Name: Ontwerp en gebruik van een Low Cost, Automatiseren Morbidostat voor Adaptive evolutie van bacteriën onder antibioticum selectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Leer hoe u een kosteneffectieve morbidostat bouwt voor adaptieve evolutie van bacteriën onder antibiotische selectie. Dit apparaat monitort groei continu en past medicijnconcentraties dynamisch aan voor microbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen Prof. Sze-Bi Hsu en mevrouw Zhenzhen bedanken voor nuttige discussies en hulp bij de theoretische analyse en numerieke simulatie. Y. T. Y. wil financieringsondersteuning erkennen van het Ministerie van Wetenschap en Technologie onder subsidienummers MOST 103-2220-E-007-026 en MOST 104-2220-E-007-011, en van de National Tsing Hua Universiteit onder subsidienummers 103N2042E1, 104N2042E1 en 105N518CE1.

1. Montage en pretest van de Morbidostat Device <ol><li> Montage van de Morbidostat <ol><li> Punch 3 gaten op de kap van de cultuur flacon met een 18 G naald. Snijd drie stukken van polyethyleen buis ~ 7 cm lang. Plaats deze drie stukken van polyethyleen buis op de dop. </li><li> Gebruik tape om de rand van de kap wikkel te dienen als de gietvorm voor het polydimethylsiloxaan (PDMS) mengsel. Meng 5 g component A en 0,5 g van component B de PDMS in een 150 ml plastic container handmatig roeren met een tandenstoker. Plaats het mengsel in een 10 ml spuit. <ol><li> Giet het PDMS mengsel op de dop met de spuit. Bak de gehele dop op het PDMS harden 8 uur in de oven op 70 ° C. </li></ol></li><li> Soldeer de LED anode met 24 gauge draad en LED kathode met de koolstof weerstand met een soldeerbout. Soldeer een 680 Ω koolstof weerstand met een 24 G draad. Isoleer de draad verbinding met behulp van elektrische tape. </li><li> Zolder de collector van de fotodetector 24 met de G draad en de emitter van de fotodetector met een 100 kQ koolweerstand. Isoleer de draad verbinding met behulp van elektrische tape. </li><li> Plaats de light emitting diode in de cultuur flacon houder. Door het volgen van het schema bij het tweede Aanvullend figuur 2, sluit de lichtemitterende diode en de macht met een voeding van 5 V. Zorg ervoor dat de LED werkt met behulp van een digitale camera die IR (bijvoorbeeld een mobiele telefoon met camera) kan detecteren. </li><li> Plaats de fotodetector in de cultuur flacon houder. Door het schakelschema in figuur 2 Aanvullend sluit de fotodetector en voeding met een voeding van 5 V. Sluit de draad aan beide zijden van de fotodetector weerstanden om de spanning over de elektronisch bedieningspaneel meten. </li><li> Lijm een ​​magneet op de as van de ventilator, die als magnetische roerder unit. Merk op dat de alignment van de as van de ventilator aan de cultuur flesje, en de afstand tussen de cultuur flesje en de magneet is zeer belangrijk voor de goede werking van het magnetisch roerorgaan. </li><li> Sluit elk stuk van polyethyleen buis van de cultuur flacon in de overeenkomstige stuk van siliconen buizen voor de micro-pompen, middelgrote flessen, en de fles afval. Zet de pomp gedurende 1 uur en het meten van het totale volume van het medium fles naar de kweek flesje wordt gepompt om de pompsnelheid te bepalen. Merk op dat de normale pompsnelheid ~ 4 ml / uur, wat overeenkomt met de verdunning D = 0,33 h-1 voor een 12 ml werkvolume van de kweek injectieflacon dient. </li><li> Plaats het geheel op een middelgrote (34 cm x 34 cm x 43,5 cm) shaker incubator. </li></ol></li><li> Pretest de Morbidostat <ol><li> Set voedingsspanning van koele ventilator 5 V aan de motor om de magnetische roerstaaf testen beginnen. Merk op dat de roeren actie visueel kan worden geïnspecteerd. De spanning die rijdens de koelventilator motor wordt nauwkeurig gecontroleerd door pulsbreedtemodulatie (PWM). </li><li> Bereid een reeks van wild-type E. coli monsters met optische dichtheden bij 600 nm gewoonlijk tussen 0,07-0,3 kalibratie. Plaats een test E. coli monster in de cultuur flacon en noteer de fotodetector spanning. <ol><li> Plaats ~ 100 ul van hetzelfde monster in de plaatlezer en noteer de optische dichtheid. Gebruik de fotodetector spanning versus optische dichtheid data om de kalibratiecurve te plotten. Merk op dat typisch een eenheid verandering in optische dichtheid overeenkomt met ~ 7,6 V wijziging van de fotodetector met de bias schema hier gebruikt. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Het uitvoeren van de Morbidostat <ol><li> Voorbereiding Voordat u de Daily Experiment <ol><li> Bereid de cultuur flacon met drie ultra-chemisch bestendige Tygon buizen met een binnendiameter 1/32 inch en buitendiameter 3/32 inch voor inlaten om het apparaat zoals in hoofdstuk vormen1,1 en aanvullende figuur 1. </li><li> Bereid de M9 minimaal medium (0,2% glucose) en trimethoprim (TMP) geneesmiddel-bevattende medium. Steriliseer het medium, het medium fles, de drug medium fles, de fles afval en de cultuur flacon in een autoclaaf bij 121 ° C. OPMERKING: De TMP is een voorraadoplossing die wordt gebruikt om de concentraties in tabel 1 en de TMP geneesmiddel bevattende medium wordt niet geautoclaveerd later bereiken. </li></ol></li><li> Het uitvoeren van de Morbidostat <ol><li> Op de eerste dag van het experiment, ontdooien 1 ml bevroren wildtype E. coli MG1655 cellen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en overdracht 120 ul van de cellen aan de cultuur flacon met ~ 12 ml M9 groeimedium. Na de eerste dag, ontdooien 1 ml ingevroren E. coli-cellen uit de vorige dag gedurende 5 min en overdracht 120 ul van de cellen om een nieuwe cultuur flacon met ~ 12 ml M9 groeimedium. </li><li> Schakel de shaker incubator en stel de tempe<html> tuur tot 30 ° C zonder schudden. </li><li> Start de morbidostat operatie instelling door de micro-pomp, het magnetisch roerorgaan, en het meten extinctie. OPMERKING: Tijdens de operatie wordt een feedbackdrempel algoritme gebruikt om de geneesmiddelinjectie regelen. Als de gemeten optische dichtheid een vooraf ingestelde drempel overschrijdt, zou het geneesmiddel injectiepomp worden ingeschakeld en de circulatiepomp worden uitgeschakeld. Anders, de drug injectiepomp blijft uit en de circulatiepomp is ingeschakeld. </li><li> Controleer de spanning van tijd tot tijd om te zorgen voor microbiële groei. Let op: Als gevolg van de vorst en dooi cyclus, E. coli-cellen vertonen een vertraging van ~ 4 uur tijdens de groei elke dag. </li><li> Na ~ 23 uur, stop de micro-pomp door het uitschakelen van de voedingsspanning en neem de cultuur flacon. Voeg 15% glycerol in de cultuur flacon en bevriezen van het monster bij -80 ° C voor opslag. </li><li> Herhaal de stappen 2.2.1 tot en met 2.2.5. </li></ol></li></ol>le &quot;&gt; 3. antibioticagevoeligheid meting in 96 Well Format OPMERKING: Voer de groei gemeten in een plaat reader met een goed formaat 96 bij de resistentie tegen antibiotica te bepalen. <ol><li> Ontdooi de dagelijkse bevroren monster bij kamertemperatuur gedurende 5 min en breng 15 pl van de cellen aan de cultuur flacon met ~ 15 ml M9-medium. Laat ze groeien tot de optische dichtheid bij 600 nm ~ 0,1 bereikt. Verdeel de 15 ml in 1 ml flesjes en voeg de TMP geneesmiddel bij deze stap de gewenste geneesmiddelconcentraties verkrijgen zoals weergegeven in tabel 1. </li><li> Neem 200 ul van het monster van stap 3.1 en plaats in elk putje in de plaat lezer en hen in staat stellen om te groeien gedurende 12 uur 5. De optische dichtheid bij 600 nm golflengte wordt automatisch opgenomen tijdens de meting. LET OP: Voor elk meetpunt, drievoud metingen worden geregistreerd en gemiddeld om de consistentie van de gegevens te waarborgen. De gegevens op de optische dichtheid versus tijd be gebruikt om de groei te verkrijgen. </li><li> Plot de groei van gegevens ten opzichte van de concentratie geneesmiddel om IC 50 te verkrijgen. Merk op dat de IC50 wordt gedefinieerd als de geneesmiddelconcentratie waarbij de groei is de helft van de maximale groeisnelheid 5. </li></ol> 4. Single Cell morfologie en antibioticagevoeligheid Meting in microfluïdische apparaten <ol><li> Voer vervaardiging van microfluïdische inrichtingen via zachte meerlaagslithografie van PDMS zoals elders 15 beschreven. <ol><li> Gebruik fotolithografie om de fotoresist mal voor de controle en de stroom lagen te maken. Merk op dat voor de controle laag, gebruiken negatief fotolak (~ 15 micrometer hoogte) en de positieve fotoresist (~ 8 urn hoogte) om een ​​mal te produceren op een kale silicium wafer. </li><li> Bereid PDMS mengsels met verknoping verhoudingen van 5: 1 en 20: 1 voor de controle laag en de stroom laag resp. Doe het mengsel in een exsiccator onder vacuüm om eventuele luchtbellen te verwijderenVoor 1 uur. </li><li> Expose de controle laag fotolak schimmels op silicium wafer te trimethylchloorsilaan (TMCS) damp. Het controlepaneel laag ~ 6 mm dikte door het gieten van de PDMS mengsel (met verknoping verhouding 5: 1) op de siliciumplak de besturingslaag fotoresist schimmel. Bak de besturingslaag gedurende 40 minuten bij 80 ° C gedurende 1 uur in de oven. </li><li> Maak de stroom laag door draai het coaten van een PDMS mengsel (met de cross-linking verhouding van 20: 1, centrifugeersnelheid 3000 tpm gedurende 60 sec) op een stroom laag fotolak schimmel. Bak de stroom laag voor 30 minuten bij 80 ° C gedurende 1 uur in de oven. </li><li> Gebruik een scheermesje om de besturingslaag in de gewenste chip grootte (gewoonlijk 3 cm x 2 cm) gesneden en handmatig trek het besturingslaag. Plaats de besturing laag bovenop de laag debiet en richt ze onder een stereomicroscoop. Hard de uitgelijnde samenstel bij 80 ° C in de oven gedurende de nacht. Daarna geniet het samenstel in 250 ml gedeïoniseerd water in een plastic container voor 5 uur om de resterende TMCS oplossen. </li><li> Vervolgens punch de inlaat gaten 20 G naalden en bond de gehele elastomeer een glasplaatje gecoat met een blanco PDMS laag (PDMS verknopende verhouding 5: 1, centrifugeersnelheid 2000 tpm gedurende 30 sec) door de lucht plasmabehandeling gedurende 40 s bij 1.2 Torr luchtdruk. </li><li> Voeren uitgebreide bakken voor 36 uur bij 80 ° C voor de cytotoxische effecten van PDMS verminderen. Merk op dat deze bakstap is cruciaal voor de toxiciteit voor de bacteriële cellen te minimaliseren. </li></ol></li><li> On Chip Growth Experiment <ol><li> Voordat u in de microfluïdische apparaat, spoelen met gedemineraliseerd water gedurende 1 uur en M9 medium gedurende 1 uur. </li><li> Ontdooi de dagelijkse bevroren monster bij kamertemperatuur gedurende 5 min en beënt een nieuwe reageerbuis met vers M9 medium. Het monster wordt in een shaker incubator bij 37 ° C overnacht. </li><li> Verdun het microbiële monster 10-voudige met M9 medium en plaats hem in de microfluïdische apparaat door druk uit op de microbiële sample container bij 5 psi. laadt dan de TMP drugmedium in de chip door druk uit op de drug medium container bij 5 psi. Voer de menging tussen de microbe en geneesmiddel door het bedienen van de micromechanische klep tussen de twee kamers op de microfluïdische chip gedurende 15 min. </li><li> Plaats de microfluïdische chip in de incubator microscoop gemonteerd op de omgekeerde microscoop. Het verwerven van de afbeelding cel in de groeikamer elk uur gedurende 8 uur met de CCD camera gemonteerd op de omgekeerde microscoop. </li><li> Gebruik het aangepaste programma script om de cel aantallen te berekenen via een drempel algoritme op het beeld cel data 18. Merk op dat het aantal cellen gegevens worden gemiddeld normaal meer dan drie microfluïdische kamers. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Levy, S. B., Marshall, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+worldwide%3A+causes%2C+challenges%2C+and+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance worldwide: causes, challenges, and responses.</a> Nat. Med. 10, s122-s129 (2004).</li>
<li>Wang, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+in+vivo+evolution+of+multidrug+resistance+in+Staphylococus+aureus+by+whole+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Pro.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing.</a> Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451(2007).</li>
<li>Dragosits, M., Mattanovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+laboratory+evolution+-+principles+and+applications+for+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factory%22%5BJournal%5D)">Adaptive laboratory evolution - principles and applications for biotechnology.</a> Microbial Cell Factory. 12, 64(2013).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+emergence+of+bacterial+antibiotic+resistance+in+connected+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironment.</a> Science. 333, 1764-1767 (2011).</li>
<li>Toprak, E., Veres, A., Michel, J. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+paths+to+antibiotic+resistance+under+dynamically+sustained+drug+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection.</a> Nature Genetics. 44, 101-106 (2012).</li>
<li>Toprak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+morbidostast%3A+an+automated+continuous+culture+device+for+studying+bacterial+drug+resistance+under+dynamically+sustained+drug+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Building a morbidostast: an automated continuous culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition.</a> Nature Protocol. 8, 555-567 (2013).</li>
<li>Rosenthal, A. Z., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+evolution+of+bacterial+antibiotic+resistance+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Following evolution of bacterial antibiotic resistance in real time.</a> Nature Genetics. 44, 11-13 (2012).</li>
<li>Young, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antibacterial+resistance+selection+and+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">In vitro antibacterial resistance selection and quantitation.</a> Curr Protoc Pharmacol. , (2006).</li>
<li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+with+the+Chemostat+on+spontaneous+mutations+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).</li>
<li>Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+monitoring+of+bacteria+undergoing+programmed+population+control+in+a+microchemostat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat.</a> Science. 309, 137-140 (2005).</li>
<li>Groisman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+chemostat+for+experiments+with+bacterial+and+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells.</a> Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).</li>
<li>Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Use+of+Multiplexed+Chemostat+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays.</a> J. Vis. Exp. (72), e50262(2013).</li>
<li>Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low+cost%2C+customizable+turbidostat+for+use+in+synthetic+circuit+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization.</a> ACS Synthetic Biology. , (2015).</li>
<li>Mohan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplexed+microfluidic+platform+for+rapid+antibiotic+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectrons%22%5BJournal%5D)">A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing.</a> Biosens Bioelectrons. 49, 118-125 (2013).</li>
<li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li>
<li>Kellogg, R. A., Gomez-Sjoberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKellogg%2C+RA+%22Nat.+Protocols%22">Nat. Protocols</a>. 9, 1713(2014).</li>
<li>Gu, G. Y., Lee, Y. W., Chiang, C. C., Yang, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nanoliter+microfluidic+serial+dilution+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">A nanoliter microfluidic serial dilution bioreactor.</a> Biomicrofluidics. 9, 044126(2015).</li>
<li>Gonzalez, R. C., Woods, R. E., Eddins, S. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGonzalez%2C+RC+%22Digital+image+using+Matlab+processing%22">Digital image using Matlab processing</a>. , Pearson Prentice Hall. Upper Saddle River, New Jersey. (2004).</li>
<li>Heikkila, E., Sundstrom, L., Huovinen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimethoprim+resistance+in+Escherichia+coli+isolates+from+a+geriatric+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Trimethoprim resistance in Escherichia coli isolates from a geriatric unit.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2013-2015 (1990).</li>
<li>Flensburg, J., Skold, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+overproduction+of+dihydrofolate+reductase+in+bacteria+as+a+response+to+the+use+of+trimethoprim%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Massive overproduction of dihydrofolate reductase in bacteria as a response to the use of trimethoprim.</a> Eur. J. Biochem. 162, 473-476 (1987).</li>
<li>Ohmae, E., Sasaki, Y., Gekko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+five-tryptophan+mutations+on+structure%2C+stability+and+function+of+Escherichia+coli+dihydrofolate+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effects of five-tryptophan mutations on structure, stability and function of Escherichia coli dihydrofolate reductase.</a> J. Biochem. 130, 439-447 (2001).</li>
<li>Smith, D. R., Calvo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+dihydrofolate+reductase+genes+from+trimethoprim-resistant+mutants+of+Escherichia+coli.+Evidence+that+dihydrofolate+reductase+interacts+with+another+essential+gene+product%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of dihydrofolate reductase genes from trimethoprim-resistant mutants of Escherichia coli. Evidence that dihydrofolate reductase interacts with another essential gene product.</a> Mol. Gen. Genet. 187, 72-78 (1982).</li>
<li>Okumus, B., Yildiz, S., Toprak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluidic+and+microfluidic+tools+for+quantitative+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotech%22%5BJournal%5D)">Fluidic and microfluidic tools for quantitative systems biology.</a> Curr Opin Biotech. 25, 30-38 (2014).</li>
<li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+antimicrobial+susceptibility+test+based+on+single-cell+morphological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis.</a> Sci. Transl. Med. 17, 267(2014).</li>
<li>Hsu, S. B., Waltman, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+a+model+of+two+competitors+in+a+chemostat+with+an+external+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22SIAM+J.+Applied+Math%22%5BJournal%5D)">Analysis of a model of two competitors in a chemostat with an external inhibitor.</a> SIAM J. Applied Math. , 528-540 (1992).</li>
<li>Fu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+biomass+productivity+and+cell+density+of+Chlorella+vulgaris+by+using+light-emitting+diode-based+photobioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Maximizing biomass productivity and cell density of Chlorella vulgaris by using light-emitting diode-based photobioreactor.</a> J. Biotech. 161, 242-249 (2012).</li>
<li>Peabody, V. G. L., Winkler, J., Kao, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+developing+tolerance+to+toxic+chemicals+in+microbial+systems+and+perspectives+on+moving+the+field+forward+and+into+the+industrial+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+in+Chem+Eng%22%5BJournal%5D)">Tools for developing tolerance to toxic chemicals in microbial systems and perspectives on moving the field forward and into the industrial setting.</a> Curr Opin in Chem Eng. 6, 9-17 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een low-footprint morbidostat apparaat goedkope componenten wordt aangetoond. De toename van geneesmiddelresistentie niveau door de inrichting geregistreerde komen overeen met die van eerdere verslagen 5. Geschikt voor evolutionaire studies van resistentie, de inrichting is potentieel van toepassing op vele andere experimenten. Ten eerste kan een uitgebreide database van drugs geïnduceerde mutaties worden vastgesteld voor een grote set van klinisch relevante antibiotica. Zo kan de evolutiepad van meervoudige ...

Sinds de introductie van het eerste antibioticum penicilline heeft microbiële resistentie ontwikkeld tot een wereldwijd gezondheidsprobleem 1. Hoewel de overname van antibioticaresistentie achteraf kan worden bestudeerd in vivo, zijn de voorwaarden van deze experimenten vaak niet gecontroleerd door de hele evolutie 2. Als alternatief kan adaptieve laboratorium evolutie van de moleculaire evolutie van een microbiële soort in het kader van milieu-invloeden of selectiedruk onthullen van een antibioticum drug 3. Onlangs hebben veel goed gecontroleerde evolutionaire experimenten van antibiotica-resistentie het ontstaan ​​van resistentie tegen antibiotica drug opgehelderd. Bijvoorbeeld, Austin&#39;s groep toonde snelle opkomst in een correct ontworpen microfluïdische gecompartimenteerd milieu 4. De recent ontwikkelde morbidostat induceert systematische mutaties onder drug selectiedruk 5,6. De morbidostat, een microbieel Selectie-apparaat dat continu aanpast het antibioticum concentratie een bijna constante bevolking te behouden, is een grote stap voorwaarts van de fluctuatie-test gebruikt in de microbiologie 7,8. In de fluctuatie test wordt een antibioticum ingespoten in een hoge concentratie, en de overlevende mutanten onderzocht en geteld. In plaats daarvan, microben in een morbidostat worden voortdurend uitgedaagd en het verwerven van meerdere mutaties. De morbidostat werkt op dezelfde wijze als de chemostaat, een cultuur apparaat uitgevonden door Novick en Szliard in 1950, dat een constante populatie onderhoudt door voortdurend het leveren van voedingsstoffen, terwijl het verdunnen van de microbiële populatie 9. Sinds de introductie heeft de chemostaat naar voren gebracht en verbeterd. Huidige microfluïdische chemostaten hebben nanoliter en single-cell capaciteit bereikt. Maar deze inrichtingen zijn niet geschikt voor adaptieve evolutie experimenten, die een grote celpopulatie met vele mutatie gebeurtenissen 10,11 vereisen. Onlangs, mini-chemostaten met werkende volumes ~ 10 ml zijn ontwikkeld in de spleet tussen literschaal bioreactoren en de microfluïdische chemostaat 12,13 te vullen. Hier presenteren we het ontwerp en gebruik van een low-cost, geautomatiseerde morbidostat voor een antibioticum resistentie tegen geneesmiddelen studie. De voorgestelde module kan worden toegepast in een shaker incubator in een microbiologisch laboratorium met minimale hardware vereisten. De open source firmware ook gemakkelijk afgestemd op specifieke toepassingen van adaptieve evolutie, zoals metabolic engineering 3. Tenslotte wordt de morbidostat geïntegreerd in een gemultiplexte microfluïdische platform antibiotische gevoeligheidstests 14.

<table><tbody><tr><td>Environmental Shaker Incubator</td><td>BioSan</td><td>ES-20</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Leonardo board</td><td>Arduino</td><td>Leonardo</td><td></td></tr><tr><td>680 Ohm Carbon Resistor</td><td>Digikey</td><td></td><td>Bias resistor voor LED</td></tr><tr><td>100k Ohm Carbon resistor</td><td>Digikey</td><td></td><td>Bias resistor voor fototransistor</td></tr><tr><td>940 nm lichtemitterende diode</td><td>Bright LED Electronic</td><td>BIR-BM13E4G-2</td><td>Optische dichtheidsmeting</td></tr><tr><td>940 nm fototransistor</td><td>Kodenshi&nbsp;</td><td>ST-2L2B</td><td>Optische dichtheidsmeting</td></tr><tr><td>Darlingtonpaar IC Toshiba</td><td>Mouser</td><td>ULN2803APG</td><td>deze IC bestuurt micropompen en magnetische roerunit</td></tr><tr><td>5 V DC borstelloze ventilator</td><td>ADDA</td><td>AD0405LX-G70</td><td>spec: 5 V voedingsspanning en 80&nbsp;mA; verkrijgbaar www.jameco.com</td></tr><tr><td>Piezo-elektrische micropomp</td><td>CurieJet</td><td>PS15I-FT-5L</td><td>Druk > 3&nbsp;kPa; Stroomsnelheid >5 ml/min</td></tr><tr><td>Tygon 3350 Tuning</td><td>Saint Gobain</td><td>ABW00001</td><td>ID: 1/32" OD: 3/32" L:50'&nbsp;</td></tr><tr><td>Magnetische roerstaaf</td><td>COWIE</td><td></td><td>toelopende vorm afm: 10&nbsp;mm x 4 mm</td></tr><tr><td>Glas scintillatie 20 ml-vial</td><td>DGS</td><td></td><td>Pyrex glas 28 mm (diameter) x 61 mm (hoogte)</td></tr><tr><td>Kweekvial houder</td><td></td><td></td><td>Op maat gemaakt van Polyformaldehyde&nbsp;</td></tr><tr><td>Silicone</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>gebruikt om de glazen vial te verzegelen</td></tr><tr><td>Medium fles</td><td>VWR</td><td>66022-065</td><td></td></tr><tr><td>Difco M9 minimaal zout 5x</td><td>BD</td><td></td><td>Medium</td></tr><tr><td>Cadaminzuur</td><td>BD</td><td></td><td>Medium</td></tr><tr><td>glucose</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar Bacteriologisch</td><td>Oxoid</td><td></td><td>voor agarplaat</td></tr><tr><td>Luria Bertani medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde microscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica DMI-LED</td><td>gebruikt voor microfluïdische meting Gebruik 40X objectief NA = 0,55</td></tr><tr><td>Microscoop Incubator</td><td>Live Cell Instrument</td><td>CU-109</td><td>gebruikt voor microfluïdische meting</td></tr><tr><td>Solenoïde kleppen</td><td>Pneumadyne</td><td>S10MM-31-12-3</td><td>Normaal open 1,3 Watt 12 Vdc</td></tr><tr><td>USB-interfacekaart</td><td>Hobby Engineering</td><td>USBIO24-R Digital I/O Module&nbsp;</td><td>voor microfluïdische meting</td></tr><tr><td>Luchtcompressor</td><td>Rocker Scientific</td><td>ROCKER 440</td><td>Drukbron voor microfluïdica; Max. Druk 80 psi</td></tr><tr><td>Mannelijke luer-lock fittingen tot 1/8" barb</td><td>ValuePlastics.com</td><td>MTLL230-1</td><td>gebruikt voor microfluïdische controle</td></tr><tr><td>1/8" barb naar 10-32 schroefdraadpoort</td><td>ValuePlastics.com</td><td>B-1</td><td>gebruikt voor microfluïdische controle</td></tr><tr><td>Vrouwelijke luer-lock fittingen naar 10-32 schroefdraadpoort</td><td>ValuePlastics.com</td><td>KFTL-1</td><td>gebruikt voor microfluïdische controle</td></tr><tr><td>NPN darlington transistor 500 mA, 40&nbsp;V (2N6427)</td><td>DigiKey.com</td><td>2N6427GOS-ND</td><td>gebruikt voor microfluïdische controle</td></tr><tr><td>10 kOhm, koolstoffilmweerstand, 0,25 W</td><td>DigiKey.com</td><td>P10KBACT-ND</td><td>gebruikt voor microfluïdische controle</td></tr><tr><td>Tantaalcondensator, 10&nbsp;&mu;F, 25 V, 10%</td><td>DigiKey.com</td><td>478-1841-ND</td><td>gebruikt voor microfluïdische controle</td></tr><tr><td>Andor CCD camera</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 Plus SCMOS</td><td>gebruikt voor microfluïdische on-chip beeldvorming</td></tr><tr><td>ELISA plate reader</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tweecomponenten siliconen&nbsp;</td><td>Momentive</td><td>RTV 615</td><td>gebruikt voor microfluïdische chipfabricage</td></tr><tr><td>SU-8 fotoresist</td><td>Micrchem</td><td>SU8 2015</td><td>gebruikt voor microfluïdische chipfabricage</td></tr><tr><td>AZ4620 fotoresist</td><td>Clariant</td><td>AZ 4620</td><td>gebruikt voor microfluïdische chipfabricage</td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC 32G</td><td>gebruikt voor microfluïdische chipfabricage</td></tr><tr><td>20 Gauge Naald voor spuit</td><td>BD</td><td></td><td>gebruikt voor microfluïdische chipfabricage</td></tr><tr><td>Labcycler</td><td>Sensoquest</td><td>Labcycler</td><td>PCR</td></tr><tr><td>DNA polymerase</td><td>Toyobo</td><td>KDO Plus</td><td>PCR-amplificatie</td></tr><tr><td>Trimethoprim</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1 hybrid&nbsp;</td><td>antibioticumresistentiemeting</td></tr></tbody></table>

ontwerp en gebruik van een low cost, automatiseren morbidostat voor adaptive evolutie van bacteriën onder antibioticum selectie

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

We beschrijven een lage kostprijs, configureerbare morbidostat voor het karakteriseren van de evolutionaire route van resistentie tegen antibiotica. De morbidostat is een bacteriecultuur apparaat dat voortdurend toezicht op de groei van bacteriën en dynamisch de concentratie van het geneesmiddel om voortdurend uitdagen de bacteriën als ze zich ontwikkelen tot resistentie tegen geneesmiddelen te verwerven. Het apparaat beschikt over een werkend volume van ~ 10 ml en is volledig geautomatiseerd en uitgerust met een optische dichtheid meet- en micro-pompen voor middelgrote en drug delivery. Het platform te valideren, maten we de stapsgewijze verwerving van trimethoprim resistentie bij Escherichia coli MG 1655, en de inrichting geïntegreerd met gemultiplexte microfluïdische platform celmorfologie en antibiotische gevoeligheid onderzocht. De aanpak kan worden opgeschaald tot laboratoriumonderzoek van antibiotica-resistentie tegen geneesmiddelen, en is uitbreidbaar tot evolutie adaptieve voor stam verbeteringen in de metabolic engineering en andere bacteriële cultuur experimenten.

De bovenbeschreven morbidostat schematisch voorgesteld in figuur 1. De gemeenschappelijke morbidostat operaties, waaronder experimentele evolutie, antibioticagevoeligheid testen en celmorfologie controle werden gevalideerd in een E. coli MG1655 cultuur blootgesteld aan trimethoprim (TMP), een veel gebruikte antibioticum 5,6. TMP induceert zeer onderscheidend stapsgewijze toename van resistentie, en de mutaties zijn geclusterd rond de dihydrofolaat red...

We beschrijven een goedkope, configureerbare morbidostat die de karakterisering van antibioticaresistentie mogelijk maakt door de medicijnconcentratie dynamisch aan te passen. Het apparaat kan worden geïntegreerd met een multiplex microfluïdisch platform. De benadering kan worden opgeschaald voor laboratoriumstudies naar antibioticaresistentie.

Ontwerp en gebruik van een Low Cost, Automatiseren Morbidostat voor Adaptive evolutie van bacteriën onder antibioticum selectie

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Het algemene doel van dit experiment is om het evolutionaire pad van antibioticaresistentie te karakteriseren met behulp van een Morbidostat die de bacteriële groei continu bewaakt en de antibioticaconcentratie dynamisch aanpast naarmate de bacteriën resistentie tegen het medicijn ontwikkelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de opstelling bestaat uit goedkope, gemakkelijk verkrijgbare elektronische componenten en eenvoudig kan worden geherconfigureerd voor specifieke doeleinden. De procedures zullen worden gedemonstreerd door Po Cheng Liu en Yi Tai Lee, beiden promovendi in mijn laboratorium.Om de Morbidostat te assembleren, begint u met het ponsen van drie gaten in de dop van het kweekflesje met een naald van 18 gauge. Knip drie stukken polyethyleenslang van ongeveer zeven centimeter lang en steek deze in de gaten in de dop. Gebruik plakband om de rand van de dop om te wikkelen, zodat deze als mal dient voor het Polydimethylsiloxaan, of PDMS, mengsel.Voeg vervolgens vijf gram component A en 0,5 gram component B van de PDMS toe in een plastic beker van 150 milliliter en roer dit handmatig met een tandenstoker. Laad het mengsel in een spuit van 10 milliliter. Inj

design-use-low-cost-automated-morbidostat-for-adaptive-evolution

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Hier laten we zien een eenvoudig protocol om een ​​willekeurige mutant bibliotheek te creëren voor een bepaalde doelsequentie. We laten zien hoe deze methode, die in vivo uitgevoerd in Escherichia coli, kan worden gecombineerd met functionele selecties van nieuwe enzymatische activiteiten evolueren.

Mutagenese en functionele selectie Protocollen voor Gerichte ontwikkeling van eiwitten in E. coli</em

Source: Liu, P. C., et al. Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a microfluidic chip to visualize and compare the growth and morphology of wild-type and trimethoprim-resistant E. coli strains under trimethoprim antibiotic stress.

Bacterial Growth on a Microfluidic Chip to Study Antibiotic Drug Resistance

Source: Jian, X., et al., Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System (MMC). J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the use of a microbial microdroplet culture system to drive adaptive evolution of bacteria toward methanol tolerance. By mixing engineered bacterial cultures with a high-methanol stress medium and segmenting them into microdroplets, the system selects for mutants that exhibit improved growth under methanol stress. Through...

Adaptive Evolution of Bacteria Using a Microbial Microdroplet Culture System

Celgroei tarief is een gereguleerd proces en een primaire determinant van cel fysiologie. Continue kweken met chemostaten maakt extrinsieke controle cellen groei met nutriënten limitatie de studie van moleculaire netwerken die celgroei en hoe deze netwerken ontwikkelen om optimale celgroei regelen vergemakkelijken.

Het gebruik van chemostaten in Microbiële Systems Biology

We ontwikkeld en gevalideerd een kleine voetafdruk array van miniatuur chemostaten opgebouwd uit gemakkelijk beschikbare onderdelen voor lage kosten. Fysiologische en experimentele evolutie resultaten waren vergelijkbaar met groter volume chemostaten. De Ministat reeks biedt een compacte, goedkope, en toegankelijk platform voor traditionele chemostaat experimenten, functionele genomica, en chemische screening toepassingen.

Ontwerp en gebruik van multiplexverzending chemostaat Arrays

Bacteriën kunnen tijdens hun leven schadelijke of gunstige mutaties ophopen. In een populatie van cellen kunnen individuen die gunstige mutaties hebben geaccumuleerd, snel hun medemens overtreffen. Hier presenteren we een eenvoudige procedure om intraspecies-concurrentie in een bacteriële celpopulatie in de loop van de tijd te visualiseren met behulp van fluorescerend gelabelde individuen.

Monitoring intraspecies competitie in een bacteriële celpopulatie door cocultivatie van fluorescerend gelabelde stammen

Hier presenteren we een protocol laboratorium adaptieve evolutie van micro-organismen onder omstandigheden met behulp chemostaat cultuur te verkrijgen. Ook is genomische analyse van het vrijkomende stam besproken.

Procedure voor Adaptive Laboratorium Evolutie van micro-organismen met behulp van een Chemostat

Hier presenteren we een experimentele methode om te testen van de rol van zelfkopiërende plasmiden in de ontwikkeling van resistentie tegen antibiotica.

De rol van zelfkopiërende plasmiden testen in de ontwikkeling van resistentie tegen antibiotica

Het evolver Framework maakt een continue microbiële cultuur met hoge resolutie en dynamische controle over experimentele parameters mogelijk. Dit protocol laat zien hoe het systeem toe te passen om een complex fitness-experiment, begeleiden gebruikers op de programmering geautomatiseerde controle over vele individuele culturen, meten, verzamelen en interactie met experimentele gegevens in real-time.

Het ontwerpen van geautomatiseerde, high-throughput, continue celgroei experimenten met behulp van evolver

Snelle en efficiënte kwantificering van intracellulaire M. tuberculosis-groei is cruciaal voor het nastreven van verbeterde therapieën tegen tuberculose (TB). Dit protocol beschrijft een op bouillon gebaseerde colorimetrische detectietest met behulp van een geautomatiseerd vloeistofkweeksysteem om de Mtb-groei te kwantificeren in macrofagen die worden behandeld met kandidaat-gastheergerichte therapieën.

Een geautomatiseerd kweeksysteem voor gebruik bij preklinische tests van gastheergerichte therapieën voor tuberculose

Dit protocol biedt een methode voor de systematische wereldwijde optimalisatie van genetisch gecodeerde biosensoren door middel van geautomatiseerde generatie en beoordeling van genetische bibliotheken. Dit gaat gepaard met ontwerp-van-experimentmethodologieën om experimenten te stroomlijnen en de selectie van genetische componenten mogelijk te maken om biosensoren af te stemmen op specifieke ontwerpresultaten.

Efficiënte bemonstering van genetisch gecodeerde biosensorontwerpruimte mogelijk gemaakt met een ontwerp- en automatiseringsworkflow

Leer hoe u een kosteneffectieve morbidostat bouwt voor adaptieve evolutie van bacteriën onder antibiotische selectie. Dit apparaat monitort groei continu en past medicijnconcentraties dynamisch aan voor microbiologisch onderzoek.

Ontwerp en gebruik van een Low Cost, Automatiseren Morbidostat voor Adaptive evolutie van bacteriën onder antibioticum selectie

Meer video's verkennen