De Terroir Concept Uitgelegd door de Bes van de Druif Metabolomics en Transcriptomics

Het algemene doel van deze experimentele procedures is om de verschillende terroir-signaturen in het metaboloom en transcriptoom van de bessen van de wijnstokcultivar Corvina waar te nemen. De hier beschreven casestudy omvatte de verzameling en analyse van monsters in drie rijpingsstadia van zeven wijngaarden in drie macrozones over drie groeiseizoenen. De beschreven technieken onthullen het overheersende effect van de rijping in het oogstjaar op het metaboloom van de bes.

Duidelijke specifieke chemische signaturen die de drie macrozones vertegenwoordigen, werden ook geïdentificeerd in de rijpe bessen. De terroir-signatuur op macroniveau werd onthuld met behulp van geschikte statistische technieken zoals de PCA (principal component analysis) en de auto BLSDA (bidirectional orthogonal projection to latent structures, discriminant analysis), om zowel de transcriptomische als de metabolomische datamatrix te analyseren. Aan de andere kant zijn de verschillen tussen individuele wijngaarden subtieler en vereisen zij daarnaast geavanceerdere en gevoeligere statistische benaderingen.

Begin het experiment door een passend bemonsteringsplan op te stellen. Zorg ervoor dat in het bemonsteringsplan de bemonsteringslocaties, tijdstippen en de precieze bemonsteringsprocedure worden vermeld. Na het oogsten van 30 trossen van verschillende posities langs twee wijnrijen, selecteer willekeurig drie bessen uit elke tros, waarbij bessen met zichtbare schade en/of tekenen van infectie worden vermeden.

Herhaal dit proces om drie onafhankelijke pools te verkrijgen voor elke rijpingstadium. Verwijder de zaden uit de bessen en vries het pericarp onmiddellijk in vloeibare stikstof in. Maal alle bevroren bessen van elke pool fijn met een automatische maalmolen.

Verdeel elk gepoederde monster in twee gelijke delen, één voor transcriptomanalyse en één voor metabolomanalyse. Sluit vervolgens de vijzel, verwijder deze en bewaar de poeders bij -80 °C. Bereid de metabolische extracten van de besmonsters bij kamertemperatuur in drie volumes methanol, aangezuurd met 0,1% mierenzuur, in een ultrasoonbad bij 40 kHz gedurende 15 minuten.

Centrifugeer de extracten bij 16,000 ×g gedurende 10 minuten bij vier graden celsius. Verdun het supernatant in twee volumes gedeïoniseerd water en filtreer dit door een 0,2 micron filter. Stel de hogedrukvloeistofchromatografie op, gekoppeld aan massaspectrometrie, met gebruik van een electrospray-ionisatiebron of HPLC-ESI-MS-systeem, zoals beschreven in het tekstprotocol.

Voer de HPLC-scheiding uit met een lineaire gradiënt van oplosmiddelen A en B bij een constante stroomsnelheid van 0.2 milliliters per minuut, met een monsterinjectievolume van 30 microliters. Neem massaspectra op in afwisselende negatieve en positieve ionisatiemodi, volgens de parameters die in het tekstprotocol zijn vermeld. Implementeer voor de verwerking van de LCMS-gegevens de procedures voor piekdetectie-uitlijning, gap-filling en piekfiltering met behulp van geschikte software, zoals de open source software M Zeta Mine, versie 2.14.

Importeer de resulterende tekstbestanden in een spreadsheet. Dit produceert een datamatrix waarin alle gedetecteerde metabolieten, herkenbaar aan een identificatienummer, een massa-ladingsverhoudingswaarde en de retentietijd, in alle monsters zijn gekwantificeerd op basis van hun piekarea-waarden. Bereid de hybridisatie-assemblage voor volgens de specificaties voor het vier-pack-formaat, door 1,65 µg cyanine-gelabeld complementair RNA te plaatsen in een eindvolume van 41,8 µL gedeïoniseerd RNAse-vrij water.

Voeg 11 µL 10X blokkeringsmiddel en 2,2 µL 25X fragmentatiebuffer toe. Incubeer 30 minuten bij 60 °C in een thermostatisch bad om het RNA te fragmenteren. Koel na 30 minuten onmiddellijk één minuut op ijs af.

Voeg ten slotte 55 µL 2X hybridisatiebuffer toe en meng dit goed door te pipetteren. Na het centrifugeren gedurende één minuut bij 15.500 ×g bij kamertemperatuur, wordt de microcentrifugebuis onmiddellijk op ijs geplaatst. Om de aangepaste microarray te laden, wordt een gasket-dia met de etikette zijde naar boven geplaatst in de basis van een hybridisatiekamer.

Breng langzaam 100 µL hybridisatie-monster aan in elke gasket-well door de vloeistof met de punt van een pipette te dispenseren, waarbij luchtbellen worden vermeden. Plaats de aangepaste microarray langzaam met de voorkant naar beneden, terwijl u ervoor zorgt dat de numerieke barcode naar boven is gericht. Controleer of het sandwich-paar correct is uitgelijnd.

Plaats slutend de kap van de hybridisatiekamer op de tussengeplaatste objectglazen en draai de klem met de hand vast op de kamer. Roteer de geassembleerde kamer om de mobiliteit van luchtbellen te beoordelen. Plaats de geassembleerde objectglas-kamer in een gebalanceerde rotisserie, in een hybridisatieoven die is ingesteld op 65 °C.

Stel de rotator in op 10 RPM. Laat de hybridisatie 17 uur lang doorgaan. Om verder te gaan met het wassen van de microarray-objectglasplaatjes, bereid drie kleurbakjes voor en vul deze met de geschikte wasbuffers.

Vul twee schaaltjes met wasbuffer één op kamertemperatuur en één schaaltje met voorverwarmde wasbuffer twee. Demonteer de hybridisatiekamer en verwijder de sandwich. Dompel de sandwich, met de numerieke barcode van de microarray-dia naar boven, onder in het eerste dia-kleurschaaltje gevuld met wasbuffer één op kamertemperatuur en scheid met behulp van schone pincetten de pakking van de microarray-dia.

Verplaats de microarray-dia snel naar een diarek en plaats deze in het tweede dia-kleuringsbakje gevuld met wasbuffer één bij kamertemperatuur. Plaats het dia-kleuringsbakje op een magnetische roerder en was gedurende één minuut onder matig roeren. Verplaats het diarek snel naar het derde dia-kleuringsbakje, gevuld met voorverwarmde wasbuffer twee, en was gedurende één minuut onder matig roeren.

Verwijder het rek langzaam uit de kleurbak en haal de slide voorzichtig uit het rek, waarbij druppelvorming wordt vermeden. Plaats de micro-array slide in een geschikte scanner en scan elke array met de parameterinstellingen die worden aanbevolen in de handleiding van de fabrikant van de micro-array. Importeer eerst de metabolomics- en transcriptomicsgegevens om de software voor statistische analyse voor te bereiden.

Ga naar Bestand, Nieuw regulier project, Nieuw regulier project, om de verkregen datamatrix te importeren. Klik vervolgens op Bewerken. Transponeer de gehele matrix, startpagina, en wijs de juiste primaire en secundaire ID toe. En voltooi het proces.

Om de multivariate statistische analyse uit te voeren, navigeert u naar het Workset-venster, selecteert u PCAX als modeltype en klikt u op AutoFit. Selecteer Scores en vervolgens Scatter om de plot te bekijken die de mogelijke groepering van de monsters weergeeft. Inspecteer de PCA-scoreplot.

Als er een goed model is verkregen, gebruik dan dezelfde klassen monsters om een O2PLS-discriminantieanalysemodel te bouwen. Om twee O2PLS-discriminantieanalysemodellen te bouwen met de door MacroZone geclassificeerde monsters, wijst u de klassen toe door naar het venster Home te gaan, vervolgens naar New As, M1 en Observations. Stel de gewenste klassen in.

Wijzig vervolgens het modeltype van PCAX naar O2PLS-discriminantieanalyse. Druk op Autofit. Selecteer M2 in het projectvenster, klik op Scores en vervolgens op Scatter om de plot en de positie van de monsterklassen te bekijken.

Ga naar Select Data Type en selecteer Observations and Loadings. Klik vervolgens op Add Series en selecteer de items PQ correlation one en PQ correlation two, of verdere componenten indien aanwezig. Klik met de rechtermuisknop op de plot, ga naar Property, selecteer Color en kies vervolgens By Terms, om de plotsymbolen tussen moleculen en klassen te onderscheiden.

Ga naar Layout, Format Plot, Access and or Styles, om de plot aan te passen met de gewenste kenmerken. Om te observeren welke metabolieten één of meer specifieke klassen kenmerken, gaat u naar Plot List en vervolgens naar Scatter. Exploratieve analyse van de gehele datamatrix via PCA liet zien dat monsters clusterden volgens het rijpingsstadium, waaronder veraison, middenrijping en rijp, langs de eerste en tweede hoofdcomponenten.

De monsters clusterden volgens het groeiseizoen langs de derde hoofdcomponent. O2PLS-discriminantieanalyse van rijpe bessen maakt de identificatie van specifieke terroir-kenmerken mogelijk, die de drie macrozones vertegenwoordigen: Valpolicella, Gardameer en Soave. De loading plots van deze modellen worden uitgedrukt als PQ-correlatie, de correlatie tussen P, de klasse van de monsters, en Q, de metabolieten.

In de loadings-plots vertegenwoordigen de rode vierkanten de klasse van monsters of macrozones, en de gekleurde driehoeken vertegenwoordigen de individuele metabolieten. De metabolieten zijn kleurgecodeerd op basis van hun chemische klasse, en de afstand tussen de metabolieten en de monsters weerspiegelt hun onderlinge relaties. De macrozone van het Gardameer werd gekenmerkt door stilbenen, terwijl Soave en Valpolicella werden gekenmerkt door flavonoïden.

Binnen de anthocyanen waren peonidine en zijn derivaten meer aanwezig in de macrozone van het Gardameer, terwijl de overige anthocyanen vaker voorkwamen in de macrozone van Valpolicella. Bovendien waren anthocyanine-3-O-glucosiden prominenter in de macrozone van Valpolicella, terwijl geacyleerde en gecumereerde derivaten vaker voorkwamen in de macrozone van Soave. Transcriptomics, RA en RNA-sig-methoden maken het mogelijk om duizenden transcripten van de wijnstok gelijktijdig te monitoren.

Onlangs is er een nieuwe op maat gemaakte microarray ontworpen die een nog groter aantal probes bevat, die representatief zijn voor aanvullende, onlangs ontdekte genera van de wingerstok. Gezien de snelle veroudering van transcriptomische platforms, hebben we een alternatieve procedure beschreven met gebruik van een nieuw platform dat meer probes bevat dan het oude, waaronder 249 meer voorspelde peno-transcripten, voor 1392 nieuw geïdentificeerde peno-loci en 179 corvina prava-genen. Metabolomanalyse via HPLC-ESI-MS is gevoelig genoeg om grote aantallen metabolieten gelijktijdig te detecteren.

Het vermogen om een representatief bemonsteringsvlak te creëren is cruciaal. De keuze voor één enkele kloon om genetische verschillen te minimaliseren, en de meervoudige duur van de bemonstering, maakten het mogelijk om de werkelijke verschillen tussen de terroirs te identificeren. Het zou interessant zijn om dezelfde cultivar te vergelijken die in minder optimale zones is gekweekt, maar helaas waren deze wijngaarden niet beschikbaar.