Implementatie van een permeabel membraan Insert-gebaseerde infectiesysteem: Effecten van uitgescheiden bacteriële toxinen op zoogdiergastheercellen Studie
19 augustus 2016
Hier wordt een methode waarbij een permeabel membraan-insert gebaseerde infectiesysteem de effecten van streptolysine S, een uitgescheiden toxine geproduceerd door Groep A Streptococcus bestuderen op keratinocyten beschreven. Dit systeem kan eenvoudig worden toegepast op de studie van andere uitgescheiden bacteriële eiwitten op verschillende types gastheercel tijdens infectie.
Het algemene doel van dit op een permeabele membraaninvoeging gebaseerde infectiesysteem is om de effecten van uitgescheiden bacteriële toxinen op gastheercellen tijdens infectie te bestuderen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van gastheer-pathogeen interacties te beantwoorden, zoals hoe specifieke uitgescheiden bacteriële componenten bijdragen aan gastheercelreacties tijdens bacteriële infectie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de studie van uitgescheiden bacteriële componenten mogelijk maakt en een fysiologisch relevante gastheer-pathogeen omgeving in de context van menselijke infectie nauwer modelleert.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Rebecca Flaherty, een senior afgestudeerde student uit mijn laboratorium. Om isogene wildtype groep A streptococcus, of GAS, en GAS M1T1 5448 mutante stammen voor te bereiden, start u overnacht vloeibare culturen door vijf tot 10 milliliter Todd Hewitt bouillon te inoculeren en 16 uur te incuberen bij 37 graden Celsius. Centrifugeer de overnachtse bacterieculturen en gebruik het originele volume vers bacteriemedium om het pellet op te schrijven.
Normaliseer vervolgens de bacterieculturen tot gelijke startconcentraties door de opgeschorte culturen te verdunnen in aanvullend medium om tot dezelfde OD600 te komen. Om lysaten te verzamelen voor het uitvoeren van signaalanalyse en ATP-bepaling assays, plateer HaCaT-cellen in zes-well plates met een zitdichtheid van ongeveer drie keer 10 tot de vijfde cellen per well, en kweek tot 90%confluence. Om ethidium homodimeer membraanpermeabilisatie en lactate dehydrogenase release assays uit te voeren, plateer HaCaT-cellen in 24-well plates met een zitdichtheid van ongeveer vijf keer 10 tot de vierde cellen per well, en laat groeien tot 90%confluence.
Onmiddellijk voorafgaand aan de behandeling, gebruik 1x PBS om de cellen te wassen. Breng vervolgens twee milliliter vers groeimedium met of zonder farmacologisch behandeling aan in de zes-well plates, of 0,5 milliliter medium in de wells van 24-well plates. Plaats vervolgens, onder een laminaire stromingshaak, met steriele forceps voorzichtig een steriele 0,4 micron permeabele membraaninvoeging in elke well.
Voorzichtig en sterieel handelen van de permeabele invoegingen tijdens de infectievoorbereiding is cruciaal om te voorkomen dat het membraan tijdens dit proces wordt aangetast of besmet. Breng vers cellencultuurmedium aan op de bovenste kamer van elke well volgens de instructies van de fabrikant. Breng vervolgens een geschikt volume van de genormaliseerde bacterieculturen aan op de bovenste kamer van het permeabele membraaninvoeging systeem, en breng bacteriemedium aan op de controle wells.
Voorzichtige toevoeging van de bacteriën aan de bovenste kamer, evenals voorzichtig transport van de geïnfecteerde cellen naar de incubator, zijn cruciaal, omdat het essentieel is dat bacteriën de onderste kamer niet besmetten tijdens de experimentele opstelling. Om uitgescheiden gastheerproteïnen te beoordelen, gebruik steriele forceps om voorzichtig de permeabele membraaninvoeging te verwijderen. Verzamel vervolgens, zonder de monolaag van cellen te verstoren, het medium van de onderste kamer in 1,5-milliliter buisjes.
Centrifugeer de monsters bij 14.000 RCF en vier graden Celsius gedurende 10 minuten om cellulaire deeltjes te pelletten. Verwijder vervolgens alles behalve 50 microliter van de supernatant, breng over naar een verse 1,5-milliliter buis en bewaar bij min 20 graden Celsius, of gebruik onmiddellijk. Voor beoordeling van gastheercel lysaten, zuig voorzichtig het medium boven de monolaag af zonder de gastheercellen te verstoren.
Gebruik vervolgens PBS om de cellen eenmaal te spoelen. Zuig voorzichtig het PBS af, en breng onmiddellijk een volume ijskoud lyseerbuffer aan om, bijvoorbeeld, een eiwitconcentratie van 0,5 tot 1,5 milligram per milliliter te bereiken. Bewaar vervolgens de monsters gedurende 15 minuten op ijs.
Gebruik vervolgens een cellenkrabber om de cellen los te maken van het plaatoppervlak van elke well, en breng de volledige inhoud van elke well over naar een 1,5-milliliter buis. Centrifugeer vervolgens de monsters bij 14.000 RCF en vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Om oplosbare lystaat componenten te beoordelen, breng de supernatant over naar een verse buis en bewaar bij min 20 graden Celsius, of gebruik onmiddellijk.
Om nucleaire of andere onoplosbare lysaten componenten te beoordelen, bewaar het pellet en bewaar bij min 20 graden Celsius, of gebruik onmiddellijk. Voor beoordeling door immunofluorescentie beeldvorming, zuig het medium af en gebruik 1x koud PBS om de cellen te wassen. Fixeer vervolgens de cellen met 4%PFA en PBS gedurende de nacht.
Voer verdere analyses uit volgens het tekstprotocol. De western blot data die hier wordt getoond, demonstreert significant verbeterde p38 MAP kinase activering en keratinocyten in de aanwezigheid van streptolysine S of SLS-producerende gas stammen, wat aangeeft dat dit systeem kan worden gebruikt om veranderingen in de activering van contact-onafhankelijke gastheer signaal eiwitten te beoordelen. In deze figuur wordt de SLS-afhankelijke activering van de belangrijke inflammatoire mediator nucleair factor-kappa B getoond, die vanuit het cytoplasma naar de kern transloceert bij activering, wat aangeeft dat dit systeem kan worden gebruikt om de effecten van uitgescheiden bacteriële factoren op gastheer eiwitresponsen te visualiseren met behulp van immunofluorescentie microscopie benaderingen.
Hier worden significante toenames in zowel membraanpermeabilisatie als in de afgifte van LDH van gastheercellen gedemonstreerd na blootstelling aan SLS-producerende gas stammen, vergeleken met niet-geïnfecteerde cellen of cellen blootgesteld aan een SLS-deficiënte stam. Deze resultaten geven aan dat dit systeem toxine-afhankelijke veranderingen in gastheercytotoxiciteit kan beoordelen. In dit experiment werden de niveaus van ATP in keratinocyten en respons op gasinfectie bepaald.
16 uur na infectie werd een significante vermindering in ATP waargenomen, en de verlies van ATP was duidelijker in de aanwezigheid van SLS, consistent met de toxine-afhankelijke toenames in gastheer stressrespons signaal en
Overzicht
Dit artikel beschrijft een op permeable membraan inserts gebaseerd infectiesysteem om de effecten van Streptolysine S, een toxine geproduceerd door Group A Streptococcus, op keratinocyten te bestuderen. Deze methode modelleert gastheer-pathogeen interacties en kan worden toegepast op verschillende uitgescheiden bacteriële eiwitten.
Belangrijkste onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Celbiologie
- Gastheer-Pathogeen Interacties
Achtergrond
- Streptolysine S is een uitgescheiden toxine van Group A Streptococcus.
- Het begrijpen van bacteriële toxinen kan inzicht geven in gastheercelresponsen.
- Deze methode maakt een fysiologisch relevantere studie van infecties mogelijk.
- Het kan worden aangepast voor verschillende bacteriële eiwitten en gastheerceltypen.
Doel van het onderzoek
- Om de effecten van uitgescheiden bacteriële toxinen op gastheercellen te onderzoeken.
- Om gastheer-pathogeen interacties in een gecontroleerde omgeving te modelleren.
- Om de activering van gastheer signaalroutes tijdens infectie te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van bacterieculturen en normalisatie van concentraties.
- Gebruik van permeable membraan inserts voor co-cultuur van bacteriën en gastheercellen.
- Assays voor cell viabiliteit, signaalanalyse en ATP bepaling.
- Immunofluorescence microscopie om gastheer proteïne responsen te visualiseren.
Belangrijkste resultaten
- Verhoogde activering van p38 MAP kinase in keratinocyten blootgesteld aan Streptolysine S.
- Significante membraan permeabilisatie en LDH release uit gastheercellen.
- Vermindering van ATP niveaus in keratinocyten na infectie met SLS-producerende stammen.
- Aangetoond potentieel voor het bestuderen van verschillende uitgescheiden microbiële factoren.
Conclusies
- Het permeable membraan insert systeem modelleert effectief bacteriële infecties.
- Het biedt inzicht in de cytotoxische effecten van bacteriële toxinen.
- Deze techniek kan worden gebruikt voor bredere studies over gastheerresponsen op microbiële factoren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Modeling the effects of secreted bacterial toxins on mammalian host cells is critical for de-risking early anti-infective discovery and understanding host-pathogen interactions. The permeable membrane insert-based infection system enables physiologically relevant interrogation of toxin-mediated cellular responses, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. This approach informs portfolio decisions by clarifying the functional impact of secreted virulence factors under near-physiological conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of secreted bacterial toxin effects on host cell signaling and viability.
- Supports mechanistic de-risking by isolating contact-independent host responses.
- Facilitates functional target validation for virulence factors with complex post-translational modifications.
- Improves predictive confidence by modeling continuous toxin exposure as in natural infection.
Screening & Assay Development
- Prepares validated host-pathogen co-culture systems for downstream cytotoxicity and signaling assays.
- Standardizes quantitative readouts such as membrane permeabilization, LDH release, and ATP depletion.
- Enables reproducible assessment of toxin-dependent cellular phenotypes across experimental runs.
- Supports scalable adaptation to diverse host cell types and secreted factors.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant host responses observed during infection.
- Provides continuity from mechanistic discovery to preclinical model development for anti-virulence strategies.
- Enables risk-adjusted advancement of candidates targeting secreted bacterial factors.
Pipeline & Workflow Integration
This system bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven testing of secreted toxin effects in a controlled, physiologically relevant context.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing for toxin-mediated host cell responses and pathway activation.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs for cytotoxicity and signaling assays.
- Analytics: Provides statistical comparison of wild-type versus mutant bacterial strains and pharmacological interventions.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro findings with in vivo infection models when supported by downstream studies.
- Enterprise Reuse: Adaptable platform for evaluating diverse secreted microbial factors across multiple host cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity for secreted virulence factors.
- Operational Value: Standardizes infection modeling and enables reproducible, scalable workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying toxin-specific cellular effects under physiologically relevant conditions.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of anti-infective and host-directed therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile technique and host-pathogen co-culture systems.
- Needs access to permeable membrane inserts, cell culture infrastructure, and analytical assays (e.g., western blot, immunofluorescence, cytotoxicity).
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various host cell types and secreted factors with protocol optimization.
- Biohazard safety protocols are essential for handling pathogenic bacteria and infectious materials.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Bacterial Culture
1:48
Host Cell Infection with Permeable Membrane Insert System
3:52
Sample Collection
6:13
Results: Effect of Secreted Group A Streptococcus Toxins on Host Cells Using a Permeable Membrane Insert-based Infection System
7:56
Conclusion
