Soorten Bepaling en kwantificering in mengsels met behulp van MRM Massaspectrometrie van peptiden Applied to Meat Authentication

Het algemene doel van deze methode is om meervoudige reactiebewaking massaspectrometrie te gebruiken om de soorten in rauwe vleesmengsels te identificeren en te kwantificeren voor gebruik als een hulpmiddel voor de detectie van voedselfraude. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van voedselintegriteit, zoals het bevestigen van de soorten die aanwezig zijn in producten zoals worst of hamburgers. Onze aanpak is gebaseerd op massaspectrometrie van de eiwitcomponent.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een snel en kwantitatief resultaat kan geven. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we merkten dat de eiwitten die bekend staan onder dezelfde naam en verschillende soorten eigenlijk verschillend genoeg zijn om soortenidentificatie te geven, maar genoeg vergelijkbaar om kwantificering mogelijk te maken. Thermisch gedenatureerde gezuiverde referentie myoglobines door het monster in een heet blok te verwarmen bij 95 graden Celsius gedurende 30 minuten.

Laat het monster ongeveer 15 minuten afkoelen tot het kamertemperatuur bereikt. Voeg vervolgens 30 milligram ureum toe om de vertering te verbeteren en meng. Voeg een trypsinoplossing toe aan het monster in een verhouding van een op dertig van enzym tot substraat naar gewicht.

Meng vervolgens door voorzichtig te vortexen en laat het overnacht proteolyseren bij 37 graden Celsius. Ontzilt vervolgens het post-proteolysemonster door het monster eerst één tot twee volume op volume met water te verdunnen. Activeer een polymere omgekeerde fase cartridge gevuld met 30 milligram omgekeerde fase materiaal door een milliliter methanol toe te voegen.

Equilibreer vervolgens de cartridge door een milliliter van een procent formiazine toe te voegen. Laad het monster onder zwaartekracht op de cartridge. Was nu met een milliliter van vijf procent methanol bevattende één procent formiazine.

Elueer de peptiden met één milliliter acetonitril water in twee milliliter microcentrifugebuisjes voorgevuld met vijf microliter DMSO. Verwijder vervolgens het oplosmiddel onder vacuüm bij 50 graden Celsius gedurende 120 minuten met behulp van een centrifugale evaporator. Herdissolve het residu in 250 microliter acetonitril water.

Breng de oplossing over naar een autosamplervial met laag volume. Localiseer de myoglobinesequenties voor de verschillende vleessoorten in de UniProt-database. Voer de myoglobinesequenties in in het doelvak van de peptide en overgangsvoorspellingssoftware.

Als dat nodig is, beweeg over een peptide om de fragmentenlijst te onthullen. Na het invoeren van de voorkeuren zoals beschreven in het tekstprotocol, klikt u op Export en selecteert u Overgangslijst om een spreadsheet te maken met de gegenereerde MRM-overgangen en parameters. Stel een hoogwaardige vloeistofchromatografie of HPLC-systeem van een binair gradiënt in met een autosampler en een C18 kernschaal HPLC-kolom aangesloten op een triple quadrupole massaspectrometer die in positieve elektrospraymodus werkt met MRM-detectie.

Selecteer in de sectie bewerkingsparameters van de vloeistofchromatografie massaspectrometrie gegevensverzameling software de scantype als MRM en de polariteit als positief. Voer de Q1, Q3, tijd, ID, DP en CE waarden in voor de overgangen die in de spreadsheet zijn gemaakt en sla de acquisitiemethode op. Nadat u de methodeparameters hebt ingesteld zoals beschreven in het tekstprotocol, navigeert u naar de gegevensverzameling software, klikt u op Verwerven en selecteert u Equilibrate.

Selecteer in het vak dat opent de vereiste acquisitiemethode om de instrumentequilibratie te starten. Plaats vervolgens de monsterbuisjes in een rek in de autosampler. Klik op Bestand en selecteer Nieuw, gevolgd door Acquisitiebatch.

In de veldnaam voert u de identiteit in van elk van de monsters die moeten worden geanalyseerd. Zie het tekstprotocol voor details over hoe u de verworven gegevens kunt visualiseren. Gebruik vlees dat eerder is ingevroren en vervolgens tot poeder gemalen.

Bereid een reeks vleesmengsels door respectieve hoeveelheden vlees af te wegen in 15 milliliter plastic centrifugebuisjes. Voeg vier milliliter extractiebuffer toe aan het vleespoeder. Na 30 seconden te hebben gevormd, extraheer op een laboratoriumschudklok bij kamertemperatuur gedurende twee uur bij 250 cycli per minuut.

Breng twee milliliter van het extract over in een twee milliliter microcentrifugebuis en centrifugeer gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en 17.000 G.Breng 200 microliter aliquots van de supernatant over in twee milliliter centrifugebuisjes. Droog de monsters met een centrifugale evaporator voordat u de eiwitconcentratie van de monsters bepaalt zoals beschreven in het tekstprotocol. Om proteolyse van vleesmengsels uit te voeren, herdissolve het gedroogde residu in één milliliter van 25 millimolair ammoniumbicarbonaat oplossing.

Meng goed door te vortexen en voer proteolyse uit zoals eerder. Stel vervolgens de LCMS in en voer deze uit op een vergelijkbare manier met behulp van geplande MRM. Geef het volledige chromatogram weer in de gegevensweergavesoftware.

Geef de geëxtraheerde ionen voor elke overgangsset op volgorde weer. Bevestig visueel dat elke cluster het vereiste aantal belletjesvormige pieken heeft bij de verwachte retentietijd. Hierdoor wordt de aanwezigheid van het geselecteerde peptide bevestigd.

Dubbelklik vervolgens op Kwantitatieve Assistent in de navigatiebalk. Maak in het Selecteer voorbeeldvenster een kwantitatieve set aan door een enkel gegevensbestand te selecteren. Selecteer vervolgens een of meer beschikbare voorbeelden.

Selecteer Volgende om instellingen en querybox te tonen. Laat de standaardinstellingen staan en selecteer Volgende om Selecteer Methode weer te geven. Selecteer het integratiemethodebestand uit de vervolgkeuzelijst Methode en selecteer tenslotte Voltooien.

Sla de resultatentabel op, exporteer als tekstbestand en open deze in een spreadsheet om de gegevens te beoordelen zoals beschreven in het tekstprotocol. Deze figuur toont de meest intense MRM-overgangen voor paard verkregen uit een een procent gewicht op gewicht mengsel met rundvlees. De rode lijn toont daarentegen de overgang van rundvlees wanneer er geen paard aanwezig is.