Detectie van gemodificeerde vormen van cytosine behulp Sensitive Immunohistochemie

Het algemene doel van dit immunochemische protocol is het evalueren van de ruimtelijke distributie van gemodificeerde vormen van cytosine in verschillende weefsel- en cellulaire contexten, gebaseerd op het gebruik van peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen en tyramide-signaalversterking. Deze methode overwint de beperking van andere technieken die geen ruimtelijke informatie bieden die noodzakelijk is voor het begrijpen van de biologische functie van gemodificeerde vormen van cytosine. Daarnaast maakt deze methode de co-detectie van gemodificeerde vormen van cytosine met eiwitlijnage-markers mogelijk en kan deze worden ingezet om hun nucleaire lokalisatie te bestuderen.

Om deze procedure te starten, worden gerehydrateerde weefselcoupes van wild-type CD1-muisembryo's en adult hersenweefsel gefixeerd door ze gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur instueel in ijskoud 4% PFA of 4% FA te plaatsen. Verwijder vervolgens het overtollige fixatief door de coupes gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur te wassen in PBS. Permeabiliseer daarna de weefselcoupes door ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een Coplin-pot gevuld met PBX te plaatsen.

Verwijder vervolgens het overtollige PBX door de coupes kort te wassen in PBT. Plaats de permeabiliseerde coupes nu gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur in 2 N HCl voor DNA-depurinatie. Verplaats de coupes vervolgens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur naar 10 millimolair Tris-Hcl om het HCl te neutraliseren.

Als alternatief kunnen de coupes drie keer gedurende vijf minuten worden gewassen in PBS. Incubeer de coupes gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur in PBT. Verwijder daarna voorzichtig de vloeistof uit het gebied rondom de weefselcoupes.

Houd de weefselsneden in de tussentijd vochtig. Gebruik een hydrofobe barrièrepen om de sneden te omcirkelen zonder ze aan te raken. Incubeer de sneden vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur in een vochtige kamer in 100 µL blokkeringsoplossing.

Incubeer vervolgens de weefselcoupes gedurende één uur bij kamertemperatuur in 100 µL van een 1:5000 verdunning van een muis monoklonaal anti-5hmC primair antilichaam en een 1:1000 verdunning van een konijn polyklonaal anti-5caC primair antilichaam in blokkeringsoplossing. Als alternatief kan de incubatie overnacht bij 4 °C worden uitgevoerd. Verwijder daarna het overtollige antilichamen door de coupes drie keer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur te wassen in een Coplin-pot gevuld met PBT.

Verwijder vervolgens het overtollige PBT en omring de coupes, indien nodig, opnieuw met een hydrofobe barrièrepen, aangezien PBT detergent bevat dat de hydrofobe barrière kan verzwakken. Maak daarna een 1:400 verdunning van geiten anti-konijn HRP-geconjugeerd antilichaam en een 1:400 verdunning van ezel anti-muis 555-geconjugeerd antilichaam in blokkeringsoplossing. Incubeer de weefselcoupes vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur in een bevochtigingskamer in 100 microliters van het mengsel van secundaire antilichamen.

Was daarna de weefselsneden drie keer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur in een Coplin-pot gevuld met PBT. Breng de weefselsneden vervolgens gedurende twee minuten bij kamertemperatuur over naar 100 microliters tyramide bij een verdunning van 1:200 in de tyramide-signaalversterkingsbuffer. De incubatietijd van de tyramide-oplossing moet experimenteel worden geoptimaliseerd voor elke afzonderlijke batch van de tyramide-signaalversterkingskit, waarbij een lineair verband tussen de signaalintensiteit en de duur van de tyramide-gebaseerde signaalversterking wordt waargenomen.

Verwijder direct daarna het overtollige tyramide-oplossing door de coupes drie keer gedurende vijf minuten te wassen in PBT. Verwijder voorzichtig het overtollige PBT en bedek de coupes onmiddellijk met een druppel monteermiddel. Plaats voorzichtig een dekglas op de weefselcoupes en kit het dekglas af met nagellak.

Bewaar de weefselcoupes vervolgens gedurende enkele uren bij vier graden Celsius vóór microscopisch onderzoek. Om de distributie van 5hmC in hersenweefselcoupes te bepalen, werd de co-detectie van deze epigenetische modificatie uitgevoerd met een marker voor post-mitotische neuronen, NeuN. Immunohistochemische analyse toonde aan dat hoewel de prominente 5hmC-kleuring colocaliseerde met NeuN-positieve cellen, NeuN-negatieve gliacellen lagere niveaus van genomische 5hmC vertoonden.

Om de distributie van 5caC in differentiërende neurale stamcellen te bepalen, werd een co-kleuring van deze marker uitgevoerd met een gliale marker, GFAP, op de gefixeerde culturen van neurale stamcellen drie dagen na de inductie van gliale differentiatie. In tegenstelling tot in neurale stamcellen of mature astrocyten, werd een sterk 5caC-signaal waargenomen in een groot deel van de cellen die GFAP tot expressie brachten. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in ongeveer acht uur worden voltooid indien correct uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat alle reagentia en materialen samen met uw monsters klaarstaan. Na deze procedure kan confocale beeldvorming worden uitgevoerd om aanvullende vragen over de nucleaire distributie van gemodificeerde vormen van cytosine te beantwoorden. Dit kan bijdragen aan het ontcijferen van hun potentiële biologische functie.

Vergeet niet dat werken met 2 N Hcl uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het gebruik van een veiligheidskast en beschermende kleding, tijdens het uitvoeren van deze procedure.