Name: De Visual Colorimetrische Detectie van Multi-nucleotide polymorphisms op een pneumatische Droplet Manipulation Platform (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Leer een visuele colorimetrische methode voor het detecteren van multi-nucleotide polymorfismen op een pneumatisch druppelmanipulatieplatform. Deze eenvoudige techniek werkt zonder geavanceerde instrumenten en is toegankelijk voor biochemisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Het Ministerie van Wetenschap en Technologie van Taiwan heeft financiële ondersteuning voor dit onderzoek verleend onder contracten MOST-103-2221-E-002 -097 -MY3.

1. Methode om MNP Detect Let op: Dit gedeelte beschrijft de procedure voor het MNP te detecteren op basis van de hybridisatie-gemedieerde groei van goud nanodeeltjes. <ol><li> Bereid de DNA probe (5&#39;-thiol-GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 &#39;) oplossing bij een concentratie van 100 uM. </li><li> Bereid de probe DNA-gemodificeerde AuNP (AuNP sonde) deeltjes. 21 Opmerking: Het volume hier hangt af van de vereiste DNA probe-gemodificeerde AuNP (AuNP probe) deeltjes. Het is derhalve afhankelijk van het aantal experimenten uitgevoerd. We bereiden meestal overtollige AuNP sonde deeltjes als reserve. Het volume dat in deze stappen instelbaar en flexibel. <ol><li> Voeg probe-DNA (100 uM, bereid in stap 1,1) een oplossing van gouden nanodeeltjes (13 nm, 17 nM) bij concentraties 1 OD / ml. </li><li> Breng de eindconcentraties van natriumdodecylsulfaat (NaCl 12 H 25 SO 4, SDS) en fosfaatbuffer (PBS) met 0,01% en 0,01 M, respectively. </li><li> Na 20 min, brengt de concentratie van natriumchloride (NaCl) tot 0,05 M met een oplossing van NaCI (2 M) en PBS (0,01 M) terwijl SDS bij 0,01% en incubeer gedurende 20 minuten. </li><li> Verhoging van de NaCl-concentratie in stappen van 0,1 M tot een uiteindelijke concentratie van 1 M gedurende 20 minuten intervallen. </li><li> Incubeer overnacht onder schudden op een vortex menger bij 23 ° C. De schudsnelheid niet zolang de DNA-monsters en AuNP probes worden gehybridiseerd beïnvloeden het experiment. </li><li> Centrifugeer de gouden nanodeeltjes bij 7000 xg gedurende 30 seconden en de bovenstaande vloeistof. </li></ol></li><li> Voeg AuNP probe deeltjes in gedeïoniseerd water (DI water) bij een concentratie van 25 nM (AuNP probe-oplossing). </li><li> Bereid doel DNA monsters (volledig complementair: 5&#39;-CTTGCCTACGCCACCAGCTC-3 &#39;, drie basenpaar mismatched: 5&#39;-TTT CTTGCCTAC ACCAGCTC-3&#39;, zes basenparen mismatched: 5&#39;-CTTGCCT TTTTTT CCAGCTC-3 &#39;) bij concentratiesvan 0,06, 0,11, 0,17, 0,20, 0,30, 0,50 uM, respectievelijk. </li><li> Voeg AuNP probe-oplossing (6 pl, 25 nM) in de DNA-monsters (350 ul) met NaCl (14 uM). </li><li> Schud het mengsel van DNA-monsters en AuNP probes met een vortex menger bij 23 ° C gedurende 5 min voor DNA hybridisatie. </li><li> Voor AuNP groei, voeg NH 2 OH (6 pl, 400 mM) en HAuCl 4 (6 pl, 25,4 mmol) aan de oplossing (het mengsel van DNA-monsters en AuNP probes). De groei van AuNP duurt ongeveer 30 seconden voor de voltooiing. De gestage verandering van kleur onderhoudt meer dan 1 uur. LET OP: Huid contact met HAuCl 4 zou ernstige toxische effecten veroorzaken. Raadpleeg de veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor gebruik. Draag handschoenen en gebruik een zuurkast bij het gebruik van HAuCl 4. </li></ol> 2. Fabricage van een pneumatische Droplet Manipulation Platform Opmerking: De PDMS gebaseerde druppel manipulatie platform bestaat uit twee componenten: een PDMS membraan (100 pm) met een super-hydrofoob oppervlak en een lucht-kanaallaag (5 mm). Zonder MEMS proces werden de gemeenschappelijke bewerkingsprocessen gebruikt om deze inrichting die computer-numerieke besturing (CNC) micromachining omvat voor het maken van een mal, PDMS gieten en replicatie voor rapid prototyping van de microfluïdische componenten en laser micromachining fabriceren voor de vervaardiging van een super-hydrofoob oppervlak (zie Figuur 3). <ol><li> Gebruik de CNC machine voorzien van een boorkop (0,5 mm) tot PMMA-gebaseerde meester mallen (zie figuur 3) met microstructuren te produceren. Met een toevoersnelheid van de boorbeitel 7 mm / s en een rotatiesnelheid 26.000 rpm. Gebruik een luchtblazer en DI-water te verwijderen van de PMMA schroot en aan het oppervlak van de meester mallen te reinigen. </li><li> Maak een mengsel van PDMS basis en de verharder in verhouding 10: 1. Ontgas het mengsel in een exsiccator gedurende 30 minuten of totdat alle luchtbellen worden verwijderd. </li><li> Giet de PDMS in the meester schimmel en bak de PDMS gedurende 3 uur bij 60 ° C in de oven om de inverse microstructuren van de luchtkamers (PDMS membraan) en luchtkanalen (PDMS laag) te verkrijgen. </li><li> Verwijder de PDMS laag van de meester mal (met de hand). Punch gaten in de PDMS laag voor lucht-zuig inhammen. </li><li> Doe de PDMS membraan, de PDMS-laag en het glassubstraat in de kamer van de zuurstof-plasmabehandelsysteem. Na zuurstof plasmabehandeling, bond de PDMS membraan, de PDMS-laag en het glassubstraat samen op een verwarmingsplaat (90 ° C) gedurende 10 min. </li><li> Zet de samengestelde chip in de laser-snijmachine (PDMS membraan naar boven). Importeer het DWG-bestand naar de superhydrophobic gebied (15 mm x 12 mm) te definiëren. Zie figuur 3. Direct graveren de PDMS membraan met een CO2-laser machine naar de superhydrophobic gebied op het PDMS membraan (vermogen 12 W, aftastsnelheid 106,68 mm / sec) te creëren. </li><li> Reinig het superhydrophobic oppervlak met DI-water te wassenweg van de verkoolde resten aan de oppervlakte. </li><li> Sluit de air-aanzuigmond en vacuümpomp via een magneetklep (zie figuur 4). Sluit de elektromagnetische klep naar de computer en controle met het digitale I / O-module USB. </li></ol> 3. Gebruik voor de detectie van MNP op de Pneumatische Platform Opmerking: Dit hoofdstuk beschrijft de operatie om colorimetrisch en snel kan identificeren het MNP op de pneumatische druppel manipulatie platform (zie figuur 5). Alle stappen vinden plaats bij 23 ° C (omgevingstemperatuur) en relatieve vochtigheid 85%. <ol><li> Plaats het doelwit DNA monster druppel (10 ui, 0,5 uM) op het superhydrofobe oppervlak van de pneumatische druppel manipulatie platform. </li><li> Plaats de sonde AuNP druppel (10 pi, 25 nM) aan het superhydrofobe oppervlak van de pneumatische druppel manipulatie platform. </li><li> Controle van de lucht afzuigen om de afbuiging van de PDMS membraan veroorzaken met een elektromagnetische klep en een simple programma (bijvoorbeeld Labview). Verschaffen luchtaanzuiging in elke luchtkamer langs de migratie van de druppels (bevattende doel-DNA en AuNP probes respectievelijk) op de PDMS membraan zodat de druppeltjes botsen met elkaar samensmelten. Gebruik een bedrijfsdruk van de vacuümpomp van -80 kPa (overdruk). <ol><li> Als alternatief, de controle van de luchtaanzuiging handmatig zolang de druppel volledig gemengd. Met de hand, sluiten of te ontkoppelen van de vacuümpomp en inhammen van de luchtkamer met buizen in de vroege stadia van het testen. </li></ol></li><li> Controle van de lucht afzuigen van de samengevoegde druppel te rollen naar voren en naar achteren om het mengen van efficiëntie te verbeteren gedurende 3 minuten met behulp van het controlerende systeem van de elektromagnetische klep. Het doelwit DNA en AuNP sondes worden goed gemengd en gehybridiseerd binnen 3 min. Gebruik een aandrijffrequentie en een werkdruk van 5 Hz en -80 kPa (overdruk), respectievelijk. </li><li> Plaats een druppel met NH 2 OH (2 pl, 400 mm) en HAuCl4 (2 pl, 25,4 mM) aan het superhydrofobe oppervlak van de pneumatische druppel manipulatie platform. </li><li> Controle van de lucht afzuigen (-80 kPa overdruk) te laten de druppeltjes botsen met elkaar en samenvloeien. controle dan de lucht zuigkracht (5 Hz en -80 kPa overdruk) te laten de samengevoegde druppel roll naar voren en naar achteren om het mengen van efficiëntie te verbeteren gedurende 1 min. </li><li> Meet en noteer de kleur van de samengevoegde druppel met het blote oog. </li></ol>

<ol><li>Chorley, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+verification+of+functional+single+nucleotide+polymorphisms+in+regulatory+genomic+regions%3A+current+and+developing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.+Rev.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Discovery and verification of functional single nucleotide polymorphisms in regulatory genomic regions: current and developing technologies.</a> Mutat. Res. Rev. Mutat. 659 (1), 147-157 (2008).</li>
<li>Hinds, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+patterns+of+common+DNA+variation+in+three+human+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Whole-genome patterns of common DNA variation in three human populations.</a> Science. 307 (5712), 1072-1079 (2005).</li>
<li>Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+multi-nucleotide+polymorphisms+in+the+human+genome+characterized+by+whole+genome+and+exome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing.</a> Nucleic Acids Res. , 408(2010).</li>
<li>Whelan, S., Goldman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+frequency+of+events+that+cause+multiple-nucleotide+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Estimating the frequency of events that cause multiple-nucleotide changes.</a> Genetics. 167 (4), 2027-2043 (2004).</li>
<li>Saiki, R. K., Walsh, P. S., Levenson, C. H., Erlich, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+amplified+DNA+with+immobilized+sequence-specific+oligonucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (16), 6230-6234 (1989).</li>
<li>Kim, S., Misra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping%3A+technologies+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping: technologies and biomedical applications.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 9, 289-320 (2007).</li>
<li>Kwok, P. Y., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Issues+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of single nucleotide polymorphisms.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 5, 43-60 (2003).</li>
<li>Elghanian, R., Storhoff, J. J., Mucic, R. C., Letsinger, R. L., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+colorimetric+detection+of+polynucleotides+based+on+the+distance-dependent+optical+properties+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles.</a> Science. 277 (5329), 1078-1081 (1997).</li>
<li>Lee, J. S., Han, M. S., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+Detection+of+Mercuric+Ion+%28Hg2%2B%29+in+Aqueous+Media+using+DNA-Functionalized+Gold+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem%22%5BJournal%5D)">Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-Functionalized Gold Nanoparticles.</a> Angew. Chem. 119 (22), 4171-4174 (2007).</li>
<li>Storhoff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticle-based+detection+of+genomic+DNA+targets+on+microarrays+using+a+novel+optical+detection+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticle-based detection of genomic DNA targets on microarrays using a novel optical detection system.</a> Biosens. Bioelectron. 19 (8), 875-883 (2004).</li>
<li>Bao, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+identification+in+unamplified+human+genomic+DNA+with+gold+nanoparticle+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SNP identification in unamplified human genomic DNA with gold nanoparticle probes.</a> Nucleic Acids Res. 33 (2), 15-15 (2005).</li>
<li>Chen, Y. T., Hsu, C. L., Hou, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+single-nucleotide+polymorphisms+using+gold+nanoparticles+and+single-strand-specific+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Detection of single-nucleotide polymorphisms using gold nanoparticles and single-strand-specific nucleases.</a> Anal. Biochem. 375 (2), 299-305 (2008).</li>
<li>Li, H., Rothberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+detection+of+DNA+sequences+based+on+electrostatic+interactions+with+unmodified+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (39), 14036-14039 (2004).</li>
<li>Fang, W. F., Chen, W. J., Yang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+determination+of+DNA+concentration+and+mismatches+using+hybridization-mediated+growth+of+gold+nanoparticle+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor.+Actuat.+B+Chem%22%5BJournal%5D)">Colorimetric determination of DNA concentration and mismatches using hybridization-mediated growth of gold nanoparticle probes.</a> Sensor. Actuat. B Chem. 192, 77-82 (2014).</li>
<li>Wang, Z., Zhang, J., Ekman, J. M., Kenis, P. J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-mediated+control+of+metal+nanoparticle+shape%3A+one-pot+synthesis+and+cellular+uptake+of+highly+stable+and+functional+gold+nanoflowers%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">DNA-mediated control of metal nanoparticle shape: one-pot synthesis and cellular uptake of highly stable and functional gold nanoflowers.</a> Nano Lett. 10 (5), 1886-1891 (2010).</li>
<li>Chen, L., Manz, A., Day, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+nucleic+acid+analysis+integrated+on+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Total nucleic acid analysis integrated on microfluidic devices.</a> Lab Chip. 7 (11), 1413-1423 (2007).</li>
<li>Lien, K. Y., Liu, C. J., Lin, Y. C., Kuo, P. L., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+genomic+DNA+and+detection+of+single+nucleotide+polymorphism+genotyping+utilizing+an+integrated+magnetic+bead-based+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Extraction of genomic DNA and detection of single nucleotide polymorphism genotyping utilizing an integrated magnetic bead-based microfluidic platform.</a> Microfluid. Nanofluid. 6 (4), 539-555 (2009).</li>
<li>Ng, J. K. K., Feng, H. H., Liu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+discrimination+of+single-nucleotide+mismatches+using+a+microfluidic+device+with+monolayered+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Rapid discrimination of single-nucleotide mismatches using a microfluidic device with monolayered beads.</a> Anal. Chim. Acta. 582 (2), 295-303 (2007).</li>
<li>Xing, S., Harake, R. S., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-driven+transports+on+superhydrophobic-patterned+surface+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet-driven transports on superhydrophobic-patterned surface microfluidics.</a> Lab Chip. 11 (21), 3642-3648 (2011).</li>
<li>Huang, C. J., Fang, W. F., Ke, M. S., Chou, H. Y. E., Yang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biocompatible+open-surface+droplet+manipulation+platform+for+detection+of+multi-nucleotide+polymorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A biocompatible open-surface droplet manipulation platform for detection of multi-nucleotide polymorphism.</a> Lab Chip. 14 (12), 2057-2062 (2014).</li>
<li>Mirkin, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C., Storhoff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA-based+method+for+rationally+assembling+nanoparticles+into+macroscopic+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials.</a> Nature. 382 (6592), 607-609 (1996).</li>
<li>Ichimura, K., Oh, S. K., Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-driven+motion+of+liquids+on+a+photo-responsive+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Light-driven motion of liquids on a photo-responsive surface.</a> Science. 288 (5471), 1624-1626 (2000).</li>
<li>Jones, T. B., Gunji, M., Washizu, M., Feldman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectrophoretic+liquid+actuation+and+nanodroplet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Dielectrophoretic liquid actuation and nanodroplet formation.</a> J. Appl. Phys. 89 (2), 1441-1448 (2001).</li>
<li>Lee, J., Kim, C. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-tension-driven+microactuation+based+on+continuous+electrowetting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microelectromech.+S%22%5BJournal%5D)">Surface-tension-driven microactuation based on continuous electrowetting.</a> J. Microelectromech. S. 9 (2), 171-180 (2000).</li>
<li>Daniel, S., Chaudhury, M. K., De Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibration-actuated+drop+motion+on+surfaces+for+batch+microfluidic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Vibration-actuated drop motion on surfaces for batch microfluidic processes.</a> Langmuir. 21 (9), 4240-4248 (2005).</li>
<li>Darhuber, A. A., Valentino, J. P., Davis, J. M., Troian, S. M., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+actuation+by+modulation+of+surface+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Microfluidic actuation by modulation of surface stresses.</a> Appl. Phys. Lett. 82 (4), 657-659 (2003).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

In dit protocol, een eenvoudige colorimetrische methode voor het opsporen MNP kunnen in concentraties variërend 0,11-0,50 uM in reactievaatjes uitgevoerd. Verder is de voorgestelde MNP detectiemethode uitgevoerd op een pneumatische druppel manipulatie platform met een sterk vermogen voor het screenen van DNA en andere biomedische toepassingen heeft. In de praktijk, het detecteerbare bereik van het monster DNA-concentratie is afhankelijk van het mengrendement van de besturingsplatformen. Opdat de samengevoegde druppel vo...

Enkele nucleotide polymorfisme (SNP), dat een enkele basepaar verschil in een DNA-sequentie, is een van de meest voorkomende genetische variaties. Huidige studies rapporteren dat SNPs geassocieerd met de ziekte risico, drug werkzaamheid en bijwerkingen van individuen door beïnvloeding genfunctie. 1,2 recent onderzoek is ook gebleken dat twee of meerdere puntmutaties (multi-nucleotide polymorfisme) bepaalde ziekte veroorzaakt en individuele verschillen in de effecten van de ziekte. 3.4 de detectie van nucleotide polymorfisme is daarom noodzakelijk in prescreening ziekte. Eenvoudige en efficiënte werkwijzen voor de snelle detectie van sequentie-specifieke oligonucleotiden werden sterk ontwikkeld in de laatste twee decennia. 1,5 Huidige benaderingen voor DNA-mutaties typisch procedures waaronder probe immobilisatie fluorescentie labeling, gelelektroforese, etc. identificeren betrekken 6,7 maar deze methoden vereisen over het algemeen een lange analytisch proces, uitgasive apparatuur, goed opgeleide technici, en een aanzienlijk verbruik van de monsters en reagentia. Een nanodeeltjes met een grote verhouding van oppervlak tot volume en unieke fysisch-chemische eigenschappen is een ideaal materiaal als een zeer gevoelige en goedkope detectie platform voor specifieke biomarkers. Gouden nanodeeltjes (AuNP) worden veel gebruikt voor DNA detectie vanwege hun grote vermogen om te worden gemodificeerd met oligonucleotideprobes. 8-10 SNP detectie technieken werden ontwikkeld met AuNP. 11-13 In dit werk wij een nieuwe benadering voor de colorimetrische detectie aangenomen multi-nucleotide polymorfisme (MNP) door middel van DNA-hybridisatie-gemedieerde groei van AuNP probes. 14 Deze eenvoudige en snelle indringende methode is gebaseerd op de theorie dat verschillende lengten van enkelstrengs DNA (ssDNA) of dubbelstrengs DNA (dsDNA) geconjugeerd aan AuNP invloed op de groei grootte en vorm van de AuNP (zie figuur 1). 15 Deze methode van detectie DNAheeft een klein verbruik van reagentia, een kleine test periode (enkele minuten), en een eenvoudige procedure zonder temperatuurregeling die prospectief toepasbaar voor klinische diagnose en huishoudelijke medische screening. Verscheidene microfluïdische systemen voor de DNA-sequentie te detecteren zijn ontwikkeld; 16 deze microfluïdische systemen geëvolueerd van traditionele experimentele protocollen vereist minder stukken grootschalige apparatuur en vereenvoudigde de testprotocollen teneinde de gevoeligheid, detectielimiet en specificiteit van de DNA verbeteren biosensor. DNA detectiemethoden in de microfluïdische systemen nog vereisen echter instrumenten van een volgend proces, zoals een PCR (polymerasekettingreactie) machine voor signaalversterking en een fluorescentie lezer voor een uitlezing van de heterogene SNP identificeren. 17,18 ontwikkelen van een eenvoudige platform zonder verdere verwerking direct uitlezen van de resultaten van de multi-nucleotide polymorfismeis zeer gewenst. Vergeleken met goed gebruikt, conventioneel, gesloten microfluïdische systemen, de open oppervlak microfluïdische inrichtingen verscheidene voordelen, zoals een heldere optische pad een eenvoudige toegang tot het monster, een rechtstreekse milieu toegankelijkheid en niet gemakkelijk gevormd cavitatie of grensvlak obstructie in bieden veelbelovend het kanaal. 19 Ons voorgaand onderzoek werd een eenvoudige pneumatische platform open oppervlak druppel manipulatie (zie figuur 2). 20 op dit platform, druppeltjes kunnen gelijktijdig worden getransporteerd en gemanipuleerd zonder inmenging van een aandrijfenergie via een zuigkracht die een heeft een groot potentieel in de biologische en chemische toepassingen. Deze pneumatische platform wordt aldus gebruikt voor de manipulatie van DNA-monsters uitgevoerd voor MNP detectie in combinatie met de colorimetrische benadering hand van het begrip van DNA-hybridisatie-gemedieerde groei van AuNP probes. Het protocol in dit document beschrijfteen eenvoudige visuele detectie van multi-nucleotide polymorfismen op de pneumatische druppel manipulatie platform een ​​open oppervlak. Dit werk bevestigd dat meerdere nucleotide polymorfisme detecteerbaar met het blote oog; de voorgestelde pneumatische platform is geschikt voor biologische en chemische toepassingen.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>benchtop engravers</td><td>Roland DG</td><td>EGX-400</td><td></td></tr><tr><td>laser cutting machine</td><td>Universal Laser Systems, Inc.</td><td>VLS 3.50</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen plasma treatment system</td><td>Femto Science Inc. Korea</td><td>CUTE-MPR</td><td></td></tr><tr><td>solenoid valve</td><td></td><td></td><td>zelf gebouwd</td></tr><tr><td>vacuum pump</td><td>ULVAC KIKO, Inc.</td><td>DA-30D</td><td></td></tr><tr><td>13-nm AuNP solution</td><td>TAN Bead Inc., Taiwan</td><td>NG-13</td><td></td></tr><tr><td>DNA (met 5'-end gelabeld thiol)</td><td>MDBio, Inc., Taiwan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>UniRegion&nbsp;Bio-Tech,. Taiwan</td><td>PBS001-1L</td><td></td></tr><tr><td>natriumdodecylsulfaat (SDS)</td><td>J. T. baker</td><td>4095-04</td><td></td></tr><tr><td>hydroxylamine oplossing (NH2OH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>467804</td><td></td></tr><tr><td>Chloorgoudzuur (HAuCl4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4022</td><td></td></tr><tr><td>natriumchloride (NaCl)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vortexmixer</td><td>Digisystem Laboratory Instruments Inc.</td><td>VM-2000</td><td></td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>Hermle Labortechnik GmbH.</td><td>Z 216 MK</td><td></td></tr></tbody></table>

de visual colorimetrische detectie van multi-nucleotide polymorphisms op een pneumatische droplet manipulation platform

The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

Een eenvoudige en visuele methode om multi-nucleotide polymorfisme (MNP) sporen werd uitgevoerd op een pneumatische druppel manipulatie platform een ​​open oppervlak. Deze benadering van DNA colorimetrische detectie werd gebaseerd op de hybridisatie-gemedieerde groei van goud nanodeeltjes probes (AuNP probes). De groei afmeting en configuratie van de AuNP worden gedomineerd door het aantal DNA-monsters gehybridiseerd met de probes. Gebaseerd op de specifieke grootte-en vorm-afhankelijke optische eigenschappen van de nanodeeltjes, het aantal verkeerde paringen in een DNA-monster fragment de probes kan worden onderscheiden. De tests werden uitgevoerd via druppeltjes bevattende reagentia en DNA-monsters respectievelijk, en werden getransporteerd en gemengd op de pneumatische platform met de bediende pneumatische zuigkracht van de flexibele PDMS-gebaseerde superhydrophobic membraan. Druppeltjes gelijktijdig en nauwkeurig worden afgeleverd op een open-oppervlak op de voorgestelde pneumatische platform dat is zeer biocompatibel zonder zijde effect van DNA-monsters in de druppels. De combinatie van de twee voorgestelde methoden, kan de multi-nucleotide polymorfismen worden gedetecteerd op zicht op de pneumatische druppel manipulatie platform; geen extra instrument noodzakelijk. De procedure van het installeren van de druppels op het platform om het eindresultaat duurt minder dan 5 minuten, veel minder dan bij bestaande werkwijzen. Bovendien is deze gecombineerde MNP detectiebenadering vereist een monstervolume van 10 pl in elke operatie, hetgeen opmerkelijk lager is dan die van een macro systeem.

In dit werk werden drie DNA monsters getest met een eenvoudige en nieuwe detectie- door DNA-hybridisatie-gemedieerde groei van de AuNP probes. De sequenties van de probe DNA en DNA-monsters van drie soorten specifiek cDNA (volledig complementair aan DNA sonde), TMDNA (drie basenparen mismatched DNA) en SixMDNA (zes basenparen mismatched DNA) zijn vermeld in Protocol stap 1. de mismatches met de sonde van de hier geteste DNA monsters zowel het middensegment van de DNA-monsters. Fi...

Dit werk geeft een eenvoudige en visuele methode om multi-nucleotide polymorfismen detecteren op een pneumatische druppel manipulatie platform. Met de voorgestelde werkwijze, het gehele experiment, met inbegrip druppeltje manipulatie en detectie van multi-nucleotide polymorfismen dergelijke kunnen bij 23 ° C zonder behulp van geavanceerde instrumenten.

De Visual Colorimetrische Detectie van Multi-nucleotide polymorphisms op een pneumatische Droplet Manipulation Platform

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

Het algemene doel van deze procedure is om een eenvoudige methode voor de visuele detectie van multi-nucleotide polymorfismen te combineren met een pneumatisch platform voor druppelmanipulatie. Het DNA-detectieplatform bevindt zich op een open oppervlak en is gemakkelijk te gebruiken voor biochemisch onderzoekers. We hebben een eenvoudig instrument onderzocht om herhaaldelijk genetische mutaties en genetische ziekten te detecteren.Het heeft een groter potentieel om ons te helpen begrijpen hoe genetische variatie leidt tot ziekten. We hebben twee nieuwe en eenvoudige methoden gecombineerd. Het multi-nucleotide polymorfisme kan op het pneumatische druppelmanipulatieplatform met het blote oog en zonder aanvullende instrumenten worden gedetecteerd.De methode voor het detecteren van multi-nucleotide polymorfismen zal worden gedemonstreerd door Tzu-Ming Wang, postdoctoral onderzoeker in onze groep. Ter voorbereiding van deze procedure bereidt u een 100 micromolaire oplossing van probe-DNA voor, zoals aangegeven in het tekstprotocol. Voeg vervolgens het probe-DNA toe aan een oplossing van goudnanodeeltjes met een OD van één per milliliter.Breng de uiteindelijke concentratie SDS naar 0,01%

the-visual-colorimetric-detection-multi-nucleotide-polymorphisms-on

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Druppel op basis van microfluïdische platforms zijn veelbelovende kandidaten voor high throughput experimenten, omdat zij in staat zijn om goedkoop te genereren picoliter, self-gecompartimenteerde schepen op kHz tarieven. Door integratie met snelle, gevoelige en een hoge resolutie fluorescentie spectroscopische methoden, kunnen de grote hoeveelheden informatie uit die in deze systemen efficiënt kunnen worden geëxtraheerd, aangewend en gebruikt.

Fluorescentie detectiemethoden voor microfluïdische druppel platforms

In this video, we present a step-by-step procedure to generate emulsified nano-droplets to detect target nucleic acids by digital polymerase chain reaction or dPCR.

Droplet Digital Polymerase Chain Reaction: A Method to Generate Nanodroplet PCR Reactions for Detecting Rare Tumor Mutations

This video demonstrates the role of digital droplet polymerase chain reaction in identifying indel mutation in a DNA sample. The high precision and sensitivity of ddPCR enable accurate and consistent detection of rare mutations present in a sample, even at low levels. It can identify and quantify indel mutations in different regions of the genome, providing valuable insights into the mechanisms of mutation and the functional consequences of these mutations.

Digital Droplet Polymerase Chain Reaction for Indel Mutation Detection in Target Genes

This video demonstrates the multiplex droplet polymerase chain reaction technique for the simultaneous quantification of methylated DNA regions in different white blood cell populations as an early biomarker for clinical diagnosis and prognosis.

Multiplex Droplet Polymerase Chain Reaction to Detect DNA Methylation in Leukocytes

This video demonstrates the utility of digital PCR in a chip-in-a-tube format for the detection of single nucleotide variations in DNA samples. A single PCR reaction is partitioned into chambers that act as independent PCR reactions, and the detection of fluorescence signals from the amplified targets in the chambers is used to compute the frequency of the variant allele in the sample.

Chip-in-a-Tube-Based Digital PCR for Quantification of Single Nucleotide Variants

Het doel van deze video wijzen voor geautomatiseerde DNA-extractie van formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) referentiestandaard cellijnen en digitale druppeltje PCR (ddPCR) analyse zeldzame mutaties te detecteren in een klinische setting voeren. Detecteren van mutaties in FFPE monsters toont de klinische bruikbaarheid van ddPCR in FFPE monsters.

Gebruikmakend Digital Droplet PCR om BRAF V600E Mutaties Detect in formaline gefixeerde paraffine-ingebedde Reference Standard cellijnen

Meerkleurige fluorescentiedetectie in druppelmicrofluidica omvat doorgaans omvangrijke en complexe detectiesystemen op basis van epifluorescentiemicroscopen. Hier beschrijven we een compact en modulair meerkleurig detectieschema dat gebruikmaakt van een reeks optische vezels om meerkleurige gegevens die door een enkele fotodetector worden verzameld, tijdelijk te coderen.

Multicolor Fluorescentie detectie voor Droplet Microfluidics Met behulp van optische vezels

Dit protocol beschrijft de fabricage van een kleine, kant-en-klare cassette die kan worden toegepast voor visuele detectie van meerdere nucleic zuren in een enkele, test die is eenvoudig te bedienen. In deze benadering werd een capillaire matrix gebruikt voor multiplex en zeer efficiënte opsporing van GGO-doelstellingen.

Visuele detectie van meerdere Nucleic Acids in een capillaire matrix

Hier presenteren we een protocol om meerdere genetische wijzigingen van een target gebied in een enkele reactie drop-off ddPCR met een unieke combinatie van hydrolyse sondes nauwkeurig te kwantificeren.

Één druppel digitale Polymerase-kettingreactie voor alomvattende en gelijktijdige detectie van mutaties in Hotspot regio 's

Epigenetische markers worden gebruikt voor witte bloedcellen (WBC) subtypering door de kwantificering van DNA-methylatiepatronen. Dit protocol presenteert een multiplex druppelpolymeerkettingreactie (mdPCR) methode met behulp van een thermoplastische elastomer (TPE) gebaseerd microfluïde apparaat voor druppelgeneratie waardoor nauwkeurige en multiplex methylatie-specifieke doelkwantificering van WBC differentiële telt.

Methylatiespecifieke Multiplex Droplet PCR met polymeerdruppelgenerator voor hematologische diagnostiek

Dit protocol biedt de stappen van DNA-extractie tot experimentele opstelling voor digitale druppel PCR (ddPCR), inclusief analyse voor de identificatie en kwantificering van niet-homologe end-joining (NHEJ) gebeurtenissen op doellocaties na gRNA-geïnduceerde Cas9-splitsing en DNA-reparatie. Andere toepassingen van deze methode zijn toepassingen zoals polymorfismedetectie en genbewerkingsvariantverificatie.

Digital-Droplet PCR om indels mutaties in genetisch gemodificeerde anopheline muggenpopulaties te detecteren

Leer een visuele colorimetrische methode voor het detecteren van multi-nucleotide polymorfismen op een pneumatisch druppelmanipulatieplatform. Deze eenvoudige techniek werkt zonder geavanceerde instrumenten en is toegankelijk voor biochemisch onderzoek.

De Visual Colorimetrische Detectie van Multi-nucleotide polymorphisms op een pneumatische Droplet Manipulation Platform

Meer video's verkennen