Ontwikkeling van een antigeen-gedreven Colitis Model naar Presentatie van antigenen te bestuderen door antigen presenterende cellen om T-cellen
18 september 2016
In dit antigeengedreven colitismodel werden OT-II CD4+ T-cellen die een rood fluorescent eiwit tot expressie brengen adoptief overgebracht naar RAG-/- muizen die een groen fluorescent eiwit tot expressie brengen in mononucleaire fagocyten (MP's). De gastheren werden uitgedaagd met Escherichia coli (E.coli) die het ovalbumine-eiwit (OVA) tot expressie brengt, gefuseerd met een cyaan fluorescent eiwit (CFP).
Het algemene doel van dit antigeen-gedreven colitismodel is om te bepalen of CX3, CR1-positieve mononucleaire fagocyten interacteren met en CD4-positieve T-cellen activeren tijdens antigeenspecifieke colitis en of deze mononucleaire fagocyt-afhankelijke expansie van effector T-cellen plaatsvindt binnen de lamina propria van de darm. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van inflammatoire darmziekten, zoals welk type interactie plaatsvindt tussen antigeenpresenterende cellen en de effector T-cellen in de lamina propria van het colon. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de studie mogelijk maakt naar de interactie tussen immuuncellen en de elementen die leiden tot de pathogeniteit van inflammatoire darmziekten.
Deze methode maakt gebruik van het T-celtransfer-colitismodel, waarbij rood fluorescent antigen-specifieke naïeve CD4 T-cellen worden overgebracht naar de immuundeficiënte gastheer, die het groen fluorescent proteïne tot expressie brengt in mononucleaire cellen. De celtransfer wordt gevolgd door orale toediening van blauw fluorescent antigen-expresserende bacteriën. De immuungebeurtenissen die plaatsvinden in de lamina propria van de darm van de gastheren kunnen worden gemonitord in verschillende stadia van de ziekteontwikkeling.
Gebruik dissectiescharen om de dikke darm in de lengte open te snijden en was het weefsel in een petrischaal met 25 milliliters PBS om alle resten en slijm te verwijderen. Snijd de dikke darm in stukjes van vijf tot acht millimeter en plaats de resulterende fragmenten in 20 milliliters verse DPBS zonder calcium en magnesium, aangevuld met tien millimolar HEPES en vijf millimolar EDTA. Vortex de buis met het monster gedurende 30 seconden op maximale snelheid.
Incubeer vervolgens gedurende tien minuten bij 37 °C onder zacht schudden om het epitheel te verwijderen. Vortex na afloop van de incubatie opnieuw gedurende 30 seconden. Verwijder daarna het supernatant dat de epitheelcellen bevat.
Breng de weefselstukjes over naar een nieuwe buis met 20 milliliters verse PBS, HEPES- en EDTA-buffer, en herhaal de incubatie inclusief de vortexstappen ervoor en erna. Na de derde herhaling zijn alle epitheelcellen verwijderd en is het supernatant helder. Was de weefselfragmenten voorzichtig in PBS om eventuele resterende epitheelcellen te verwijderen.
Snijd de weefselfragmenten in stukjes van twee bij twee millimeter en breng de stukjes over voor digestie in 10 mL RPI-medium, aangevuld met 0,5 mg/mL collagenase type eight en 10 units/mL DNAse one. Vortex de monsters gedurende 30 seconden. Incubeer de weefselstukjes vervolgens gedurende 30 tot 35 minuten bij 37 °C onder shaking en vortex de buis elke vijf minuten tijdens de incubatie.
Zodra het weefsel is verteerd, wordt het resulterende mengsel door een celzeef van 70 micron in een conische buis van 50 milliliter gefiltred. Was de celzeef eenmaal en centrifugeer de enkelcel-suspensie. Was de cellen tot slot eenmaal in PBS en centrifugeer.
Bepaal vervolgens het aantal levensvatbare cellen via trypaanblauw-uitsluiting. Cyan fluorescent protein ovalbumine-producerende e. coli activeren de productie van interferon gamma in OT-II-cellen in vitro, in tegenstelling tot e.
coli die enkel CFP tot expressie brengen. Ex vivo 3D confocale beeldvorming van het colonweefsel van transgene muizen die groen fluorescerend eiwit tot expressie brengen en gevoed zijn met e. coli PCFP ova, demonstreert de aanwezigheid van de fluorescent eiwit-exprimerende bacteriën binnen de coloncrypten nabij de intestinale epitheelcellen en gecolokaliseerd met de intestinale fagocyten van de gastheer.
Bij OT-II rode dieren worden de CD4-positieve T-cellen gekenmerkt door hun co-expressie van rood fluorescent eiwit en V bèta 5.1. Wanneer ze worden uitgedaagd met e. coli PCFP ova, verliezen BNT lymfocyt-deficiënte, groen fluorescent eiwit-exprimerende transgene muizen, die adoptief zijn getransplanteerd met OT-II rode CD4-positieve CD62-ligand-positieve T-cellen, snel lichaamsgewicht en ontwikkelen ze klinische tekenen van colitis.
Zeven dagen na de celoverdracht hebben slechts enkele gastheer-fagocyten e. coli PCFP ova opgenomen en worden er geen OT-II rood-positieve cellen gedetecteerd. 14 dagen na de celoverdracht hebben gastheer-fagocyten die de e.
E. coli PCFP-ova bevinden zich in nauwe nabijheid van de adoptief overgedragen OT-II red-positieve cellen. Tegen 21 dagen na de celoverdracht hebben een groot aantal gastheercellen de e. coli PCFP-ova bemonsterd en de donor OT-II red-positieve cellen, die verspreid over de lamina propria van het colon worden aangetroffen, staan in nauw contact met de intestinale fagocyten van de gastheer.
Wanneer deze techniek onder de knie is, kan deze in vier uur worden voltooid mits correct uitgevoerd. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals kleuring van de intestinale lymfocyten en serumcytokine-analyse, worden toegepast om aanvullende vragen over de activatiestatus van CD4 T-cellen te beantwoorden en de ernst van de colitis te bevestigen. Met elke verdere ontwikkeling baant deze techniek de weg voor onderzoek op het gebied van de immunologie om de kleine gebeurtenissen te onderzoeken die leiden tot inflammatoire darmziekten in het muismodel.
Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u immuuncellen uit de lamina propria van het colon kunt isoleren voor verdere ex vivo analyse.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie maakt gebruik van een antigeen-gedreven colitismodel om de interacties tussen CX3, CR1-positieve mononucleaire fagocyten en CD4-positieve T-cellen te onderzoeken. Het model maakt het mogelijk om immuungebeurtenissen in de lamina propria van de darm te volgen tijdens de ziekteontwikkeling.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Inflammatoire darmziekte
- Cellulaire interacties
Achtergrond
- Het begrijpen van de rol van mononucleaire fagocyten bij de activatie van T-cellen.
- Het verkennen van interacties tussen immuuncellen in de lamina propria van het colon.
- Het onderzoeken van pathogene mechanismen bij inflammatoire darmziekten.
- Het gebruik van fluorescerende eiwitten om immuunresponsen te volgen.
Doel van de studie
- Om de interactie tussen mononucleaire fagocyten en CD4 T-cellen te bepalen.
- Om de expansie van effector T-cellen in de lamina propria van de darm te beoordelen.
- Om inzicht te verschaffen in de mechanismen van inflammatoire darmziekten.
Gebruikte methoden
- Adoptieve transfer van OT-II CD4 + T-cellen in RAG -/- muizen.
- Gebruik van fluorescente eiwitten om immuuncellen te labelen.
- Orale gavage van E.coli die ovalbumine gefuseerd met CFP tot expressie brengt.
- Monitoring van immuungebeurtenissen in verschillende stadia van de ziekte.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van interacties tussen mononucleaire fagocyten en T-cellen.
- Bewijs van expansie van effector T-cellen in de lamina propria van de darm.
- Inzichten in de pathogenese van inflammatoire darmziekten.
- Demonstratie van het nut van het T-celtransfermodel voor colitis.
Conclusies
- De studie belicht kritieke interacties in de immuunrespons tijdens colitis.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de mechanismen bij inflammatoire darmziekten.
- Het model biedt een kader voor toekomstig onderzoek in de immunologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Dit antigeengestuurde colitismodel maakt mechanistische analyse mogelijk van interacties tussen antigeenpresenterende cellen en T-cellen binnen een gedefinieerde immunologische context, wat targetvalidatie in onderzoek naar inflammatory bowel disease ondersteunt. Door een reproduceerbaar systeem te bieden voor het bestuderen van pathogene interacties tussen immuuncellen in de lamina propria, vergroot het het voorspellende vertrouwen bij preklinische risicoanalyse van immunomodulerende kandidaten. Het model sluit aan bij vroege discovery-workflows die gericht zijn op pathway-verduidelijking en biologische target-engagement.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken met betrekking tot antigeenspecifieke T-celactivatie door mononucleaire fagocyten.
- Operationele waarde: Biedt een gedefinieerd, door antigenen aangestuurd systeem om biologische pathways te verhelderen die betrokken zijn bij de pathogenese van colitis.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door effector T-cel-expansiegebeurtenissen in darmweefsel te isoleren.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Genereert gevalideerde biologische systemen met fluorescentiegelabelde immuuncellen voor daaropvolgende ex vivo analyse.
- Kwantitatieve resultaten: Maakt meting mogelijk van interacties tussen immuuncellen en cytokineproductie als reactie op blootstelling aan een gedefinieerd antigeen.
- Reproduceerbaarheid: Gestandaardiseerde celisolatie en weefselverwerking ondersteunen consistente monitoring van immuungebeurtenissen over experimentele herhalingen heen.
Translationeel en preklinisch onderzoek
- Ziekte-relevantie: Modelleert antigeen-gedreven intestinale ontsteking om mechanismen te bestuderen die relevant zijn voor subtypen van inflammatoire darmziekten.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen immuuninteractiegegevens uit de ontdekkingsfase en preklinische validatie van therapeutische kandidaten.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Faciliteert de evaluatie van target-engagement en mechanistische effecten voorafgaand aan de lead-optimalisatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode ondersteunt vroege discovery biology door hypothesetests mogelijk te maken van de functies van antigeenpresenterende cellen bij T-celactivatie, waardoor deze methode vóór de stadia van lead-identificatie wordt geplaatst. Het genereert kwantitatieve gegevens over immuunreacties die nuttig zijn voor analytische vergelijking van experimentele condities bij immunologische screening. Het systeem is ontworpen als een herbruikbaar platform voor het bestuderen van immuungemedieerde pathways in meerdere campagnes voor targetvalidatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking van antigeenspecifieke immuunresponsen in de darm.
- Screening: Levert reproduceerbare protocollen voor de isolatie en stimulatie van immuuncellen voor de evaluatie van verbindingen of modulatoren.
- Analytics: Biedt meetbare read-outs, zoals interferon gamma-productie en lokalisatie van immuuncellen, voor het vergelijken van condities.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt mechanistische inzichten met preklinische continuïteit via gedefinieerde antigeen-gestuurde ziektemodellering.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een gestandaardiseerde workflow voor het bestuderen van APC-T-celinteracties die toepasbaar is op meerdere immunologische targets.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in interacties tussen immuuncellen te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid via gedefinieerde antigen-challenge- en celtransferprotocollen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroegtijdige beoordeling van target-gemedieerde biologische effecten mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van immunomodulerende kandidaten op basis van gegevens over immuunactiviteit in de lamina propria.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in immunologie, flowcytometrie en fluorescentiemicroscopie voor de isolatie en analyse van immuuncellen.
- Afhankelijk van toegang tot transgene muismodellen, fluorescerende eiwit-expresserende bacteriën en apparatuur voor de verwerking van darmweefsel.
- Vereist standaardisatie tussen teams wat betreft de timing van celoverdracht, antigeendosering en schema's voor weefselwinning.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten de compatibiliteit van het modelsysteem met verschillende antigeenspecifieke T-celreceptoren en fagocytenmarkers.
- Praktische beperkingen omvatten de technische complexiteit van de isolatie van lamina propria-cellen en de noodzaak van monitoring van de ziekteontwikkeling over meerdere dagen.
