Ontwikkeling van een antigeen-gedreven Colitis Model naar Presentatie van antigenen te bestuderen door antigen presenterende cellen om T-cellen
September 18th, 2016
In dit antigeengedreven colitismodel werden OT-II CD4+ T-cellen die een rood fluorescent eiwit tot expressie brengen adoptief overgebracht naar RAG-/- muizen die een groen fluorescent eiwit tot expressie brengen in mononucleaire fagocyten (MP's). De gastheren werden uitgedaagd met Escherichia coli (E.coli) die het ovalbumine-eiwit (OVA) tot expressie brengt, gefuseerd met een cyaan fluorescent eiwit (CFP).
Het algemene doel van dit antigeen-gedreven colitismodel is om te bepalen of CX3, CR1 positieve mononucleaire fagocyten interageren met en CD4 positieve T-cellen activeren tijdens antigeenspecifieke colitis en of deze mononucleaire phagocyt-afhankelijke effector T-celexpansie plaatsvindt binnen de intestinale lamina propria. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het veld van inflammatoire darmaandoeningen, zoals welke soorten interacties er optreden binnen antigeenpresenterende cellen en de effector T-cellen in de colonale lamina propria. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de studie van de interactie van immuuncellen en de elementen die leiden tot de pathogeniteit van inflammatoire darmaandoeningen mogelijk maakt.
Deze methode gebruikt het T-celtransfercolitismodel, waarbij de rode fluorescerende antigeenspecifieke naive CD4 T-cellen worden overgebracht naar de immunodeficiënte gastheer, die het groene fluorescerende eiwit in mononucleaire cellen tot expressie brengt. De celtransfer wordt gevolgd door orale intubatie van de blauw fluorescerende antigeen-expresserende bacteriën. De immuungebeurtenissen die plaatsvinden in de intestinale lamina propria van de gastheren kunnen in verschillende stadia van ziekteontwikkeling worden gemonitord.
Gebruik dissectiescharen om de colon longitudinaal te openen en was het weefsel in een petrischaaltje met 25 milliliter PBS om eventueel vuil en slijm te verwijderen. Snijd de colon in stukken van vijf tot acht millimeter en plaats de resulterende fragmenten in 20 milliliter vers DPBS zonder calcium en magnesium, aangevuld met tien millimolair HEPES en vijf millimolair EDTA. Vortex de buis met het monster gedurende 30 seconden op maximale snelheid.
Incubeer vervolgens gedurende tien minuten bij 37 graden Celsius met zachtjes schudden om het epitheel te verwijderen. Aan het einde van de incubatie, vortex opnieuw gedurende 30 seconden. Gooi vervolgens het supernatant dat de epitheelcellen bevat weg.
Breng de weefselstukken over in een nieuwe buis met 20 milliliter vers PBS, HEPES en EDTA-buffer en herhaal de incubatie met de vortexstap voor en na. Na de derde herhaling zijn alle epitheelcellen verwijderd en is het supernatant helder. Was de weefselfragmenten voorzichtig in PBS om eventuele resterende epitheelcellen te verwijderen.
Snij de weefselfragmenten in stukken van twee bij twee millimeter en breng de stukken over voor vertering in tien milliliter RPI-medium, aangevuld met 0,5 milligram per milliliter collageenase type acht en tien eenheden per milliliter DNAse een. Vortex de monsters gedurende 30 seconden. Incubeer vervolgens de weefselstukken gedurende 30 tot 35 minuten bij 37 graden Celsius met schudden en vortex de buis elke vijf minuten tijdens de incubatie.
Wanneer het weefsel is verteerd, zeeft het resulterende mengsel door een 70 micron celzeef in een 50 milliliter kegelbuis. Was de celzeef eenmaal en centrifugeer de enkele celsuspensie. Was tenslotte de cellen eenmaal in PBS en centrifugeer.
Bepaal vervolgens het aantal levensvatbare cellen door trypaanblauwe uitsluiting. Cyaan fluorescerend eiwit ovalbumine eiwit producerende e. coli activeren interferon gamma productie in OT-II cellen in vitro in contrast met e.
coli die alleen CFP tot expressie brengen. Ex vivo 3D confocale beeldvorming van het colonale weefsel van transgene groen fluorescerende eiwit expresserende muizen, gevoed met e. coli PCFP ova toont de aanwezigheid van de fluorescerende eiwit-expresserende bacteriën binnen de colonale crypten nabij de intestinale epitheelcellen en geco-lokaliseerd met de intestinale fagocyten van de gastheer.
Bij OT-II rode dieren worden de CD4 positieve T-cellen gekenmerkt door hun co-expressie van rood fluorescerend eiwit en V beta vijf punt een. Wanneer uitgedaagd met e. coli PCFP ova, verliezen BNT-lymfocytendeficiënte groen fluorescerende eiwit-expresserende transgene muizen die adoptief zijn getransplanteerd met OT-II rode CD4 positieve CD62-ligande positieve T-cellen snel lichaamsgewicht en ontwikkelen klinische tekenen van colitis.
Zeven dagen na celtransfer hebben slechts enkele gastheerfagocyten e. coli PCFP ova bemonsterd en OT-II rode positieve cellen worden niet gedetecteerd. Veertien dagen na celtransfer bevinden gastheerfagocyten die de e.
coli PCFP ova hebben bemonsterd zich in nauwe nabijheid van de adoptief overgedragen OT-II rode positieve cellen. Naar 21 dagen na celtransfer hebben een groot aantal gastheercellen de e. coli PCFP ova bemonsterd en donor OT-II rode positieve cellen, die verspreid zijn over de colonale lamina propria, zijn in nauw contact met de intestinale fagocyten van de gastheer.
Wanneer beheerst, kan deze techniek in vier uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals het kleuren van de intestinale lymfocyten en serum cytokine analyse worden uitgevoerd om aanvullende vragen over de activeringstoestand van CD4 T-cellen te beantwoorden en om de ernst van de colitis te bevestigen. Na elke ontwikkeling baant deze techniek de weg voor onderzoek op het gebied van en immunologie om de kleine gebeurtenissen te onderzoeken die leiden tot inflammatoire darmaandoeningen in het muismodel.
Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u colonale lamina propria immuuncellen kunt isoleren voor de downstream ex vivo analyse.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie maakt gebruik van een antigeen-gedreven colitis model om de interacties tussen CX3, CR1 positieve mononucleaire fagocyten en CD4 positieve T-cellen te onderzoeken. Het model maakt het mogelijk om immuungebeurtenissen in de intestinale lamina propria tijdens ziekteontwikkeling te monitoren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Inflammatoire darmaandoeningen
- Cellulaire interacties
Achtergrond
- Het begrijpen van de rol van mononucleaire fagocyten bij T-celactivering.
- Het onderzoeken van immuuncelinteracties in de colonische lamina propria.
- Het onderzoeken van pathogene mechanismen bij inflammatoire darmaandoeningen.
- Het gebruik van fluorescerende eiwitten om immuunresponsen te volgen.
Doel van de studie
- Om de interactie tussen mononucleaire fagocyten en CD4 T-cellen te bepalen.
- Om de expansie van effector T-cellen in de intestinale lamina propria te beoordelen.
- Om inzichten te geven in de mechanismen van inflammatoire darmaandoeningen.
Gebruikte methoden
- Adoptieve overdracht van OT-II CD4 + T-cellen naar RAG -/- muizen.
- Gebruik van fluorescerende eiwitten om immuuncellen te labelen.
- Orale toediening van E.coli die ovalbumine toont dat gefuseerd is met CFP.
- Monitoring van immuungebeurtenissen in verschillende ziektestadia.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van interacties tussen mononucleaire fagocyten en T-cellen.
- Bewijs van expansie van effector T-cellen in de intestinale lamina propria.
- Inzichten in de pathogeniteit van inflammatoire darmaandoeningen.
- Demonstratie van de nuttigheid van het T-cel overdracht colitis model.
Conclusies
- De studie benadrukt kritische interacties in de immuunrespons tijdens colitis.
- Bevindingen dragen bij aan het begrijpen van de mechanismen van inflammatoire darmaandoeningen.
- Het model biedt een raamwerk voor toekomstig onderzoek in immunologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This antigen-driven colitis model enables mechanistic interrogation of antigen-presenting cell and T cell interactions in a defined immunological context, supporting target validation in inflammatory bowel disease research. By providing a reproducible system to study pathogenic immune cell crosstalk in the lamina propria, it enhances predictive confidence in preclinical de-risking of immunomodulatory candidates. The model aligns with early discovery workflows focused on pathway clarification and biological target engagement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding antigen-specific T cell activation by mononuclear phagocytes.
- Operational Value: Provides a defined antigen-driven system to clarify biological pathways involved in colitis pathogenesis.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by isolating effector T cell expansion events in intestinal tissue.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated biological systems with fluorescently labeled immune cells for downstream ex vivo analysis.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of immune cell interactions and cytokine production in response to defined antigen exposure.
- Reproducibility: Standardized cell isolation and tissue processing support consistent immune event monitoring across experimental replicates.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models antigen-driven intestinal inflammation to study mechanisms relevant to subsets of inflammatory bowel disease.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase immune interaction data with preclinical validation of therapeutic candidates.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates evaluation of target engagement and mechanistic effects prior to lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports early discovery biology by enabling hypothesis testing of antigen-presenting cell functions in T cell activation, positioning it before lead identification stages. It generates quantitative immune event data useful for analytics-driven comparison of experimental conditions in immunology screening. The system is designed as a reusable platform for studying immune-mediated pathways across multiple target validation campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification of antigen-specific immune responses in the gut.
- Screening: Delivers reproducible immune cell isolation and stimulation protocols for compound or modulator evaluation.
- Analytics: Provides measurable readouts such as interferon gamma production and immune cell localization for condition comparison.
- Translational Research: Connects mechanistic insights to preclinical continuity through defined antigen-driven disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for studying APC-T cell interactions applicable to multiple immunology targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in immune cell interactions.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined antigen challenge and cell transfer protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of target-mediated biological effects.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on lamina propria immune event data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunology, flow cytometry, and fluorescent microscopy for immune cell isolation and analysis.
- Dependent on access to transgenic mouse models, fluorescent protein-expressing bacteria, and intestinal tissue processing equipment.
- Necessitates cross-team standardization of cell transfer timing, antigen dosing, and tissue harvest schedules.
- Adaptation considerations include model system compatibility with different antigen-specific T cell receptors and phagocyte markers.
- Practical limitations include the technical complexity of lamina propria cell isolation and the need for multi-day disease development monitoring.
