Name: Ontwikkeling van een antigeen-gedreven Colitis Model naar Presentatie van antigenen te bestuderen door antigen presenterende cellen om T-cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Leer een antigeen-gedreven colitis model om interacties tussen mononucleaire fagocyten en CD4-positieve T-cellen in de darm lamina propria te bestuderen. Deze methode biedt inzicht in de pathogenese van inflammatoire darmziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JHN wordt ondersteund door de Swiss National Foundation (SNSF 310030_146290).

De muizen werden gefokt en onder specifieke pathogeenvrije (SPF) omstandigheden in het dier faciliteit van Ulm University (Ulm, Duitsland) gehouden. Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het plaatselijke dierenasiel gebruik en onderhoud commissie en de Nationale Animal Welfare Law. 1. De bouw van de pCFP-OVA Plasmid <ol><li> Versterken de volledige grootte OVA gen met de primers Ova_SpeI_fw (3&#39;-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 &#39;) en Ova_ClaI_rev (3&#39;GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5&#39;) 37 met behulp van vector pCI-OVA (ampicilline resistente) 42 als een matrijs. Kloon het PCR product (de OVA coderende sequentie) in een in de handel verkrijgbaar faag mid-vector met behulp Spel en Clal restrictieplaatsen van de vector en primers aan de specifieke OVA-plasmide verkregen. </li><li> Versterken de GVB-coderende gen samen met de sterke constitutieve promotor P hyper behulp van plasmide pad 1 </sub&gt; -cCFP (chlooramfenicolresistente) 43 als een matrijs en primers CFP_SacII_fw (3&#39;-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5 &#39;) en CFP_SpeI_rev (3&#39;-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5&#39;) 37. </li><li> Kloon de CFP-coderende gen in de specifieke OVA-plasmide (ampicilline resistente) met de Spel en SacI restrictieplaatsen van de vector primers en 37. Dit introduceert een spacer van 6 glycine residu&#39;s tussen de GVB-codering van OVA-coderende sequentie. </li></ol> 2. Constructie van E.coli pCFP-OVA <ol><li> Kweek E. coli stam DH10B in 100 ml Luria Bertani (LB) -medium aeroob bij 37 ° C op een roterende schudder overnacht. </li><li> Meng 800 gl bacteriekweek met 200 pl glycerol glycerol en opslag te creëren bij -80 ° C. </li><li> Voeg 50 pl E.coli stam DH10B uit glycerol voorraad in 5 ml LB medium en groeien ze aëroob bij 37 ° C op een roterende schudinrichting overnight. </li><li> Breng de kweek in een van schotten 1 L erlenmeyer met 250 ml LB-medium bij 37 ° C in een roterende schudden. </li><li> Groeien bacteriën tot een optische dichtheid bij 600 nm (OD 600) van 0,5 en dan chill de cultuur op ijs gedurende 30 min. Centrifugeer de kiemen bij 5000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer bacteriën met 100 ml van ijskoud steriel H2O en gecentrifugeerd bij 5000 xg bacteriën gedurende 10 minuten bij 4 ° C Resuspendeer bacteriën met 100 ml ijskoude 10% glycerol en centrifugeer de kiemen bij 5000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Herhaal deze laatste stap twee keer. </li><li> Na de laatste wasstap, resuspendeer bacteriën in 700 pi 10% glycerol. Freeze 50 gl aliquots in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C. </li><li> Ontdooi een 50 pi aliquot op ijs en overbrengen in een voorgekoeld elektroporatie cuvette (2 mm elektrodeafstand). </li><li> Voeg 5 ul plasmide-DNA (100 ng) met de 50 pl E. coli aliquots. Voer elektroporatie met een enkele puls bij 25 uF, 200 ohm (Ω) en 2,5 kV. </li><li> Resuspendeer bacteriën in 1 ml voorverwarmde SOC medium (5 g / l gistextract, 2 g / l trypton, 10 mM natriumchloride, 2,5 mM kaliumchloride, 10 mM magnesiumchloride, 10 mM magnesiumsulfaat) en incubeer bij 37 ° C aëroob gedurende 1 uur. </li><li> Plaat bacteriën op LB-agarplaten gesupplementeerd met ampicilline 100 ug / ml (voeg 100 ul van een 100 mg / ml ampicilline bouillon aan 100 ml LB-agar) en incubeer overnacht aëroob bij 37 ° C. </li><li> Pick enkele kolonies en opnieuw streak ze in LB-agarplaten gesupplementeerd met ampicilline 100 ug / ml. Incubeer overnacht aëroob bij 37 ° C. </li><li> Pick enkele kolonies en groeien ze overnacht in 10 ml LB medium aangevuld met ampicilline 100 ug / ml voor plasmide-isolatie. Gebruik in de handel verkrijgbare plasmide mini prep kit en elueer plasmide DNA met 30 pi dH 2 O (gedestilleerd water) volgens de fabrikant &#39;; S protocol. Controleer plasmiden door restrictie-analyse en DNA-sequencing 37,42,43. </li><li> Het opzetten van een cultuur van positieve klonen van E. coli pCFP-OVA in 100 ml LB medium aangevuld met ampicilline 100 ug / ml. Grow aëroob bij 37 ° C op een roterende shaker &#39;s nachts. </li><li> Meng 800 gl bacteriekweek met 200 pi zuivere glycerol en bewaar bij -80 ° C. </li><li> Centrifugeer de rest van de kweek gedurende de nacht bij 5000 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur (RT) en resuspendeer de pellet in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Breng 10 ul van de suspensie op glasplaatje en bedek het met een dekglaasje. </li><li> Let op de monsters in een standaard fluorescentie microscopie om de expressie fluorescentie van de GVB-OVA (GVB excitatie bij 450 nm, emissie bij 480 nm) te bevestigen. Analyseer de bacteriën beginnen met vergroting 400X. </li><li> Centrifuge 1 ml bacteriën overnacht kweken bij 5000 xg gedurende 10 min, RT. Resuspendeer de pellet in 40 glPBS en kookt bij 95 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Centrifugeer de monsters bij 30.000 xg gedurende 10 min en de supernatanten gebruikt voor Western blot-analyse 37. Gebruik de-konijn verhoogde anti-OVA polyklonaal antilichaam verdund 1: 400. </li></ol> 3. Productie van OT-II / Rode Muizen <ol><li> Cross een man / vrouw OT-II muis met een vrouwelijke / mannelijke muizen tot expressie rood fluorescerend eiwit (beide stammen in de handel verkrijgbaar) om de OT-II / Red 37 muizen te genereren. </li></ol> 4. Spleen Cell Isolation <ol><li> Euthanize de OT-II / Red muizen door cervicale dislocatie na verdoving door inhalatie van elke gehalogeneerde ether (tot 5% voor inductie) commercieel verkrijgbaar. </li><li> Knip met een schaar de linker superieure buikgedeelte van de muis gesneden. Op grond van deze abdominale deel is er de milt (ovale vorm met een donker-rode kleur). Gebruik een schaar en pincet om het te verwijderen. <ol><li> Pak de milt van de OT-II / Red muizen en doorgeven door een 100um zeef cel geplaatst op een 50 ml buis met behulp van de zuiger van een 1 ml spuit teneinde een enkel celsuspensie te verkrijgen. Was het filter tweemaal met 10 ml PBS aangevuld met 1% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS). </li></ol></li><li> Centrifugeer de celsuspensie bij 390 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet met 5 ml voorverwarmde lysisbuffer (144 mM NH4Cl, 17 mM Tris, pH = 7,2) om de rode bloedcellen te lyseren. Incubeer 10 min bij 37 ° C. </li><li> Was het monster met 25 ml PBS aangevuld met 1% FBS. Centrifugeer bij 390 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet in 10 ml PBS aangevuld met 1% FBS. </li><li> Tel de cellen met behulp van een Neubauer telkamer. Mix 10 ul van de celsuspensie met 10 ul van een 0,4% trypan blauwe oplossing. Incubeer gedurende 1-2 min. <ol><li> Vul het hemocytometer kamer met 10 ul van gekleurde cellen. Tellen cellen onder de microscoop in vier 1 x 1 mm 2 vierkantjes van één kamer en determine het gemiddeld aantal cellen per vierkante. Levensvatbare cellen lijken wit, dode cellen blijken blauw. Om het aantal cellen te bepalen / ml aantal cellen te vermenigvuldigen met een factor van verdunning. Als 2-4 kwadranten worden geteld, te delen door het aantal kwadranten. </li></ol></li></ol> 5. CD4 + CD62 L + T Cell Verrijking <ol><li> Verrijken miltcellen voor CD4 + CD62L + T cellen via magnetische isolatie kit volgens de principes van negatieve of positieve selectie. Hier, Gebruik negatieve selectie aan CD4 + T-cellen te isoleren en te gebruiken positieve selectie verder te verrijken in de CD62L + populatie in de CD4 + T-cel pool. Opmerking: In de negatieve selectieprocedure, de cellen, die niet geïsoleerd worden (hier: alle CD4 negatieve cellen) gelabeld met specifieke antilichamen gekoppeld aan magnetische microkralen. Tijdens de kolom wasstappen zullen de CD4 + T-cellen door de kolom passeren zodat ze kunnen worden easily verzameld. In de positieve selectieprocedure cellen geïsoleerd worden gelabeld zijn met geschikte antilichaam gekoppeld aan magnetische microkralen. Tijdens de kolom wasstappen de gemerkte cellen blijft in de kolom en ze kunnen worden verzameld door het verwijderen van de kolom uit het magnetische veld en spoelen met buffer. </li><li> Voor de negatieve selectieprocedure, resuspendeer 10 7 totale miltcellen in 40 ul koude PBS aangevuld met 0,5% runderserumalbumine (BSA). Voeg 10 ul met biotine gelabelde antilichaam cocktail met de magnetische isolatie kit (specifieke antilichamen die niet-CD4 + T-cellen) en incubeer 15 min op ijs. <ol><li> Voeg 30 ul koud PBS aangevuld met 0,5% BSA en 20 pl anti-biotine microbolletjes. Incubeer 20 min op ijs. </li><li> Voeg aan het monster 10 ml PBS aangevuld met 0,5% BSA en centrifugeer bij 390 xg gedurende 5 minuten. Herhaal deze stap twee keer. Resuspendeer de cellen in 1 ml koude PBS aangevuld met 0,5% BSEEN. </li><li> Plaats de kolom specifiek voor de negatieve selectieprocedure in het magnetische veld en spoelen met 3 ml koude PBS aangevuld met 0,5% BSA op de kolom. Voeg de celsuspensie op de kolom en was 3 maal met 3 ml koude PBS aangevuld met 0,5% BSA. </li><li> Centrifugeer cellen van het effluent bij 390 xg gedurende 5 minuten. Effluent passeren door de kolom bevat ongelabelde CD4 + T-cellen. Resuspendeer de pellet in 1 ml PBS aangevuld met 0,5% BSA en tel de cellen. </li><li> Tel de cellen met behulp van een Neubauer telkamer. Mix 10 ul van de celsuspensie met 10 ul van een 0,4% trypan blauwe oplossing. Incubeer gedurende 1-2 min. <ol><li> Vul het hemocytometer kamer met 10 ul van gekleurde cellen. Aantal cellen onder de microscoop in vier 1 x 1 mm 2 velden van de ene kamer en moet het gemiddelde aantal cellen per vierkant. Levensvatbare cellen lijken wit, dode cellen blijken blauw. Om het aantal cellen / mL vermenigvuldigen cel bepalenl aantal met een factor van verdunning. Als 2-4 kwadranten worden geteld, te delen door het aantal kwadranten. </li></ol></li></ol></li><li> Voor de positieve selectieprocedure, voeg 10 ul van CD62L microkralen per 10 7 voorverrijkte CD4 + T celfractie. Incubeer 15 min op ijs. <ol><li> Voeg aan het monster 10 ml PBS aangevuld met 0,5% BSA en centrifugeer bij 390 xg gedurende 5 minuten. Herhaal deze stap twee keer. Resuspendeer in 500 ul koud PBS aangevuld met 0,5% BSA. </li><li> Plaats de bepaalde kolom van de negatieve selectieprocedure in het magnetische veld en spoelen met 500 ul koud PBS aangevuld met 0,5% BSA op de kolom. Voeg celsuspensie op de kolom en was 3 maal met 500 ul koud PBS aangevuld met 0,5% BSA. </li><li> Verwijder de kolom uit het magnetische veld en plaats het op een geschikte collectie buis. Voeg 1 ml PBS aangevuld met 0,5% BSA op de kolom en spoel CD4 + CD62L + T cels vastgehouden in de kolom door stevig op de zuiger in de kolom. OPMERKING: De geïsoleerde CD4 + CD62L + T cellen zijn nu klaar voor verdere toepassingen, zoals in vivo experimenten. Volgens de instructies van de fabrikant van de CD4 + CD62L + T cellen isolatiekit de microkralen niet toxisch. Vanwege de geringe omvang (ongeveer 50 nm), doen ze niet cellen te activeren en zij zullen niet te verzadigen celoppervlak epitopen. Dus de geïsoleerde cellen kunnen worden overgebracht in immunodeficiënte muizen colitis 37,44,45 induceren. </li><li> Tel de cellen met behulp van een Neubauer telkamer. Mix 10 ul van de celsuspensie met 10 ul van een 0,4% trypan blauwe oplossing. Incubeer gedurende 1-2 min. <ol><li> Vul het hemocytometer kamer met 10 ul van gekleurde cellen. Aantal cellen onder de microscoop in vier 1 x 1 mm 2 velden van de ene kamer en moet het gemiddelde aantal cellen per vierkant. Levensvatbare cellen appear wit, dode cellen blijken blauw. Om het aantal cellen te bepalen / ml aantal cellen te vermenigvuldigen met een factor van verdunning. Als 2-4 kwadranten is berekend, delen door het aantal kwadranten. </li></ol></li></ol></li></ol> 6. Inductie van Antigen-driven Colitis <ol><li> Injecteren intraperitoneaal 3 x 10 5 OT-II / Red CD4 + CD62L + T cellen in CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - muizen. Voor inductie van antigenspecifieke colitis toedienen E. coli pCFP-OVA om de dag met een dosis van 1 x 10 8 kolonievormende eenheid (CFU) in 100 pl PBS per dier sonde of orale instillatie achter de snijtanden. </li><li> Monitor tweemaal per week het lichaamsgewicht van getransplanteerde muizen en hun klinische toestand (aanwezigheid van bloed in de ontlasting, ontlasting en de activiteit van muizen). </li></ol> 7. Tissue Monsters voor histopathologisch onderzoek <ol><li> Neem weefselmonsters van the dikke darm van muizen, vast te stellen in neutraal gebufferde formaline (10%) en insluiten in paraffine zoals eerder beschreven 36,46. </li><li> Section de paraffine monsters op een microtoom, monteren op dia&#39;s, en het uitvoeren van de H &amp; E stain 47,48. </li><li> Categoriseren de histologie van de dikke darm, zoals eerder 47,48 gepubliceerd: normaal (score 0); milde colitis (score 1), matige colitis (score 2) en ernstige colitis (score 3). </li></ol> 8. Isolatie van de dikke darm Lamina Propria Cells <ol><li> Euthanaseren getransplanteerde muizen door cervicale dislocatie na verdoving door inhalatie van elke gehalogeneerde ether (tot 5% voor inductie) commercieel verkrijgbaar. </li><li> Plaats het dier af met de buik naar boven. Gebruik een tang om de huid naar voren te grijpen om de urethra opening. Gebruik schaar om het huidsnede langs de ventrale middellijn van de lies tot de borst. Trek de huid weer aan de zijkanten. </li><li> Snijd door de doorzichtige peritoneale spierwand enopenstelling van de lichaamsholte. Identificeer de colon die gaat van de anus tot de blindedarm 49. Snijd de 2 extremiteiten en bevrijden van het weefsel van een vet. </li><li> Open de colon langsrichting met een dissectie schaar. Gebruik een pincet om het darmweefsel schud in een petrischaal met 25 ml PBS aangevuld met 1% FBS om vuil en slijm te verwijderen. Snijd de dikke darm in 5-8 mm stuks. </li><li> Plaats de colon segmenten in een 50 ml buis met 20 ml van de wasbuffer. The Wash buffer bevat 500 ml DPBS, 10 mM Hepes en 5 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA). </li><li> Vortex de buis gedurende 30 seconden bij maximale snelheid. </li><li> Incubeer de buis met het colon segmenten in een waterbad bij 37 ° C met 200 rpm schudden gedurende 10 minuten. </li><li> Na de incubatie vortex de buis gedurende 30 seconden bij maximale snelheid. </li><li> Gooi de supernatanten en plaats de weefselmonsters in een nieuwe 50 ml buis met 20 ml van de wasbuffer. Herhaal stappen 6-9 driemaal </li><li> Gooi de supernatants en plaats de weefselmonsters in een petrischaal met 25 ml PBS. Gebruik een pincet om voorzichtig de weefselmonsters te schudden in de petrischaal gedurende enkele seconden om de resterende epitheliale cellen te verwijderen. Herhaal deze stap drie keer. </li><li> Snijd colonic weefsels in 2 x 2 mm stukjes 2 en verteren door incubatie in 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium met 0,5 mg / ml collagenase type VIII van Clostridium histolyticum en 10 U / ml DNasel. </li><li> Vortex de buis gedurende 30 seconden bij maximale snelheid. </li><li> Incubeer de colon fragmenten in een waterbad bij 37 ° C met 200 rpm schudden gedurende 35 min en vortex de buis gedurende 30 seconden bij maximale snelheid om de 5 min. </li><li> Aan het einde van de incubatie vortex de buis gedurende 30 seconden bij maximale snelheid. </li><li> Verzamel de verkregen fragmenten met ze door een 70 um cel zeef geplaatst op een nieuwe 50 ml buis. </li><li> Was het monster door het toevoegen van 20 ml DPBS en centrifugeer bij 400 g gedurende 5 minuten. Dan resuspendeer thij cellen in 1 ml van DPBS. </li><li> Tel de cellen met behulp van een Neubauer telkamer. Mix 10 ul van de celsuspensie met 10 ul van een 0,4% trypan blauwe oplossing. Incubeer gedurende 1-2 min. <ol><li> Vul het hemocytometer kamer met 10 ul van gekleurde cellen. Aantal cellen onder de microscoop in vier 1 x 1 mm 2 velden van de ene kamer en moet het gemiddelde aantal cellen per vierkant. Levensvatbare cellen lijken wit, dode cellen blijken blauw. Om het aantal cellen te bepalen / ml aantal cellen te vermenigvuldigen met een factor van verdunning. Als 2-4 kwadranten worden geteld, te delen door het aantal kwadranten. </li></ol></li></ol> 9. Extracellulaire kleuring voor FCM Analyse <ol><li> Centrifuge de CLP-cellen 5 min bij 390 x g. Resuspendeer de cellen in 1 ml FACS A (PBS aangevuld met 1% BSA en 0,1% natriumazide) OPMERKING: Natriumazide is zeer giftig. Het kan hypotensie, hypothermie, hoofdpijn convulsies of de dood veroorzaken. Verdunde oplossing van natriumazide (00,1-1,0%) meestal niet bijzonder gevaar voor de gebruiker, maar zij zijn ogen en huid irriterend. Gebruik daarom natriumazide alleen in de chemische kap terwijl het dragen van een laboratorium jas en een dubbele paar disposable nitril handschoenen. </li><li> Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur met het monoklonale antilichaam (mAb) tegen de 2.4G2 FcyRIII / II CD16 / CD32 (0,5-1 ug mAb / 10 6 cellen) verdund in FACS A. </li><li> Voeg 200 ul FACS A aan de cellen en centrifugeer 5 min bij 390 x g. Herhaal deze stap twee keer. Incubeer de cellen met 0,5 ng / 10 6 cellen van de toepasselijke mAb gedurende 20 min bij 4 ° C. Verdun de antilichamen in FACS A. </li><li> Voeg 200 ul FACS A aan de cellen en centrifugeer 5 min bij 390 x g. Herhaal deze stap twee keer. Resuspendeer de monsters in 100 ui FACS A. </li><li> Analyseer T-cellen van CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - muizen gereconstitueerd met OT-II / Red CD4 T-cellen in de flowcytometer 37. </li><li&gt; data analyseren met behulp van commercieel verkrijgbare software. </li></ol> 10. Confocale microscopie Analyse <ol><li> Analyseer de dikke darm van de CX 3 CR1 GFP / + muizen opgelost of niet met de OT-II / Red CD4 + CD62L + T-cellen en mondeling gevoerd om de dag met 1 x 10 8 CFU E. coli-stam DH10B pCFP-OVA. </li><li> Verwijder het colon van muizen met een schaar en pincet. Openen lengterichting met een dissectie schaar. </li><li> Knip een 5-8 mm stuk colon monster met behulp van een schaar, zet op glas dia&#39;s en dek af met dekglaasjes. </li><li> Analyseer de colon monsters met een confocale microscoop bij een vergroting van 40 / 1,30. </li><li> Detecteren de CX 3 CR1 + Kamerleden, gelabeld met groene fluoresceïne eiwit (GFP), met behulp van een filter set met excitatie bij 488 nm en emissie bij 509 nm. </li><li> Detecteren van CD4 + T-cel die rood proteïne met een filter set met excitatie bij 554 nm en emissie bij 586 nm. </li><li> Detecteren E.coli pCFP-OVA met een filter set met excitatie bij 450 nm en emissie bij 480 nm. </li><li> Definieer een gebied van belang en het genereren van scatter diagrammen zoals eerder beschreven 50 de co-lokalisatie analyse uit te voeren. Gebruik 2 verschillende formules: de Overlap Coëfficiënt volgens Manders en de Pearson&#39;s coëfficiënt. </li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Net als bij elk ander model, kan de antigeen gedreven colitis model hierboven beschreven enkele kwesties die de onderzoeker het uitvoeren van de techniek zich bewust van moet zijn te presenteren. Bij het ​​injecteren van de OT-II / Red + CD4 + T CD62L + cellen in de gastheren, moet de onderzoeker zeer zacht en voorzichtig zijn om de naald in de buikholte. Doet u dit niet kan leiden tot het scheuren van de darm van de muis die kunnen leiden tot de dood, of een subcutane toediening van cel...

De darm is het grootste vlak van het lichaam dat is blootgesteld aan de externe omgeving. Enorme arrays van de ingezeten microben koloniseren de menselijke darm de darmflora (of microflora) te vormen. Dit is naar schatting bestaan ​​uit maximaal 100000000000000 microbiële cellen en vormt een van de meest dichtbevolkte bacteriële habitats in de biologie 1-3 bekend. In het GIT bacteriën koloniseren een intestinale niche waar ze kunnen overleven en zich vermenigvuldigen 4. In ruil daarvoor, de microbiota schenkt de gastheer met extra functionele kenmerken niet gecodeerd op zijn genoom 1. Bijvoorbeeld de microbiota stimuleert de proliferatie van epitheelcellen, produceert vitaminen die gastheer kan produceren op zichzelf metabolisme reguleert en beschermt tegen pathogenen 4-6. Gezien deze voordelige relatie, hebben sommige auteurs gesuggereerd dat de mens zijn &quot;super-organismen&quot; of &quot;holobionts&quot;, dat zijn een mix van bacteriële en menselijke genen 7,8. Gezien de gunstige invloed van de microbiota van de (menselijke) gastheer, de intestinale immuunsysteem moet commensal microben tolereren om hun bestaan ​​in het lumen mogelijk te maken, maar ook de dood van de ziekteverwekkers die binnenvallen van luminale kant 9-11. De intestinale immuunsysteem mechanismen om onderscheid te maken tussen onschadelijke en potentieel schadelijke microben luminaal ontwikkeld; Maar deze mechanismen zijn nog niet goed begrepen 12. Handhaven intestinale integriteit vereist een strak gereguleerd immuunhomeostase het evenwicht tussen tolerantie en immuniteit 13 houden. Een onbalans bij immuun homeostase bij aan de inductie van intestinale ziekten zoals inflammatoire darmziekten (IBD) 3,14. Er zijn twee belangrijke types van IBD: ziekte van Crohn (CD) en colitis ulcerosa (UC). Patiënten met deze ziekten vaak lijden aan rectaal bloeden, ernstige diarree en buikpijn 15,16. De oorzaak van IBD is nog steedsonbekend, maar een combinatie van genetische factoren, omgevingsinvloeden en ontregelde immuunreacties kunnen de belangrijkste gebeurtenis ziekteontwikkeling 15 zijn. Diermodellen voor IBD zijn al meer dan 50 jaar. In de afgelopen decennia nieuwe IBD modelsystemen ontwikkeld om de verschillende hypothesen met betrekking tot de pathogenese van IBD 17,18. De meest bestudeerde van chronische colitis is de T-celoverdracht model verstoring van T-cel homeostase 19,20 induceert. Dit model gaat overbrengen naïeve T-cellen van muizen in immunocompetente gastheer die T- en B-cellen (bijvoorbeeld RAG - / - muizen en SCID) missen 16,21. De ontwikkeling van de ziekte in dit model wordt gecontroleerd 3-10 weken door onderzoek van de aanwezigheid van diarree, verminderde fysische activiteit, en verlies van lichaamsgewicht. Dit wordt zo genoemd het wasting syndroom 16. In vergelijking met de gezonde muizen de dikke weefsel van getransplanteerde gastheren is Thicker, korter en zwaarder 16. DE T celoverdracht model, is het mogelijk om te begrijpen hoe verschillende T cel populaties kan bijdragen tot de pathogenese van IBD 22. De T celoverdracht model niet de interactie tussen APC en T-cellen in het ziekteproces analyseren een antigeen-specifieke wijze. Het is aangetoond dat een interactie tussen myeloïde cellen en lymfoïde cellen die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van darmontsteking 23 zijn. Hoewel veel aspecten van IBD zijn opgehelderd, de initiële gebeurtenissen die leiden tot de ontwikkeling van de ziekte moet nog duidelijk worden begrepen. Aangetoond is dat bij het ​​uitblijven van microbiota overdracht colitis kan niet worden vastgesteld 24. Onlangs heeft een aantal theorieën komt IBD gevolg van een immuunrespons tegen commensale bacteriën 25 zijn. Auteurs hebben voorgesteld dat commensale bacteriën noodzakelijk om ontsteking te induceren in de distale darm26. In kiemvrij (GF) dieren de intestinale immuunsysteem verzwakte 27,28, maar een kolonisatie van deze muizen met een mengsel van specifiek-pathogeenvrije bacteriën resulteert in de ontwikkeling van de volledig competent intestinaal immuunsysteem 29. Vandaar de microbiota lijkt een sleutelelement in de pathogenese van IBD, hetzij als een mechanisme dat predisponeert voor of beschermen tegen de ontwikkeling van darmontsteking 30,31. Huidige theorieën komt IBD is een gevolg van microbiële onbalans, genoemd dysbiose in genetische aanleg 32 patiënten, maar het is niet duidelijk of de dysbiosis de oorzaak of gevolg van de ziekte 12. Gezien de rol van micro-organismen in de ontwikkeling van IBD, in vitro experimenten toonden aan dat CD4 + T-cellen kunnen worden geactiveerd door APCs gepulst met darmbacteriën 33,34. Bovendien is aangetoond dat antigenen vanverschillende commensale bacteriën, zoals E. coli, Bacteroides, Eubacterium en Proteus, kunnen CD4 + T-cellen 35 activeren. Dit geeft aan dat de presentatie van bacteriële antigenen aan T-cellen van belang is voor de ontwikkeling van IBD. De complexiteit van meerdere antigenen verkregen door de microflora in de ziekte te verminderen, heeft E. coli stam gecreëerd die het OVA antigen produceert. Overdracht colitis werd geïnduceerd door injectie van OVA-specifieke T-cellen in RAG - / - dieren gekoloniseerd met OVA tot expressie E. coli. Dit model is gebaseerd op de recente aanwijzingen dat CX 3 CR1 + Kamerleden, een grote mobiele subgroep in het colon lamina propria (CLP) 36, zijn interactie met CD4 + T-cellen tijdens de overdracht colitis 37. MPs proeven het darmlumen voor deeltjesvormig antigeen, zoals bacteriën, met behulp van hun dendrieten 36, 38,39. Vorige studiesaangetoond dat MPs ook kan opnemen oplosbare antigenen, zoals OVA, ingebracht in het darmlumen 40,41. Gezien de overvloed van CX 3 CR1 + MPs in de CLP, is het mogelijk dat deze cellen luminale bacteriën monster en interactie met CD4 T-cellen. Confocale beeldvorming van muizen getransplanteerd met OVA-specifieke CD4 + T-cellen gekoloniseerd met E. coli CFP-OVA, blijkt dat CX 3 CR1 + MPs in contact met OT-II CD4 + T-cellen tijdens de ontwikkeling van antigeen gedreven colitis. Dit model maakt de studie van de antigeenpresentatie proces tussen intestinale APC&#39;s en T-cellen die specifiek alleen voor specifieke antigeen expressie bacteriën in het darmlumen.

<table><tbody><tr><td>LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Rotary Shake</td><td>Reiss Laborbedarf e. K.</td><td>Model 3020 GFL</td><td></td></tr><tr><td>2 mm gap couvettes&nbsp;</td><td>Peqlab Biotechnologie GmbH</td><td>71-2020</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell system&nbsp;</td><td>BioRad Laboratories GmbH</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Difco</td><td>244510</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393-5G</td><td></td></tr><tr><td>SOC Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1797-100ML</td><td></td></tr><tr><td>High Pure Plasmid Isolation Kit</td><td>Roche</td><td>11754777001</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth GmbH &amp; Co</td><td>3810.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>537020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gel chamber&nbsp;</td><td>PEQLAB Biotechnology GmbH</td><td>40-0708</td><td></td></tr><tr><td>Loading Dye</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNA Ladder&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM0312</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide solution</td><td>Carl Roth GmbH &amp; Co. KG</td><td>2218.3</td><td></td></tr><tr><td>Photo-documentation system&nbsp;</td><td>Decon Science Tech GmbH</td><td>DeVision G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DNA sequencing&nbsp;</td><td>MWG-Biotech GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Biochrom</td><td>L182-50</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>HBO 100</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra System</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1658005</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder&nbsp;</td><td>Fermentas, St. Leon-Rot, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IstanBlue Solution</td><td>Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane&nbsp;</td><td>Macherey-Nagel GmbH &amp; Co. KG</td><td>741280</td><td></td></tr><tr><td>Electro blotter&nbsp;</td><td>Biometra GmbH</td><td>846-015-600</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumins (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003-25G</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ovalbumin antibody&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab181688</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG&nbsp; HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0545&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate</td><td>Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc</td><td>32132</td><td></td></tr><tr><td>Forene</td><td>Abbott</td><td>2594.00.00</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainers</td><td>Fischer Scientific&nbsp;</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254134-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>CD4+ CD62 L+ T isolation kit&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-227&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS Columns&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS Columns&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Feeding Needle 20G</td><td>SouthPointe Surgical Supply, Inc</td><td>FN-7903</td><td></td></tr><tr><td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1496904</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9627</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230251&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type VIII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-2139</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium</td><td>AppliChem</td><td>A2044, 9050</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>438456</td><td></td></tr><tr><td>Mouse BD Fc Block</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated mAb binding V&szlig; 5.1, 5.2&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>553189</td><td></td></tr><tr><td>APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>17-0041-83</td><td></td></tr><tr><td>FACS Calibur&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FCS Express V3 software</td><td>DeNovo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meta scanning confocal microscope&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Workstation</td><td>Zeiss</td><td>LSM 7</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss ZEM software&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>v4.2.0.121</td><td></td></tr><tr><td>Maxisorp immuno plates&nbsp;</td><td>NUNC, Roskilde</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin conjugated alkaline phosphatase</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>016-050-084</td><td></td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71768-5G</td><td></td></tr><tr><td>mAb R4-6A2</td><td>BD Biosciences</td><td>551216</td><td></td></tr><tr><td>mAb XMG1.2&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>554410</td><td></td></tr><tr><td>TECAN microplate-ELISA reader</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasyWin software</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNase I recombinant</td><td></td><td>4536282001</td><td></td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van een antigeen-gedreven colitis model naar presentatie van antigenen te bestuderen door antigen presenterende cellen om t-cellen

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatoire darmziekte (IBD) is een chronische ontsteking die het maag-darmkanaal (GIT) aantast. Een van de beste manieren om de immunologische mechanismen die tijdens de ziekte betrokken zijn te bestuderen, is het T-cel overdrachtsmodel van colitis. In dit model worden immunodeficiënte muizen (RAG-/- receptoren) gereconstitueerd met naïeve CD4+ T-cellen van gezonde wildtype gastheren.
Dit model maakt onderzoek van de vroegste immunologische gebeurtenissen die leiden tot ziekte en chronische ontsteking mogelijk, wanneer de darmontsteking zichzelf in stand houdt maar niet afhankelijk is van een gedefinieerd antigeen. Om de mogelijke rol van antigeen-presenterende cellen (APC's) in het ziekteproces te bestuderen, is het nuttig om een antigeen-gedreven ziektemodel te hebben, waarin een gedefinieerd, van commensalen afgeleid antigeen leidt tot colitis. Een antigeen-gedreven colitismodel is daarom ontwikkeld. In dit model worden OT-II CD4+ T-cellen, die alleen specifieke epitopen in het OVA-eiwit kunnen herkennen, overgedragen naar RAG-/- gastheren die worden uitgedaagd met CFP-OVA-expresserende E. coli. Dit model maakt onderzoek van de interacties tussen APC's en T-cellen in de lamina propria mogelijk.

Om een antigeen gedreven colitis model een E. vestigen coli stam is geconstrueerd dat een plasmide waarin het gen voor het GVB gefuseerd aan de coderende sequentie voor de kippen ovalbumine eiwit en het fusie-construct tot expressie wordt gebracht onder controle van de sterke constitutieve promoter P hyper (Figuur 1A) bevat. Fluorescentiemicroscopie toont dat de recombinante E. coli pCFP-OVA, maar niet de ouderlij...

In dit antigeengedreven colitismodel werden OT-II CD4+ T-cellen die een rood fluorescent eiwit tot expressie brengen adoptief overgebracht naar RAG-/- muizen die een groen fluorescent eiwit tot expressie brengen in mononucleaire fagocyten (MP's). De gastheren werden uitgedaagd met Escherichia coli (E.coli) die het ovalbumine-eiwit (OVA) tot expressie brengt, gefuseerd met een cyaan fluorescent eiwit (CFP).

Ontwikkeling van een antigeen-gedreven Colitis Model naar Presentatie van antigenen te bestuderen door antigen presenterende cellen om T-cellen

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Het algemene doel van dit antigeen-gedreven colitismodel is om te bepalen of CX3, CR1-positieve mononucleaire fagocyten interacteren met en CD4-positieve T-cellen activeren tijdens antigeenspecifieke colitis en of deze mononucleaire fagocyt-afhankelijke expansie van effector T-cellen plaatsvindt binnen de lamina propria van de darm. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van inflammatoire darmziekten, zoals welk type interactie plaatsvindt tussen antigeenpresenterende cellen en de effector T-cellen in de lamina propria van het colon. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de studie mogelijk maakt naar de interactie tussen immuuncellen en de elementen die leiden tot de pathogeniteit van inflammatoire darmziekten.Deze methode maakt gebruik van het T-celtransfer-colitismodel, waarbij rood fluorescent antigen-specifieke naïeve CD4 T-cellen worden overgebracht naar de immuundeficiënte gastheer, die het groen fluorescent proteïne tot expressie brengt in mononucleaire cellen. De celtransfer wordt gevolgd door orale toediening van blauw fluorescent antigen-expresserende bacteriën. De immuungebeurtenissen die plaatsvinden in de lamina propria van de darm van de gastheren kunnen worden gemonitord in verschillende stadia van de ziekteontwikkeling.Gebruik dissectiescharen om de dikke darm in de lengte open te snijden en was het weefsel in een petrischaal met 25 milliliters PBS om alle resten en slijm te verwijderen. Snijd de dikke darm in stukjes van vijf tot acht millimeter en plaats de resulterende fragmenten in 20 milliliters verse DPBS zonder calcium en magnesium, aangevuld met tien millimolar HEPES en vijf millimolar EDTA. Vortex de buis met het monster gedurende 30 seconden op maximale snelheid.Incubeer vervolgens gedurende tien minuten bij 37 °C onder zacht schudden om het epitheel te verwijderen. Vortex na afloop van de incubatie opnieuw gedurende 30 seconden. Verwijder daarna het supernatant dat de epitheelcellen bevat.Breng de weefselstukjes over naar een nieuwe buis met 20 milliliters verse PBS, HEPES- en EDTA-buffer, en herhaal de incubatie inclusief de vortexstappen ervoor en erna. Na de derde herhaling zijn alle epitheelcellen verwijderd en is het supernatant helder. Was de weefselfragmenten voorzichtig in PBS om eventuele resterende epitheelcellen te verwijderen.Snijd de weefselfragmenten in stukjes van twee bij twee millimeter en breng de stukjes over voor digestie in 10 mL RPI-medium, aangevuld met 0,5 mg/mL collagenase type eight en 10 units/mL DNAse one. Vortex de monsters gedurende 30 seconden. Incubeer de weefselstukjes vervolgens gedurende 30 tot 35 minuten bij 37 °C onder shaking en vortex de buis elke vijf minuten tijdens de incubatie.Zodra het weefsel is verteerd, wordt het resulterende mengsel door een celzeef van 70 micron in een conische buis van 50 milliliter gefiltred. Was de celzeef eenmaal en centrifugeer de enkelcel-suspensie. Was de cellen tot slot eenmaal in PBS en centrifugeer.Bepaal vervolgens het aantal levensvatbare cellen via trypaanblauw-uitsluiting. Cyan fluorescent protein ovalbumine-producerende e. coli activeren de productie van interferon gamma in OT-II-cellen in vitro, in tegenstelling tot e.coli die enkel CFP tot expressie brengen. Ex vivo 3D confocale beeldvorming van het colonweefsel van transgene muizen die groen fluorescerend eiwit tot expressie brengen en gevoed zijn met e. coli PCFP ova, demonstreert de aanwezigheid van de fluorescent eiwit-exprimerende bacteriën binnen de coloncrypten nabij de intestinale epitheelcellen en gecolokaliseerd met de intestinale fagocyten van de gastheer.Bij OT-II rode dieren worden de CD4-positieve T-cellen gekenmerkt door hun co-expressie van rood fluorescent eiwit en V bèta 5.1. Wanneer ze worden uitgedaagd met e. coli PCFP ova, verliezen BNT lymfocyt-deficiënte, groen fluorescent eiwit-exprimerende transgene muizen, die adoptief zijn getransplanteerd met OT-II rode CD4-positieve CD62-ligand-positieve T-cellen, snel lichaamsgewicht en ontwikkelen ze klinische tekenen van colitis.Zeven dagen na de celoverdracht hebben slechts enkele gastheer-fagocyten e. coli PCFP ova opgenomen en worden er geen OT-II rood-positieve cellen gedetecteerd. 14 dagen na de celoverdracht hebben gastheer-fagocyten die de e.E. coli PCFP-ova bevinden zich in nauwe nabijheid van de adoptief overgedragen OT-II red-positieve cellen. Tegen 21 dagen na de celoverdracht hebben een groot aantal gastheercellen de e. coli PCFP-ova bemonsterd en de donor OT-II red-positieve cellen, die verspreid over de lamina propria van het colon worden aangetroffen, staan in nauw contact met de intestinale fagocyten van de gastheer.Wanneer deze techniek onder de knie is, kan deze in vier uur worden voltooid mits correct uitgevoerd. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals kleuring van de intestinale lymfocyten en serumcytokine-analyse, worden toegepast om aanvullende vragen over de activatiestatus van CD4 T-cellen te beantwoorden en de ernst van de colitis te bevestigen. Met elke verdere ontwikkeling baant deze techniek de weg voor onderzoek op het gebied van de immunologie om de kleine gebeurtenissen te onderzoeken die leiden tot inflammatoire darmziekten in het muismodel.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u immuuncellen uit de lamina propria van het colon kunt isoleren voor verdere ex vivo analyse.

development-an-antigen-driven-colitis-model-to-study-presentation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Hier hebben we details van een methodologie voor de snelle isolatie van de muis intestinale dendritische cellen (DC's) en macrofagen. Fenotypische karakterisering van intestinale DCs en macrofagen wordt uitgevoerd met behulp van multi-kleuren flowcytometrische analyse, terwijl magnetische kraal verrijking gevolgd door celsortering wordt gebruikt om zeer zuivere populaties voor functionele studies opleveren.

Isolatie en karakterisering van dendritische cellen en macrofagen van de muis Darm

This video demonstrates a technique to generate a chemical-induced murine model of colitis — an inflammatory bowel disease. The mouse is allowed to consume a dextran sodium sulfate (DSS) solution for an adequate duration. Upon consumption, DSS damages the mucus and epithelial layer barrier in the colon, allowing gut microbes to enter the underlying tissue — where they are sensed by the resident immune cells to mediate an exaggerated immune response, resulting in inflammation.

A Technique to Generate a Murine Model of Dextran Sulfate Sodium-Induced Colitis

DNBS / TNBS colitis biedt een alternatieve en goedkope methode om de pathobiology van ontstekingsdarmziekte bestuderen. Het protocol besproken in dit document schetst de succesvolle toepassing van DNBS om colitis te induceren bij muizen en ratten en maakt het mogelijk om grondig te bestuderen host-mediated intestinale reacties.

DNBS / TNBS Colitis modellen: Inzicht geven Into Inflammatory Bowel Disease en effecten van vet in de voeding

Hier presenteren we een protocol om colonontsteking bij muizen te induceren door adoptieve overdracht van syngeneïsche CD4+CD45RBhigh T-cellen naar ontvangers zonder T- en B-cellen. Klinische en histopathologische kenmerken bootsen inflammatoire darmziekten bij mensen na. Deze methode maakt de studie van de initiatie van colonontsteking en de progressie van de ziekte mogelijk.

Inductie van Muriene darmontsteking door adoptieve overdracht van effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoog</sup&gt; T cellen in immunodeficiënte muizen

Er bestaan verschillende zeldzame populaties van dendritische celsubpopulaties in lymfoïde organen en daarom zijn ze lastig te isoleren in voldoende aantallen en zuiverheid voor immunologische experimenten. Hier beschrijven we een methode met hoge efficiëntie en hoog rendement voor het isoleren van alle momenteel bekende belangrijke subpopulaties van dendritische cellen in de milt van muizen.

Een efficiënte en High Yield methode voor het isoleren van de muis dendritische cel subsets

We beschrijven hier een transgenisch reportermuismodel om de IL-22-producerende cellen in verschillende muisweefsels te visualiseren. Deze methode kan worden gebruikt om de locatie van andere cytokinen of secretoire eiwitten in de muis te volgen.

Visualisatie van IL-22-uiting van lymfocyten Met behulp van Reporter Muizen

Lymfkliertest distale colostomie biedt een lymfkliertest model voor menselijke afleiding colitis, een overwegend lymfatische colitis in dikke darm segment van de fecale stream uitgesloten.

Lymfkliertest distale colostoma, een nieuw Model van afleiding Colitis in C57BL/6 muizen

Het protocol presenteert een volledig gevalideerd TNBS-geïnduceerde murine model van de ziekte van Crohn en methoden voor visualisatie van oestrogeenreceptoren door immunohistochemie met behulp van immunofluorescentie van formaline-vaste darm secties ingebed in paraffine.

Visualisatie van oestrogeenreceptoren in colons van muizen met tnbs-geïnduceerde ziekte van Crohn met behulp van immunofluorescentie

In dit protocol wordt een darmmicrobiota-antigeenspecifiek T-cel adoptief transfer colitismodel beschreven. CD4+ T-cellen worden geïsoleerd uit CBir1 TCR transgene muizen. Deze zijn specifiek voor een immunodominant darmmicrobiota-antigeen CBir1 flagellin, dat wordt overgedragen in ontvangende Rag1-/- muizen, wat leidt tot darmontsteking.

Inductie van darmontsteking door adoptieve overdracht van CBir1 TCR transgene CD4 + T-cellen naar immunodeficiënte muizen

Een nieuwe DC-onafhankelijke methode voor de inductie en de uitbreiding van antigeen-specifieke T-cellen wordt beschreven. HLA A2-Ig op basis van kunstmatige antigeen presenterende cellen (aAPC) zijn geladen met HLA-A2 beperkt peptiden om efficiënt uit te breiden CTL van diverse antigen specificiteit. Deze technologie biedt veel mogelijkheden voor CTL-op basis van adoptieve immunotherapie.

HLA-Ig Based Artificial antigeen presenterende cellen voor efficiënte Ex vivo Uitbreiding van de Mens CTL

Leer een antigeen-gedreven colitis model om interacties tussen mononucleaire fagocyten en CD4-positieve T-cellen in de darm lamina propria te bestuderen. Deze methode biedt inzicht in de pathogenese van inflammatoire darmziekten.

Ontwikkeling van een antigeen-gedreven Colitis Model naar Presentatie van antigenen te bestuderen door antigen presenterende cellen om T-cellen (Video) | JoVE Journal

Ontwikkeling van een antigeen-gedreven Colitis Model naar Presentatie van antigenen te bestuderen door antigen presenterende cellen om T-cellen

Meer video's verkennen