Name: Detectie van gemodificeerde vormen van cytosine behulp Sensitive Immunohistochemie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Leer een gevoelige immunochemische methode om de ruimtelijke verdeling van 5mC-oxidatiederivaten in muizenhersenen te detecteren met tyramide-signaalversterking. Deze techniek maakt co-detectie met neuronale merkers mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de Advanced Microscopy Unit (School of Life Sciences, University of Nottingham) en het Histology-team van de MRC Human Reproductive Sciences Unit (Edinburgh), het Institute of Neuroscience bij de ULB en de FNRS voor hun hulp en ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door MRC (MR/L001047/1 aan A.D.J.).

Alle dieren betrokken procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Universiteit van Nottingham ethische toetsing boord. 1. selecteren van geschikte Tissue Voorbereiding voor Immunokleuring <ol><li> Genereren van in paraffine ingebedde deel van wildtype CD1 mouse embryo en volwassen hersenweefsel zoals hiervoor 25 beschreven. Gebruik hersenen met ofwel 4% formaldehyde (FA) of 4% paraformaldehyde (PFA) voor immunokleuring methode 25 vaste weefselsecties. Opmerking: Het gebruik van paraffine ingebedde weefselsecties vereist de-waxen vóór antilichaam labeling. Omdat de behandeling met 2-4 M zoutzuur (HCl) die werkzaam zijn in het protocol voor DNA denaturering is niet compatibel met de meeste antigen herstel strategieën, adviseren wij het gebruik van een van beide cryo- of microtoom secties voor co-detectie van 5MC oxidatie derivaten met eiwit markers. </li></ol> 2. ontwassen paraffine ingebedde weefselcoupes &lt;<html> / P&gt; <ol><li> In een lopende klasse II veiligheidskabinet, was de paraffine ingebedde weefselcoupes in een Coplin pot gevuld met xyleen, 2 keer voor 10 minuten elk bij RT. LET OP: Het is belangrijk om verse xyleen gebruiken als onvolledig paraffine verwijdering kan leiden tot inconsistent kleurpatronen. </li><li> Na de-harsen, snel hydrateren de weefselcoupes door wassen achtereenvolgens in 95, 75 en 50% ethanol gedurende 10 min elk bij kamertemperatuur. </li></ol> 3. Fixatie en permeabilisatie van Cryo-en Microtoom Secties <ol><li> Bevestig de gerehydrateerd weefselcoupes door ze in ofwel ijskoude 4% PFA of 4% FA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Overtollig fixatief door het wassen van de secties in PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Permeabilize de weefselcoupes door in een Coplin pot gevuld met PBX (0,5% Triton X-100 in PBS) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder overtollige PBX door het wassen van de afdelingen binnenkort in PBT (0,01% Tween 20 in PBS). </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. Immunokleuring voor Oxi-5MC Derivatives <ol><li> Plaats de gepermeabiliseerd secties in 2 N HCl gedurende 60 min bij KT depurinering van het DNA. Opmerking Hoewel hogere concentraties HCl (bijvoorbeeld, 4 N) leiden tot een efficiëntere DNA denaturering, zijn ze niet geschikt voor co-detectie van oxi-mcs met DAPI. </li><li> Plaats de secties in 10 mM Tris-HCl (pH 8,5) gedurende 30 min bij RT om het HCl te neutraliseren. Alternatief driemaal wassen secties voor 5 min elk in PBS. Incubeer de secties in PBT gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder voorzichtig de vloeistof uit de omgeving van het gedeelte weefsel zonder dat het gedeelte weefsel volledig drogen op elk stap door voorzichtig schudden van de glijbaan. Gebruik een hydrofobe barrière pen om het gedeelte omringen zonder het aan te raken. NB: De hydrofobe barrière pen vermindert het volume van antilichaam die nodig is om het weefsel vlekken en kan toestaan ​​dat meerdere secties te worden gemerkt met different antilichamen op dezelfde dia. </li><li> Incubeer secties in 100 pl blokkeeroplossing (10% runderserumalbumine in PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een vochtige kamer. LET OP: Het overslaan van deze stap zou geen invloed op de efficiëntie van het kleuren van de gemodificeerde cytosine bases. </li><li> Incubeer de weefselcoupes in 100 ui van een 1: 5000 verdunning van monoklonaal anti-5hmC en een 1: 1000 verdunning van konijnen polyklonaal anti-5caC primaire antilichamen in blokkeeroplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een vochtige kamer. Als alternatief voert de incubatie overnacht bij 4 ° C indien nodig. OPMERKING: Secties verwerkt zonder primaire antilichamen kunnen als geschikte negatieve controles dienen voor de kleuring procedure. De 12,5 dagen na coïtus muriene embryonale hersensecties verrijkt 5caC, 5fC en 5hmC 20 kan worden gebruikt als positieve controle. </li><li> Verwijder het teveel aan antilichamen door het wassen van de secties in een Coplin pot gevuld met PBT driemaal gedurende 5 minuten elk in een Coplin pot bij kamertemperatuur. OPMERKING: verhoging van wasoplossingen kunnen achtergrondkleuring te verminderen. </li><li> Verwijder overtollig PBT en, indien nodig, omringen de afdelingen opnieuw met de hydrofobe barrière pen als PBT detergent dat de hydrofobe barrière kan verzwakken bevatten. </li><li> Maak een 1: 400 verdunning van geit anti-konijn HRP geconjugeerd antilichaam en een 1: 400 verdunning van ezel-anti-muizen-555-geconjugeerd antilichaam in blokkeeroplossing. </li><li> Incubeer de weefselcoupes in 100 pi secondair antilichaam mengsel van stap 4,9 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een vochtige kamer. </li><li> Was de weefselcoupes in een Coplin pot gevuld met PBT driemaal gedurende 5 minuten elk bij kamertemperatuur. </li><li> Plaats de weefselcoupes in 100 ui van een 1: 200 verdunning van tyramide in het tyramide signaalversterking buffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Onmiddellijk verwijderen overtollige tyramide oplossing door het wassen van de dia&#39;s drie keer gedurende 5 minuten elk in PBT. </li><li> carefully verwijderen overtollige PBT en direct betrekking hebben op de secties met een daling van een Mounting Medium (zie Materials List). </li><li> Plaats voorzichtig een dekglaasje op het weefsel secties en onmiddellijk sluit de dekglaasje met nagellak. </li><li> Bewaar de weefselcoupes bij 4 ° C gedurende enkele uren vóór microscopisch onderzoek. Onderzoek onder een fluorescentiemicroscoop bij 405, 488 en / of 555 nm (10 - 40x vergroting). </li></ol>

<ol><li>Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+patterns+and+epigenetic+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">DNA methylation patterns and epigenetic memory.</a> Genes Dev. 16, 6-21 (2002).</li>
<li>Reik, W., Dean, W., Walter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+in+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming in mammalian development.</a> Science. 293, 1089-1093 (2001).</li>
<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat Genet. 33, 245-254 (2003).</li>
<li>Li, E., Bestor, T. H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutation+of+the+DNA+methyltransferase+gene+results+in+embryonic+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality.</a> Cell. 69 (6), 915-926 (1992).</li>
<li>Okano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methyltransferases+Dnmt3a+and+Dnmt3b+are+essential+for+de+novo+methylation+and+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development.</a> Cell. 99 (3), 247-257 (1999).</li>
<li>Cedar, H., Bergman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+of+DNA+methylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Programming of DNA methylation patterns.</a> Annu Rev Biochem. 81, 97-117 (2012).</li>
<li>Amir, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rett+syndrome+is+caused+by+mutations+in+X-linked+MECP2%2C+encoding+methyl-CpG-binding+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2.</a> Nat Genet. 23, 185-188 (1999).</li>
<li>Chouliaras, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consistent+decrease+in+global+DNA+methylation+and+hydroxymethylation+in+the+hippocampus+of+Alzheimer%27s+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Consistent decrease in global DNA methylation and hydroxymethylation in the hippocampus of Alzheimer's disease patients.</a> Neurobiol Aging. 34, 2091-2099 (2013).</li>
<li>Jowaed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+regulates+alpha-synuclein+expression+and+is+decreased+in+Parkinson%27s+disease+patients%27+brains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains.</a> J Neurosci. 30, 6355-6359 (2010).</li>
<li>Reik, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+at+onset+in+Huntington%27s+disease+and+methylation+at+D4S95%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Age at onset in Huntington's disease and methylation at D4S95.</a> J Med Genet. 30, 185-188 (1993).</li>
<li>Landgrave-Gòmez, J., Mercado-Gòmez, O., Guevara-Guzmán, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+mechanisms+in+neurological+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases.</a> Front Cell Neurosci. 27, 9-58 (2015).</li>
<li>Seisenberger, S., Peat, J. R., Hore, T. A., Santos, F., Dean, W., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+DNA+methylation+in+the+mammalian+life+cycle%3A+building+and+breaking+epigenetic+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Reprogramming DNA methylation in the mammalian life cycle: building and breaking epigenetic barriers.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 368 (1609), (2013).</li>
<li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+Tet+protein-mediated+5-+methylcytosine+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5- methylcytosine oxidation.</a> Genes Dev. 25, 2436-2452 (2011).</li>
<li>Oswald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+demethylation+of+the+paternal+genome+in+the+mouse+zygote%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote.</a> Curr Biol. 10 (8), 475-478 (2000).</li>
<li>Ooi, S. K., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+colorful+history+of+active+DNA+demethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The colorful history of active DNA demethylation.</a> Cell. 133 (7), 1145-1148 (2008).</li>
<li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324, 929-930 (2009).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+proteins+can+convert+5-methylcytosine+to+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine.</a> Science. 333, 1300-1303 (2011).</li>
<li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333, 1303-1307 (2011).</li>
<li>Wheldon, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+accumulation+of+5-carboxylcytosine+indicates+involvement+of+active+demethylation+in+lineage+specification+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transient accumulation of 5-carboxylcytosine indicates involvement of active demethylation in lineage specification of neural stem cells.</a> Cell Rep. 7, 1353-1361 (2014).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base-resolution+analysis+of+5-hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome.</a> Cell. 149, 1368-1380 (2012).</li>
<li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modification+assisted+bisulfite+sequencing+%28CAB-Seq%29+for+5-carboxylcytosine+detection+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Chemical modification assisted bisulfite sequencing (CAB-Seq) for 5-carboxylcytosine detection in DNA.</a> J Am Chem Soc. 26, 9315-9317 (2013).</li>
<li>Globisch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine+and+search+for+active+demethylation+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates.</a> PLoS One. 5, e15367(2010).</li>
<li>Szwagierczak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+enzymatic+quantifi+cation+of+5-+hydroxymethylcytosine+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Sensitive enzymatic quantifi cation of 5- hydroxymethylcytosine in genomic DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38, e181(2010).</li>
<li>Ruzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-specific+distribution+of+high+levels+of+genomic+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Lineage-specific distribution of high levels of genomic 5-hydroxymethylcytosine in mammalian development.</a> Cell Res. 21, 1332-1334 (2011).</li>
<li>Almeida, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-quantitative+immunohistochemical+detection+of+5-hydroxymethyl-cytosine+reveals+conservation+of+its+tissue+distribution+between+amphibians+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Semi-quantitative immunohistochemical detection of 5-hydroxymethyl-cytosine reveals conservation of its tissue distribution between amphibians and mammals.</a> Epigenetics. 7, 137-140 (2012).</li>
<li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341, 1237905(2013).</li>
<li>Santos, F., Dean, W. Chapter 11, Using immunofluorescence to observe methylation changes in mammalian preimplantation embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSantos%2C+F+%22Nuclear+reprogramming+methods+and+Protocols%22">Nuclear reprogramming methods and Protocols</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. 129-138 (2006).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+5-carboxycytosine+recognition+by+RNA+polymerase+II+elongation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex.</a> Nature. 523, 621-625 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Hoewel de gerapporteerde geringe hoeveelheden 5MC oxidatie derivaten 5fC en 5caC in sommige weefsels belangrijke beperkingen zou doen voor een standaard immunochemische protocol, de opname van peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen kon de detectie van deze cytosine wijzigingen gefixeerde weefsels en cellen (figuur 2) . Echter, de optimale incubatietijd met tyramide oplossing experimenteel worden geoptimaliseerd voor elke afzonderlijke partij tyramide signaalamplificatie kit waarin een lineaire relatie tussen de signaalintensiteit en duur van tyramide gebaseerde signaalversterking waargenomen, zie voor details Almeida et al. 2012 26 . Bovendien kan de signaal / achtergrond verhouding significant verbeterd door het uitvoeren van de wassen in een Coplin jar om efficiënte verwijdering van overmaat antilichamen mogelijk. Na incubatie met tyramide oplossing, is het belangrijk de reactie door wassen in PBT oplossing voor d onmiddellijk stoppenaling achtergrond kleuring. Het is essentieel niet om de secties drogen op enig moment tijdens de procedure. De efficiëntie van DNA depurinering kan worden verbeterd door het uitvoeren van de depurinering reactie bij 37 ° C. Tijdens het gebruik van 4N HCl in plaats van 2 N verbetert de kleuring van de gemodificeerde vormen van 5MC gebruik 4 N HCl DNA depurinering zou niet toestaan ​​co-kleuring met DAPI, omdat deze uitsluitend samenwerkt met dubbelstrengs DNA. Hoewel deze techniek robuuste semi-kwantitatieve evaluatie van de gemodificeerde vormen van cytosine basen wanneer detecteerbaar kunnen verschaffen, kan het niet worden gebruikt voor het evalueren van de absolute niveaus van 5MC of zijn oxidatie derivaten. Daarom raden wij het ​​gebruik van andere aanvullende maar kwantitatieve benaderingen 16, 19 -24. Sinds de ontdekking van 5MC oxidatie derivaten zoogdieren genomen, zijn verschillende methoden ontwikkeld om de biologische rol 16, 19-24 bestuderen. Hoewel deze approaches kan waardevol zijn bij het ​​bepalen van de absolute niveaus van 5MC oxidatie derivaten zijn, hebben ze geen informatie te verstrekken over hun ruimtelijke verdeling 20, 26. We hebben met succes gebruik gemaakt van de hier beschreven methode om de ruimtelijke verdeling en lokalisatie van 5MC oxidatie derivaten in verschillende celtypen in kaart van de zich ontwikkelende en volwassen hersenen 20 Door de onthulling van hun ruimtelijke verdeling 20 Deze techniek kan cruciaal zijn voor het begrijpen van de biologische gevolgen en het lot van geoxideerde derivaten van 5MC in verschillende biologische contexten waarin deze gemodificeerde derivaten van 5MC kan worden gedetecteerd zoals cellulaire differentiatie, ontwikkeling en ziekte. Bovendien kan de methode hier beschreven semi-kwantitatieve evaluatie van de geoxideerde derivaten van 5MC in verschillende weefsels geven door het bepalen van de kinetiek van peroxidase reactie (die evenredig is met de kleurintensiteit) op verschillende incubatietijden met tyramide 26.

Methylatie van cytosine basen in DNA (5MC) vormt een belangrijke epigenetische merk gevonden in gewervelde dieren genomen in verband met transcriptie silencing 1. 5MC wordt geïntroduceerd en beheerd door DNA-methyltransferase 2-5, en is aangetoond dat het een belangrijke rol spelen bij een aantal biologische processen, waaronder genomische imprinting, X-chromosoom inactivatie, cellulaire differentiatie en ontwikkeling 3, 6. Bijgevolg verstoring van 5MC genomische patronen wordt geassocieerd met een aantal ziekten 7, 8-11. Ondanks de vooruitgang in het begrijpen 5MC rol bij ontwikkeling en ziekte, is het nog altijd grotendeels onbekend hoe deze markering wordt verwijderd ontwikkelen en volwassen weefsels. Verschillende mogelijke mechanismen van DNA demethylering onlangs voorgesteld de actieve en passieve mechanismen demethylering 12, 13, 14, 15. Ontdekking van de producten van de sequentiële oxidatie 5MC gemedieerd door 10-11 translocatie enzymes (tet1 / 2/3), zoals 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) en 5-carboxylcytosine (5caC) in eukaryotische DNA 16, 17, 18, ​​19 gevraagd speculaties of zij als tussenproducten kunnen dienen DNA demethylering processen of fungeren als stabiel epigenetische merken in hun eigen recht 13. Terwijl de demonstratie dat het onderdeel van de base excisie reparatie, thymine-DNA glycosylase (TDG) kan binden en verwijder beide 5fC en 5caC uit DNA 19, 20 suggereert een rol voor de gewijzigde 5MC derivaten in een actieve DNA demethylering. Recent bewijs dat 5fC / 5caC de snelheid van RNA II processivity punten kunnen moduleren op mogelijke betrokkenheid van deze merken in gentranscriptieregulatie 29. Vanwege deze potentiële biologische belang van geoxideerde vormen van 5MC hebben verschillende biochemische en antilichaam-gebaseerde technieken toegepast voor het bestuderen van hun genomische distributie en wereldwijde content 16, 19-24. Aangezien de meeste tHij vertebrate organen bestaan ​​uit verschillende celtypes en dat de verdeling van gemodificeerde basen cytosine is weefsel en celtype-specifieke 16-18, 20, 23, 25-27, het bepalen van de ruimtelijke verdeling van geoxideerde 5MC derivaten in verschillende weefsels wordt een belangrijke experimentele taak die nodig zijn voor het onthullen van hun biologische functies. De meeste biochemische en antilichaam-gebaseerde benaderingen geven geen ruimtelijke informatie over de verdeling van de gemodificeerde vormen van 5MC in verschillende weefsels en celtypen. Daarentegen kan immunochemie gebaseerde technieken een snelle beoordeling mogelijk maakt de ruimtelijke verdeling en nucleaire lokalisatie van 5MC 28 en geoxideerde derivaten 20 te verschaffen. Dat wordt gezegd, de gerapporteerde zeer lage overvloed aan 5fC (20 op de 10 6 cytosine) en 5caC (3 op de 10 6 cytosine) in de muis genoom 18 is een belangrijke uitdaging voor de standaard immunochemische. Hier,We beschrijven een zeer gevoelige methode die immunochemische robuust en levert een snelle detectie van geoxideerde vorm van cytosine in zoogdieren hersenweefsel. Door de integratie peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen gekoppeld aan een signaal amplificatiestap, deze methode omzeilt de problemen van het detecteren van de zeer kleine hoeveelheden in 5fC en 5caC. Daarnaast kan deze techniek gebruikt worden om samen detecteren gemodificeerde vormen van cytosine met lijnspecifieke markers, effectief aanvulling op andere benaderingen in het ophelderen van de biologische functies van deze epigenetische markeringen.

<table><tbody><tr><td>Coplin potje</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-48585-30</td><td>Van glas gemaakt</td></tr><tr><td>XYleen</td><td></td><td></td><td>Alleen gebruiken in Klasse II veiligheidskast</td></tr><tr><td>Fosfaat bufferoplossing met zout (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12821680</td><td>pH 7.5, gefilterd voor gebruik</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Eenmaal gemaakt kan het worden bewaard bij -20 °C in aliquoten voor meerdere maanden</td></tr><tr><td>4% formaldehyde&nbsp; (FA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td>Eenmaal gemaakt kan het worden bewaard bij -20 °C in aliquoten voor meerdere maanden</td></tr><tr><td>Ethanol, watervrij gedenatureerd, histologisch kwaliteit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64-17-5</td><td>95, 75, 50% in PBS</td></tr><tr><td>0.01% Tween 20 in PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>PBT</td></tr><tr><td>0.5% Triton X-100 in PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>PBX</td></tr><tr><td>2 N HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71826</td><td>Voorzichtig, extreem toxisch</td></tr><tr><td>100 mM Tris-HCl&nbsp;</td><td>Promega</td><td>H5121</td><td>pH aangepast naar 8.5</td></tr><tr><td>Hydrofobe barrière pen</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td>voor immunohistologie</td></tr><tr><td>Glijvochtkamer</td><td>Scientific Device Laboratory</td><td>197-BL</td><td></td></tr><tr><td>Anti-5mC muis antilichaam</td><td>Diagenode</td><td>C15200081</td><td>monoklonaal primair antilichaam</td></tr><tr><td>Anti-5hmC antilichaam</td><td>Active Motif</td><td>39791</td><td>konijn polyklonaal primair antilichaam</td></tr><tr><td>Anti-5caC antilichaam</td><td>Active Motif</td><td>61225</td><td>konijn polyklonaal primair antilichaam</td></tr><tr><td>Peroxidase-geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaam</td><td>Dako</td><td>K1497</td><td></td></tr><tr><td>555-geconjugeerd geiten anti-muis antilichaam</td><td>Molecular probes</td><td>A-11005</td><td>secundair antilichaam</td></tr><tr><td>10% BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td>Blokkingsoplossing</td></tr><tr><td>22 x 32 mm glazen dekglasjes</td><td>BDH</td><td>406/0188/24</td><td></td></tr><tr><td>Tyramide Signaalversterkingssysteem</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL741001KT</td><td>Andere met fluorochroom geconjugeerde secundaire antilichamen kunnen worden gebruikt voor co-detectie van oxi-5mC&nbsp;</td></tr><tr><td>Montagemedium met DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Kleurloze nagellak</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kippen polyklonaal anti-GFAP polyklonaal antilichaam</td><td>Thermo Scientific</td><td>PA5-18598</td><td>1:400 verdunning</td></tr><tr><td>Anti-NeuN muis monoklonaal antilichaam</td><td>Merck milipore</td><td>MAB377B</td><td>1:400 verdunning</td></tr></tbody></table>

detectie van gemodificeerde vormen van cytosine behulp sensitive immunohistochemie

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylatie van cytosinebasen (5-methylcytosine, 5mC) die voorkomt in vertebratengenomen wordt meestal geassocieerd met transcriptionele silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) en 5-carboxylcytosine (5caC) zijn de recent ontdekte gemodificeerde cytosinebasen die geproduceerd worden door enzymatische oxidatie van 5mC, waarvan de biologische functies relatief onduidelijk blijven. Er zijn een aantal benaderingen, variërend van biochemische tot op antilichamen gebaseerde technieken, gebruikt om de genomische verdeling en globale inhoud van deze modificaties in verschillende biologische systemen te bestuderen. Hoewel sommige van deze benaderingen nuttig kunnen zijn voor kwantitatieve beoordeling van deze gemodificeerde vormen van 5mC, bieden de meeste van deze methoden geen ruimtelijke informatie over de verdeling van deze DNA-modificaties in verschillende celtypen, wat nodig is voor een correct begrip van hun functionele rollen. Hier presenteren we een zeer gevoelige methode voor immunochemische detectie van de gemodificeerde vormen van cytosine. Deze methode maakt co-detectie van deze epigenetische markeringen met eiwitlijnmarkers mogelijk en kan worden gebruikt om hun nucleaire lokalisatie te bestuderen, en draagt zo bij aan het ontcijferen van hun potentiële biologische rollen in verschillende experimentele contexten.

De verdeling van 5hmC in hersenweefsel secties bepalen, voerden wij co-detectie van deze epigenetische modificatie met een marker voor post-mitotische neuronen, NeuN, gebruik commerciële anti-5hmC antilichaam dat specifiek interageert met dit merkteken maar niet met andere vormen van gemodificeerd cytosine 20, 25. Immunohistochemische analyse van 5hmC en 5caC verdelingen in de volwassen hersenen bleek dat dat de prominente 5hmC kleuring co-lokaliseert met NeuN positieve cellen, NeuN-negatieve gliacellen bezitten lagere genomisch 5hmC (figuur 1) 20. We hebben onlangs bleek dat Tet-afhankelijke 5MC oxidatie werkzaam is tijdens lineage specificatie van neurale stamcellen (NSCs) 20. Ondanks het feit dat immunochemisch niet op te sporen in NSCs, 5fC en 5caC vertonen prominent immunokleuring in een vroeg stadium van NSCs differentiatie in de richting van een neuronale<html> nd gliale lijnen. Beide merken voorbijgaand accumuleren gelijktijdig met het uiterlijk van de markers van de vroege neuronale en gliacellen differentiatie 20. De verdeling van 5caC te differentiëren NSCs voerden wij co-kleuring van het teken met een gliale marker GFAP op het vaste kweken van NSC op 3 dagen na inductie van gliale differentiatie bepalen. In tegenstelling tot NSCs of rijpe astrocyten (gegevens niet getoond) observeerden we sterk 5caC signaal relatief groot gedeelte van de cellen die GFAP in deze kweken (figuur 2) 20. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54416/54416fig1.jpg" /> Figuur 1. Co-immunokleuring van 5hmC (groen) met Neun (rood) in de Adult Brain Tissue tegengekleurd met DAPI (blauw). Individuele kanalen en de samengevoegde weergave worden getoond. Schaal bars zijn 25 urn.blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54416/54416fig2.jpg" /> Figuur 2. Co-immunokleuring van 5caC met GFAP in de cultuur van NSC op dag 3 van Glial Differentiatie. Individuele kanalen en de samengevoegde weergave worden getoond. Schaal bars zijn 20 urn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54416/54416fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Hier beschrijven we een gevoelige immunochemische methode voor het in kaart brengen van de ruimtelijke verdeling van 5mC-oxidatiederivaten op basis van het gebruik van peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen en tyramide-signaalversterking.

Detectie van gemodificeerde vormen van cytosine behulp Sensitive Immunohistochemie

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Het algemene doel van dit immunochemische protocol is het evalueren van de ruimtelijke distributie van gemodificeerde vormen van cytosine in verschillende weefsel- en cellulaire contexten, gebaseerd op het gebruik van peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen en tyramide-signaalversterking. Deze methode overwint de beperking van andere technieken die geen ruimtelijke informatie bieden die noodzakelijk is voor het begrijpen van de biologische functie van gemodificeerde vormen van cytosine. Daarnaast maakt deze methode de co-detectie van gemodificeerde vormen van cytosine met eiwitlijnage-markers mogelijk en kan deze worden ingezet om hun nucleaire lokalisatie te bestuderen.Om deze procedure te starten, worden gerehydrateerde weefselcoupes van wild-type CD1-muisembryo's en adult hersenweefsel gefixeerd door ze gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur instueel in ijskoud 4% PFA of 4% FA te plaatsen. Verwijder vervolgens het overtollige fixatief door de coupes gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur te wassen in PBS. Permeabiliseer daarna de weefselcoupes door ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een Coplin-pot gevuld met PBX te plaatsen.Verwijder vervolgens het overtollige PBX door de coupes kort te wassen in PBT. Plaats de permeabiliseerde coupes nu gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur in 2 N HCl voor DNA-depurinatie. Verplaats de coupes vervolgens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur naar 10 millimolair Tris-Hcl om het HCl te neutraliseren.Als alternatief kunnen de coupes drie keer gedurende vijf minuten worden gewassen in PBS. Incubeer de coupes gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur in PBT. Verwijder daarna voorzichtig de vloeistof uit het gebied rondom de weefselcoupes.Houd de weefselsneden in de tussentijd vochtig. Gebruik een hydrofobe barrièrepen om de sneden te omcirkelen zonder ze aan te raken. Incubeer de sneden vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur in een vochtige kamer in 100 µL blokkeringsoplossing.Incubeer vervolgens de weefselcoupes gedurende één uur bij kamertemperatuur in 100 µL van een 1:5000 verdunning van een muis monoklonaal anti-5hmC primair antilichaam en een 1:1000 verdunning van een konijn polyklonaal anti-5caC primair antilichaam in blokkeringsoplossing. Als alternatief kan de incubatie overnacht bij 4 °C worden uitgevoerd. Verwijder daarna het overtollige antilichamen door de coupes drie keer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur te wassen in een Coplin-pot gevuld met PBT.Verwijder vervolgens het overtollige PBT en omring de coupes, indien nodig, opnieuw met een hydrofobe barrièrepen, aangezien PBT detergent bevat dat de hydrofobe barrière kan verzwakken. Maak daarna een 1:400 verdunning van geiten anti-konijn HRP-geconjugeerd antilichaam en een 1:400 verdunning van ezel anti-muis 555-geconjugeerd antilichaam in blokkeringsoplossing. Incubeer de weefselcoupes vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur in een bevochtigingskamer in 100 microliters van het mengsel van secundaire antilichamen.Was daarna de weefselsneden drie keer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur in een Coplin-pot gevuld met PBT. Breng de weefselsneden vervolgens gedurende twee minuten bij kamertemperatuur over naar 100 microliters tyramide bij een verdunning van 1:200 in de tyramide-signaalversterkingsbuffer. De incubatietijd van de tyramide-oplossing moet experimenteel worden geoptimaliseerd voor elke afzonderlijke batch van de tyramide-signaalversterkingskit, waarbij een lineair verband tussen de signaalintensiteit en de duur van de tyramide-gebaseerde signaalversterking wordt waargenomen.Verwijder direct daarna het overtollige tyramide-oplossing door de coupes drie keer gedurende vijf minuten te wassen in PBT. Verwijder voorzichtig het overtollige PBT en bedek de coupes onmiddellijk met een druppel monteermiddel. Plaats voorzichtig een dekglas op de weefselcoupes en kit het dekglas af met nagellak.Bewaar de weefselcoupes vervolgens gedurende enkele uren bij vier graden Celsius vóór microscopisch onderzoek. Om de distributie van 5hmC in hersenweefselcoupes te bepalen, werd de co-detectie van deze epigenetische modificatie uitgevoerd met een marker voor post-mitotische neuronen, NeuN. Immunohistochemische analyse toonde aan dat hoewel de prominente 5hmC-kleuring colocaliseerde met NeuN-positieve cellen, NeuN-negatieve gliacellen lagere niveaus van genomische 5hmC vertoonden.Om de distributie van 5caC in differentiërende neurale stamcellen te bepalen, werd een co-kleuring van deze marker uitgevoerd met een gliale marker, GFAP, op de gefixeerde culturen van neurale stamcellen drie dagen na de inductie van gliale differentiatie. In tegenstelling tot in neurale stamcellen of mature astrocyten, werd een sterk 5caC-signaal waargenomen in een groot deel van de cellen die GFAP tot expressie brachten. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in ongeveer acht uur worden voltooid indien correct uitgevoerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat alle reagentia en materialen samen met uw monsters klaarstaan. Na deze procedure kan confocale beeldvorming worden uitgevoerd om aanvullende vragen over de nucleaire distributie van gemodificeerde vormen van cytosine te beantwoorden. Dit kan bijdragen aan het ontcijferen van hun potentiële biologische functie.Vergeet niet dat werken met 2 N Hcl uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het gebruik van een veiligheidskast en beschermende kleding, tijdens het uitvoeren van deze procedure.

detection-modified-forms-cytosine-using-sensitive

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De EpiMark 5-HMC en 5-mC Analysis Kit kan gebruikt worden om te analyseren en te kwantificeren 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine binnen een spe cifieke locus. De kit onderscheidt vijf-mC van 5-HMC door de toevoeging van glucose aan de hydroxylgroep van 5-HMC via een enzymatische reactie gebruik te maken van β-glucosyltransferase (T4-BGT). Bij het 5-HMC vindt plaats in het kader van CCGG, deze wijziging zet een splitsbare MspI site om een ​​niet-splitsbare site.

Hoge gevoeligheid 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb / C hersenweefsel

Beschreven is een twee stappen proces labeling met β-glucosyltransferase (β-GT) een azide-glucose dragen aan 5-HMC, gevolgd door een klik chemie biotine linker gemakkelijk en dichtheid onafhankelijk verrijking brengen. Deze efficiënte en specifieke etiketteringsvoorschriften methode maakt het mogelijk verrijking van 5-HMC met extreem lage achtergrond en high-throughput epigenomisch mapping vinden plaats via next-generation sequencing.

Selectieve vangen van 5-hydroxymethylcytosine van genomisch DNA

This video presents the protocol for signal detection during RNA chromogenic in situ hybridization. This technique can be used to diagnose an active oncogenic infection visually in an intact tissue specimen.

RNA CISH Signal Detection: A Technique to Detect Chromogenic Signals During RNA In Situ Hybridization in Intact Tissue Specimens

This video describes the technique of dot-blot to determine the level of DNA methylation in human chondrocytes in vitro via the blotting of DNA samples on a nylon membrane and the subsequent visualization using monoclonal antibodies. This helps to determine the chondrocytes' phenotype at various stages in culture.

5-Methylcytosine Dot Blot to Determine the Extent of DNA Methylation

Dit protocol beschrijft qPCR-detectie van cytomegalovirus in formaline-gefixeerd, in paraffine ingebed biopsieweefsel, wat snel, gevoelig, specifiek is en nuttig voor het interpreteren van twijfelachtige hematoxyline en eosine of immunohistochemische kleuringspatronen.

qPCR is een gevoelige en snelle methode voor de detectie van Cytomegaloviral DNA in formaline gefixeerde, paraffine-ingebedde biopsieweefsel

Hier presenteren we een protocol gebaseerd op immunohistochemische detectie van het c-FOS-eiwit, een klassieke techniek die wordt gebruikt voor de identificatie van neuronale populaties die betrokken zijn bij specifieke fysiologische reacties in vivo en ex vivo.

De c-FOS Protein Immunohistologische Detection: Een handig hulpmiddel als een marker van Central Pathways betrokken bij specifieke fysiologische reacties<em&gt; In Vivo</em&gt; en<em&gt; Ex Vivo</em

Onlangs ontdekte geoxideerde vormen van 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) en 5-carboxylcytosine (5caC) kan verschillende DNA wijzigingen met unieke functionele rollen. Hier wordt een semi-kwantitatieve workflow voor visualisatie van oxi-mCs ruimtelijke verdeling, signaal intensiteit profilering en colocalization omschreven.

Immunokleuring voor DNA wijzigingen: computationele analyse van Confocal beelden

Het doel van dit verslag is om te beschrijven van het protocol voor robuuste immunohistochemische detectie van epigenetische markers, 5-methylcytosine (5mC) en 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) bij de ontwikkeling en postmitotic muis netvlies.

Immunohistochemische detectie van 5-Methylcytosine en 5-Hydroxymethylcytosine bij de ontwikkeling en Postmitotic muis Retina

Hier presenteren we een protocol voor het opsporen van 5-hydroxymethylcytosine in cellen en hersenweefsels, met behulp van immunofluorescentie kleuring en DNA dot-Blot-methoden.

De detectie van 5-Hydroxymethylcytosine in neurale stamcellen en hersenen van muizen

Het huidige protocol belicht een gemodificeerde methode voor het detecteren en kwantificeren van DNA-eiwit crosslinks (DPC's) en hun posttranslationele modificaties (PTM's), waaronder ubiquitylering, SUMOylation en ADP-ribosylatie geïnduceerd door topoisomeraseremmers en door formaldehyde, waardoor de vorming en reparatie van DPC's en hun PTM's kan worden bestudeerd.

Kwantitatieve detectie van DNA-eiwit crosslinks en hun posttranslationele modificaties

Het protocol beschrijft een tandem-immunofluorescentiehybridisatietest met in formaline gefixeerd in paraffine ingebed weefsel om microRNA en gemultiplexte eiwitten tegelijkertijd te detecteren en te kwantificeren.

MicroRNA-amplificatie en -herkenning door middel van locked-nucleic-acid in situ hybridisatie als een nieuwe detectie- en kwantificeringsmethode

Leer een gevoelige immunochemische methode om de ruimtelijke verdeling van 5mC-oxidatiederivaten in muizenhersenen te detecteren met tyramide-signaalversterking. Deze techniek maakt co-detectie met neuronale merkers mogelijk.

Detectie van gemodificeerde vormen van cytosine behulp Sensitive Immunohistochemie

Meer video's verkennen