Detectie van gemodificeerde vormen van cytosine behulp Sensitive Immunohistochemie
August 16th, 2016
Hier beschrijven we een gevoelige immunochemische methode voor het in kaart brengen van de ruimtelijke verdeling van 5mC-oxidatiederivaten op basis van het gebruik van peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen en tyramide-signaalversterking.
Het algemene doel van dit immunochemische protocol is om de ruimtelijke verdeling van gemodificeerde vormen van cytosine in verschillende weefsel- en celcontexten te evalueren op basis van het gebruik van peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen en tyramide-signaalversterking. Deze methode overwint de beperking van andere technieken die geen ruimtelijke informatie bieden die nodig is voor het begrijpen van de biologische functie van gemodificeerde vormen van cytosine. Bovendien maakt deze methode co-detectie van gemodificeerde vormen van cytosine met eiwit-lijnmarkers mogelijk en kan worden gebruikt om hun nucleaire lokalisatie te bestuderen.
Om deze procedure te beginnen, fixeer rehydrateerde weefselsecties van wild-type CD1 muis embryo's en volwassen hersenweefsel door ze 15 minuten op kamertemperatuur in ijskoud 4%PFA of 4%FA te plaatsen. Verwijder vervolgens het overtollige fixeermiddel door de secties vijf minuten bij kamertemperatuur in PBS te wassen. Bepaal vervolgens de weefselsecties door ze 30 minuten bij kamertemperatuur in een Coplin-pot gevuld met PBX te plaatsen.
Verwijder vervolgens het overtollige PBX door de secties kort in PBT te wassen. Plaats nu de gepermeabiliseerde secties gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur in 2 N HCl voor DNA-depurinatie. Breng vervolgens de secties over naar 10 millimolar Tris-HCl gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om de HCl te neutraliseren.
Alternatief, was de secties drie keer gedurende vijf minuten in PBS. Bepaal de secties in PBT gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verwijder daarna voorzichtig de vloeistof uit het gebied rond de weefselsecties.
Houd ondertussen de weefselsecties vochtig. Gebruik een hydrofobe barrièrepen om de secties te omcirkelen zonder ze aan te raken. Vervolgens bepaal de secties gedurende één uur bij kamertemperatuur in een vochtige kamer in 100 microliter blokkeringsoplossing.
Bepaal vervolgens de weefselsecties gedurende één uur bij kamertemperatuur in 100 microliter van een 1:5000 verdunning van een muis monoklonaal anti-5hmC primaire antilichaam en 1:1000 verdunning van een konijn polyklonaal anti-5caC primaire antilichaam in blokkeringsoplossing. Uitvoeren van de incubatie kan ook 's nachts worden uitgevoerd bij vier graden Celsius. Verwijder vervolgens overtollige antilichamen door de secties in een Coplin-pot gevuld met PBT drie keer vijf minuten bij kamertemperatuur te wassen.
Verwijder vervolgens overtollig PBT en omcirkel indien nodig de secties opnieuw met een hydrofobe barrièrepen, aangezien PBT detergent bevat dat de hydrofobe barrière kan verzwakken. Maak vervolgens een 1:400 verdunning van geit anti-konijn HRP-geconjugeerd antilichaam en een 1:400 verdunning van ezel anti-muis 555-geconjugeerd antilichaam in blokkeringsoplossing. Bepaal vervolgens de weefselsecties gedurende één uur bij kamertemperatuur in een vochtige kamer in 100 microliter van de secundaire antilichaammix.
Was vervolgens de weefselsecties in een Coplin-pot gevuld met PBT drie keer vijf minuten bij kamertemperatuur. Breng vervolgens de weefselsecties over naar 100 microliter tyramide bij een 1:200 verdunning in de tyramide-signaalversterkingsbuffer gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. De incubatietijd waarbij de tyramide-oplossing experimenteel moet worden geoptimaliseerd voor elke individuele batch van tyramide-signaalversterkingskit, waarbij een lineaire relatie tussen signaalintensiteit en de duur van tyramide-gebaseerde signaalversterking wordt waargenomen.
Verwijder onmiddellijk overtollig tyramide-oplossing door de slides drie keer vijf minuten in PBT te wassen. Verwijder voorzichtig overtollig PBT en bedek de secties onmiddellijk met een druppel montagemedium. Plaats voorzichtig een dekglas op de weefselsecties en verzegel het dekglas met nagellak.
Bewaar vervolgens de weefselsecties enkele uren bij vier graden Celsius voor microscopisch onderzoek. Om de verdeling van 5hmC in hersenweefselsecties te bepalen, werd de co-detectie van deze epigenetische modificatie uitgevoerd met een marker voor post-mitotische neuronen, NeuN. Immunohistochemische analyse toonde aan dat, terwijl de prominente 5hmC-kleuring samenviel met NeuN-positieve cellen, NeuN-negatieve gliacellen lagere niveaus van genomisch 5hmC bevatten.
Om de verdeling van 5caC in differentiërende neurale stamcellen te bepalen, werd costaining van deze marker uitgevoerd met een gliacellenmarker, GFAP, op de gefixeerde culturen van neurale stamcellen drie dagen na de inductie van gliacellendifferentiatie. In tegenstelling tot neurale stamcellen of volwassen astrocyten, werd een sterk 5caC-signaal in een groot deel van de cellen die GFAP tot expressie brengen waargenomen. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in ongeveer acht uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd.
Wanneer u deze procedure probeert, is het belangrijk om alle reagentia en materialen samen met uw monsters klaar te hebben. Na het volgen van deze procedure kan confocale beeldvorming worden uitgevoerd om aanvullende vragen over de nucleaire verdeling van gemodificeerde vormen van cytosine te beantwoorden. Dit kan bijdragen aan het ontcijferen van hun mogelijke biologische functie.
Vergeet niet dat het werken met 2 N HCl extreem gevaarlijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen zoals een veiligheidskast en beschermende kleding moeten altijd worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.
Overzicht
Dit artikel presenteert een gevoelige immunochemische methode voor het in kaart brengen van de ruimtelijke verdeling van 5mC-oxidatiederivaten met behulp van peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen en tyramide-signaalversterking. De methode maakt het mogelijk om gemodificeerde vormen van cytosine in verschillende weefsel- en cellulaire contexten te evalueren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Biochemie
- Celbiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van de ruimtelijke verdeling van gemodificeerd cytosine is cruciaal voor het verduidelijken van zijn biologische functies.
- Huidige technieken missen vaak ruimtelijke resolutie, wat hun effectiviteit beperkt.
- Deze methode maakt co-detectie mogelijk met eiwit-lijnmarkers.
- Het kan worden toegepast om de nucleaire lokalisatie van cytosine-modificaties te bestuderen.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het in kaart brengen van de verdeling van 5mC-oxidatiederivaten.
- Om ruimtelijke informatie te verstrekken die nodig is voor het begrijpen van de biologische rollen van deze modificaties.
- Om de studie van gemodificeerd cytosine in verschillende weefsels te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Fixatie van weefselsecties van muis-embryo's en volwassen hersenen.
- Permeabilisatie en DNA-depurinatie van weefselsecties.
- Incubatie met primaire antilichamen specifiek voor gemodificeerd cytosine.
- Gebruik van tyramide-signaalversterking voor verbeterde detectie.
Belangrijkste resultaten
- 5hmC-kleuring co-lokaliseerde met NeuN-positieve neuronen.
- Lagere niveaus van genomisch 5hmC werden gevonden in NeuN-negatieve gliacellen.
- Sterk 5caC-signalen werden waargenomen in differentiërende neurale stamcellen die GFAP tot expressie brengen.
- De methode kan in ongeveer acht uur worden voltooid.
Conclusies
- Deze immunochemische methode biedt een robuuste aanpak voor het bestuderen van cytosine-modificaties.
- Het verbetert het begrip van de biologische functies van deze modificaties in neurale contexten.
- Veiligheidsmaatregelen zijn essentieel bij het hanteren van reagentia zoals 2 N HCl.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding the spatial distribution of cytosine modifications is critical for deciphering epigenetic regulation in disease-relevant systems. This method enables co-detection with lineage markers, supporting target validation and mechanistic de-risking in neuroscience and oncology research. It provides predictive confidence by linking DNA modifications to cellular phenotypes in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by mapping 5hmC and 5caC localization in specific cell types.
- Operational Value: Enables functional target validation through co-detection with NeuN and GFAP markers.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating epigenetic marks with neuronal or glial differentiation states.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream epigenetic screening workflows.
- Quantitative Outputs: Tyramide signal amplification provides sensitive, reproducible detection of low-abundance modifications.
- Platform Reuse: Standardized protocol allows scalability across tissue types and antibody panels.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Studied in embryonic and adult brain tissues, relevant to neurodevelopmental and neurodegenerative disorders.
- Translational Continuity: Nuclear localization data supports biomarker alignment from discovery to preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Spatial resolution reduces mechanistic ambiguity in target engagement studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical biomarker assessment, enabling iterative refinement of epigenetic targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing cell-type-specific distribution of 5mC oxidation derivatives.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized fixation, permeabilization, and amplification steps.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence readouts enabling comparison of modification levels across conditions.
- Translational Research: Connects epigenetic marks to cell identity markers, supporting biomarker-driven preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to multiple tissue types and antibody combinations, promoting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking cytosine modifications to specific cellular lineages.
- Operational Value: Tyramide signal amplification ensures standardization and reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing spatial context for epigenetic target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on epigenetic activity in disease-relevant cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry and epitope retrieval techniques.
- Dependent on hydrolysis steps (2 N HCl) necessitating specialized safety equipment and training.
- Needs standardized blocking and washing protocols to minimize background signal.
- Adaptation across model systems requires validation of antibody specificity and permeabilization efficiency.
- Practical limitation: HCl treatment may affect epitope integrity for some protein targets, requiring optimization.
