De Visual Colorimetrische Detectie van Multi-nucleotide polymorphisms op een pneumatische Droplet Manipulation Platform

Het algemene doel van deze procedure is om een eenvoudige methode voor het visueel detecteren van multi-nucleotide polymorfismen te combineren met een platform voor pneumatische druppelmanipulatie. Het DNA-detectieplatform bevindt zich op een open oppervlak en is eenvoudig te gebruiken voor biochemisch onderzoekers. We onderzochten een eenvoudig hulpmiddel om herhaaldelijk genetische mutaties en genetische ziekten te detecteren.

Het heeft een groter potentieel om ons te helpen begrijpen hoe genetische variatie leidt tot ziekte. We combineerden twee nieuwe en eenvoudige methoden. De multi-nucleotide polymorfie kan worden gedetecteerd op het platform voor pneumatische druppelmanipulatie met het blote oog en zonder enig extra instrument.

De methode voor het detecteren van multi-nucleotide polymorfie zal worden gedemonstreerd door Tzu-Ming Wang, de postdoctor in onze groep. Om deze procedure te starten, bereid een 100 micromolar oplossing van probe DNA voor zoals aangegeven in het tekstprotocol. Voeg vervolgens de probe DNA toe aan een oplossing van één OD per milliliter goudnanodeeltjes.

Breng de uiteindelijke concentratie van SDS naar 0,01% en van PBS naar 0,01 molair. Laat de oplossing gedurende 20 minuten incuberen. Verhoog vervolgens de concentratie natriumchloride tot 0,05 molair door een oplossing van twee molaire natriumchloride en 0,01 molaire PBS toe te voegen.

Houd de SDS-concentratie op 0,01% en laat de oplossing nog 20 minuten incuberen. Verhoog de concentratie van natriumchloride in stappen van 0,1 molair over intervallen van 20 minuten tot een eindconcentratie van één molair is bereikt. Incubeer de oplossing gedurende de nacht op 23 graden Celsius op een rotator.

Nadat de DNA-monsters en goudnanodeeltjes geconjugeerd zijn, centrifugeer de oplossing gedurende 30 seconden bij 7.000 keer g. Verwijder de supernatant. Bereid vervolgens een 25 nanomolar oplossing van goudnanodeeltjeprobe door het pellet in gedeïoniseerd water te hersuspenderen.

Bereid doel-DNA-monsters voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg zes microliters van de goudnanodeeltjeprobe-oplossing toe aan elk DNA-monster met natriumchloride. Schud elke monsteroplossing gedurende vijf minuten bij 23 graden Celsius met een vortexmixer.

Voeg vervolgens zes microliters van 400 millimolair hydroxylamine en zes microliters van 25,4 millimolair chloroaurinezuur toe aan elke DNA-monsteroplossing. Zet deze monsters opzij, want er zal in de komende uur een gestage verandering in kleur optreden. De grootte, vorm-afhankelijke optische eigenschappen van de nanodeeltje, het aantal mismatches in een typische DNA-fragment van een monster kan met het blote oog worden onderscheiden.

Om te beginnen met het fabriceren van het platform voor druppelmanipulatie, gebruik een computer numeriek bestuurde machine uitgerust met een 0,5 millimeter boorstang om PMMA-gebaseerde mastervormen met microstructuren te produceren. Gebruik voor de boor een aanvoersnelheid van zeven millimeter per seconde en een rotatiesnelheid van 26.000 tpm, en inspecteer de mallen na het boren. Gebruik een luchtblazer en gedeïoniseerd water om het oppervlak van de mastervormen te reinigen en eventuele PMMA-scrap te verwijderen.

Bereid vervolgens een 10 tot 1 mengsel van PDMS-basis en verhardingsmiddel. Ontgas het mengsel in een exsiccator tot alle luchtbellen zijn verwijderd. Giet vervolgens het PDMS-mengsel in de mastervorm.

Bak gedurende drie uur bij 60 graden Celsius om de inverse microstructuren in de luchtkamers en luchtkanalen te verkrijgen. Nadat het bakken voltooid is, verwijder de PDMS-laag van de mastervorm en maak er gaten in voor de luchtaanzuigingsopeningen. Gebruik een zuurstofplasmabehandelingssysteem om de PDMS-membraan en PDMS-laag te reinigen.

Na de behandeling, verbind de PDMS-membraan en de PDMS-laag, en maak vervolgens gaten in deze geconjugeerde structuur. Verbind vervolgens de PDMS en het glazen substraat samen met behulp van een hotplate bij 90 graden Celsius gedurende 10 minuten. Zodra de lagen samen zijn verbonden, plaats de samengestelde plaat in een lasersnijmachine met de PDMS-membraan naar boven.

Importeer het dwg-bestand om het superhydrofobe gebied te definiëren, en merk op dat dit direct in de PDMS-membraan wordt gegraveerd. Reinig het nieuw gegraveerde superhydrofobe oppervlak met gedeïoniseerd water. Dit zal eventuele verkoolde residuen wegspoelen.

Nadat het oppervlak is schoongemaakt, verbind de luchtzuigingsopening en vacuümpomp via een magneetventiel. Verbind vervolgens het magneetventiel met een computer om het te besturen met een digitale IO USB-module. Zodra het platform voor pneumatische druppelmanipulatie is ingesteld, voeg 10 microliter van 0,5 micromolar doel-DNA toe op het superhydrofobe gebied.

Voeg vervolgens 10 microliter vers gehybridiseerde 25 nanomolar goudnanodeeltjeprobe-oplossing naast de doel-DNA-druppel toe. Gebruik een eenvoudig programma om de luchtzuiging naar het platform te regelen via een magneetventiel. Stel de druk in op negatief 80 kilopascal en de aandrijffrequentie op vijf hertz.

Zorg voor zuiging langs de trillingspaden van de druppel, waardoor ze botsen en samenvloeien. Meng vervolgens de samengevoegde druppel door de zuiging te manipuleren om het monster gedurende drie minuten te rollen. Voeg twee microliters van 400 millimolair hydroxylamine en twee microliters van 25,4 millimolair chloroaurinezuur toe aan het superhydrofobe gebied van het platform voor pneumatische druppelmanipulatie.

Manipuleer de zuiging zodat de druppels botsen en samensmelten. Meng vervolgens de samengevoegde druppel door deze gedurende één minuut te rollen. Observeer de kleur van de uiteindelijke druppel met het blote oog.

In deze studie worden multi-nucleotide polymorfismen colorometrisch gedetecteerd met behulp van DNA-hybridisatie gemedieerd groei van goudnanodeeltjeprobes. Hier hebben de DNA-monsters verschillende affiniteiten voor de probe DNA, wat leidt tot verschillen in de groei van de goudnanodeeltjes, zichtbaar als een kleurverandering. Het DNA-monster met drie basenpaar mismatch heeft minder hybridisatie dan het volledig complementaire