Ontwerp en gebruik van een Low Cost, Automatiseren Morbidostat voor Adaptive evolutie van bacteriën onder antibioticum selectie

Het algemene doel van dit experiment is om het evolutionaire pad van antibioticaresistentie te karakteriseren met behulp van een Morbidostat die de bacteriële groei continu bewaakt en de antibioticaconcentratie dynamisch aanpast naarmate de bacteriën resistentie tegen het medicijn ontwikkelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de opstelling bestaat uit goedkope, gemakkelijk verkrijgbare elektronische componenten en eenvoudig kan worden geherconfigureerd voor specifieke doeleinden. De procedures zullen worden gedemonstreerd door Po Cheng Liu en Yi Tai Lee, beiden promovendi in mijn laboratorium.

Om de Morbidostat te assembleren, begint u met het ponsen van drie gaten in de dop van het kweekflesje met een naald van 18 gauge. Knip drie stukken polyethyleenslang van ongeveer zeven centimeter lang en steek deze in de gaten in de dop. Gebruik plakband om de rand van de dop om te wikkelen, zodat deze als mal dient voor het Polydimethylsiloxaan, of PDMS, mengsel.

Voeg vervolgens vijf gram component A en 0,5 gram component B van de PDMS toe in een plastic beker van 150 milliliter en roer dit handmatig met een tandenstoker. Laad het mengsel in een spuit van 10 milliliter. Injecteer vervolgens met de spuit het PDMS-mengsel op de dop.

Bak de gehele dop acht uur lang bij 70 °C om de PDMS te uitharden. Soldeer vervolgens met een soldeerbout de anode van de LED aan de 24 gauge draad en de kathode van de LED aan de koolstofweerstand. Soldeer daarna een koolstofweerstand van 680 Ohm aan een 24 gauge draad.

Gebruik isolatietape om de draadverbinding te isoleren. Soldeer de collector van de fotodetector aan de 24 gauge draad en de emitter van de fotodetector aan een 100 Ohm koolstofweerstand. Gebruik vervolgens isolatietape om de draadverbinding te isoleren.

Plaats de lichtemitterende diode in de houder voor de kweekflesjes. Verbind de lichtemitterende diode volgens het hier getoonde schakelschema en gebruik een vijf volt voeding om deze van stroom te voorzien. Controleer of de LED werkt met behulp van een digitale camera die IR kan detecteren. Plaats nu de fotodetector in de houder voor de kweekflesjes.

Sluit vervolgens, volgens het diagram, de fotodetector aan en gebruik een voeding van vijf volt om deze van stroom te voorzien. Verbind de draad met beide zijden van de fotodetector-weerstanden om het voltage over de elektronische besturingskaart te meten. Lijm een magneet op de as van de koelventilator, die dient als de magnetische roereenheid.

Omdat de magnetische roerunit is samengesteld uit de magneet en de koelventilator, is het essentieel om de plank van de ventilator uit te lijnen met het kweekbuisje. Ook de afstand tussen het kweekbuisje en de magneet is zeer kritisch om een stabiele werking te garanderen. Verbind elk stuk polyetheentubing van het kweekbuisje met het overeenkomstige stuk siliconentubing voor de micropompen, mediumflessen en de afvalfles.

Zet de pomp gedurende één uur aan en meet het totale volume dat van de mediumfles naar het kweekflesje wordt gepompt om de pompsnelheid te bepalen. De typische pompsnelheid moet ongeveer 4 ml per uur zijn, wat overeenkomt met een verdunningssnelheid van D = 0,33 per uur voor een werkvolume van 12 ml in het kweekflesje. Wanneer de opstelling is voltooid, wordt de gehele assemblage in een middelgrote schudincubator geplaatst.

Om de Morbidostat voor te testen, stelt u de voedingsspanning van de koelventilator in op vijf volt om de motor te starten en zo de magnetische roerkolf te testen. Nadat een reeks E-coli-monsters is voorbereid en een kalibratiecurve is uitgezet volgens het tekstprotocol, bereidt u het kweekflesje voor met drie stukken ultra-chemisch bestendige Tygon-slangen van zeven centimeter met een binnendiameter van 1/32 inch en een buitendiameter van 3/32 inch voor de inlaatopeningen om het apparaat te vormen. Bereid M9-minimaal medium voor met 0,2% glucose en M9 bevattend het geneesmiddel Trimethoprim of TMP.

Steriliseer vervolgens het medium, de mediumfles, de fles met drugmedium, de afvalfles en het kweekbuisje in een autoclaaf bij 121 °C. Ontdooi op de eerste dag van het experiment één milliliter bevroren wild-type E-coli MG1655-cellen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en breng 120 µL van de cellen over naar een kweekbuisje met ongeveer 12 mL M9-groeimedium. Zet de schudincubator aan en stel de temperatuur in op 30 °C zonder schudden.

Start de werking van de Morbidostaat door de micropomp, de magnetische roerder en de optische dichtheidsmeting in te schakelen. Stop na ongeveer 23 uur de micropomp door de voedingsspanning uit te schakelen en haal het kweekflesje eruit. Voeg 15% glycerol toe aan het kweekflesje en vries de monsters in bij -80 °C voor opslag.

Het overstappen naar een nieuw kweekflesje aan het begin van elk van deze experimenten is ook belangrijk om de vorming van biotine te voorkomen. Anders kan de vorming van biotine binnen twee of drie dagen optreden. Inoculeer na het ontdooien van het dagelijks ingevroren monster gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur een nieuwe reageerbuis met vers M9-medium.

Plaats het monster gedurende de nacht in een schudincubator bij 37 °C. Gebruik de volgende dag M9-medium om het microbiële monster tienvoudig te verdunnen en breng het in het microfluïdische apparaat door de container met het microbiële monster onder een druk van vijf PSI te zetten. Breng vervolgens het medium met TMP in de chip door de container met M9 en TMP onder een druk van vijf PSI te zetten.

Voer de menging tussen het micro-organisme en het geneesmiddel uit door de micromechanische klep tussen de twee kamers op de microfluïdische chip gedurende 15 minuten te activeren. Plaats de microfluïdische chip vervolgens in de microscoopincubator die op de omgekeerde microscoop is gemonteerd. Leg met een CCD-camera elke uur gedurende acht uur beelden van de cellen in de groeikamer vast.

Bereken de celgetalgegevens volgens het tekstprotocol. De gangbare Morbidostat-operaties, waaronder experimentele evolutie, antibiotica-gevoeligheidstesten en het controleren van de celmorfologie, werden gevalideerd met behulp van een E-coli MG1655-cultuur die werd blootgesteld aan het antibioticum TMP, dat een kenmerkende stapsgewijze toename van drugresistentie induceert met mutaties geclusterd rond het dihydrofolaatredirectase-gen, of DHFR-gen. Er wordt verwacht dat de microbe elke dag boven de vooraf ingestelde drempelwaarde voor de optische dichtheid groeit en de injectie van het geneesmiddel activeert, zoals hier wordt getoond.

De injectie van het geneesmiddel is naar verwachting de groei zal remmen en als gevolg daarvan de optische dichtheid zal verlagen. Deze grafiek toont de temporele toename van de resistentie tegen het antibioticum in een experiment om de IC50 te bepalen. De resistentie tegen het geneesmiddel nam in ongeveer 12 dagen ongeveer 1500 keer toe tot 1, 000 micrograms per milliliter.

In overeenstemming met eerdere bevindingen. De DHFR-puntmutaties in de mutant van de laatste dag werden gemeten via Sanger-sequencing en staan in deze tabel vermeld. De ontwikkeling van geneesmiddelenresistentie met meerdere mutaties bewijst het nut van de Morbidostat.

Aangezien selectie op agarplaten met geneesmiddelen de neiging heeft om slechts een enkele mutatie te induceren, toont deze figuur de groeicurves op de chip bij verschillende concentraties TMP. De gemuteerde monsters vertonen een significante toename in resistentie tegen het antibioticum.

Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers om de positie van antibioticaresistentie in een reële gecontroleerde laboratoriumomgeving te bestuderen. Na deze procedure kunnen andere metingen, zoals microfluïdische enkelcelmetingen, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de vraag of de morfologie nog steeds verandert door blootstelling aan antibiotica. Zodra dit apparaat onder de knie is, kan het eenvoudig worden geherconfigureerd voor alle bacteriële kweekexperimenten, zoals de cultivatie van een specifieke bacterie of het verhogen van het tolerantieniveau van een bacteriële stam.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de acquisitie van antibioticaresistentie kunt bestuderen in een echt gecontroleerd adaptief laboratorium-evolutieexperiment. Vergeet niet de drugresistente bacteriën te behandelen volgens de biosafety-regels voor microbiologische praktijken. Voor een experiment waarbij basis training van bacteriën wordt toegepast, kan speciale toestemming vereist zijn.