Name: Het ontwikkelen van een Speeksel Antibody Multiplex Immunoassay menselijke blootstelling aan Environmental Pathogens Meet (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Leer een bead-based multiplex immunoassay voor speekselantilichamen om menselijke blootstelling aan meerdere omgevingspathogenen tegelijkertijd te meten. Deze methode biedt snelle, kosteneffectieve inzichten voor exposure science.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Clarissa Curioso kreeg ondersteuning via een benoeming in het Research Participation Program bij de U.S. Environmental Protection Agency, beheerd door het Oak Ridge Institute for Science and Education via een interdepartementaal akkoord tussen het U.S. Department of Energy en de U.S. EPA.

Goedkeuring werd verkregen van de Institutional Review Board (IRB # 08-1844, Universiteit van North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) voor het verzamelen van gestimuleerde crevicular speekselmonsters van strandgangers in Boquerón Beach, Puerto Rico, als onderdeel van de Verenigde Staten Environmental Protection Agency (US EPA) De nationale Epidemiologische en Environmental Assessment van recreatief (NEEAR) Water Study 23 tot zwemmen bijbehorende risico&#39;s en ziekten te beoordelen. Proefpersonen mits informed consent en werden geïnstrueerd over het gebruik van het speeksel collectie apparaat door getrainde USEPA aannemers. De speekselmonsters werden verscheept op ijs en bij ontvangst, werden zij gecentrifugeerd en opgeslagen bij -80 ° C zoals beschreven 4. 1. Bead Activation <ol><li> Resuspendeer kralen set voorraden door vortexen en sonificeren gedurende 20 seconden en de overdracht van ongeveer 5,0 x 10 6 van de voorraad kralen (400 ul) naar microcentrifugebuizen. Opmerking: THij parels worden geleverd in een concentratie van 12,5 x 10 6 kralen / ml. </li><li> Pellet de voorraad parels door centrifugeren bij 10.000 xg gedurende 2 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de gepelleteerde kralen in 100 ul gedistilleerd water (dH 2 O) van vortex en sonicatie gedurende 20 sec. Herhaal stap 1.2. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de gewassen parels in 80 pl 100 mM monobasisch natriumfosfaat, pH 6,2 door vortex en sonicatie gedurende 20 sec. </li><li> Vlak voor het gebruik maken van een oplossing 50 mg / ml N -hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) door toevoeging van 200 pl dH 2 O tot de 10 mg sulfo-NHS aliquot. Meng door vortex. </li><li> Voeg 10 ul van 50 mg / ml sulfo-NHS aan de korrels. Meng door vortex. </li><li> Vlak voor het gebruik maken van een 50 mg / ml 1-ethyl- [3dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) door toevoeging van 200 ul gedestilleerd water (dH 2 O) aan de 10 mg EDC aliquot. Meng door vortex. </li><li> Voeg 10 ul van 50mg / ml EDC oplossing van de kralen. Meng door vortex. Incubeer de kralen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker onder mengen door vortex op 10 min intervallen. Pellet de geactiveerde korrels door microcentrifugatie bij 10.000 xg gedurende 2 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de kralen in 250 ui 50 mM 2- [N -Morpholino] ethaansulfonzuur (MES), pH 5,0 door vortex en sonicatie gedurende 20 sec. </li><li> Pellet de geactiveerde korrels door microcentrifugatie bij 10.000 xg gedurende 2 minuten. </li><li> Herhaal stap 1.9 en 1.10. Opmerking: Dit levert een totaal van twee wassingen met 50 mM MES, pH 5,0. </li><li> Resuspendeer de kralen in 100 pi 50 mM MES, pH 5,0 door vortex en sonicatie gedurende 20 sec. </li></ol> 2. Bead Koppeling <ol><li> Stel de antigenen aan de korrel sets in met de in Tabel 1 concentraties. </li><li> Voeg elk antigeen aan de geactiveerde kralen en breng het totale volume op 500 pl in 50 mM MES, pH 5,0. Meng de antigenen eend kralen door vortex. </li><li> Incubeer de antigenen en de parels gedurende 2 uur onder mengen door rotatie (~ 15 rpm) bij kamertemperatuur in het donker. Pellet de gekoppelde korrels door microcentrifugatie bij 10.000 xg gedurende 2 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de kralen in 500 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) -bovine serumalbumine (BSA) -polyoxyethylenesorbitan monolauraat (Tween-20) natriumnitraat azide (PBS-TBN) pH 7,4 door vortex en sonicatie. Pellet de kralen door microcentrifugatie bij 10.000 xg gedurende 2 minuten en verwijder het supernatant. Let op: Natriumazide is een acuut giftig chemisch product. Het is dodelijk bij inslikken of in contact komt met de huid. Voorkom inademen van stof / rook / gas / nevel / damp of spray. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM&#39;s) bij het hanteren en afvoeren in overeenstemming met de relevante wetten. </li><li> Resuspendeer de kralen in 1 ml PBS-TBN van vortex en sonicatie gedurende 20 sec. </li><li> Pellet de korrels door microcentrifugatie bij 10.000 xg gedurende 2 minuten. </li><li>Herhaal de stappen 2,5 en 2,6. Opmerking: Dit levert een totaal van twee wassingen met PBS-TBN. </li><li> Resuspendeer de gekoppelde en gewassen kralen in 1 ml PBS, 1% BSA, 0,05% azide, pH 7,4. Bewaar de gekoppelde parels in een 2-8 ° C koelkast in het donker. </li></ol> 3. Bead Count <ol><li> Bereid een 1:10 verdunning van de gekoppelde korrels in water of PBS buffer. </li><li> Load 10 ul van de verdunning kraal op een hemocytometer op monsterintroductie punt. </li><li> Tel de korrels gezien in één van de 4 x 4 corner roosters. Bereken het aantal gekoppelde korrels met de volgende formule: Count (1 hoek van 4 x 4 raster) x (1 x 10 4) x (verdunningsfactor) x resuspensie in ml. </li></ol> 4. Bevestiging van de Antigen Coupling <ol><li> Resuspendeer de voorraad mengsel van kralen gekoppeld aan antigenen van rente door vortex en sonicatie gedurende 20 sec. </li><li> Bereid een werkende kraal mengsel door verdunning van de gekoppelde kraal voorraden tot een definitieveconcentratie van 100 kralen / ul van elke unieke kralen in PBS-1% BSA (PBS-1% BSA, pH 7,4). </li><li> Maak minstens 7 tweevoudige seriële verdunningen van anti-species IgG primaire antilichaam volgens de aanbevelingen van de fabrikant in 96-well rondbodem plaat met PBS-1% BSA buffer. </li><li> Pre-nat afzonderlijke 8-putjes kolom (8 rijen) van een 96-well filter bodemplaat voor elke test antigen koppeling bevestiging met 100 ui wasbuffer en verwijder supernatant door vacuüm. Voeg 50 ul van werken bead mengsel (-antigen gekoppelde korrels) in de pre-nat putjes. </li><li> Voeg 50 ul antilichaam verdunningen 1-7 rijen van elke kolom van de 96-well filterplaat en 50 pi PBS-1% BSA buffer rij 8 in plaats van verdund antilichaam te dienen als achtergrond putjes. Meng met een multi-kanaal pipet op en neer te pipetteren 5 keer. Voer dezelfde procedure voor elk antigeen gekoppeld kraal set te worden bevestigd. </li><li> Dek af en laat incubeer in het donker bij kamertemperatuurerature gedurende 1 uur op een microplaat schudinrichting bij 500 rpm. Verwijder supernatant door vacuüm. </li><li> Was de putjes met 100 ui wasbuffer en verwijder supernatant door vacuüm. 1x herhalen. Resuspendeer de kralen in 50 ul PBS-1% BSA met een multi-channel pipet. </li><li> Verdun gebiotinyleerd anti-species IgG secundaire detectie antilichaam tegen 16 ug / ml in PBS-1% BSA. </li><li> Voeg 50 pl verdund secundair antilichaam aan elk putje door en neer te pipetteren 5 keer. </li><li> Bedek filterplaat en laat incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten op een plaat schudder. Verwijder supernatant door vacuüm. Was de putjes met 100 ui wasbuffer en verwijder supernatant door vacuüm. Herhaal wassen 1x. </li><li> Resuspendeer de kralen in 50 ul PBS-1% BSA met een multi-channel pipet. </li><li> Verdunde streptavidine-R-fycoerythrine reporter (SAPE) tot 24 ug / ml in PBS-1% BSA. </li><li> Voeg 50 ul van reporter aan elk putje en meng door en neer te pipetteren 5 keer. </li><li> Cvia filterplaat en laat incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten op een plaat schudder. Verwijder supernatant door vacuüm. Was de putjes met 100 ui wasbuffer en verwijder supernatant door vacuüm. Herhaal wassen 1x. </li><li> Resuspendeer kralen in 100 ul PBS-1% BSA en geanalyseerd 50 gl met de analysator 29. Opmerking: De resultaten van de kraal-gebaseerde multiplex immunoassay worden gemeten in Median Fluorescence Intensity (MFI). Raadpleeg altijd de meest recente versie van de software handleiding, indien beschikbaar om fouten te voorkomen. </li></ol> 5. Speeksel Multiplex Immunoassay <ol><li> Verwijderen speeksel uit de -80 ° C vriezer en laten ontdooien bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer antigen gekoppeld kralen voorraden door vortex en sonicatie gedurende 20 sec. </li><li> Maak een werkoplossing door verdunning kraal mengsel de gekoppelde kraal voorraden tot een uiteindelijke concentratie van 100 kralen / ul van elke unieke set kralen in PBS-1% BSA buffer. </li><li> Maak een 1: 4 verdunning van speeksel wet PBS-1% BSA buffer in een 96 well, diepe put plaat. </li><li> Pre-nat filter plaat met 100 ul wasbuffer en verwijder supernatant door vacuüm. </li><li> Voeg 50 ul van een werkende korrel mengsel en een gelijk volume verdund speeksel 95 putjes van de 96 putjes filterplaten een 1: 8 eindverdunning. Meng reacties met een multi-channel pipet. De ene controleputje, voeg 50 ul antigen gekoppelde korrels plus 50 pi PBS-1% BSA buffer (ter vervanging van speeksel). </li><li> Dek af en laat incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur op een microplaat schudinrichting bij 500 rpm. Verwijder supernatant door vacuüm. Was de putjes met 100 ui wasbuffer en verwijder supernatant door vacuüm. Herhaal wassen 1x. </li><li> Resuspendeer kralen in 50 ul PBS-1% BSA met een multi-channel pipet. </li><li> Verdun gebiotinyleerd geit anti-humaan IgG secundair antilichaam voor detectie 16 ug / ml in PBS-1% BSA. </li><li> Voeg 50 ul verdund secundair antilichaam aan elk putje en meng de inhoud meteen multi-channel pipet. </li><li> Bedek filterplaat en laat incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten op een plaat schudder. Verwijder supernatant door vacuüm. Was de putjes met 100 ui wasbuffer en verwijder supernatant door vacuüm. Herhaal wassen 1x. </li><li> Resuspendeer kralen in 50 ul PBS-1% BSA met een multi-channel pipet. </li><li> Verdunde streptavidine-R-fycoerythrine reporter (SAPE) tot 24 ug / ml in PBS-1% BSA. </li><li> Voeg 50 ul aan elk putje reporter en meng met een multi-channel pipet. </li><li> Bedek filterplaat en laat incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten op een plaat schudder. Verwijder supernatant door vacuüm. Was de putjes met 100 ui wasbuffer en verwijder supernatant door vacuüm. Herhaal wassen 1x. </li><li> Resuspendeer kralen in 100 ul PBS-1% BSA en geanalyseerd 50 gl met de analysator 29. Opmerking: De resultaten van de multiplex immunoassay worden gemeten in Median Fluorescence Intensity (MFI) eenheden. Raadpleeg altijdde nieuwste versie van de software manual, indien beschikbaar om fouten te voorkomen. </li></ol>

<ol><li>Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPr%C3%BCss-%C3%9Cst%C3%BCn%2C+A+%22Safer+water%2C+better+health%3A+costs%2C+benefits+and+sustainability+of+interventions+to+protect+and+promote+health%22">Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health</a>. , World Health Organization. Geneva. (2008).</li>
<li>Augustine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+approaches+to+developing+a+multiplex+immunoassay+for+determining+human+exposure+to+environmental+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens.</a> J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).</li>
<li>Griffin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+salivary+antibody+immunoassays+for+the+detection+of+incident+infections+with+Norwalk+virus+in+a+group+of+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers.</a> J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).</li>
<li>Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+multiplex+microsphere+immunoassay+for+the+quantitation+of+salivary+antibody+responses+to+selected+waterborne+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens.</a> J Immunol Methods. 364 (1-2), 83-93 (2011).</li>
<li>Ferguson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+diagnostic+uses+of+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Current diagnostic uses of saliva.</a> J Dent Res. 66, 420-424 (1987).</li>
<li>Mandel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnostic+uses+of+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oral+Pathol+Med%22%5BJournal%5D)">The diagnostic uses of saliva.</a> J Oral Pathol Med. 19, 119-125 (1990).</li>
<li>Malamud, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva+as+a+Diagnostic+Fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+Med+J%22%5BJournal%5D)">Saliva as a Diagnostic Fluid.</a> Brit Med J. 305, 207-208 (1992).</li>
<li>Ballam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting+is+useful+in+the+salivary+diagnosis+of+Helicobacter+pylori+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection.</a> J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).</li>
<li>Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+saliva+as+a+source+of+anti-malarial+antibodies+to+examine+population+exposure+to+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum.</a> Malar J. 10, 104(2011).</li>
<li>Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+invasive+amebiasis+by+enzyme-linked+immunosorbent+assay+of+saliva+to+detect+amebic+lectin+antigen+and+anti-lectin+immunoglobulin+G+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies.</a> J Clin Microbiol. 38 (6), 2344-2347 (2000).</li>
<li>Toyoguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+reactivity+to+Cryptosporidium+parvum+in+saliva+of+calves+after+experimental+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vet+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection.</a> J Vet Med Sci. 62 (11), 1231-1234 (2000).</li>
<li>Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+and+booster+salivary+antibody+responses+to+a+7-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+infants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants.</a> J Infect Dis. 182 (4), 1260-1263 (2000).</li>
<li>Tourinho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+the+cutoff+ratio+for+detecting+antibodies+against+hepatitis+A+virus+in+oral+fluids+by+enzyme+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay.</a> J Virol Methods. 173 (2), 169-174 (2011).</li>
<li>Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+saliva+as+an+alternative+to+plasma+for+the+detection+of+hepatitis+C+virus+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies.</a> Indian J Med Microbiol. 26 (4), 327-332 (2008).</li>
<li>Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+norwalk+virus+infection+by+indirect+enzyme+immunoassay+detection+of+salivary+antibodies+to+recombinant+norwalk+virus+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1028-1034 (2004).</li>
<li>Yap, G., Sil, B., Ng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+saliva+for+early+dengue+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Use of saliva for early dengue diagnosis.</a> PLoS Negl Trop Dis. 5 (5), e1046(2011).</li>
<li>Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+saliva-based+test+for+detecting+antibodies+to+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 6 (4), 577-580 (1999).</li>
<li>Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+saliva+for+antibodies+to+the+LPS+of+Escherichia+coli+O157+in+patients+with+serum+antibodies+to+E.+coli+O157+LPS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS.</a> J Med Microbiol. 52 (Pt 7), 569-572 (2003).</li>
<li>Ashbolt, N., Bruno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+and+refinement+of+the+WHO+risk+framework+for+recreational+waters+in+Sydney%2C+Australia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Water+Health%22%5BJournal%5D)">Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia.</a> J Water Health. 1 (3), 125-131 (2003).</li>
<li>Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QMRA+%28quantitative+microbial+risk+assessment%29+and+HACCP+%28hazard+analysis+and+critical+control+points%29+for+management+of+pathogens+in+wastewater+and+sewage+sludge+treatment+and+reuse%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse.</a> Water Sci Technol. 50 (2), 23-30 (2004).</li>
<li>Ashbolt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+contamination+of+drinking+water+and+disease+outcomes+in+developing+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions.</a> Toxicology. 198 (1-3), 229-238 (2004).</li>
<li>Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+model+to+assess+microbial+health+risks+associated+with+beneficial+uses+of+biosolids%5BTitle%5D)+AND+%22Risk+Anal%22%5BJournal%5D)">A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids.</a> Risk Anal. 24, 221-236 (2004).</li>
<li>Wade, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWade%2C+TJ+%22Report+on+2009+National+Epidemiologic+and+Environmental+Assessment+of+Recreational+Water+Epidemiology+Studies%2C+US+EPA.+US+EPA+Report+Number%3A+EPA%2F600%2FR-10%2F168%3A+US+EPA2011%22">Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011</a>. , (2011).</li>
<li>Fujii, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serological+surveillance+development+for+tropical+infectious+diseases+using+simultaneous+microsphere-based+multiplex+assays+and+finite+mixture+models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models.</a> PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040(2014).</li>
<li>Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measles+serological+survey+in+the+Italian+population%3A+interpretation+of+results+using+mixture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model.</a> Vaccine. 26 (34), 4403-4409 (2008).</li>
<li>Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+serological+surveys+using+mixture+models%3A+the+seroepidemiology+of+measles%2C+mumps+and+rubella+in+England+and+Wales+at+the+beginning+of+the+21st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century.</a> Epidemiol Infect. 134 (6), 1303-1312 (2006).</li>
<li>Baughman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+diagnostic+cutoff+points+for+levels+of+serum+antibodies+to+pertussis+toxin%2C+filamentous+hemagglutinin%2C+and+fimbriae+in+adolescents+and+adults+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1045-1053 (2004).</li>
<li>Clotilde, L., Bernard, C. IV, Hartman, G., Lau, D., Carter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbead-based+immunoassay+for+simultaneous+detection+of+Shiga+toxins+and+isolation+of+Escherichia+coli+O157+in+foods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods.</a> J Food Prot. 74 (3), 373-379 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Luminex+User+Software+Manual+%28RUO%29+xPONENT+3.1+Rev.+2%22">Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2</a>. 3, 6-102 (2014).</li>
<li>Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+non-specific+binding+in+serological+Luminex+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays.</a> J Immunol Methods. 309 (1-2), 200-204 (2006).</li>
</ol>

De United States Environmental Protection Agency via haar Bureau voor Onderzoek en Ontwikkeling gefinancierd en beheerd de hier beschreven onderzoek. Het is onderworpen aan een administratieve herziening van het Agentschap en goedgekeurd voor publicatie. Vermelding van handelsnamen of commerciële producten geen goedkeuring of aanbeveling voor het gebruik opleveren.

Deze resultaten geven aan dat de multiplex immunoassay werkwijze nuttig voor het onderscheiden tussen speekselmonsters die immunologisch of immunonegative zijn. Om immunopositivity te bepalen werd een cut-off point ontwikkeld door berekening van het gemiddelde plus drie standaardafwijkingen van de log-getransformeerde MFI reacties van de besturing gekoppelde parels getest met alle speekselmonsters. De cut-off point leverde de mogelijkheid van blootstelling en immunoprevalence beoordelen in een enkele of meerdere pathoge...

Achtentachtig procent van diarree gerelateerde ziekte wereldwijd wordt in verband gebracht met de blootstelling aan verontreinigde water, onveilig voedsel en slechte sanitaire / hygiëne, waardoor ongeveer 1,5 miljoen doden, van wie de meerderheid zijn kinderen 1. Dit is een belangrijke bron van zorg voor de openbare gezondheid van de ambtenaren en beleidsmakers. In een poging om blootstelling en ziekten die verband houden met water en andere milieu-pathogenen te onderzoeken, ontwikkelden we een multiplex immunoassay om antilichamen in menselijke monsters 2-4 te meten. Deze methode kan worden toegepast epidemiologische studies menselijke blootstelling aan deze pathogenen te bepalen en beter omlijnd en immunoprevalence incidente infecties. Speeksel houdt aanzienlijke belofte als alternatief voor serum biomarker voor menselijk onderzoek. Onder de voordelen van speeksel zijn de niet-invasieve en gemak van monsterverzameling, lage kosten, en samples gemakkelijk worden opgehaald kinderen 5-7 &lt;/ Sup&gt;. Serum- en speekselmonsters werden uitgebreid onderzocht op antilichamen tegen H. pylori 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumonia 12, hepatitis virussen A en C 13-14, noroviruses 2-4,15, T. gondii 2-4, dengue virus 16, humaan immunodeficiëntievirus (HIV) 17 en Escherichia coli O157: H7 18. Een multiplex immunoassay maakt de analyse van meerdere analyten tegelijk in één monstervolume binnen een enkele cyclus of lopen. Multiplexverzending antigenen van C. jejuni, T. gondii, H. pylori, werden hepatitis A virus, en twee noroviruses toegepast om menselijke speeksel IgG en IgA 2-4 3,4 en 2,3 plasma IgG antilichaamresponsen meten deze pathogenen met eenBead-based multiplexing immunoassay. Bij gebruik in combinatie met epidemiologische onderzoeken van blootstelling aan microben in water, bodem en voedsel, kan het type assay beschreven in deze studie waardevolle informatie voor het begrijpen van infecties veroorzaakt door ziekteverwekkers uit de omgeving te verruimen. Bovendien kan het speeksel antilichaam gegevens verkregen uit deze studies worden gebruikt om de risico-evaluatie modellen 19-22 te verbeteren.

<table><tbody><tr><td>Utrusting en Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>75002446</td><td>Worden gebruikt om monsters te centrifugeren</td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>VWR</td><td>G560</td><td>Worden gebruikt om monsters te mengen</td></tr><tr><td>Sonicator (mini)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-337-22</td><td>Worden gebruikt om kralen te scheiden</td></tr><tr><td>Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch.</td><td>Capp</td><td>Verschillende</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer (Bright Line)</td><td>Housser Scientific&nbsp;</td><td>3200</td><td>Worden gebruikt om gekoppelde kralen te tellen</td></tr><tr><td>Multiscreen Vacuum Manifold</td><td>Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td>Worden gebruikt in wasstappen om supernatant te verwijderen</td></tr><tr><td>MicroShaker</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td>Worden gebruikt om kralen tijdens incubatie te agiteren</td></tr><tr><td>Buisjesrek (1,5 ml en 0,5 ml) (gesorteerd)</td><td>VWR</td><td>30128-346</td><td></td></tr><tr><td>Weegschaal</td><td>Mettler of andere</td><td></td><td>Worden gebruikt om wasreagentia te meten voor het maken van buffers</td></tr><tr><td>Dynabead Sample Mixer</td><td>Invitrogen</td><td>947-01</td><td>Worden gebruikt tijdens koppelingsincubatiestap</td></tr><tr><td>MatLab (R2014b)</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td></td><td>Worden gebruikt om antilichaamresponsgegevens te analyseren</td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2014</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td>Worden gebruikt om antilichaamresponsgegevens te analyseren</td></tr><tr><td>Luminex Analyzer met xPonent 3.1 software</td><td>Luminex Corporation</td><td>LX200-XPON3.1</td><td>Instrument en software die worden gebruikt om het test uit te voeren</td></tr><tr><td>Antigenen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GI.1 Norwalk Virus: p-deeltje</td><td>Xi Jiang (CCHMC)*</td><td>NA</td><td>*Cincinnati Childrens' Hospital. Laatste conc. 5 &micro;g.</td></tr><tr><td>GII.4 Norovirus VA387: p-deeltje</td><td>Xi Jiang (CCHMC)*</td><td>NA</td><td>*Cincinnati Childrens' Hospital. Laatste conc. 5 &micro;g.</td></tr><tr><td>Hepatitis A Virus: concentraat van graad II uit celkweek</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>8505</td><td>Antigeen gekoppeld bij 100 &micro;g</td></tr><tr><td>Helicobacter pylori: lysate</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>R14101</td><td>Antigeen gekoppeld bij 25 &micro;g</td></tr><tr><td>Toxoplasma gondii: recombinant p30 (SAG1)</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>R18426</td><td>Antigeen gekoppeld bij 25 &micro;g</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni: verhitte hele cellen</td><td>KPL</td><td>50-92-93</td><td>Antigeen gekoppeld bij 50 &micro;g</td></tr><tr><td>Primaire antilichamen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guinea pig anti-Norovirus</td><td>(CCHMC)*</td><td>NA</td><td>Worden gebruikt voor koppelingsbevestiging</td></tr><tr><td>Muis anti-Hepatitis A IgG</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>C65885M</td><td>Worden gebruikt voor koppelingsbevestiging</td></tr><tr><td>Muis anti-Hepatitis A IgG</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>C65885M</td><td>Worden gebruikt voor koppelingsbevestiging</td></tr><tr><td>BacTraceAffinity Gezuiverd Antilichaam voor Helicobacter pylori</td><td>KPL</td><td>01-93-94</td><td>Worden gebruikt voor koppelingsbevestiging</td></tr><tr><td>Geiten pAb to Toxoplasma gondii</td><td>Abcam</td><td>Ab23507</td><td>Worden gebruikt voor koppelingsbevestiging</td></tr><tr><td>BacTrace Geiten anti-Campylobacter soorten</td><td>KPL</td><td>01-92-93</td><td>Worden gebruikt voor koppelingsbevestiging</td></tr><tr><td>Secundaire  Antilichamen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Ezel anti-Geit IgG (H+L)</td><td>Jackson</td><td>705-065-149</td><td>Worden gebruikt voor koppelingsbevestiging</td></tr><tr><td>Biotinyleerde Konijn anti-Geit IgG (H+L)</td><td>KPL</td><td>16-13-06</td><td>Worden gebruikt voor koppelingsbevestiging</td></tr><tr><td>Biotinyleerde Geiten anti-Muis IgG (H+L)</td><td>KPL</td><td>16-18-06</td><td>Worden gebruikt voor koppelingsbevestiging</td></tr><tr><td>Affiniteit Gezuiverd Antilichaam Biotinyleerde Geiten anti-Konijn IgG (H+L)</td><td>KPL</td><td>176-1506</td><td>Worden gebruikt voor koppelingsbevestiging</td></tr><tr><td>Verbruiksartikelen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml copolymere microcentrifugebuisjes</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td>Worden gebruikt als microcentrifugebuisjes met lage binding</td></tr><tr><td>10 &micro;l pipettentipvullingen</td><td>BioVentures</td><td>5030050C</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;l pipettentipvullingen</td><td>BioVentures</td><td>5030080C</td><td></td></tr><tr><td>1.000 &micro;l pipettentipvullingen</td><td>BioVentures</td><td>5130140C</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Verschillende leveranciers</td><td></td><td>Worden gebruikt om kralen in het donker te houden tijdens incubatie</td></tr><tr><td>Diepe putten</td><td>VWR</td><td>40002-009</td><td>Worden gebruikt voor het verdunnen van speekselmonsters</td></tr><tr><td>Multiscreen Filter Platen</td><td>Millipore</td><td>MABVN1250</td><td>Worden gebruikt voor het uitvoeren van tests</td></tr><tr><td>Oracol speekselopvangsysteem</td><td>Malvern Medical Developments Limited</td><td></td><td>Worden gebruikt voor speekselopvang</td></tr><tr><td>Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gecarboxyleerde microsferen (kralen)</td><td>Luminex Corporation</td><td>Afhankelijk van kralenstel</td><td>Antigenen worden gekoppeld aan de microsferen</td></tr><tr><td>EDC (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride)</td><td>Pierce</td><td>77149 of 22980</td><td>Worden gebruikt bij kralenactivatie</td></tr><tr><td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td><td>Pierce</td><td>24510</td><td>Worden gebruikt bij kralenactivatie</td></tr><tr><td>Steptavidin-R-fycoerytrine (1 mg/ml)</td><td>Molecular Probes</td><td>S-866</td><td>Worden gebruikt als reporter</td></tr><tr><td>MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)</td><td>Sigma</td><td>M-2933</td><td>Worden gebruikt voor koppeling</td></tr><tr><td>Tween

het ontwikkelen van een speeksel antibody multiplex immunoassay menselijke blootstelling aan environmental pathogens meet

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

De etiologie en de effecten van menselijke blootstelling aan omgevingsfactoren ziekteverwekkers zijn wereldwijd grote zorg, en dus zou de mogelijkheid om de blootstelling en infecties met behulp van kosteneffectieve, high-throughput benaderingen te beoordelen onontbeerlijk. Dit manuscript beschrijft de ontwikkeling en analyse van een korrel-gebaseerde multiplex immunoassay mogelijkheid gelijktijdig de aanwezigheid van antilichamen in menselijk speeksel meerdere pathogenen. Speeksel is bijzonder aantrekkelijk in deze toepassing omdat het invasief, goedkoper en gemakkelijker te verzamelen dan serum. Antigenen van ziekteverwekkers uit de omgeving gekoppeld waarbij gecarboxyleerde microsferen (korrels) en gebruikt om antilichamen in zeer kleine volumes menselijke speekselmonsters met een kraal gebaseerde, oplossing-fase-assay gemeten. Bolletjes werden in combinatie met antigenen van Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovirussen (G I.1 en G II.4) en hepatitis A-virus. Opdat de antigenen voldoende gekoppeld terde korrels, werd bevestigd middels koppelmiddelen soortspecifieke, dierlijke primaire invangantilichamen, gevolgd door incubatie met gebiotinyleerd anti-species secundaire detectie antilichamen en streptavidine-R-fycoerythrine reporter (SAPE). Als een controle voor het meten aspecifieke binding werd één kraal set identiek behandeld als de anderen behalve dat niet gekoppeld aan een antigeen. De antigeen gekoppelde en controle parels werden vervolgens geïncubeerd met prospectief verzamelde menselijke speekselmonsters, gemeten op een high throughput analyse gebaseerd op de principes van flowcytometrie, en de aanwezigheid van antilichamen tegen elk antigeen werd gemeten mediane fluorescentie- intensiteit eenheden (MFI) . Deze multiplex immunoassay heeft een aantal voordelen, waaronder meer gegevens met minder monster; lagere kosten en arbeid; en de mogelijkheid om de bepaling te passen aan verschillende doelen plaats. Resultaten geven aan dat de speekselklieren multiplex immunoassay kan identificeren eerdere blootstelling en infecties, wat kan worden especially nuttig in surveillance studies met grote menselijke bevolking.

Een unieke kraal set werd gebruikt als een controle om niet-specifieke binding te meten en het monster van de variabiliteit proeven. Deze bolletjes werden identiek behandeld om het antigeen gekoppeld kralen met de uitzondering dat ze niet werden geïncubeerd met elk antigeen in de koppelingsstap. MFI-waarden&gt; 500 verkregen uit de controle kralen geïncubeerd met alle speekselmonsters werden verwijderd uit verdere analyses vanwege vermoedelijke besmetting uit serum en de resterende react...

In het huidige klimaat van schaarse middelen, ontstaan er nieuwe technologieën die het onderzoekers mogelijk maken om studies goedkoper, sneller en met meer precisie uit te voeren. Hier beschrijven we de ontwikkeling van een kralen-gebaseerde speekselantilichaam multiplex immunoassay om de blootstelling van mensen aan meerdere omgevingspathogenen gelijktijdig te meten.

Het ontwikkelen van een Speeksel Antibody Multiplex Immunoassay menselijke blootstelling aan Environmental Pathogens Meet

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Het algemene doel van deze bead-gebaseerde multiplex immunoassay voor salivaire antilichamen is het identificeren van de etiologische agentia die verantwoordelijk zijn voor milieu-gerelateerde symptomatische en asymptomatische ziekten, door de IgG-antilichaamresponsen tegen meerdere pathogenen gelijktijdig te meten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de blootstellingswetenschap. Bijvoorbeeld: welke pathogenen zijn verantwoordelijk voor het veroorzaken van ziekten in specifieke populaties.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden gebruikt om snel en kosteneffectief antilichamen tegen meerdere analyten tegelijkertijd te meten met zeer kleine, eenvoudige volumes. Deze methode kan inzicht bieden in etiologische agentia en hun blootstellingsbronnen, waaronder voedsel-, water- en luchtroutes. Een officiële demonstratie van deze procedure is essentieel, omdat de resultaten onbetrouwbaar kunnen zijn als de opzet niet correct is uitgevoerd.Begin met het vortexen en soniceren van de voorraadmengsels van kralen gekoppeld aan de antigeenen van belang gedurende telkens 20 seconden om homogene kraalsuspensies te genereren. Verdun vervolgens de gekoppelde kraalvoorraden tot een eindconcentratie van 100 kralen per microliter van elke unieke kraalset in PBS, aangevuld met 1% BSA. Stel daarna ten minste zeven twee-voudige seriële verdunningen van anti-species IGG primair antilichaam op in PBS plus BSA in een 96-wells plaat met ronde bodem, volgens de aanbevelingen van de fabrikant.Bevochtig voor elke bevestigingstest van de antigeenkoppeling een aparte kolom van acht tot twaalf putjes van een 96-wells filterbodemplaat vooraf met 100 µL wasbuffer en verwijder het supernatant via vacuüm. Voeg vervolgens 50 µL van de antigeen-gekoppelde beads toe aan de vooraf bevochtigde putjes, 50 µL van het serieel verdunde antilichaam aan de rijen één tot en met zeven van de 96-wells filterplaat, en 50 µL PBS plus BSA aan rij acht als achtergrondcontrole voor het verdunde antilichaam. Gebruik een multikanalpipet om de inhoud van elk van de putjes vijf keer op en neer te mengen.Dek vervolgens de plaat af en incubeer de antilichamen met de antigen-gekoppelde beads in het donker bij kamertemperatuur op een microplaat-schudder bij 500 rpm. Aspireer na één uur het supernatant en was de wells met twee aliquots van 100 microliter wasbuffer. Vervang na de tweede wasbeurt de buffer door 50 microliters PBS plus BSA.Verdun nu het gebiotinyleerde anti-soortspecifieke IGG secundaire detectie-antilichaam tot 16 micrograms per milliliter in PBS plus BSA en voeg 50 microliters van het verdunde secundaire antilichaam toe aan elke rij. Incubeer de beads en antilichamen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker op een plaatshaker. Aspireer aan het einde van de incubatie het supernatant en was de beads met twee aliquots van 100 microliter wasbuffer.Resuspendeer de beads na de tweede wasbeurt in 50 µL PBS plus BSA en verdun de streptavidine r-phycoerythrin-reporter tot 24 µg/mL in PBS plus BSA. Voeg 50 µL van de reporter toe aan elke put en meng door te pipetteren. Incubeer de plaat 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur op de schudmachine, gevolgd door twee spoelbeurten van 100 µL met wasbuffer zoals gedemonstreerd.Resuspendeer de beads vervolgens in 100 µL PBS plus BSA en evalueer de antigen-gekoppelde beads op de analyzer. Nadat de voorraden antigen-gekoppelde beads zijn geresuspendeerd door vortexen en sonicatie gedurende 20 seconden, worden de gekoppelde bead-voorraden verdund tot een eindconcentratie van 100 beads per µL van elke unieke bead-set in PBS plus BSA. Bereid vervolgens een verdunning van 1 op 4 van speeksel op kamertemperatuur in PBS plus BSA voor in een 96-well deep well plaat.Bevocht een filterplaat vooraf met 100 µL wasbuffer en aspireer het supernatant. Voeg vervolgens 50 µL antigeen-gekoppelde beads en een gelijk volume van het verdunde speeksel toe aan 95 wells van de 96-well filterplaat voor een uiteindelijke verdunning van 1 tot 8. Voeg tegelijkertijd 50 µL antigeen-gekoppelde beads en 50 µL PBS met BSA alleen toe aan de controlewell.Incubeer de kraaltjes gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker op de microplaatenschudder bij 500 rpm. Aspireer vervolgens het supernatant en was de wells twee keer met 100 µL wasbuffer. Resuspendeer de kraaltjes na de tweede wasstap in 50 µL PBS plus BSA.Verdun de secundaire antistof en voeg 50 µL hiervan toe aan elke put. Nadat de inhoud van de putten met een multichannelpipet is gemengd, wordt de plaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker op de schudder geïncubeerd. Was de putten vervolgens twee keer met 100 µL wasbuffer en resuspendeer de beads in 50 µL verse PBS plus BSA. Verdun nu de reporter en voeg 50 µL toe aan elke put.Meng grondig met een meerkanaals pipet. Na 30 minuten bij kamertemperatuur op de schudmachine in het donker, was de wells twee keer zoals gedemonstreerd, resuspendeer de beads vervolgens in 100 microliters PBS plus BSA en evalueer de monsters op de analyzer. Om er zeker van te zijn dat de met antigeen gekoppelde beads in staat zijn om het dynamische bereik van de assay te benaderen, wordt een correcte koppeling gedefinieerd als een gemiddelde fluorescentie-intensiteit groter dan of gelijk aan 18, 000.Zoals aangetoond voor deze representatieve koppelingsbevestigingen van de antigenen in de assay voor C.jejuni en T.gondii. Op basis van het vastgestelde afkapunt varieerden de immunoprevalentiepercentages voor de monsters van ongeveer 2% voor T.gondii tot bijna 50% voor Norovirus genogroep 1.1, wat aangeeft dat de immunoprevalentie het hoogst was voor de Norovirussen, gevolgd door Hepatitis A en H.Pylori. Hoewel 32% van de monsters immuno-negatief was voor alle pathogenen in de assay, was 68% immuno-positief voor één of meer pathogenen.Zodra deze procedure onder de knie is, kan deze bij juiste uitvoering in ongeveer vier uur worden voltooid. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de beads in het donker te bewaren om fotobleking te voorkomen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals ELISA's en Western Blotting, worden gebruikt om aanvullende vragen over sensitiviteit en specificiteit te beantwoorden.Evenals de kruisreactiviteit van de antilichamen. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in de velden van de epidemiologie, blootstellingswetenschap en klinische microbiologie om de menselijke risico's van blootstelling aan het milieu te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een zeer goed begrip moeten hebben van hoe u een multiplex immunoassay ontwikkelt, analyseert en de resultaten interpreteert, waarbij antilichamen tegen meerdere pathogenen gelijktijdig worden gemeten.Vergeet niet dat het werken met lichaamsvloeistoffen en natriumazide uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure, zoals het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en het correct afvoeren van reagentia.

developing-salivary-antibody-multiplex-immunoassay-to-measure-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Met behulp van Luminex Corporation xMAP microsfeer technologie, hebben we de multiplexverzending fluorometrische immunoassay (MFIA) voor serologische tests van de verschillende proefdier. De MFIA een suspensie microarray waar antigen, weefselcontrole of immunoglobulinen covalent gekoppeld aan gekleurde polystyreen microsferen. De MFIA testmethode, evenals verschillende onderwerpen voor problemen oplossen is gericht.

Multiplexed fluorometrische Immunoassay Methodiek en problemen oplossen

This video demonstrates a bead-based multiplex immunoassay technique to simultaneously detect antibodies for multiple environmental pathogens in human saliva. Fluorescent beads were coupled to antigens from different pathogens, which were captured using antibodies in the human saliva sample. Upon labeling the antibodies using a fluorescent reporter, the beads were analyzed using flow cytometry to assess the presence of different pathogen-specific antibodies in the saliva.

A Bead-Based Multiplex Immunoassay to Identify Pathogen-Specific Antibodies in Saliva

We beschrijven een werkwijze voor het profileren speekseleiwitten met multiplex-microsfeer gebaseerde antilichaam arrays. Monoklonale antilichamen werden covalent gebonden aan fluorescerende kleurstof gecodeerd 4,5 urn polymere microsferen middels carbodiimide chemie. De gewijzigde microsferen werden afgezet in glasvezel-microwells eiwit niveaus in het speeksel te meten met behulp van fluorescentie sandwich immunoassays.

Multiplexed Fluorescent Microarray voor menselijk speeksel bij Eiwit analyse met behulp van Polymer microsferen en Glasvezel-Bundles

Dit protocol beschrijft een noninvasive techniek voor de bemonstering van ongestoord mucosal voering vloeistof uit de bovenste luchtwegen. Het kan worden gebruikt voor het uitvoeren van de kwantificering van in vivo niveaus van proteïne bemiddelaars, zoals cytokines en chemokines, bij patiënten van alle leeftijden.

Noninvasive bemonstering van Mucosal voering vloeistof voor de kwantificering van In Vivo bovenste luchtwegen immuun-bemiddelaar niveaus

Hier presenteren we een protocol om te beschrijven van de ontwikkeling en validatie van een enkel molecuul matrix digitale Analyse ELISA, waarmee de ultra gevoelige detectie van alle IFN-α subtypen in menselijke specimens.

Ontwikkeling en validatie van een Ultrasensitive enkel molecuul Array digitale Enzyme-linked Immunosorbent Assay voor menselijk Interferon-α

Dit document stelt een protocol voor het opsporen van serum specifieke immunoglobuline met een cartridge gebaseerde Chemoluminescentie-systeem van microfluidic en de evaluatie van het nut ervan in allergie diagnoses.

Toepassing van Biochip Microfluidic technologie te detecteren Serum allergeen-specifieke Immunoglobulin E (sIgE)

We presenteren een protocol voor het gebruik van een proteïne-Microarray die is geconstrueerd door het afdrukken van influenza-antigenen op nitrocellulose gecoate dia's om gelijktijdig sonde serum te gebruiken voor meervoudige antilichaam isotypes tegen meer dan 250 antigenen van verschillende virusstammen, dus het meten van de breedte van serum antilichamen over virus subtypen mogelijk te maken.

Gebruik van een influenza antigeen Microarray voor het meten van de breedte van serum antilichamen over de virus subtypen

Een stroomanalysesysteem voor op kralen gebaseerde multiplexed-assays dat een twee-reporter-uitlezing biedt, werd gebruikt voor de ontwikkeling van multiplex serologische en antilichaamneutralisatietests die tegelijkertijd neutraliserende IgG- en IgM-antilichamen voor SARS-CoV-2 kunnen meten.

Een Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG en IgM SARS-CoV-2 Neutralisatie assay voor een Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Dit artikel beschrijft een handige methode voor het gelijktijdig monitoren van dynamische veranderingen in antilichaamtiters voor twee immunoglobuline-isotypen (IgA, IgM of IgG) als gevolg van een immuunrespons op SARS-CoV-2-infectie of vaccinatie. Dit 'Multianalyte Covid-19 Immune Response Panel' maakt gebruik van drie indirecte immunoassays gebouwd op gecodeerde microsferen die worden gelezen met behulp van een flow-gebaseerde multiplexlezer met 'dual-channel' mogelijkheid.

Dynamische monitoring van seroconversie met behulp van een multianalyt immunokraaltest voor Covid-19

Een driekanaals dual-reporter fluorescentiestroomanalysesysteem werd gebruikt om een op kralen gebaseerde multiplex-immunoassay te ontwikkelen die tegelijkertijd serummonsters evalueert voor IgG en IgM die worden opgewekt tegen meerdere antigenen van verschillende Borrelia-soorten die Lyme-borreliose veroorzaken in Europa en Noord-Amerika.

Gelijktijdige detectie van verschillende antilichaamklassen in een gemultiplexte serologische test

Multiplexfluorescentie-immunoassays worden een referentie voor serologische tests. Hun toepassing wordt echter beperkt door de complexiteit en tijdrovende processen voor het koppelen van kralen en analyten. Dit rapport presenteert een semi-automatisch, reproduceerbaar multiplex-protocol voor het koppelen van microbolletjes dat vergelijkbaar is met de standaardmethode, terwijl de tijd tot resultaten aanzienlijk wordt verkort.

Een multiplex serologische test voor de detectie van antilichaamresponsen op arbovirussen

Leer een bead-based multiplex immunoassay voor speekselantilichamen om menselijke blootstelling aan meerdere omgevingspathogenen tegelijkertijd te meten. Deze methode biedt snelle, kosteneffectieve inzichten voor exposure science.

Het ontwikkelen van een Speeksel Antibody Multiplex Immunoassay menselijke blootstelling aan Environmental Pathogens Meet

Meer video's verkennen