Name: Voorbereiding van de Homogene MALDI Monsters voor Quantitative Applications (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Leer een geoptimaliseerde gedroogde-druppelmethode voor MALDI-massaspectrometrie met temperatuurregeling. Deze techniek vermindert ruimtelijke heterogeniteit in ionensignalen en verbetert de betrouwbaarheid van analytische resultaten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door het Genomics Research Center, Academia Sinica en het Ministerie van Wetenschap en Technologie van Taiwan, de Republiek China (contractnr. 104-2119-M-001-014).

Opmerking: Dit protocol is ontwikkeld voor het verminderen van de ruimtelijke heterogeniteit van maltotriose en bradykinine fragment (1-7) bereid met de gedroogde-druppel-methode. Het protocol bestaat uit drie belangrijke stappen, inclusief voorbereiding en conditionering, sample depositie en drogen, en massaspectrometrie data-analyse. De procedures zijn beschreven en in meer detail hieronder beschreven: 1. Voorbereiding en Voorconditionering <ol><li> Het schoonmaken van de Sample Plate <ol><li> Draag nitril en met de hand wassen van het monster plaat voorzichtig met afwasmiddel en gedestilleerd-gedeïoniseerd water (DDW). </li><li> Spoel het monster plaat met methanol (MeOH) en DDW. </li><li> Plaats het monster plaat in een bekerglas van 600 ml en vul met DDW. </li><li> Ultrasone trillingen het monster plaat DDW gedurende 15 minuten in een ultrasoon bad (200 W, 40 kHz). </li><li> Verwijder DDW uit de beker en vul de beker met MeOH. </li><li> Ultrasone trillingen het monster plaat in MeOH gedurende 15 minuten in het ultrasoonbad (200 W, 40 kHz). </li><li> Afblazen het oplosmiddel druppels op de plaat met stikstofgas en houden het monster plaat droog is voordat sample depositie. </li></ol></li><li> Reguleren droogkamer Temperatuur LET OP:. De droogkamer is een 35 x 20 x 45 cm 3 (B x D x H) acryl kamer Figuur 1 toont het beeld van dit droogsysteem. De kamer wordt gespoeld met stikstofgas kamertemperatuur door een gas stromingsmeter met een constant debiet een lage relatieve luchtvochtigheid bewaakt door een gekalibreerde hygrometer in de droogkamer de geïnstalleerde. Een koperen basis blok in de droogkamer uitgerust met een geprogrammeerde constante temperatuur water circulatiepomp wordt gebruikt om roestvast stalen monster platen tegemoet te komen. De koperen basisblok kan de monsterplaat temperatuur van 5 regelen tot 25 ° C. De temperatuur van de lucht, koperen basis blok, en het monster plaat worden bewaakt door K-type thermokoppels. <ol><li> Open de deur en snel zet het monster plaat op de koperenbasis blok en sluit de deur. </li><li> Handmatig aanpassen van het gas stroommeter aan het stikstof debiet tot 10 standaard kubieke voet per uur (SCFH) in te stellen. </li><li> Bewaken van de relatieve vochtigheid in de droogkamer door de hygrometer en fine-tunen van het gas flowmeter te zorgen voor de relatieve luchtvochtigheid is altijd minder dan 25%. </li><li> Bewaken van de temperatuur van het monster plaat door K-type thermokoppels en het water circulatiepomp temperatuur handmatig in te stellen totdat het monster plaat 5 ° C voor experiment of kamertemperatuur (25 ° C) voor de controle bereikt. Opmerking: Om de monsterplaat stabiliseren op een temperatuur bedoeld, de watercirculatie temperatuur doorgaans ingesteld 0-5 ° C hoger dan de ontworpen monster. Om bijvoorbeeld 5 ° C te handhaven op de monsterplaat de temperatuurinstelling van de watercirculatie in het traject van 0 tot 2 ° C; het monster plaat bij 25 ° C te houden, de temperatuurinstelling van de watercirculatie in het traject van 23 tot 25 ° C. </li><li> Zorg ervoor dat de vereiste temperaturen en de relatieve vochtigheid worden bereikt (tabel 1) voor sample depositie. Opmerking: Alle parameters en hun instelwaarden voor droogprocessen met verschillende monsterplaat temperaturen worden in tabel 1. LET OP: Bij een lage monster plaat temperatuur, kan water condensatie op het monster plaat optreden als het deurtje is geopend voor een lange tijd. Als er water condensatie optreedt, sluit de deur en GEEN monster op het storten tot condensatie van water is uitgedroogd. </li></ol></li><li> Bereiding van matrix en analyt Solutions <ol><li> Bereiding van matrix oplossingen <ol><li> Bereid 0,1 M THAP oplossing met 50% acetonitril (ACN): 50% DDW waterige oplossing. </li></ol></li><li> Bereiding van analyten <ol><li> Bereid 10 -4 M maltotriose oplossing DDW. </li><li> Bereid 10 -5 M bradykinine fragment (1-7) oplossing in 50% acetonitril(ACN): 50% DDW waterige oplossing. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Sample Afzetting en Drogen <ol><li> Premix 0,25 pl 0,1 M THAP oplossing en 0,25 pl 10 -4 M maltotriose of 10 -5 M bradykinine fragment (1-7) oplossingen in een microcentrifugebuis. </li><li> Vortex de gemengde oplossing gedurende 3 sec. </li><li> Centrifugeer de gemengde oplossing gedurende 2 sec (2000 xg) om de oplossing op de bodem van de centrifugebuis verzamelen. </li><li> Open de deur van de droogkamer, zorgvuldig deponeren 0,1 ul van de oplossing op het monster plaat met pipet en sluit de deur onmiddellijk. </li><li> Wacht tot het monster druppel uit te drogen. . Opmerking: De typisch waargenomen droogtijd met verschillende monsterplaat temperaturen worden in tabel 1 voor steekproefplaat temperatuur van 5 ° C, de gemiddelde droogtijd is 800 tot 1.000 sec; voor steekproefplaat temperatuur van 25 ° C, de gemiddelde droogtijd is 100 tot 150 sec. </li><li> Na het drogen, open de deur van de droogkamer. </li><li> Zet het water circulatiepomp temperatuur tot kamertemperatuur (25 ° C). OPMERKING: Sla deze stap als het monster plaat constant op kamertemperatuur (25 ° C) tijdens het droogproces wordt gehouden. </li><li> Nadat het monster plaat temperatuur weer op kamertemperatuur (25 ° C), verwijder het monster plaat uit de droogkamer. </li><li> Onderzoek het monster morfologie onder een 5X stereomicroscoop en neem beeld snapshot bright-field. Opmerking: Als het kristal morfologie niet zoals verwacht, is het noodzakelijk om een ​​nieuw monster te maken met dezelfde procedure. Typische kristal morfologie wordt in de bovenste panelen van figuur 2. LET OP: In de gevallen met een lage monster plaat temperaturen, zoals 5 ° C, is het belangrijk om op te warmen het monster plaat op kamertemperatuur alvorens het uit de droogkamer. Bij het afzetten van de monsters, hier niet aan houden de voorgemengde solution in de punt van de pipet meer dan 10 sec. Niet meer gebruik maken van de vooraf gemengde oplossing na het afzetten van de monsters. De bovenste panelen van figuur 2 tonen bright-field beelden van de monsters bereid met verschillende steekproefplaat temperaturen. </li></ol> 3. Mass Spectrometry Data Analysis <ol><li> Mass Spectrometry Data Acquisition LET OP: Na de bereiding kan het monster worden geanalyseerd met behulp van beeldvormende massaspectrometrie. In deze studie worden de beeldvormende MS experimenten met laboratoriumonderzoek ingebouwde gesynchroniseerde dual-polariteit TOF (DP-TOF) massaspectrometer beeldvorming. 15 Commercial MALDI-TOF mass spectrometers met imaging vermogen zijn ook geschikt voor deze experimenten. De massaspectrometer wordt gebruikt in lineaire extractie en positieve ion modi met geoptimaliseerde afzuiging vertragingen. De kinetische energie van ionen 20 kV. De laserstraal grootte 35 pm in diameter op het monsteroppervlak en het spectrum van elke plek is de avewoede van 5 laser shots. <ol><li> Plaats het monster plaat in de MALDI massaspectrometer. </li><li> Voer imaging massaspectrometrie analyse om het monster bereid in stappen 2,1-2,9. </li><li> Selecteer een karakteristieke massa piek van de massa lijst weergegeven in het venster resultaat en klik op &quot;2D&quot; om de afbeelding van een twee-dimensionale ion plotten. LET OP: Voor maltotriose gemengd met THAP, de karakteristieke pieken sodiated maltotriose, geprotoneerde THAP en sodiated THAP. Voor bradykinine fragment (1-7) gemengd met THAP, omvatten de karakteristieke pieken geprotoneerde bradykinine fragment (1-7), geprotoneerd THAP en sodiated THAP. </li><li> Klik op de aanpassing knoppen in het pop-up venster om de bovenste en onderste grenzen van de intensiteit van het signaal te bepalen en klik op &quot;een afbeelding op te slaan&quot;. Deze instelling bepaalt het contrast van ionen beelden. LET OP: In elke individuele set van gegevens, worden de gebarsten regio&#39;s en de nul vlekken toont lage helderheid geëlimineerd. </li><li> Observeren en vergelijk de ionafbeelding het beeld helder-veld dat werd genomen op stap met 2.9. OPMERKING: Imaging massaspectrometrie en constructie van afbeeldingen van bepaalde ionen kan worden bereikt met commerciële instrumenten. Als gevolg van de verscheidenheid van de data-acquisitie en analyse software, moeten de gebruikers software instructies van de leverancier instrument om beelden van hoge kwaliteit te krijgen volgen. </li></ol></li><li> Gegevensanalyse LET OP: De heterogeniteit van de monsters wordt kwantitatief geanalyseerd. In deze demonstratie wordt elk monster verdeeld over meerdere concentrische gebieden door ontwikkelde software in huis om de ruimtelijke verdeling van de ionen te analyseren. De analyse kan ook worden uitgevoerd met zelfstandige gegevensanalyse software. <ol><li> Klik op de nul vlekken en de gebarsten regio&#39;s van de ion afbeelding weergegeven in het venster resultaat in om onbelangrijke gebieden te verwijderen. OPMERKING: Deze procedure definieert de essentiële gebied imago ion van. </li><li> Klik op &quot;vind edge&quot; knop om de buitenste laag op het ion van te vinden. </li><li> Klik op &#39;aftrekken&#39; om de ion overvloed informatie van de buitenste laag in een database op te slaan en tegelijkertijd verwijder deze laag op de ionen uit. Een selectievakje vertegenwoordigt deze buitenste laag zal verschijnen in de &quot;output data&quot; lijst van het venster resultaat. </li><li> Herhaal stap 3.2.2 en 3.2.3 tot het midden van het ion van wordt gedefinieerd. </li><li> Klik op en selecteer alle selectievakjes in de &quot;output data&quot; en klik op &quot;export&quot; om de gegevens te exporteren. </li><li> Open de geëxporteerde gegevens met behulp van spreadsheet-software om de gemiddelde ion overvloed aan elke laag te berekenen aan de ruimtelijke verdeling van ionen informatie te verkrijgen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Desorption+Ionization+of+Proteins+with+Molecular+Masses+Exceeding+10000+Daltons%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons.</a> Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988).</li>
<li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Velocity+Distributions+of+Intact+High+Mass+Polypeptide+Molecule+Ions+Produced+by+Matrix+Assisted+Laser+Desorption%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Velocity Distributions of Intact High Mass Polypeptide Molecule Ions Produced by Matrix Assisted Laser Desorption.</a> Chem. Phys. Lett. 181, 479-484 (1991).</li>
<li>Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic+Acid+as+a+Matrix+for+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Mass-Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-Assisted Laser Desorption Mass-Spectrometry.</a> Org. Mass Spectrom. 27, 156-158 (1992).</li>
<li>Ehring, H., Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Photoionization+and+Photochemistry+in+Ionization+Processes+of+Organic-Molecules+and+Relevance+for+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization+Mass-Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Role of Photoionization and Photochemistry in Ionization Processes of Organic-Molecules and Relevance for Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry.</a> Org. Mass Spectrom. 27, 472-480 (1992).</li>
<li>Strupat, K., Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C5-Dihydroxybenzoic+Acid+-+a+New+Matrix+for+Laser+Desorption+Ionization+Mass-Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom.+Ion+Process%22%5BJournal%5D)">2,5-Dihydroxybenzoic Acid - a New Matrix for Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry.</a> Int. J. Mass Spectrom. Ion Process. 111, 89-102 (1991).</li>
<li>Hu, H., Larson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaporation+of+a+Sessile+Droplet+on+a+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Evaporation of a Sessile Droplet on a Substrate.</a> J. Phys. Chem. B. 106, 1334-1344 (2002).</li>
<li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+Flow+as+the+Cause+of+Ring+Stains+from+Dried+Liquid+Drops%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capillary Flow as the Cause of Ring Stains from Dried Liquid Drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li>
<li>Hu, J. -B., Chen, Y. -C., Urban, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coffee-Ring+Effects+in+Laser+Desorption%2FIonization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Coffee-Ring Effects in Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal. Chim. Acta. 766, 77-82 (2013).</li>
<li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Tissue+Analysis+Using+Matrix-Assisted+Laser+Desorption%2FIonization+Mass+Spectrometry%3A+Practical+Aspects+of+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Direct Tissue Analysis Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry: Practical Aspects of Sample Preparation.</a> J. Mass Spectrom. 38, 699-708 (2003).</li>
<li>Hu, H., Larson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marangoni+Effect+Reverses+Coffee-Ring+Depositions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Marangoni Effect Reverses Coffee-Ring Depositions.</a> J. Phys. Chem. B. 110, 7090-7094 (2006).</li>
<li>Bhardwaj, R., Fang, X., Attinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+Formation+During+the+Evaporation+of+a+Colloidal+Nanoliter+Drop%3A+A+Numerical+and+Experimental+Study%5BTitle%5D)+AND+%22New+J.+Phys%22%5BJournal%5D)">Pattern Formation During the Evaporation of a Colloidal Nanoliter Drop: A Numerical and Experimental Study.</a> New J. Phys. 11, 075020(2009).</li>
<li>Savino, R., Paterna, D., Favaloro, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Buoyancy+and+Marangoni+Effects+in+an+Evaporating+Drop%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thermophys+Heat+Tr%22%5BJournal%5D)">Buoyancy and Marangoni Effects in an Evaporating Drop.</a> J Thermophys Heat Tr. 16, 562-574 (2002).</li>
<li>Probstein, R. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aProbstein%2C+RF+%22Surface+Tension.+in+Physicochemical+Hydrodynamics+%3A+An+Introduction%22">Surface Tension. in Physicochemical Hydrodynamics : An Introduction</a>. , John Wiley & Sons. Ch. 10 305-361 (1994).</li>
<li>Lai, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Spatial+Heterogeneity+of+MALDI+Samples+with+Marangoni+Flows+During+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27, 1314-1321 (2016).</li>
<li>Hsiao, C. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Molecular+Imaging+of+Photolabile+Surface+Samples+with+Synchronized+Dual-Polarity+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Molecular Imaging of Photolabile Surface Samples with Synchronized Dual-Polarity Time-of-Flight Mass Spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 25, 834-842 (2011).</li>
<li>Vorm, O., Roepstorff, P., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Resolution+and+Very+High-Sensitivity+in+MALDI+TOF+of+Matrix+Surfaces+Made+by+Fast+Evaporation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Improved Resolution and Very High-Sensitivity in MALDI TOF of Matrix Surfaces Made by Fast Evaporation.</a> Anal. Chem. 66, 3281-3287 (1994).</li>
<li>Gabriel, S. J., Schwarzinger, C., Schwarzinger, B., Panne, U., Weidner, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Segregation+as+the+Major+Cause+for+Sample+Inhomogeneity+in+MALDI+Dried+Droplet+Spots%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Matrix Segregation as the Major Cause for Sample Inhomogeneity in MALDI Dried Droplet Spots.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 1356-1363 (2014).</li>
<li>Mampallil, D., Eral, H. B., van den Ende, D., Mugele, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Evaporating+Complex+Fluids+through+Electrowetting%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Control of Evaporating Complex Fluids through Electrowetting.</a> Soft Matter. 8, 10614-10617 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Op basis van eerdere theoretische voorspellingen, kan temperatuur geïnduceerde hydrodynamische stromen binnen druppels naar buiten te overwinnen capillair stromen veroorzaakt door verdamping van het oplosmiddel. De efficiëntie van dit interne recirculatie van moleculen wordt versterkt wanneer de temperatuur gradiënten binnen een druppel verhogen. Volgens de voorspelde resultaten bij het houden van de monsterplaat temperatuur onder 5 ° C onder handhaving van zijn omgeving bij omgevingstemperatuur, de gemiddelde snelheid ...

Massaspectrometrie (MS) is een van de belangrijkste analytische technieken voor het analyseren van de moleculaire samenstellingen van complexe monsters. Van alle ionisatiemethoden die in MS worden gebruikt, is matrix-ondersteunde laserdesorbentie/ionisatie (MALDI) de meest gevoelige en meest gebruikte methode in bioanalytische toepassingen.1 In vergelijking met andere ionisatietechnieken heeft MALDI de hoogste gevoeligheid en een hoge tolerantie voor zoutverontreinigingen. Dergelijke analytische eigenschappen maken MALDI tot de eerste keuze voor koolhydraatanalyse en vele proteomics-toepassingen. Echter, monstervoorbereiding is een cruciale stap voor het verkrijgen van hoogwaardige gegevens in MALDI-MS.
De meest gebruikte monstervoorbereidingsmethode voor MALDI-MS is de dried-droplet-methode, waarbij monsterdruppels op een oppervlak worden afgezet en onder omgevingsomstandigheden worden gedroogd. Deze droogmethode is eenvoudig en over het algemeen effectief.2-5 Echter, een veelvoorkomend probleem in de dried-droplet-methode is dat de resulterende analyt/matrixkristallen zich normaal gesproken onregelmatig verdelen. In veel gevallen verzamelen de kristallen zich aan de rand van de monsters, wat resulteert in de zogenaamde ring-stain-vorming.6-8 De heterogene kristalmorfologieën beïnvloeden de ruimtelijke verdeling van analytmoleculen, wat resulteert in ernstige fluctuaties in het ionisatie-signaal over monsters. Dergelijke ernstige signaalschommelingen en slechte gegevensreproduceerbaarheid staan bekend als het "sweet spot"-probleem in MALDI-MS.9 Daarom is er een grote behoefte aan het verminderen van ruimtelijke heterogeniteiten in MALDI-MS dried-droplet-toepassingen.
Hydrodynamische stromingen in de monstersdruppel spelen een belangrijke rol bij het bepalen van de ruimtelijke verdeling van monsters die zijn voorbereid met de dried-droplet-methode.10-12 Er werd gevonden dat het verdampen van het oplosmiddel capillaire stromingen naar buiten binnen druppels induceert, die verantwoordelijk zijn voor de ring-stain-vorming.7,10 In tegenstelling hiermee kunnen recirculatiestromingen, veroorzaakt door tangentiale oppervlaktespanningsgradiënten, de naar buiten gerichte capillaire stromingen compenseren.13 Als de recirculatiesnelheden hoger zijn dan die van de naar buiten gerichte capillaire stromingen, kunnen de monsters efficiënt worden herverdeeld om het heterogeniteitsprobleem te verminderen.14
In dit werk demonstreren we een gedetailleerd protocol voor het voorbereiden van monsters met een eenvoudige droogkamer om efficiënte recirculatiestroom te induceren tijdens het droogproces van druppels. Droogcondities voor druppels worden nauwkeurig gecontroleerd, inclusief de temperaturen van de monsterschaal en de omgeving ervan, en de relatieve luchtvochtigheid binnen de kamer. De model-analyten omvatten maltotriose en bradykinine-keten (1-7). De matrix die voor de demonstratie wordt gebruikt, is 2,4,6-trihydroxyacetofenon (THAP). De monsters worden onderzocht met time-of-flight (TOF) MS en de gegevens worden kwalitatief geanalyseerd om de reductie van heterogeniteit te tonen.

<table><tbody><tr><td>Reagens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detergentpoeder</td><td>Alconox</td><td>242985</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Merck</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Merck</td><td>100003</td><td></td></tr><tr><td>2,4,6-trihydroxyacetofenon (THAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T64602&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bradykinine fragment (1-7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1651</td><td></td></tr><tr><td>Maltotriose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47884</td><td></td></tr><tr><td>Pipettips</td><td>Mettler Toledo</td><td>17005091</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugebuis</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q waterzuiveringssysteem</td><td>Millipore</td><td>ZMQS6VFT1</td><td></td></tr><tr><td>Poedervrije nitrilhandschoenen</td><td>Microflex</td><td>SU-690</td><td></td></tr><tr><td>600 ml beker</td><td>Duran</td><td>2110648</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasone reiniger</td><td>Delta</td><td>DC300H</td><td></td></tr><tr><td>Hygrometer</td><td>Wisewind</td><td>5330</td><td></td></tr><tr><td>Stikstofgas flowmeter</td><td>Dwyer</td><td>RMA-6-SSV</td><td></td></tr><tr><td>K-type thermokoppels</td><td>Digitron</td><td>311-1670</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Select BioProducts</td><td>Force Mini&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Rainin</td><td>pipet-lite XLS</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Temperatuurcontroleerbare droogkamer</td><td>this lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gesynchroniseerde dubbelpooltijd-of-vlucht beeldvormende massaspectrometer (DP-TOF IMS)</td><td>this lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF roestvrijstalen monsterdoelwit</td><td>this lab</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding van de homogene maldi monsters voor quantitative applications

Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications

Dit protocol toont een eenvoudige monstervoorbereiding om ruimtelijke heterogeniteit in ionensignalen te verminderen tijdens matrix-ondersteunde laserdesorptie/ionisatie (MALDI) massaspectrometrie. De heterogeniteit van ionensignalen is een ernstig probleem in MALDI, wat resulteert in slechte reproduceerbaarheid van gegevens en MALDI ongeschikt maakt voor kwantitatieve analyse. Door de temperatuur van de monsterplaat tijdens de monstervoorbereiding te regelen, zijn thermisch geïnduceerde hydrodynamische stromingen in druppels monstersoplossing in staat om het heterogeniteitsprobleem te verminderen. Een monstervoorbereidingskamer op kamertemperatuur, uitgerust met een temperatuurgeregelde koperen basisblok dat MALDI-monsterplaten bevat, maakt nauwkeurige controle van de monsterdroogconditie mogelijk. Na het drogen van monsters op de plaat, wordt de temperatuur van de monsters op kamertemperatuur teruggebracht en uit de kamer verwijderd voor verdere massaspectrometrische analyse. De gebieden van monsters worden onderzocht met MALDI-beeldmassaspectrometrie om de ruimtelijke verdeling van alle componenten in het monster te verkrijgen. In vergelijking met de conventionele dried-droplet methode die monsters voorbereidt onder omgevingsomstandigheden zonder temperatuurregeling, vertonen de monsters die met de hierin beschreven methode zijn bereid significant betere ruimtelijke verdeling en signaalintensiteit. Volgens waarnemingen met koolhydraat- en peptidemonsters kan het verlagen van de substraattemperatuur terwijl de omgeving op kamertemperatuur wordt gehouden tijdens het droogproces effectief de heterogeniteit van ionensignalen verminderen. Deze methode is over het algemeen toepasbaar op verschillende combinaties van monsters en matrices.

De lichte-veldbeelden en de MS afbeeldingen maltotriose en bradykinine fragment (1-7) bereid met monsterplaat temperatuur van 5 en 25 ° C zijn weergegeven in figuur 1. Bij sodiated maltotriose, het ion signaal voornamelijk bevolkt aan de rand van het waarnemingsveld als het wordt bereid met een monsterplaat temperatuur van 25 ° C. Door verlaging van de monsterplaat temperatuur tot 5 ° C, het signaal vult homogeen over het gehele monstergebied. Het enige merkbare nadeel b...

Een protocol voor het verminderen ruimtelijke heterogeniteit van ionen signalen in MALDI massaspectrometrie door het regelen substraattemperatuur tijdens droogprocessen monster wordt aangetoond.

Voorbereiding van de Homogene MALDI Monsters voor Quantitative Applications

This protocol demonstrates a simple sample preparation to reduce spatial heterogeneity in ion signals during matrix-assisted laser desorption/ionization ...

Het algemene doel van deze monsterpreparatiemethode voor MALDI MS is het verminderen van de ruimtelijke heterogeniteit in ionsignalen tijdens MALDI MS. Er is een goed gecontroleerde droogomgeving gebouwd om de conventionele gedroogde-druppelmethode te optimaliseren door de hydrodynamische stromingen binnen de monsterdruppel tijdens het droogproces te manipuleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de ruimtelijke heterogeniteit van de ionsignalen voor het monster, geprepareerd via de geoptimaliseerde gedroogde-druppelmethode, effectief kan worden verminderd. Deze methode kan homogene monsters leveren voor het THAP Metric System.Het kan ook worden toegepast op andere matricesystemen, zoals alfa-cyano-4-hydroxycinnamazuur. Over het algemeen hadden personen die nieuw waren met deze methode moeite, omdat het beheersen van de droogcondities niet eenvoudig is. Om deze procedure te starten, opent u de deur van een droogkamer en plaatst u onmiddellijk een eerder gereinigde monsterplaat op het blok op koperbasis.Sluit vervolgens de deur. Stel de gasstroommeter handmatig in om de stikstofstroom op 10 standard cubic feet per uur te zetten. Verfijn daarna de gasstroommeter om ervoor te zorgen dat de relatieve vochtigheid in de droogkamer, gemeten met een hygrometer, altijd onder de 25% blijft.Gebruik K-type thermokoppels om de temperatuur te bewaken en stel de temperatuur van de watercirculator handmatig in, totdat de monsterplaat een temperatuur van 5 °C bereikt voor het experiment. Zorg ervoor dat de vereiste temperaturen en de relatieve vochtigheid zijn bereikt voordat de monsters worden gedeponeerd. Meng 0,25 µL van een 0,1 M THAP-oplossing en 0,25 µL van de gewenste analyt in een microcentrifugebuis.Vortex de sample gedurende drie seconden. Centrifugeer de sample vervolgens twee seconden om de oplossing onderin de microcentrifugebuis te verzamelen. Open na centrifugatie de deur van de droogkamer en breng voorzichtig 0,1 µL van de oplossing met een pipette aan op de sampleplaat.Sluit de deur onmiddellijk en wacht tot de monsterdruppel is opgedroogd. Wanneer de temperatuur van de monsterplaat lager wordt gehouden dan die van de omgeving, neemt de gemiddelde snelheid van de recirculatiestromingen binnen de druppel aanzienlijk toe om moleculen te herverdelen. De depositie van het monster is de meest kritieke stap die de datakwaliteit en reproduceerbaarheid bepaalt.De vooraf gemengde monsteroplossing moet onmiddellijk op de monsterplaat worden aangebracht om ervoor te zorgen dat het monster onder gecontroleerde omstandigheden kristalliseert. Open na het drogen de deur van de droogkamer.Stel vervolgens de temperatuur van de watercirculator in op 25 °C. Zodra de temperatuur van de monsterplaat is teruggekeerd naar 25 °C, wordt de monsterplaat uit de droogkamer gehaald. Onderzoek de morfologie van de monsters onder een stereomicroscoop met een vijfvoudige vergroting en maak een snapshot-beeld in brightfield.Plaats op dit punt de monsterplaat in een MALDI-massaspectrometer. Voer vervolgens een imaging massaspectrometrie-analyse uit. Selecteer een kenmerkende massapiek uit de massalijst in het resultaatvenster en klik op 2D om een tweedimensionaal ionenbeeld te genereren.Klik vervolgens op de aanpassingsknoppen in het pop-upvenster om de boven- en ondergrenzen van de signaalintensiteit te bepalen, om de beeldresolutie te verhogen en klik op 'save a picture'. Observeer en vergelijk het ionenbeeld met het eerder verkregen brightfield-beeld om het essentiële monstergebied te bepalen. Klik nu op de lege plekken en de gebarsten regio's in het ionenbeeld dat in het resultatenvenster wordt getoond om het te analyseren gebied nauwkeurig af te stellen.Klik op de knop find edge om de buitenste laag van het ionenbeeld te bepalen. Klik vervolgens op deduct om de informatie over de ionenovervloed van de buitenste laag in een database op te slaan en deze laag gelijktijdig uit het ionenbeeld te verwijderen. Herhaal de voorgaande stappen totdat het centrum van het ionenbeeld is gedefinieerd, selecteer vervolgens alle selectievakjes in de lijst met outputgegevens en klik op export om de gegevens te exporteren.Open ten slot de geëxporteerde gegevens in een spreadsheetprogramma om de gemiddelde ionenabundantie van elke laag te berekenen, om zo de informatie over de ruimtelijke verdeling van ionen te verkrijgen. In de brightfield- en MALDI-beelden van maltotriose bevindt het ionsignaal van de gesodineerde vorm zich voornamelijk aan de periferie van het monstergebied wanneer dit is geprepareerd bij een temperatuur van de monsterplaat van 25 °C. Door de temperatuur te verlagen naar 5 °C verdeelt het signaal zich homogeen over het gehele monstergebied, wat suggereert dat het prepareren van monsters bij een lagere temperatuur van de monsterplaat de moleculen aanzienlijk kan herverdelen en de heterogeniteit kan verminderen.De ionenafbeelding van het geprotoneerde bradykinine-fragment vertoont een vergelijkbare trend als die van het genatriumde maltotriose. Statistische analyses laten zien dat de heterogeniteit van de ionensignalen verkregen bij een monsterplaattemperatuur van 5 graden Celsius met 60 tot 80 procent afneemt ten opzichte van die bij 25 graden Celsius. In het geval van genatriumde maltotriose zijn, bij een monsterplaattemperatuur van 25 graden Celsius, de signaalintensiteiten in de centra veel lager dan bij een temperatuur van 5 graden Celsius.Het geprotoneerde bradykininefragment vertoont minder variatie wanneer de temperatuur van de monsterplaat wordt verlaagd van 25 naar 5 graden Celsius. Tijdens het toepassen van deze droogmethode moeten de temperatuur en de relatieve vochtigheid in de droogkamer zorgvuldig worden gecontroleerd en gemonitord. Zodra deze techniek onder controle is, kan een monster dat op deze wijze is voorbereid binnen 30 minuten gereed zijn, mits dit correct wordt uitgevoerd.Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van MALDI MS om kwantitatieve analyse voor gedroogde-druppelmonsters te verkennen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u homogene gedroogde-druppelmonsters bereidt voor MALDI MS-analyse.

preparation-of-homogeneous-maldi-samples-for-quantitative-applications

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Deze video toont de voorbereiding van een ultra-dunne matrix / analyt laag voor het analyseren van peptiden en eiwitten door Matrix-assisted laser desorptie ionisatie massaspectrometrie (MALDI-MS).

MALDI Monstervoorbereiding: de Ultra Thin Layer methode

Wij ontwikkelden een technologie op basis van silica mesoporeuze dunne film voor het selectief herstel van laagmoleculaire peptiden en eiwitten van humaan serum. De fysisch-chemische eigenschappen van onze mesoporeuze chips zijn volledig afgestemd op grote controle in peptide verrijking 'en derhalve profiel van de serum proteoom voor diagnostische doeleinden.

Laag moleculair gewicht eiwitverrijking op mesoporeuze silica dunne films voor de ontdekking van biomarkers

Nauwkeurige massa meting betekent een belangrijke stap tijdens het onderzoek van eiwitten. Matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie (MALDI) massaspectrometrie (MS) kan worden gebruikt voor deze vaststelling en van zijn belangrijkste voordeel is de tolerantie voor zouten, detergentia en verontreinigingen. Hier tonen we een toegankelijke benadering voor de analyse van eiwitten groter dan 100 kDa door MALDI-MS.

Matrix-laserdesorptie / ionisatie Time of Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrische analyse van intacte eiwitten groter dan 100 kDa

Dit protocol beschrijft het gebruik van hele-cel MALDI-TOF massaspectrometrie op eukaryote cellen. Hier illustreren we de nauwkeurigheid van deze techniek door de meerdere activeringstoestanden van macrofagen te analyseren als reactie op hun micro-omgeving.

Whole-cell MALDI-TOF massaspectrometrie is een nauwkeurige en snelle methode om verschillende vormen van macrofaagactivering Analyseer

Massaspectrometrische imaging (MSI) is een krachtig instrument dat kan worden gebruikt om verschillende chemische stoffen ontdekken en identificeren intacte weefsels behoud van de verbindingen in hun eigen omgeving, waarin nieuwe inzichten in biologische processen kunnen leveren. Hierin een MSI werkwijze ontwikkeld voor de analyse van kleine moleculen beschreven.

MALDI-Massaspectrometrische Imaging voor onderzoek naar metabolieten in<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Wortelknolletjes

Grootte-exclusiechromatografie gekoppeld aan inductief gekoppelde plasma - massaspectrometrie (ICP-MS) is een krachtig hulpmiddel om veranderingen in de abundantie van metalloproteïnen direct uit biologische monsters te meten. Hier beschrijven we een reeks metalloproteïne-standaarden die worden gebruikt om de moleculaire massa en de hoeveelheid metaal geassocieerd met onbekende eiwitten te schatten.

Normen voor Quantitative Metalloproteomic analyse met behulp van Size Exclusion ICP-MS

Een protocol voor de kwantificering van de eiwitten in complexe biologische vloeistoffen met behulp van geautomatiseerde immuno-MALDI (iMALDI) technologie wordt gepresenteerd.

Peptide en proteïne kwantificering met behulp van geautomatiseerde Immuno-MALDI (iMALDI)

Dit protocol beschrijft een reproduceerbare en betrouwbare methode voor de sublimatie gebaseerde voorbereiding van formaline vaste weefsels die bestemd zijn voor imaging Spectrometrie van de massa.

Optimale voorbereiding van formaline vaste monsters voor Peptide Matrix gebaseerde bijgestaan Laser desorptie/ionisatie massaspectrometrie Imaging Workflows

Een protocol voor het verbeteren van koolhydraten ion signalen in de Spectrometrie van de massa van de MALDI door hervorming kristallijnen structuren tijdens preparatietechnieken voor monster wordt aangetoond.

Een efficiënte Sample voorbereiding methode om koolhydraten Ion signalen in Laser Matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie

Het doel van dit protocol is om gedetailleerde richtlijnen te geven over de monstervoorbereiding bij het plannen van experimenten met MALDI MSI om metabole en moleculaire detectie in biologische monsters te maximaliseren.

Monstervoorbereiding voor metabole profilering met behulp van MALDI massaspectrometrie beeldvorming

Leer een geoptimaliseerde gedroogde-druppelmethode voor MALDI-massaspectrometrie met temperatuurregeling. Deze techniek vermindert ruimtelijke heterogeniteit in ionensignalen en verbetert de betrouwbaarheid van analytische resultaten.

Voorbereiding van de Homogene MALDI Monsters voor Quantitative Applications

Meer video's verkennen