56 (3), 681-695 (2005).</li>
<li>Lee, S. W., Mitchell, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+widely+distributed+toxin+biosynthetic+gene+cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Discovery of a widely distributed toxin biosynthetic gene cluster.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (15), 5879-5884 (2008).</li>
<li>Mitchell, D. A., Lee, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+dissection+of+the+heterocyclic+peptide+cytotoxin+streptolysin+S%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural and functional dissection of the heterocyclic peptide cytotoxin streptolysin S.</a> J Biol Chem. 284 (19), 13004-13012 (2009).</li>
<li>Bárcena-Uribarri, I., Benz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Clostridium+perfringens+TpeL+Toxin+Gene+Carriage+Production%2C+Cytotoxic+Contributions%2C+and+Trypsin+Sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomem%22%5BJournal%5D)">Characterization of Clostridium perfringens TpeL Toxin Gene Carriage Production, Cytotoxic Contributions, and Trypsin Sensitivity.</a> Biochim Biophys Acta Biomem. 1848 (6), 2369-2381 (2015).</li>
<li>Bárcena-Uribarri, I., Benz, R., Winterhalter, M., Zakharian, E., Balashova, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+forming+activity+of+the+potent+RTX-toxin+produced+by+pediatric+pathogen+Kingella+kingae%3A+Characterization+and+comparison+to+other+RTX-family+members%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomem%22%5BJournal%5D)">Pore forming activity of the potent RTX-toxin produced by pediatric pathogen Kingella kingae: Characterization and comparison to other RTX-family members.</a> Biochim Biophys Acta Biomem. 1848 (7), 1536-1544 (2015).</li>
<li>Carr, A., Sledjeski, D. D., Podbielski, A., Boyle, M. D., Kreikemeyer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+between+complement-mediated+and+streptolysin+S-mediated+hemolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Similarities between complement-mediated and streptolysin S-mediated hemolysis.</a> J Biol Chem. 276 (45), 41790-41796 (2001).</li>
<li>Flaherty, R. A., Puricelli, J. M., Higashi, D. L., Park, C. J., Lee, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptolysin+S+Promotes+Programmed+Cell+Death+and+Enhances+Inflammatory+Signaling+in+Epithelial+Keratinocytes+during+Group+A+Streptococcus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Streptolysin S Promotes Programmed Cell Death and Enhances Inflammatory Signaling in Epithelial Keratinocytes during Group A Streptococcus Infection.</a> Infect Immun. 83 (10), 4118-4133 (2015).</li>
<li>Guedon, J. T., Luo, K., Zhang, H., Markham, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+and+Single+Domain+Antibodies+Targeting+%CE%B2-Integrin+Subunits+Block+Sexual+Transmission+of+HIV-1+in+In+Vitro+and+In+Vivo+Model+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Acquir+Immune+Defic+Syndr%22%5BJournal%5D)">Monoclonal and Single Domain Antibodies Targeting β-Integrin Subunits Block Sexual Transmission of HIV-1 in In Vitro and In Vivo Model Systems.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 69 (3), 278-285 (2015).</li>
<li>Hu, D., Zhou, J., Wang, F., Shi, H., Li, Y., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPV-16+E6%2FE7+promotes+cell+migration+and+invasion+in+cervical+cancer+via+regulating+cadherin+switch+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Gynecol+Obstet%22%5BJournal%5D)">HPV-16 E6/E7 promotes cell migration and invasion in cervical cancer via regulating cadherin switch in vitro and in vivo.</a> Arch Gynecol Obstet. 292 (6), 1345-1354 (2015).</li>
<li>Gangl, K., Waltl, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+with+Rhinovirus+Facilitates+Allergen+Penetration+Across+a+Respiratory+Epithelial+Cell+Layer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Infection with Rhinovirus Facilitates Allergen Penetration Across a Respiratory Epithelial Cell Layer.</a> Int Arch Allergy Immunol. 166 (4), 291-296 (2015).</li>
<li>Peng, X., Zhang, Q., Zeng, Y., Li, J., Wang, L., Ai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evodiamine+inhibits+the+migration+and+invasion+of+nasopharyngeal+carcinoma+cells+in+vitro+via+repressing+MMP-2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Evodiamine inhibits the migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma cells in vitro via repressing MMP-2 expression.</a> Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1173-1184 (2015).</li>
<li>Zheng, Y., Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxM1+transactivates+PTTG1+and+promotes+colorectal+cancer+cell+migration+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med+Genomics%22%5BJournal%5D)">FoxM1 transactivates PTTG1 and promotes colorectal cancer cell migration and invasion.</a> BMC Med Genomics. 8, 49(2015).</li>
<li>Losa, D., Köhler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+Epithelial+Cell+Integrity+Protects+from+Cytotoxicity+of+Pseudomonas+aeruginosa+Quorum-Sensing+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Airway Epithelial Cell Integrity Protects from Cytotoxicity of Pseudomonas aeruginosa Quorum-Sensing Signals.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 53 (2), 265-275 (2015).</li>
<li>Cook, K. W., Letley, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL20%2FCCR6-mediated+migration+of+regulatory+T+cells+to+the+Helicobacter+pylori-infected+human+gastric+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">CCL20/CCR6-mediated migration of regulatory T cells to the Helicobacter pylori-infected human gastric mucosa.</a> Gut. 63 (10), 1550-1559 (2014).</li>
<li>Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+keratinization+in+a+spontaneously+immortalized+aneuploid+human+keratinocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line.</a> J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).</li>
<li>Krieg, R. C., Dong, Y., Schwamborn, K., Knuechel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+quantification+and+its+tolerance+for+different+interfering+reagents+using+the+BCA-method+with+regard+to+2D+SDS+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein quantification and its tolerance for different interfering reagents using the BCA-method with regard to 2D SDS PAGE.</a> J Biochem Biophys Methods. 65 (1), 13-19 (2005).</li>
<li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-dimensional+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+%281D+SDS-PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE).</a> Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hierin wordt beschreven een methode waarbij een permeabel membraan-insert gebaseerde infectiesysteem om de effecten van het bacteriële toxine streptolysine S menselijke epitheliale keratinocyten in een in vitro systeem te onderzoeken. Dit protocol kan worden aangepast voor de studie van andere uitgescheiden bacteriële virulentiefactoren en alternatieve gastheercel. Dit recent ontwikkelde systeem biedt een aantal voordelen ten opzichte van experimentele methoden die gezuiverd toxinen of gefilterd bacteriële supernatanten 1 gebruiken - 3,8,18 - 20. Het permeabele membraan insert-systeem zorgt voor een constant gehandhaafd dosis van de betreffende bacteriële toxine aan gastheercellen tijdens het produceren, waardoor maximale toxineactiviteit te handhaven en verhoogt ook de samenhang tussen experimenten. Bovendien, dit systeem nabootst fysiologische omstandigheden doordat de afgegeven factor te accumuleren in de tijd als infectie voortschrijdt en Elimisprong uit de noodzaak om willekeurig selecteren specifieke toxine concentraties gelden voor gastheercellen. Bovendien zou dit systeem ook middelen voor onderzoekers te beoordelen of een bacteriële factor van belang is afgeleverd aan gastheercellen in een contact-afhankelijke wijze. Contact-afhankelijkheid wordt vaak getest door het genereren van isogene mutanten die deficiënt zijn in bacteriële hechting of door het gebruik van reagentia die hechting verhinderen. Het hier beschreven systeem zou een eenvoudig alternatief voor aanvulling of vervanging van deze traditionele benaderingen. In aanvulling op de geteste applicaties in hoofdstuk 5 van het protocol beschreven, andere toepassingen waarvoor deze infectie systeem kan eenvoudig worden aangepast onder meer het verzamelen van monsters voor cytokine-arrays en ELISA assays. In beide gevallen kan een soortgelijk protocol als beschreven voor LDH-afgifte assays worden gevolgd. Hoewel hier niet getoond, is dit systeem gebruikt om effectief te verzamelen gastheercel monsters te zijn eennalyzed door flowcytometrie. In deze toepassing wordt het permeabele membraan insert verwijderd na de infectie periode worden de cellen gewassen om celkweekmedium te verwijderen en trypsine wordt toegepast het verzamelen van de cellen voor analyse mogelijk. De fysieke scheiding van bacteriën uit gastheercellen bijzonder bruikbaar voor deze toepassing omdat het helpt bij de vorming van grote aggregaten omvat gehecht bacteriën en gastheercellen die anders met nauwkeurig celtelling kunnen storen met de stroom cytometer voorkomen. Hoewel zeer consistente gastheer responsen bij vergelijking van de resultaten van het permeabele membraan-insert gebaseerde infectie studies met traditionele direct infectie studies waargenomen werden enkele opvallende verschillen in de kinetiek van deze gastheerreacties waargenomen 21. Bijvoorbeeld veranderingen in gastheer signalering en membraan-gebaseerde cytotoxiciteit nemen 30-50% meer voor te komen in de permeabel membraan-insert gebaseerde infectie model dan correageert direct infectie modellen. Omdat het doorlaatbare membraan-insert gebaseerde systeem vereist medium wordt toegepast om de bovenste en onderste compartimenten van elk putje, de ontwikkelde voor de hier beschreven studies systeem vereist een toename van 30% in totaal gemiddeld volume per putje vergeleken met overeenkomstige rechtstreekse infectiemodellen voorheen 21. Dit verschil in totaal gemiddeld volume, in combinatie met de grotere afstand tussen bacteriën en gastheercellen bij direct contact is verboden, waarschijnlijk verhoogt de tijd die SLS diffunderen door het medium gastheercellen bereiken en wekken de waargenomen effecten. Daarnaast is de permeabel membraan insert-systeem verwijdert vele GAS virulentie factoren die kunnen bijdragen tot beschadiging van cellen te hosten zijn; de afwezigheid van deze bijkomende factoren in dit systeem kan bijdragen aan de vertraging in de gastheercel dood en de start van de gastheer signalering gebeurtenissen in vergelijking met directe infectie 21 ook. Deze factoren worden overwogenbij het ontwerpen van experimenten met ander uitgescheiden bacteriële bestanddelen beoordelen. De meest betekenisvolle voorwaarden aangeeft voor het testen van de effecten van uitgescheiden bacteriële factoren op gastheercellen, het testen van een reeks van tijdstippen voor elke toepassing van het permeabele membraan-insert gebaseerde infectiesysteem aanbevolen. Het is belangrijk na te gaan onder welke omstandigheden het specifieke virulentie factor van belang is optimaal om de gevolgen succesvol observeren geproduceerd (bijv log fase stationaire fase, als reactie op bepaalde omgevingssignalen, etc.). In experimenten gericht op het evalueren van veranderingen in ontvangst signaaleiwitten, was het noodzakelijk om tijdstippen dat voldoende tijd voor SLS gastheercellen bereiken en worden in voldoende hoeveelheden voor het induceren signaal verandert 21 toegestaan ​​te selecteren. Tegelijkertijd, worden gelet op wijzigingen in de ontvangende signalen moeten worden uitgevoerd voorafgaand aan SLS geïnduceerde membraan permeabilisatie, omdat dit effect complicates het verzamelen van gastheercellysaten voor analyse. Celdood geïnduceerd door SLS optimaal kunnen worden waargenomen in zowel directe als permeabel membraan-gebaseerde insertie infectiemodellen enkele uren na het begin van de gerapporteerde signaleringsgebeurtenissen 21. Bovendien bij het selecteren tijdstippen plaats, is het ook belangrijk dat de bacteriën bestudeerd in staat zijn het poreuze inzetstuk penetreren tijdens de studieperiode. De productie van bepaalde bacteriële bestanddelen gedurende een langere periode kan de integriteit van het membraan verstoren en laat de doorgang van bacteriën aan het onderste compartiment. Om te bepalen of dit een probleem in het systeem van belang, kan de bacteriestammen te onderzoeken worden toegepast om de bovenste kamer van het permeabele membraan insert-systeem op verschillende tijdstippen. Op elk tijdstip, kan het inzetstuk voorzichtig worden verwijderd en het medium uit de onderste kamer kan worden verzameld en gebruikt in een standaard kolonie counting assay (zie paragraaf 1.5). Als er geen kolonies worden gevormd uit het celkweekmedium in het onderste compartiment, kan het inzetstuk membraan worden aangenomen dat effectief het passeren van bacteriën op het tijdstip en bacteriële verontreiniging getest. Andere experimentele opzet onderdeel dat wil optimalisering vereisen voor efficiënte analyse van uitgescheiden bacteriële factoren is de multipliciteit van infectie (MOI). De MOI verwijst naar de verhouding van bacteriële cellen per gastheercel, en wordt derhalve beïnvloed door de gastheercel confluentie op het moment van infectie en het aantal bacteriële kolonievormende eenheden (CFU) bij de cellen gevoegd. In deze studies werden keratinocyten gekweekt tot 90% confluentie, waardoor deze cellen een samenhangend monolaag met intacte tight junctions vormen. Doordachte overweging van de fysiologische organisatie van de gastheercellen te bestuderen moet een geschikte confluentie geïnfecteerd experimenten selecteren. Zodra een KREDIETENiate aantal gastheercellen per putje wordt bepaald, kan een geschikte bacteriële CFU berekend worden op basis van de gewenste MOI. In de hier beschreven studies werd GAS aangebracht aan gastheercellen in een MOI van 10. Geschikte MOI zal variëren met verschillende bacteriën en de gewenste follow-up analyses. Een lage begin MOI is meestal meer fysiologisch relevante en zorgt voor de bacteriële factor van belang langzaam genoeg om subtiele veranderingen in de gastheercel signaling vast te leggen voordat dramatische veranderingen in levensvatbaarheid van de gastheercel zijn duidelijk te accumuleren. Hogere MOI&#39;s worden in veel studies beoordeling van cytotoxiciteit, maar dit effect kan ook worden bereikt door te beginnen met een lage MOI en waarbij de infectie vooruitgang voor een langere periode. Het is belangrijk een nauwkeurige CFU bepaling van optische dichtheid uitvloeisel alle bacteriestammen worden getest, als isogene mutanten een veranderde groei kan hebben in vergelijking met wildtype bacteriën en kunnen dus eisen dat een hogere of lagere CFU worden per putje toegevoegd aanzorgen voor een passende vergelijking van de gastheer respons tussen stammen. Wanneer de zoogdiergastheercellen bestudeerd zijn in staat bacteriën te doden of remmen van de groei of nonsynchronous groei tussen bacteriestammen wordt vermoed, kan het ook nuttig zijn studies uit te voeren om de uiteindelijke bacteriële belasting op het einde van de infectieperiode beoordelen. Dit kan worden bereikt door het verzamelen van de inhoud van de doorlatende inzetstuk en het uitvoeren van een kolonie telling assay vergelijkbaar met die in punt 1.5 van de beschreven procedure. Selecteren geschikte grootte putjes de gewenste test is ook van belang voor het verkrijgen van een optimaal resultaat. Permeabel membraan inserts zijn verkrijgbaar in verschillende afmetingen, maar de meest consistente resultaten voor de hier getoonde studies werden waargenomen middels inzetstukken ontworpen 24 goed en 6 putjes weefselkweekplaten. Dit insert maten zijn relatief gemakkelijk te hanteren met steriele pincet en gemak van manipulatie kritisch preventing ongewenste overdracht van bacteriën uit het bovenste compartiment naar het onderste compartiment van de put. Voor experimenten met het verzamelen van gastheercellysaten, 6 putjes een passend aantal cellen per voorwaarde voor de meeste analyses en zijn groot genoeg om cel schrapers voor monstername tegemoet te komen. Op cytotoxiciteit assays waarin de gastheercellen blijft hechtende en gelabeld met een fluorescente of colorimetrische kleurstof die kan worden gemeten op een plaatlezer (bijvoorbeeld ethidium homodimeer assay trypan blauw exclusietest), gebruik van een 24 wells plaat met de overeenkomstige inserts is aanbevolen. Voor experimenten waarbij celkweekmedium worden verzameld en geanalyseerd (bijv LDH-afgifte, cytokine studies) hetzij de 24 put of 6 well platen kunnen worden gebruikt, hoewel de kleinere putjes geven doorgaans voldoende monstervolumes voor deze analyses en het gebruik van de vereiste minimaliseren reagentia. Kortom, de methode is zeer veelzijdig en kan worden aangepast nodig sampl bereidenes voor tal van follow-up-toepassingen.

Inzicht in de functie van bacteriële virulentiefactoren in het kader van de gastheercel infectie is een belangrijke focus van bacteriële pathogenese onderzoek. Veel bacteriële pathogenen actief scheiden toxines en andere oplosbare factoren die helpen bij de vernietiging van gastheerweefsel te signaleren veranderingen in gastheercellen te veroorzaken voor immuunreacties manipuleren tijdens infectie 1-10. Hoewel werkwijzen ontwikkeld om succesvol zuiveren en produceren vele van deze belangrijke virulentiefactoren voor studie, sommige bacteriële producten hebben unieke structuren of extensieve posttranslationele modificaties die hen recalcitrante kandidaat zuiveringsmethoden maken en kan dus niet worden onderzocht geïsoleerd middels in vitro systemen . Bijvoorbeeld, groep A Streptococcus, de bacteriële verwekker voor een groot aantal infecties variërend van faryngitis tot necrotiserende fasciitis en toxische shocksyndroom, produceert een uitgescheidenbacteriële toxine bekend als streptolysine S (SLS) 11-17. Deze ribosomaal geproduceerde peptide wordt gecodeerd door de streptolysine S geassocieerde gen (sag) cluster en het rijpe product wordt geschat op 2,7 kDa in grootte 14-17. De protoxine, gecodeerd door saga, wordt gewijzigd post-translationeel door verschillende enzymen (SAGB, SAGC en SAGD) naar de rijpe, functionele vorm te produceren 15-17. De complexiteit van deze post-translationele modificaties in combinatie met ongewone aminozuurvolgorde het toxine hebben het toxine onverenigbaar met alle zuivering en structuuropheldering inspanningen die geprobeerd hebben tot op heden 15,17 teruggegeven. Deze uitdagingen zijn ingewikkeld inspanningen om de specifieke rol van deze toxine in gastheer pathogenese bepalen. Wanneer de bereiding van toxines of andere uitgescheiden factoren om complexe onmogelijk, mechanismenophelderen van de functie van deze producten zijn van oudsher onderzocht door de bereiding van gefilterde bacteriële supernatanten, die vervolgens worden toegepast om gastheercellen 18-20. Er zijn verscheidene problemen geassocieerd met deze techniek. Eerste, veel van deze uitgescheiden factoren, zoals SLS, houden geen maximale en constante activiteit wanneer bewaard en toegepast om gastheercellen later. Bovendien, wanneer supernatanten op één tijdstip worden verzameld en daarna op gastheercellen, is het moeilijk om fysiologische relevantie te bepalen en directe conclusies over het natuurlijke infectieproces, waarbij uitgescheiden factoren mogen accumuleren tijdens infectie een trekken fysiologisch relevante concentratie. Dit tweede probleem geldt niet alleen voor het gebruik van bacteriële supernatanten, maar ook voor het gebruik van de toxines in gastheercel studies 1 - 3,8. Om deze problemen, een permeabel membraan inse pakkenrt-gebaseerde infectiesysteem is ontwikkeld om de effecten van SLS op gastheercellen op een manier die optimale toxine activiteit behoudt, en voorkomt dat de variabele direct contact tussen bacteriën en gastheercellen beoordelen. In dit systeem worden menselijke epitheliale cellen gekweekt in een monolaag in de onderste kamer van een tweekamer goed en bacteriën worden ingebracht in de bovenste kamer van dezelfde put. Een poreus membraan (0,4 urn poriën) scheidt de bovenste en onderste kamers, waardoor uitgescheiden die moeten worden uitgewisseld tussen de twee kamers, maar het passeren van bacteriën. Dit systeem heeft het mogelijk gemaakt voor een effectieve evaluatie van de gastheer reacties die uitsluitend zijn te wijten aan aanhoudende uitgescheiden bacteriële componenten terwijl het elimineren van alle reacties die kunnen optreden door direct contact tijdens Groep A streptokokken-infectie. Hoewel andere uitgescheiden bacteriële factoren naast SLS ook door het poreuze membraan kan passeren, het gebruik van een isogene mutant panel inclusief wild-type (WT), een SLS-knockout (ΔsagA) en een Saga aangevuld stam (ΔsagA + SAGA) zorgt voor een nauwkeurige evaluatie van de gastheer reacties die strikt SLS-afhankelijke 21. Hoewel vergelijkbaar permeabel membraan insert systemen zijn toegepast voor het onderzoek van uitgescheiden factoren betrokken bij virale infecties, kanker biologie en immune celmigratie 22-26, weinig studies met bacteriële interacties met gastheercellen hebben deze benadering 6,27,28 gebruikt. Zelfs studies die dergelijke systemen gebruikt om interacties tussen bacteriën en gastheercellen staand zijn voornamelijk gericht op migratie van ontstekingscellen of bacteriën door een epitheliale of endotheliale monolaag uitgeplaat op de permeabele membraan insert. Het permeabele membraan insert gebaseerde infectiesysteem hierin beschreven is een eenvoudige en effectieve methode die is gebaseerd op de scheiding van bacteriën en gastheercellen via een poreus membraan de effe beoordelencts van de uitgescheiden toxine, SLS, op host membraanintegriteit, cellulaire levensvatbaarheid, cellulaire signaaltransductie en uitgescheiden gastheercel factoren. Deze techniek kan worden aangepast aan de studie van andere uitgescheiden virulentiefactoren op verschillende zoogdierlijke soorten gastheercel om de rol van een specifieke bacteriële factor in de loop van een infectie te onderzoeken.

<table><tbody><tr><td>Todd-Hewitt bouillon</td><td>Acumedia</td><td>7161A</td><td>Gebruik geschikte bouillon voor de belangrijkste bacteriesoorten.</td></tr><tr><td>BioSpectrometer</td><td>Eppendorf</td><td>basismodel</td><td>Elke UV-Vis spectrofotometer is geschikt. </td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>Andere merken zijn geschikt.</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A1296-1kg</td><td>Andere merken zijn geschikt.</td></tr><tr><td>HaCaT humane epitheliale keratinocyten</td><td></td><td></td><td>Cadeau van het lab van Victor Nizet.</td></tr><tr><td>Dulbecco's Gemodificeerd Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td>Gebruik geschikte media voor de cellijn van belang.</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S162H</td><td>Gebruik geschikte media-additieven voor de cellijn van belang.</td></tr><tr><td>10 cm weefselkweekschotels</td><td>Nunc</td><td>150350</td><td>Andere merken zijn geschikt.</td></tr><tr><td>6 wel weefselkweekschotels</td><td>CytoOne</td><td>cc7682-7506</td><td>Andere merken zijn geschikt, maar moeten compatibel zijn met de Corning insert.</td></tr><tr><td>24 wel weefselkweekschotels</td><td>CytoOne</td><td>cc7682-7524</td><td>Andere merken zijn geschikt, maar moeten compatibel zijn met de Corning insert.</td></tr><tr><td>Glasdeksels</td><td>Fisherbrand</td><td>12-541-B</td><td>Deze moeten worden geautoclaveerd voor gebruik bij celbeplating.</td></tr><tr><td>Fosfaatbufferoplossing (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Rood Vrije DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>31053028</td><td>Fenol Rood Vrije media is alleen vereist voor de LDH-vrijlatingstest.</td></tr><tr><td>Bovien Serum Albumine (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030149</td><td>Alleen vereist om celkweekmedia aan te vullen voor de LDH-vrijlatingstest.</td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Gibco</td><td>BP356100</td><td>Alleen vereist om celkweekmedia aan te vullen voor de LDH-vrijlatingstest.</td></tr><tr><td>Collageen gecoate 0.4 μm Transwell inserts (6 well)</td><td>Corning</td><td>3540</td><td></td></tr><tr><td>Collageen gecoate 0.4 μm Transwell inserts (24 well)</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Pincetten</td><td>Fisher</td><td>3120018</td><td>Deze moeten worden gesteriliseerd met ethanol voordat ze Transwell inserts worden gehanteerd.</td></tr><tr><td>Celkrabbers</td><td>Fisherbrand</td><td>08-100-241</td><td>Deze zijn alleen vereist voor het verzamelen van cellyses.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>04042-500</td><td>TOXISCH.  Dit is alleen vereist voor immunofluorescentie beeldvorming.</td></tr><tr><td>Bicinchoninic zuur (BCA) testkit</td><td>Pierce</td><td>23227</td><td>Andere eiwit kwantificeringstests kunnen worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Tris-glycine 4 - 15% polyacrylamide gels</td><td>BioRad</td><td>4561083</td><td>Buffer systeem en percentage polyacrylamide moeten worden geselecteerd op basis van eiwitten van belang.</td></tr><tr><td>Electroforese cassette benodigdheden</td><td>BioRad</td><td>1658063</td><td>Alleen vereist voor Western Blotting.</td></tr><tr><td>Electroforese voeding</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>Alleen vereist voor Western Blotting.</td></tr><tr><td>Western blot overdracht cassette</td><td>BioRad</td><td></td><td>Alleen vereist voor Western Blotting.</td></tr><tr><td>Polyvinylideen (PVDF) Membraan</td><td>EMD Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Alleen vereist voor Western Blotting.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Konijn IgG-HRP secundair antilichaam</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc2030</td><td>Het secundaire antilichaam moet worden bepaald op basis van de geselecteerde detectiemethode. </td></tr><tr><td>Muis IgG-HRP secundair antilichaam</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc2031</td><td>Het secundaire antilichaam moet worden bepaald op basis van de geselecteerde detectiemethode. </td></tr><tr><td>Phospho-p38 (T180 + T182) MAPK antilichaam</td><td>Cell Signaling</td><td>4511</td><td>Selecteer geschikte primaire antilichamen op basis van eiwitten van belang.</td></tr><tr><td>Totale p38 MAPK antilichaam</td><td>Cell Signaling</td><td>8690</td><td>Selecteer geschikte primaire antilichamen op basis van eiwitten van belang.</td></tr><tr><td>Geit anti-konijn IgG Alexafluor 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11034</td><td>Andere secundaire antilichamen kunnen worden gebruikt voor immunofluorescentie beeldvorming detectie.</td></tr><tr><td>LumiGLO Detectiereagens</td><td>KPL</td><td>54-61-00</td><td>Alleen vereist voor Western Blotting met detectie op film.</td></tr><tr><td>Detectiefilm</td><td>Biodot</td><td>BDB57</td><td>Alleen vereist voor Western Blotting met detectie op film.</td></tr><tr><td>DeltaVision Nikon 90i fluorescentiemicroscoop</td><td>Nikon</td><td></td><td>Andere fluorescentie microscopen zijn geschikt voor deze analyses.</td></tr><tr><td>Normaal geitenserum</td><td>Thermo Scientific</td><td>31873</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500mL</td><td></td></tr><tr><td>DAPI nucleaire vlek</td><td>Cell Signaling</td><td>4083</td><td>Selecteer vlekken op basis van specifieke immunofluorescentie toepassingen van belang.</td></tr><tr><td>Rhodamine-phalloidin actine vlek</td><td>Molecular Probes</td><td>R415</td><td>Selecteer vlekken op basis van specifieke immunofluorescentie toepassingen van belang.</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Alleen vereist voor immunofluorescentie beeldvorming.</td></tr><tr><td>Ethidium homodimer 1</td><td>Molecular Probes</td><td>E1169</td><td>Alleen vereist voor membraan permeabilisatie cytotoxiciteitstest.</td></tr><tr><td>Spectramax M5 Microplate Reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Andere microplate readers die UV-vis, fluorescentie en luminescentie kunnen detecteren, kunnen geschikt zijn.</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>47036-50G-F</td><td>Alleen vereist voor membraan permeabilisatie cytotoxiciteitstest.</td></tr><tr><td>Molecular Probes ATP Bepaling Kit</td><td>Life Technologies</td><td>A22066</td><td>Andere kits zijn waarschijnlijk geschikt.</td></tr><tr><td>Cytotoxiciteits Detectie Kit voor LDH-vrijlating</td><td>Roche</td><td>11644793001</td><td>Andere kits zijn waarschijnlijk geschikt.</td></tr><tr><td>Nonidet P40 Substituut</td><td>Sigma</td><td>74385-1L</td><td>Andere leveranciers zijn geschikt.

implementatie van een permeabel membraan insert-gebaseerde infectiesysteem: effecten van uitgescheiden bacteriële toxinen op zoogdiergastheercellen studie

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Veel bacteriële pathogenen uitscheiden potente toxines te helpen bij de afbraak van gastheerweefsel te signaleren veranderingen in gastheercellen te veroorzaken voor immuunreacties manipuleren tijdens infectie. Hoewel werkwijzen ontwikkeld om succesvol zuiveren en produceren vele van deze belangrijke virulentiefactoren zijn er nog vele bacteriële toxinen waarvan de unieke structuur of extensieve posttranslationele modificaties ze moeilijk te zuiveren en studie in vitro systemen. Zelfs als zuivere toxine kan worden verkregen, zijn er veel problemen verbonden aan het bestuderen van de specifieke effecten van een toxine onder relevante fysiologische omstandigheden. De meeste in vitro celcultuur modellen om de gevolgen van uitgescheiden bacteriële toxines op gastheercellen omvatten evalueren incuberen gastheercellen met een eenmalige dosis toxine. Dergelijke methoden slecht bij benadering wat gastheercellen eigenlijk ervaring tijdens een infectie, waar de toxine voortdurend wordt geproduceerd doorbacteriële cellen en men liet ze hopen zich in de loop van de infectie. Dit protocol beschrijft het ontwerp van een permeabel membraan insert gebaseerde bacteriële infectie systeem om de effecten van streptolysine S, een potent toxine geproduceerd door groep A Streptococcus, menselijke epitheliale keratinocyten bestuderen. Dit systeem nauwer bootst de natuurlijke fysiologische omgeving tijdens een infectie dan methoden waarbij pure toxine of bacteriële bovenstaande vloeistoffen direct worden toegepast op gastheercellen. Belangrijk is dat deze werkwijze elimineert ook de voorspanning van gastheerreacties die als gevolg van directe contact tussen de bacteriën en gastheercellen. Dit systeem is gebruikt om de effecten van streptolysine S (SLS) op gastheer membraanintegriteit, cellulaire levensvatbaarheid en cellulaire signalering reacties kunnen beoordelen. Deze techniek kan gemakkelijk worden toegepast op de studie van andere uitgescheiden virulentiefactoren op verschillende zoogdierlijke soorten gastheercel de specifieke rol van een uitgescheiden bacteriële factor d onderzoekenijdens het verloop van de infectie.

Het permeabele membraan-insert gebaseerde infectiesysteem protocol ontwikkeld voor de studie van uitgescheiden bacteriële factoren wordt toegelicht in figuur 1. Dit systeem is gebaseerd op de scheiding van bacteriën en gastheercellen via een poreus membraan om de effecten van uitgescheiden bacteriële factoren in aanmerking, in casu streptolysine S (SLS), op gastheerreacties als gastheer membraanintegriteit, cellulaire levensvatbaarheid, cellulaire signaaltransductie en uitgescheiden gastheercel factoren. Figuur 2 geeft representatieve Western blot gegevens die aantonen dat dit systeem kan worden gebruikt om wijzigingen in de activering van contact beoordelen -onafhankelijke gastheer signalering eiwitten. In het bijzonder, tonen de representatieve gegevens aanzienlijk verbeterde p38 MAPK activatie in de aanwezigheid van SLS producerende GAS-stammen. Dit systeem kan ook worden toegepast om de effecten van uitgescheiden bacteriële factoren gastheereiwit lokalisatie van immunofluorescentie microscopie (visualiseren &lt;strong&gt; Figuur 3). De gegevens tonen SLS-afhankelijke activering van de belangrijkste inflammatoire mediator Nucleaire Factor kappa B (NFKB), welke translokeert van het cytoplasma naar de kern 21 bij activering. De resultaten in Figuren 2 en 3 geven aan dat zowel de SLS-afhankelijke signalering inflammatoire responsen geen direct contact tussen de bacteriën en gastheercellen vereisen. Zoals eerdere experimenten reeds aangetoond SLS-afhankelijke p38 en NFKB activering in directe infectiemodellen 21, soortgelijke niveaus van p38 of NFKB activering van de drie GAS stammen in het doorlaatbare membraan-insert systeem zou hebben aangegeven dat de reactie vereiste direct contact tussen de bacteriën en gastheercellen. Figuur 4 toont dat deze infectie systeem kan worden toegepast op toxine-afhankelijke veranderingen in ontvangst cytotoxiciteit via ethidium homodimeer en LDH-afgifte assays beoordelen. Dit blijkt uit de aanzienlijke stijging in zowel membraan permeabilisatie en in het vrijkomen van LDH uit gastheercellen blootgesteld aan een stammen bevattende SLS tegenover ongeïnfecteerde cellen of cellen blootgesteld aan de SLS-deficiënte stam. Deze veranderingen in cytotoxiciteit zich niet onmiddellijk als significant effect niet duidelijk tot 12 uur na infectie bij membraan permeabilisatie en 16 uur bij LDH-afgifte. De representatieve gegevens illustreren het belang van het selecteren van passende tijdstippen en infectie voorwaarden voor de evaluatie van deze gastheerreacties. Naast het feit dat voor de beoordeling van gastheer signalering veranderingen en cytotoxiciteit, het doorlaatbare membraan-insert gebaseerde infectiesysteem geldt voor de studie van metabole veranderingen zoals nauwkeurige bepaling van ontvangst ATP door het voorkomen van bacteriële besmetting van lysaten van gastheercellen (figuur 5) . Deze gegevens laten een aanzienlijk verlies van keratinocyten ATP in reactie op infectie door GAS 16 uur na infectie met verhoogde ATP verlies in de aanwezigheid van SLS. Deze resultaten zijn consistent met de waargenomen toxine-afhankelijke toename in ontvangst stressrespons signalering en cytotoxiciteit. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54406/54406fig1.jpg" /> Figuur 1: Schema van permeabel membraan Insert-Based infectiesysteem Protocol: Effecten van uitgescheiden bacteriële factoren op gastheercellen cijfer Menselijke keratinocyten uitgeplaat in het onderste compartiment en gekweekt tot 90% confluentie.. Een collageen beklede membraan met 0,4 urn poriën scheidt de bovenste en onderste kamers, en bacteriën worden toegevoegd aan de bovenste kamer van het permeabele membraan inzetstuk voor de gewenste infectieperiode. Cel kweeksupernatanten en gastheercellen kunnen worden verzameld na de infectie periode en gebruikt voor diverse analyses. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54406/54406fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie te bekijken</a>van dit cijfer. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54406/54406fig2.jpg" /> Figuur 2:. Het permeabele membraan Insert-Based infectiesysteem kan worden gebruikt voor gastheer cellysaat Analyse door SDS-PAGE en Western Blotting De representatieve gegevens tonen aan dat SLS verbetert activatie van de p38 MAPK route in geïnfecteerde keratinocyten. (A) HaCaTs werden geïnfecteerd met GAS 7 uur via het doorlaatbare membraan insert infectiesysteem (MOI = 10) en lysaten werden getest op activering van p38. (B) densitometrische drie onafhankelijke Western blots werd uitgevoerd om de relatieve activering van p38 kwantificeren reactie op GAS&#39;infection. Gemiddelden van drie biologische herhalingen worden getoond, met error bars vertegenwoordigt standaarddeviatie. Relatieve activering van p38 wordt weergegeven als gefosforyleerd / totaal eiwitgehalte. Statistische significantie werd bepaald ten opzichte vangeïnfecteerde cellen. De totale p-waarde werd bepaald met ANOVA (p = 0,0063). Dunnett&#39;s werden uitgevoerd post hoc aan elke voorwaarde om de overeenkomstige niet-geïnfecteerde controle te vergelijken betekenen. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001-0,001; ****, P &lt;0,0001. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Flaherty et al. 2015 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54406/54406fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54406/54406fig3.jpg" /> Figuur 3:. De permeabel membraan Insert-Based infectie systeem maakt het mogelijk voor de visualisatie van Host wijzigingen in de signalering door Immunofluorescentie microscopie De representatieve gegevens tonen aan dat streptolysin S verbetert de pro-inflammatoire signalering via activering van NFKB. HaCaT menselijke keratinocyten geïnfecteerd met GAS bij een M<html> OI van 10 tot 8 uur via het doorlaatbare membraan insert gebaseerde infectiesysteem. (A en B) Nucleaire lokalisatie van NFKB werd beoordeeld door immunofluorescentie beeldvorming. Het percentage nucleair gelokaliseerde cellen werd berekend door het tellen van het aantal cellen waarin NFKB uit het cytoplasma was translocatie naar de kern voor een gegeven gebied en delen dat getal met het totale aantal cellen voor hetzelfde veld. Schaalbalken geven 100 urn. (A) Het gemiddelde van drie herhalingen biologische vertegenwoordigd voor elke conditie met foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. De totale p-waarde werd bepaald met ANOVA; p &lt;0,0001. Dunnett&#39;s proeven werden uitgevoerd om elke conditie te vergelijken met de overeenkomstige niet-geïnfecteerde controlegroep. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001-0,001; ****, P &lt;0,0001. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Flaherty et al. 2015 21./ftp_upload/54406/54406fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54406/54406fig4.jpg" /> Figuur 4:. De permeabel membraan Insert-Based infectie systeem maakt het mogelijk voor de bepaling van de bacteriële-Mediated Membraan Permeabilisatie en cytotoxiciteit in de afwezigheid van direct contact tussen bacteriën en gastheercellen De representatieve gegevens tonen aan dat keratinocyten levensvatbaarheid afneemt in de aanwezigheid van actieve SLS toxine . GAS - geïnduceerde celdood in HaCaT cellen beoordeeld op aanwezigheid van WT, SLS-deficiënte of Saga aangevuld GAS keratinocyten blootgesteld aan gas via het doorlaatbare membraan-insert gebaseerde infectiesysteem voor 8-16 uur bij een MOI van 10. (. A) Levensvatbaarheid werd bepaald door ethidium homodimeer assay of (B) LDH-afgifte assay. In beide panelen, 3 replicates worden gemiddeld en fout balken geven standaarddeviatie. Significantie voor elk tijdstip werd bepaald door ANOVA (A) 8 hr, p = 0,0241; 12 uur, p &lt;0,0001 (B) 8 uur, p = 0,0287; 12 uur, p = 0,1977; 16 uur, p = 0,0031. Dunnett&#39;s werden uitgevoerd om gemiddelden te vergelijken van elke conditie aan het wildtype infectie van het overeenkomstige tijdstip. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001-0,001; ****, P &lt;0,0001. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Flaherty et al. 2015 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54406/54406fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/54406/54406fig5.jpg" /> Figuur 5: De permeabel membraan Insert-Based infectie systeem maakt nauwkeurige bepaling van Host ATP Levels door te voorkomen Bacterial Besmetting van gastheercellysaten. De representatieve gegevens tonen SLS-afhankelijke verlies van ATP in Groep A streptokokken-infectie. HaCaT-cellen werden geïnfecteerd met GAS 8-16 uur via het doorlaatbare membraan insert gebaseerde infectiesysteem. Technische replicaten (n = 3) tussen gemachtigden biologische repliceren (2 x 10 6 cellen per monster) werden gemiddeld voor elke conditie, met foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. De totale p-waarden werden bepaald met ANOVA (12 hr, p &lt;0,0001; 16 h, p &lt;0,0001). Dunnett&#39;s proeven werden uitgevoerd om elke conditie met wildtype infectie Vergelijk het overeenkomstige tijdstip. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001-0,001; ****, P &lt;0,0001. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Flaherty et al. 2015 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54406/54406fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Hier wordt een methode waarbij een permeabel membraan-insert gebaseerde infectiesysteem de effecten van streptolysine S, een uitgescheiden toxine geproduceerd door Groep A Streptococcus bestuderen op keratinocyten beschreven. Dit systeem kan eenvoudig worden toegepast op de studie van andere uitgescheiden bacteriële eiwitten op verschillende types gastheercel tijdens infectie.

Implementatie van een permeabel membraan Insert-gebaseerde infectiesysteem: Effecten van uitgescheiden bacteriële toxinen op zoogdiergastheercellen Studie

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Het algemene doel van dit infectiesysteem op basis van een doorlaatbaar membraan-insert is om de effecten van uitgescheiden bacteriële toxines op gastheercellen tijdens een infectie te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van gastheer-pathogeeninteracties, zoals de manier waarop specifieke uitgescheiden bacteriële componenten bijdragen aan de respons van de gastheercel tijdens een bacteriële infectie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de studie van uitgescheiden bacteriële componenten mogelijk maakt en een fysiologisch relevante gastheer-pathogeenomgeving in de context van een menselijke infectie nauwkeuriger modelleert.De procedure zal worden gedemonstreerd door Rebecca Flaherty, een senior promovendus uit mijn laboratorium. Om isogene wild-type groep A streptokokken, of GAS, en GAS M1T1 5448 mutantstammen voor te bereiden, start u overnight vloeibare culturen door vijf tot 10 milliliters Todd Hewitt-bouillon te inoculeren en 16 uur lang te incuberen bij 37 °C. Centrifugeer de overnight bacteriële culturen en gebruik het oorspronkelijke volume vers bacteriëmedium om het pellet opnieuw te suspenderen.Normalise vervolgens de bacteriële culturen naar gelijke startconcentraties door de geresuspendeerde culturen te verdunnen in extra medium om tot dezelfde OD600 te komen. Om lysaten te verzamelen voor het uitvoeren van signaleringsanalyses en ATP-bepaalsassays, zaaien HaCaT-cellen in six-well plates uit met een zaaidichtheid van ongeveer drie keer 10⁵ cellen per well, en kweken deze tot 90% confluentie. Om assays voor ethidium-homodimeer membraanpermeabilisatie en lactaatdehydrogenase-vrijgave uit te voeren, zaaien HaCaT-cellen in 24-well plates uit met een zaaidichtheid van ongeveer vijf keer 10⁴ cellen per well, en kweken deze tot 90% confluentie.Was de cellen direct vóór de behandeling met 1x PBS. Voeg vervolgens twee milliliter vers groeimedium, met of zonder farmacologische behandeling, toe aan de zes-wellplaten, of 0,5 milliliter medium aan de wells van 24-wellplaten. Plaats daarna, onder een laminaire flowkast, met een steriele pincet voorzichtig een steriele permeabele membraaninsert van 0,4 micron in elke well.Voorzichtige en steriele hantering van de permeabele inserts tijdens de voorbereiding van de infectie is cruciaal om te voorkomen dat het membraan tijdens dit proces beschadigd raakt of besmet wordt. Voeg vers celcultuurmedium toe aan de bovenste kamer van elke well volgens de instructies van de fabrikant. Breng vervolgens een geschikt volume van de genormaliseerde bacteriële culturen aan in de bovenste kamer van het permeabele membraan-insert-systeem, en voeg bacterieel medium toe aan de controle-wells.Zorgvuldige toevoeging van de bacteriën aan de bovenkamer, evenals een voorzichtig transport van de geïnfecteerde cellen naar de incubator, zijn cruciaal, omdat het essentieel is dat bacteriën de onderkamer niet contamineren tijdens de experimentele opstelling. Om te testen op uitgescheiden gastheerproteïnen, dient het permeabele membraaninsert voorzichtig met steriele pincetten te worden verwijderd. Verzamel vervolgens het medium uit de onderkamer in 1,5-milliliter buisjes, zonder de monoc laag cellen te verstoren.Centrifugeer de monsters bij 14.000 RCF en vier graden Celsius gedurende 10 minuten om celresten te pelletteren. Verwijder vervolgens alle supernatant behalve 50 µL, breng dit over naar een nieuwe 1,5-ml buis en bewaar bij min 20 graden Celsius, of gebruik het onmiddellijk. Voor de beoordeling van gastheer-cellulysaten dient het medium boven de monolaag voorzichtig te worden geaspireerd zonder de gastheercellen te verstoren.Spoel de cellen vervolgens één keer met PBS. Aspireer het PBS voorzichtig en voeg direct een volume ijskoud lysisbuffer toe om bijvoorbeeld een eiwitconcentratie van 0,5 tot 1,5 milligram per milliliter te bereiken. Incubeer de monsters daarna 15 minuten op ijs.Gebruik vervolgens een celschraper om de cellen van het platoppervlak van elke well los te maken en breng de volledige inhoud van elke well over naar een buisje van 1,5 milliliter. Centrifugeer de monsters daarna 20 minuten lang bij 14.000 RCF en vier graden Celsius. Om de oplosbare componenten van het lysaat te beoordelen, brengt u het supernatant over naar een nieuw buisje en bewaart u dit bij min 20 graden Celsius, of gebruikt u het onmiddellijk.Om nucleaire of andere onoplosbare lysaatcomponenten te beoordelen, dient de pellet te worden bewaard bij -20 °C, of onmiddellijk te worden gebruikt. Voor beoordeling via immunofluorescentie-imaging dient het medium te worden afgezogen en moeten de cellen worden gewassen met 1x koud PBS. Fixeer vervolgens de cellen gedurende de nacht met 4% PFA en PBS.Voer verdere analyses uit volgens het tekstprotocol. De hier getoonde western blot-gegevens laten een significant verhoogde p38 MAP-kinase-activatie zien in keratinocyten in aanwezigheid van streptolysine S of SLS-producerende gas-stammen, wat aangeeft dat dit systeem kan worden gebruikt om veranderingen in de activatie van contact-onafhankelijke signaleringsproteïnen van de gastheer te beoordelen. In deze figuur wordt de SLS-afhankelijke activatie getoond van de belangrijke inflammatoire mediator nucleair factor-kappa B, die bij activatie vanuit het cytoplasma naar de kern transloceert, wat aantoont dat dit systeem kan worden gebruikt om de effecten van gesecreteerde bacteriële factoren op gastheereiwitreacties te visualiseren middels immunofluorescentiemicroscopische benaderingen.Hier wordt aangetoond dat er significante toenames zijn in zowel de membraanpermeabilisatie als in de afgifte van LDH uit gastcellen na blootstelling aan SLS-producerende gas-stammen, vergeleken met niet-geïnfecteerde cellen of cellen die zijn blootgesteld aan een SLS-deficiënte stam. Deze resultaten geven aan dat dit systeem in staat is om toxine-afhankelijke veranderingen in gastcytotoxiciteit te beoordelen. In dit experiment werden de ATP-niveaus in keratinocyten en de respons op gas-infectie bepaald.16 uur na infectie werd een significante afname van ATP waargenomen, waarbij het verlies van ATP sterker was in de aanwezigheid van SLS, wat consistent is met de toxine-afhankelijke toenames in de signalering van de stressrespons van de gastheer en de toxiciteit. Eenmaal vastgesteld, kan deze techniek worden gebruikt om de specifieke responsen van elke uitgescheiden microbiële factor op verschillende soorten gastheercellen te bestuderen. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om gedurende alle stappen van de experimentele opzet steriele technieken toe te passen en de permeabele membraaninserts zorgvuldig te hanteren, zowel tijdens de initiële opzet als tijdens de monstername.Na deze procedure kunnen methoden zoals western blotting, immunofluorescentie-imaging en membranenpermeabilisatie-assays worden uitgevoerd om te bepalen hoe de bacteriële factor van belang bijdraagt aan veranderingen in signaleringscascades en de algehele cytotoxiciteit tijdens een infectie beïnvloedt. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u gastcelmonsters voorbereidt voor de evaluatie van diverse gastcelresponsen na blootstelling aan een specifieke uitgescheiden bacteriële factor van belang. Vergeet niet dat het hanteren van biohazardous materialen, zoals bacteriële pathogenen, bepaalde veiligheidsoverwegingen vereist.Het juiste gebruik van veiligheidsbrillen, handschoenen en laboratoriumjassen, samen met het correcte gebruik van een biosafety cabinet, is noodzakelijk om deze experimenten veilig uit te voeren.

implementation-permeable-membrane-insert-based-infection-system-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

This video demonstrates a permeable membrane insert-based infection system to assess the impact of secreted bacterial toxins. By eliminating direct contact between the bacterial pathogen and the host cells using a permeable membrane, this technique allows for studying the effect of toxins secreted by pathogenic bacteria on mammalian host cells.

A Permeable Membrane Insert-Based Infection System to Study the Impact of Bacterial Toxins

This video demonstrates a permeable membrane insert system to investigate the impact of bacterial toxins on host cells in a controlled and isolated manner. This approach allows for the selective exposure of the cells to the toxins while maintaining a physical separation that mimics the natural host-pathogen interaction.

Extracting Host Cell Lysate from Infected Host Cells Cultured in a Permeable Membrane System

Oprichting van menselijke modellen van de bloed-hersenbarrière (BBB) ​​kan profiteren onderzoek naar hersenen voorwaarden in verband met BBB mislukking. We beschrijven hier een verbeterde techniek voor de bereiding van een contact BBB model dat coculturing menselijke astrocyten en brein endotheelcellen maakt aan de tegenovergestelde zijden van een poreus membraan.

Verbeterde werkwijze voor de bereiding van een Human-Cell gebaseerde, Contact Model van de bloed-hersenbarrière

De epitheliale cellen van de choroïdale plexus (CP) vormen de bloed-hersenwaterbarrière (BCSFB). Een in vitro model van de BCSFB gebruikt humane choroïdale plexuspapilloom (HIBCPP) cellen. Dit artikel beschrijft het kweken en basolaterale infectie van HIBCPP cellen met behulp van een cellencultuur filterinzetsysteem.

Een Choroid Plexus Epitheliale-Cell gebaseerde model van het menselijk bloed-cerebrospinale vloeistof Barrier om bacteriële infectie studie uit het basolaterale Side

Bij meercellige organismen veroorzaken uitgescheiden oplosbare factoren reacties van verschillende celtypen als gevolg van paracriene signalering. Co-cultuursystemen bieden een eenvoudige manier om de veranderingen aan te brengen die worden veroorzaakt door uitgescheiden oplosbare factoren in de afwezigheid van cel-celcontact.

Ontwikkeling van een Insert Co-cultuur systeem van twee mobiele soorten in de afwezigheid van cel-cel Contact

We hebben een permeabele microporeuze membraaninzet aangepast om het tumormicro-omgeving (TME) te imiteren. Het model bestaat uit een gemengde celcultuur, maakt een vereenvoudigde generatie van sterk verrijkte individuele celpopulaties mogelijk zonder het gebruik van fluorescente markering of celsortering, en maakt het mogelijk om intercellulaire communicatie binnen het TME te bestuderen onder normale of stressomstandigheden.

Een Mimic van de tumor micro: Een eenvoudige methode voor het genereren van verrijkte celpopulaties en Onderzoeken intercellulaire communicatie

Een methode voor de bepaling van de permeabiliteit in een membraan invoegen systeem voor multi goed platen en in silico parameter optimalisatie voor de berekening van diffusie coëfficiënten met behulp van de simulatie worden gepresenteerd.

Een methode voor de bepaling en simulatie van permeabiliteit en verspreiding in een Model van 3D weefsel in een membraan invoegen systeem voor multi goed platen

De menselijke bloed-hersenbarrière voorkomt selectief penetratie van hydrofiele moleculen en ziekteverwekkers in de hersenen. Verschillende pathologieën, waaronder meningitis en postoperatief delirium, worden geassocieerd met een verhoogde doorlaatbaarheid van de bloed-hersenbarrière. Hier beschrijven we een endothelial celkweekmodel om de barrièredoorlaatbaarheid te testen door microbiële traversal.

Analyseren van de permeability van de bloed-hersenbarrière door microbiële traversal door middel van microvasculaire endotheliale cellen

Escherichia coli veroorzaakt sepsis bij pasgeborenen die de bacteriën rond het moment van geboorte binnenkrijgen. Het proces dat betrokken is bij het vermogen van E. coli om van het enterische kanaal naar de bloedbaan te reizen, is slecht begrepen. Dit in vitro model beoordeelt het vermogen van E. coli stammen om door de darmepitheelcellen te reizen.

Beoordeling van intestinale transcytose van neonatale Escherichia coli bacteriëmie-isolaten

De studie presenteert een methode voor in vitro onderzoek van bacteriële infecties met behulp van intestinale organoïden afkomstig van weefselstamcellen. Het protocol beschrijft hoe organoïden in twee dimensies kunnen worden gekweekt en onderscheiden, geïnfecteerd met adherent-invasieve Escherichia coli, en belangrijke metingen worden beoordeeld, waaronder het doorbreken van de epitheliale barrière, infectiebeeldvorming en de repitheliale RNA-respons.

Een tweedimensionale organoïde cultuur op invasine of basement membraanextract om gastheer-bacteriën interacties te bestuderen

Leer een permeabel membraan insert-gebaseerd infectiesysteem om de effecten van uitgescheiden bacteriële toxinen op zoogdiergastheercellen te bestuderen. Deze methode modelleert gastheer-pathogeen interacties.

Implementatie van een permeabel membraan Insert-gebaseerde infectiesysteem: Effecten van uitgescheiden bacteriële toxinen op zoogdiergastheercellen Studie (Video) | JoVE Journal

Implementatie van een permeabel membraan Insert-gebaseerde infectiesysteem: Effecten van uitgescheiden bacteriële toxinen op zoogdiergastheercellen Studie

Meer video's verkennen