Voorbereiding van de Homogene MALDI Monsters voor Quantitative Applications

Het algemene doel van deze monsterpreparatiemethode voor MALDI MS is het verminderen van de ruimtelijke heterogeniteit in ionsignalen tijdens MALDI MS. Er is een goed gecontroleerde droogomgeving gebouwd om de conventionele gedroogde-druppelmethode te optimaliseren door de hydrodynamische stromingen binnen de monsterdruppel tijdens het droogproces te manipuleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de ruimtelijke heterogeniteit van de ionsignalen voor het monster, geprepareerd via de geoptimaliseerde gedroogde-druppelmethode, effectief kan worden verminderd. Deze methode kan homogene monsters leveren voor het THAP Metric System.

Het kan ook worden toegepast op andere matricesystemen, zoals alfa-cyano-4-hydroxycinnamazuur. Over het algemeen hadden personen die nieuw waren met deze methode moeite, omdat het beheersen van de droogcondities niet eenvoudig is. Om deze procedure te starten, opent u de deur van een droogkamer en plaatst u onmiddellijk een eerder gereinigde monsterplaat op het blok op koperbasis.

Sluit vervolgens de deur. Stel de gasstroommeter handmatig in om de stikstofstroom op 10 standard cubic feet per uur te zetten. Verfijn daarna de gasstroommeter om ervoor te zorgen dat de relatieve vochtigheid in de droogkamer, gemeten met een hygrometer, altijd onder de 25% blijft.

Gebruik K-type thermokoppels om de temperatuur te bewaken en stel de temperatuur van de watercirculator handmatig in, totdat de monsterplaat een temperatuur van 5 °C bereikt voor het experiment. Zorg ervoor dat de vereiste temperaturen en de relatieve vochtigheid zijn bereikt voordat de monsters worden gedeponeerd. Meng 0,25 µL van een 0,1 M THAP-oplossing en 0,25 µL van de gewenste analyt in een microcentrifugebuis.

Vortex de sample gedurende drie seconden. Centrifugeer de sample vervolgens twee seconden om de oplossing onderin de microcentrifugebuis te verzamelen. Open na centrifugatie de deur van de droogkamer en breng voorzichtig 0,1 µL van de oplossing met een pipette aan op de sampleplaat.

Sluit de deur onmiddellijk en wacht tot de monsterdruppel is opgedroogd. Wanneer de temperatuur van de monsterplaat lager wordt gehouden dan die van de omgeving, neemt de gemiddelde snelheid van de recirculatiestromingen binnen de druppel aanzienlijk toe om moleculen te herverdelen. De depositie van het monster is de meest kritieke stap die de datakwaliteit en reproduceerbaarheid bepaalt.

De vooraf gemengde monsteroplossing moet onmiddellijk op de monsterplaat worden aangebracht om ervoor te zorgen dat het monster onder gecontroleerde omstandigheden kristalliseert. Open na het drogen de deur van de droogkamer.

Stel vervolgens de temperatuur van de watercirculator in op 25 °C. Zodra de temperatuur van de monsterplaat is teruggekeerd naar 25 °C, wordt de monsterplaat uit de droogkamer gehaald. Onderzoek de morfologie van de monsters onder een stereomicroscoop met een vijfvoudige vergroting en maak een snapshot-beeld in brightfield.

Plaats op dit punt de monsterplaat in een MALDI-massaspectrometer. Voer vervolgens een imaging massaspectrometrie-analyse uit. Selecteer een kenmerkende massapiek uit de massalijst in het resultaatvenster en klik op 2D om een tweedimensionaal ionenbeeld te genereren.

Klik vervolgens op de aanpassingsknoppen in het pop-upvenster om de boven- en ondergrenzen van de signaalintensiteit te bepalen, om de beeldresolutie te verhogen en klik op 'save a picture'. Observeer en vergelijk het ionenbeeld met het eerder verkregen brightfield-beeld om het essentiële monstergebied te bepalen. Klik nu op de lege plekken en de gebarsten regio's in het ionenbeeld dat in het resultatenvenster wordt getoond om het te analyseren gebied nauwkeurig af te stellen.

Klik op de knop find edge om de buitenste laag van het ionenbeeld te bepalen. Klik vervolgens op deduct om de informatie over de ionenovervloed van de buitenste laag in een database op te slaan en deze laag gelijktijdig uit het ionenbeeld te verwijderen. Herhaal de voorgaande stappen totdat het centrum van het ionenbeeld is gedefinieerd, selecteer vervolgens alle selectievakjes in de lijst met outputgegevens en klik op export om de gegevens te exporteren.

Open ten slot de geëxporteerde gegevens in een spreadsheetprogramma om de gemiddelde ionenabundantie van elke laag te berekenen, om zo de informatie over de ruimtelijke verdeling van ionen te verkrijgen. In de brightfield- en MALDI-beelden van maltotriose bevindt het ionsignaal van de gesodineerde vorm zich voornamelijk aan de periferie van het monstergebied wanneer dit is geprepareerd bij een temperatuur van de monsterplaat van 25 °C. Door de temperatuur te verlagen naar 5 °C verdeelt het signaal zich homogeen over het gehele monstergebied, wat suggereert dat het prepareren van monsters bij een lagere temperatuur van de monsterplaat de moleculen aanzienlijk kan herverdelen en de heterogeniteit kan verminderen.

De ionenafbeelding van het geprotoneerde bradykinine-fragment vertoont een vergelijkbare trend als die van het genatriumde maltotriose. Statistische analyses laten zien dat de heterogeniteit van de ionensignalen verkregen bij een monsterplaattemperatuur van 5 graden Celsius met 60 tot 80 procent afneemt ten opzichte van die bij 25 graden Celsius. In het geval van genatriumde maltotriose zijn, bij een monsterplaattemperatuur van 25 graden Celsius, de signaalintensiteiten in de centra veel lager dan bij een temperatuur van 5 graden Celsius.

Het geprotoneerde bradykininefragment vertoont minder variatie wanneer de temperatuur van de monsterplaat wordt verlaagd van 25 naar 5 graden Celsius. Tijdens het toepassen van deze droogmethode moeten de temperatuur en de relatieve vochtigheid in de droogkamer zorgvuldig worden gecontroleerd en gemonitord. Zodra deze techniek onder controle is, kan een monster dat op deze wijze is voorbereid binnen 30 minuten gereed zijn, mits dit correct wordt uitgevoerd.

Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van MALDI MS om kwantitatieve analyse voor gedroogde-druppelmonsters te verkennen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u homogene gedroogde-druppelmonsters bereidt voor MALDI MS-analyse.