Name: Urineweginfectie in een kleine diermodel: transuretrale catheterisatie van mannelijke en vrouwelijke muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Leer transurethrale catheterisatie bij mannelijke en vrouwelijke muizen voor onderzoek naar urineweginfecties. Deze methode maakt vergelijkende studies van geslachtsverschillen in immuunrespons mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. Matthieu Rousseau voor kritische lezing van het manuscript en het laboratorium van dendritische Immunobiologie voor hun nuttige inzichten tijdens de ontwikkeling van dit protocol en project. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door financiële middelen van de Europese Unie zevende kader programma Marie Curie actie (PCIG11-GA-2012-3221170 en de Immuno-oncologie LabEx (MOI).

Muis experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig goedkeuring van protocolnummer 2012-0024 door het Comité d'éthique nl expérimentation animale Paris Centre et Sud (de ethische commissie voor dierproeven), in toepassing van de Europese richtlijn 2010/63 EU.
1. bereiding van katheters
<ol><li>Bereiden een pediatrische intraveneuze-access canule voor elke groep van muizen worden besmet. Met behulp van de ingebouwde veermechanisme, afstoten elke canule van de naald, volgens de instructies van de fabrikant. Gooi de naalden, behoud van alleen de kunststof intraveneuze canule.</li>
	<li>Steriliseren katheters in een laminaire flow-kap voor één ultraviolet (U.V.) cyclus, meestal 25-30 min. Opmerking: Katheters kunnen worden gebruikt voor meer dan één muis, maar een nieuwe katheter moet worden gebruikt tussen experimentele groepen, seksen of bacteriestammen.</li>
</ol>2. bereiding van Uropathogenic E. coli infectie
<ol><li>Ten minste twee dagen vóór de infectie, met behulp van een steriele inoculatie lus, streak UPEC uit een bevroren bacteriële voorraad op een agarplaat Luria Bouillon (LB), die bevatten antibiotica indien nodig. Incubeer bij 37 ° C's nachts. Platen kunnen bij 4 ° C gedurende maximaal één week worden opgeslagen.</li>
	<li>In een steriele erlenmeyer van 100 ml, 10 ml LB, met antibiotica indien van toepassing, met een enkele kolonie van de LB-plaat beënten en incuberen bij 37 ° C's nachts (ongeveer 16-18 hr) staande. Opmerking: Staande culturen toestaan de uitdrukking van type 1 pili, die nodig zijn voor infectie23. Culturen gegroeid schudden zal hebben minder efficiënt pili uitdrukking, en dus, inconsistente cijfers voor infecties.</li>
	<li>Meet de optische dichtheid (OD)600 van de overnachting cultuur en berekenen van het aantal bacteriën per ml met behulp van een vooraf bepaalde groeicurve. Als een voorbeeld voor UPEC stam UTI89, OD600 = 0,35 is gelijk aan 2 x 108 CFU / ml, dus een overnachting cultuur met een OD600 = 2.4 zou gelijkwaardig 13,7 x 108 kve per ml. empirisch bepalen de relatie tussen de OD600 en levensvatbare bacteriën met elke nieuwe stam werkzaam voor infectie.</li>
	<li>
Bepaal de hoeveelheid bacteriën die nodig gezien het aantal dieren besmet zijn en dat elke muis ongeveer 107 kolonie-vormende eenheden (kve verdient) in 50 µl PBS. Opnemen in de berekening het dode volume van ~ 130 µl van de katheter en spuit kern en 100 µl nodig voor het bepalen van het entmateriaal.
	<ol>
<li>Draai de bacteriële suspensie in een tafelblad microcentrifuge bij 17.000 x g gedurende 1 minuut en resuspendeer de resulterende bacteriële pellet op 2 x 108 CFU / ml in PBS. Serieel Verdun een aliquoot gedeelte van deze schorsing en plaat op LB agar, met antibiotica indien van toepassing, om te bepalen van het exacte entmateriaal voor elke infectie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trekken van de bacteriële entmateriaal in een spuit van 1 ml en bevestig de katheter aan het einde van de spuit. Tik op de spuit om te verwijderen alle lucht en drukt de zuiger te vullen de ruimte van de dode lucht in de katheter voordat u begint met de instillation.</li>
</ol>3. voorbereiding van de muizen
<ol><li>Anesthetize muizen via intraperitoneale injectie van 100 mg/kg ketamine en 5 mg/kg xylazine. Aanvullende warmte kan worden verstrekt.</li>
	<li>Ervoor zorgen dat elke muis is volledig verdoofd door het knijpen van de struikrover met gemiddelde druk. Muizen zijn volledig verdoofd wanneer ze niet reageren en vereisen van 3-5 min om deze staat te bereiken.</li>
	<li>Muizen liggende plaatsen en middelgrote druk uitoefenen op de onderbuik te legen van de blaas van urine. Volledige blazen voelt als een erwt onder de huid tussen de ileac toppen. Opmerking: Geïnhaleerde Isofluraan heeft geweest tweedehands voor catheterize vrouwelijke muizen15,22, echter het is niet getest of mannelijke muizen zijn voldoende verdoofd door geïnhaleerde Isofluraan voor deze procedure.</li>
</ol>4. transuretrale Instillation van vrouwelijke muizen
<ol><li>Met behulp van de niet-dominante hand, plaats van de duim op de staart en een vinger van de dezelfde hand op de buik van de muis en het toepassen van zachte druk in tegengestelde richtingen om de muis stevig op zijn plaats te houden.</li>
	<li>
Plaats het uiteinde van de katheter loodrecht op de muis op de urethrale opening. Met zachte druk, schuif de katheter in de urethra, totdat de hub voldoet aan de urethrale opening, terwijl het tegelijkertijd het verlagen van de spuit zodat deze parallel loopt met het werkoppervlak. De katheter vereist geen smering. Duw niet en kracht van de katheter in de urethra. De katheter moet soepel en gemakkelijk schuif in de urinebuis, met weinig tot geen weerstand.
	<ol>
<li>Voordat het wekken van het entmateriaal (stap 4.3), eenmaal is de katheter op zijn plaats, heel zachtjes trekken de buikhuid naar het hoofd van de muis met de vinger van de niet-dominante hand die nog op de buik van de muis (stap 4.1). Als de katheter in de urethra, het samenstellen van de opening van de urinebuis weefsel wordt niet verplaatst, terwijl als de katheter onjuist in de vagina geplaatst is, het weefsel omhoog en weg van de katheter verplaatsen zal. Deze snelle test moet worden uitgevoerd op elke muis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Als de hub van de katheter de urethrale opening ontmoet, langzaam afzien 50 µl van de bacteriële entmateriaal. Een langzame instillation tarief minimaliseert vesicoureteral reflux in de nier. Verwijder langzaam de katheter ter voorkoming van lekkage, over een telling van 5. Muizen in hun kooien in een liggende positie plaatsen.</li>
</ol>5. transuretrale Instillation van mannelijke muizen
<ol><li>Plaats twee duim pincet cranially en caudally naar externe genitaliën van de muis. Intrekken van de voorhuid om volledig de eikel bloot te stellen. Zodra de penis extern geplaatst wordt, laat de verlostang duim.</li>
	<li>Het verplaatsen van de verlostang om te stabiliseren van de uitstekende penis loodrecht op het dier, het houden van het orgel, zachtjes maar gemeten. Visualiseer de urethrale neusgang en zorgvuldig het introduceren van de katheter in de kleine opening aan het uiteinde van het orgel. Zachtjes begeleiden de katheter in de penis, naar het lichaam van de muis, behoud van zachte spanning met de pincet. De katheter vereist geen smering. Forceer niet de katheter in de penis; de katheter moet soepel glijden in de urinebuis, met vermelding van de juiste plaatsing.</li>
	<li>Zodra de hub van de katheter voldoet aan het puntje van de penis, heel langzaam afzien 50 µl van het entmateriaal, terwijl het handhaven van de positie van de penis. De kwaliteit van de instillation kan worden genoteerd op dit moment volgens een vooraf bepaalde instillation kwaliteitsscore, als afgebeeld in Figuur 2.</li>
	<li>Intrekken van de katheter langzaam, over een aantal 5, om te voorkomen lekkage van het entmateriaal. Muizen in hun kooien in een liggende positie plaatsen. Dieren moeten beginnen te herstellen van de 30-45 min na de toediening van de verdoving.</li>
</ol>6. bepaling van CFU in besmette organen
<ol><li>Op vooraf bepaalde tijdstippen goedgekeurde offer muizen met behulp van operationele standaardprocedures (b.v., cervicale dislocatie of kooldioxide overdosis). Bevochtig de buik grondig met 70% ethanol om besmetting te minimaliseren door het bont.</li>
	<li>Maak een incisie over het onderste derde van de muis in de buik van ten minste 2 cm met behulp van schaar en aseptisch verwijderen van de blaas en andere gewenste organen, met inbegrip van maar niet beperkt tot, nieren, testis, zaadblaasjes of preputiale klieren, in 5 ml polypropyleen module GLB buizen met 1 ml steriele PBS. Houd alle monsters op het ijs.</li>
	<li>Meng de organen met een handbediende homogenizer tot bijna geen solide weefsel blijft, ongeveer 15 tot 60 sec afhankelijk van het orgel. Vet doet niet meng goed, en is gemakkelijk te herkennen als glanzend beige-wit weefsel. Vet voorafgaand aan of volgende homogenisering negeren. Wassen van de homogenizer in ethanol gevolgd door PBS tussen elk experimentele of orgel groep. Opmerking: Gebruik meestal handheld homogeniseerders of kraal molen homogeniseerders. Terwijl al deze systemen hebben leverde vergelijkbare resultaten, zoals bepaald door directe vergelijking van bacteriële kve in 24 uur na infectie, moeten de optimale omstandigheden te homogeniseren gastheer weefsel met behoud van bacteriële levensvatbaarheid empirisch vóór worden vastgesteld routinematig uitvoeren van dit protocol.</li>
	<li>Uitvoeren van seriële verdunningen van de gehomogeniseerde orgel schorsingen. Verdunningen op LB agar platen, met antibiotica indien nodig, plaat en incubeer overnachting (~ 15 hr) bij 37 ° C. UPEC stammen hebben zeer snelle verdubbeling tijden en als zodanig moet worden gewaakt om niet broeden de agar platen te lang omdat dit de mogelijkheid om afzonderlijke kolonies tellen zal belemmeren.</li>
</ol>7. stroming cytometrische analyse van blaas weefsel
<ol><li>Spijsvertering buffer met collagenase bij 34 eenheden/mL en DNase bij 100 µg/mL, in PBS voor te bereiden. Houd op ijs. Bereiden een conische tube van 15 ml per dier te worden geanalyseerd en aliquoot 1 ml spijsvertering buffer per buis.</li>
	<li>Op vooraf bepaalde tijdstippen goedgekeurde offer muizen met behulp van operationele standaardprocedures (bijvoorbeeld cervicale dislocatie of kooldioxide overdosis). Bevochtig de buik grondig met 70% ethanol om besmetting te minimaliseren door het bont.</li>
	<li>
Maak een incisie over het onderste derde van de muis in de buik van ten minste 2 cm met behulp van schaar en de volledige blaas verwijderen. Gehakt goed met een schaar, snijden de blaas in 2-3 mm2 formaat stukken, meestal ongeveer 8 stuks.
	<ol>
<li>Voeg één gehakt blaas per buis met spijsvertering buffer. Schud om te wassen gehakt blaas weefsel in de buffer van de spijsvertering. Houd op ijs totdat alle blazen zijn ontleed en gehakt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer gehakt blazen gedurende 60-75 minuten bij 37 ° C, met een krachtig schudden met de hand voor 5 s elke 15 min. Wanneer het weefsel een glasachtig transparante uitstraling heeft, lijkend op natte tissue papier, is vertering voltooid. Langdurige spijsvertering oppervlakte eiwitten wordt verwijderd uit de cellen die nodig zijn voor de identificatie en moet worden vermeden.</li>
	<li>Inactivering van de spijsvertering enzymen door toevoeging van 2-3 mL ijskoud stroom cytometry buffer (PBS met 2% foetale runderserum (FBS) en 0,2 mM EDTA) en meng voorzichtig. Plaats de buizen op ijs.</li>
	<li>De inhoud van de tube passeren een 100 µm filter in een conische tube van 15 mL geplaatst om de schorsing van een enkele cel en te verwijderen van elk bindweefsel. Druk zachtjes op eventuele resterende weefsel door het filter met het einde van de zuiger van een injectiespuit. Was het filter met een extra 2 mL stroom cytometry buffer. Houd de monsters op ijs.</li>
	<li>Wassen van monsters door centrifugeren gedurende 7 minuten bij 200 x g, 4 ° C. Resuspendeer pellets in 100 µL stroom cytometry buffer met Fc blok, verdund tot 5 µg/mL en overdracht aan een 96-Wells ronde bodemplaat. Voeg 100 µL gewenst antilichaam cocktail aan elk monster na 10-15 min. Incubeer monsters gedurende 30-45 minuten, op ijs, beschermd tegen licht. Opmerking: Fc blok is een reagens gebruikt om te voorkomen dat de binding van het Fc deel van antilichamen tegen cellen uiten Fc receptoren. Het doel ervan is om te minimaliseren van niet-specifieke antilichaam binding. Bepaling van antilichamen te gebruiken zullen afhankelijk van de hypothese wordt getest in het experiment en moet worden geselecteerd met input uit de literatuur. In Figuur 3, voor het meten van de totale immuun cel infiltratie, een anti-CD45 antistof werkte, dat is een pan-immuun cel eiwitten.</li>
	<li>Wassen van monsters door centrifugeren gedurende 7 minuten bij 200 x g, 4 ° C. Resuspendeer cel pellets in 200 µL stroom cytometry buffer en een 40 µm cel zeef monsters passeren op een 5 ml polystyreen buis vlak voor acquisitie op een stroom cytometer.</li>
	<li>Het gehele monster verzameld op de cytometer van de stroom. Een goede vertering zal opleveren 200.000-400.000 cellen, met 8.000-10.000 CD45+ immuuncellen van naïeve muis blazen, terwijl besmette organen meer bevatten zal cellen16 (Figuur 3). Opmerking: Monsters voorbereid flow cytometrische analyse niet worden gebruikt om te evalueren van de CFU. Het is niet aanbevolen om de blaas gesplitst in twee delen, zoals geen bewijs bestaat om aan te tonen dat kolonisatie van UPEC of immuun cel infiltratie uniform in de gehele van het weefsel is.</li>
</ol>

<ol><li>Hooton, T. M., Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+uncomplicated+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Dis+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection.</a> Infect Dis Clin North Am. 11 (3), 551-581 (1997).</li>
<li>Harper, M., Fowlis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+urinary+tract+infections+in+men%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Urology%2C+Gynaecology+%26+Sexual+Health%22%5BJournal%5D)">Management of urinary tract infections in men.</a> Trends in Urology, Gynaecology & Sexual Health. 12 (1), 30-35 (2007).</li>
<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Urol%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nat Rev Urol. 7 (12), 653-660 (2010).</li>
<li>Lipsky, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+tract+infections+in+men.+Epidemiology%2C+pathophysiology%2C+diagnosis%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Urinary tract infections in men. Epidemiology, pathophysiology, diagnosis, and treatment.</a> Ann Intern Med. 110 (2), 138-150 (1989).</li>
<li>Conway, L. J., Carter, E. J., Larson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+Factors+for+Nosocomial+Bacteremia+Secondary+to+Urinary+Catheter-Associated+Bacteriuria%3A+A+Systematic+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Urol+Nurs%22%5BJournal%5D)">Risk Factors for Nosocomial Bacteremia Secondary to Urinary Catheter-Associated Bacteriuria: A Systematic Review.</a> Urol Nurs. 35 (4), 191-203 (2015).</li>
<li>Markle, J. G., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeXX+matters+in+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">SeXX matters in immunity.</a> Trends Immunol. 35 (3), 97-104 (2014).</li>
<li>Yu, C. Y., Whitacre, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex%2C+MHC+and+complement+C4+in+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sex, MHC and complement C4 in autoimmune diseases.</a> Trends Immunol. 25 (12), 694-699 (2004).</li>
<li>Castelao, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender-+and+smoking-related+bladder+cancer+risk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Gender- and smoking-related bladder cancer risk.</a> J Natl Cancer Inst. 93 (7), 538-545 (2001).</li>
<li>Donsky, H., Coyle, S., Scosyrev, E., Messing, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+incidence+and+mortality+of+bladder+and+kidney+cancers%3A+national+estimates+from+49+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Urol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Sex differences in incidence and mortality of bladder and kidney cancers: national estimates from 49 countries.</a> Urol Oncol. 32 (1), 40-e31 (2014).</li>
<li>Garg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+Disparities+in+Hematuria+Evaluation+and+Bladder+Cancer+Diagnosis%3A+A+Population-Based+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Gender Disparities in Hematuria Evaluation and Bladder Cancer Diagnosis: A Population-Based Analysis.</a> J Urol. , (2014).</li>
<li>Dobruch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+and+Bladder+Cancer%3A+A+Collaborative+Review+of+Etiology%2C+Biology%2C+and+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol%22%5BJournal%5D)">Gender and Bladder Cancer: A Collaborative Review of Etiology, Biology, and Outcomes.</a> Eur Urol. , (2015).</li>
<li>Hsu, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+tumorigenesis+and+mortality+from+bladder+cancer+in+mice+lacking+urothelial+androgen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Decreased tumorigenesis and mortality from bladder cancer in mice lacking urothelial androgen receptor.</a> Am J Pathol. 182 (5), 1811-1820 (2013).</li>
<li>El Behi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+decorin+in+bladder+cancer+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">An essential role for decorin in bladder cancer invasiveness.</a> EMBO Mol Med. 5 (12), 1835-1851 (2013).</li>
<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+urinary+tract+infections%3A+incidence%2C+morbidity%2C+and+economic+costs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs.</a> Am J Med. 113, Suppl 1A. 05S-13S (2002).</li>
<li>Ingersoll, M. A., Kline, K. A., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-CSF+induction+early+in+uropathogenic+Escherichia+coli+infection+of+the+urinary+tract+modulates+host+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">G-CSF induction early in uropathogenic Escherichia coli infection of the urinary tract modulates host immunity.</a> Cell Microbiol. 10 (12), 2568-2578 (2008).</li>
<li>Mora-Bau, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+Subvert+Adaptive+Immunity+to+Urinary+Tract+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Macrophages Subvert Adaptive Immunity to Urinary Tract Infection.</a> PLoS Pathog. 11 (7), e1005044(2015).</li>
<li>Oliveira, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Report%3A+Technique+of+Bladder+Catheterization+in+Female+Mice+and+Rats+for+Intravesical+Instillation+in+Models+of+Bladder+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22%28Conference+Title%2939th+Scand-LAS+and+ICLAS+Joint+Meeting%22%5BJournal%5D)">Technical Report: Technique of Bladder Catheterization in Female Mice and Rats for Intravesical Instillation in Models of Bladder Cancer.</a> (Conference Title)39th Scand-LAS and ICLAS Joint Meeting. 36, 5-9 (2009).</li>
<li>Seager, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravesical+delivery+of+rapamycin+suppresses+tumorigenesis+in+a+mouse+model+of+progressive+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Prev+Res+%28Phila%29%22%5BJournal%5D)">Intravesical delivery of rapamycin suppresses tumorigenesis in a mouse model of progressive bladder cancer.</a> Cancer Prev Res (Phila). 2 (12), 1008-1014 (2009).</li>
<li>Hagberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascending%2C+unobstructed+urinary+tract+infection+in+mice+caused+by+pyelonephritogenic+Escherichia+coli+of+human+origin%29%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin).</a> Infect Immun. 40 (1), 273-283 (1983).</li>
<li>Olson, P. D., Hruska, K. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgens+Enhance+Male+Urinary+Tract+Infection+Severity+in+a+New+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Androgens Enhance Male Urinary Tract Infection Severity in a New Model.</a> J Am Soc Nephrol. , (2015).</li>
<li>Knipper, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-4+Receptor+alpha+Signaling+in+Myeloid+Cells+Controls+Collagen+Fibril+Assembly+in+Skin+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Interleukin-4 Receptor alpha Signaling in Myeloid Cells Controls Collagen Fibril Assembly in Skin Repair.</a> Immunity. 43 (4), 803-816 (2015).</li>
<li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1230-1243 (2009).</li>
<li>Wright, K. J., Seed, P. C., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+intracellular+bacterial+communities+of+uropathogenic+Escherichia+coli+depends+on+type+1+pili%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of intracellular bacterial communities of uropathogenic Escherichia coli depends on type 1 pili.</a> Cell Microbiol. 9 (9), 2230-2241 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Transuretrale instillation van mannelijke muizen biedt veel nieuwe onderzoeksmogelijkheden naar de invloed van geslacht op blaas mucosal ziekte, maar ook verschillende uitdagingen. Plaats een beperking is dat de instillation aanvankelijk blijken kan te zijn technisch moeilijk, wat resulteert in buitensporige ontsteking tijdens het inbrengen van de katheter. Verbetering van de techniek kan worden bereikt door de instillation van dode muizen met een gekleurde oplossing, zoals Evans blauwe kleurstof. Om te bevestigen dat de...

Infecties van de urinewegen (UTI) zijn een van de meest voorkomende infecties in ontwikkelde landen1. Infectie tarieven zijn vergelijkbaar tussen vrouwtjes en mannetjes bij pasgeborenen en de oudere2. Premenopausal volwassen vrouwen, echter, hebben een sterk verhoogde incidentie van Gemeenschap-verworven UTI in vergelijking met mannen2,3. Gezien het feit dat deze ziekte invloed voornamelijk vrouwen, is fundamenteel en klinisch onderzoek overwegend gericht op UTI bij vrouwtjes. Urineweginfecties bij mannen is echter een aanzienlijke en understudied gezondheidszorg uitdaging4. Inderdaad, omdat Urineweginfecties bij mannen worden geassocieerd met hogere morbiditeit, deze infecties worden routinematig gedefinieerd als ingewikkeld4,5.
De evolutie van ons begrip van de centrale rol van seksuele vooroordelen in de Fysiologie en pathologie zijn nieuwe methoden nodig om te ontdekken dit eerder verwaarloosde aspect van ziekte. Geslacht verschillen spelen een essentiële rol in de immuniteit en infectie; vrouwtjes hebben een hogere incidentie van auto-immune ziekte, terwijl de mannetjes zijn meer vatbaar voor bepaalde infecties, zoals tuberculose, malaria en HIV6,7. Blaaskanker, een andere urologische pathologie, is aanzienlijk vaker voor bij mannen dan bij vrouwen, en verschillende studies hebben aangetoond een rol voor androgenen in de ontwikkeling van maligniteit8,9,10,11 ,12. Met name is echter onderzoek van intravesicale therapieën voor blaaskanker gebeurt uitsluitend bij vrouwelijke dieren, gezien het onvermogen om herhaaldelijk catheterize mannelijke muizen13.
De studie van UTI pathogenese leunt op knaagdieren modellen van infectie (bijvoorbeeld, muizen en ratten). Lymfkliertest modellen van Urineweginfecties kunnen tewerkstellen uropathogens oorspronkelijk geïsoleerd van menselijke infecties, zoals uropathogenic E. coli (UPEC), Klebsiella, Proteus, Staphylococcusof Enterococcus14. Meestal worden bacteriën in de blaas via catheterisatie van urethra binnengebracht. Na infectie, blazen en nieren kan worden verwijderd om de specifieke parameters van infecties, zoals bacteriële kolonisatie, weefselschade of15,16van de immuunrespons van de gastheer te beoordelen. Universeel, echter, worden slechts vrouwelijke dieren gebruikt voor onderzoek van de UTI. Inderdaad, veel studies hebben opgemerkt dat, als gevolg van anatomische redenen, catheterisatie van mannelijke muizen niet mogelijk13,17,18,19. Meer recentelijk, een chirurgische benadering van mannelijke instillatietest is beschreven, waarin de buik is geopend, de blaas wordt extern verplaatst door zachte druk op de opening in de buik te passen en bacteriën worden ingespoten in de blaas20. Deze aanpak maakt het mogelijk mannelijke infectie, ten koste van de chirurgische ingreep. Een belangrijke caveat van deze aanpak bevat dus, de invloed van ontsteking, over de resultaten van infectie zoals het potentieel voor het opwekken van een anti-inflammatoire wondgenezing reactie op de insnijding21. Als onze belangen omvatten geslacht bias in reactie op ziekte begrijpen ontwikkelde we een methode van bacteriële intravesicale instillation in mannelijke muizen die meer overeenkomt met de reeds lang gevestigde niet-chirurgische transuretrale aanpak gebruikt in vrouwelijke knaagdieren22 .
Ons model bouwt voort op een vastgelegde methode en biedt de mogelijkheid om rechtstreeks vergelijken de host immuunrespons op Urineweginfecties bij vrouwelijke en mannelijke dieren. Deze methode zal toelaten dissectie van geslacht gebaseerde verschillen in infectie, en potentieel bieden moleculaire en cellulaire aanwijzingen op de uitgesproken verschillen in de gevoeligheid en de reactie op de infectie tussen de seksen. Dit model heeft bovendien waarde buiten UTI studies, waardoor de oprichting van modellen te onderzoeken van andere blaas-geassocieerde ziekten, zoals blaaskanker, prostatitis, onder - of over - actieve blaas syndroom en interstitiële cystitis.

<table><tbody><tr><td>BD Insyte Autoguard Shielded IV Catheters 24 G, 0,7 mm externe diameter, 14 mM lang</td><td>BD Medical</td><td>381811 of 381411*</td><td>* catalogusnummer is landsafhankelijk</td></tr><tr><td>inoculatieslus</td><td>Greiner Bio-One</td><td>731171</td><td></td></tr><tr><td>LB Miller bouillon</td><td>Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>LB Miller agar</td><td>Difco</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td>Bio-rad</td><td>223-9955</td><td></td></tr><tr><td>spuit</td><td>B Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>Duimtang (Adson)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>5 ml buisjes, polypropyleen</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Ruptor wegwerp sondes</td><td>Qiagen</td><td>990890</td><td></td></tr><tr><td>15 ml flip-cap buisjes</td><td>Thermo Scientific</td><td>362694</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Invitrogen</td><td>18047019</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401119001</td><td>moet worden gesplitst en bewaard bij -20 &deg;C om herhaalde bevriezing en ontdooiing te voorkomen</td></tr><tr><td>100 &micro;M MACS SmartStrainers&nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-098-463</td><td>compatibel met 15 ml buisjes, voorkeur</td></tr><tr><td>100 &micro;m celstrainers&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td>compatibel met 50 ml buisjes, als MACS Smart Strainers niet beschikbaar zijn</td></tr><tr><td>96-wells plaat</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Fc blok</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td>anti-CD16/CD32</td></tr><tr><td>anti-muis CD45 antilichaam</td><td>BD Biosciences</td><td>561487</td><td>veel verschillende fluorescentie conjugatie opties zijn beschikbaar</td></tr><tr><td>5 ml buisjes polystyreen met filterdop</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>insulinespuit</td><td>Terumo</td><td>BS05M2913</td><td></td></tr><tr><td>handmatige homogenisator</td><td>Qiagen</td><td>9001272</td><td>TissueRuptor</td></tr><tr><td>flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Fortessa SORP&nbsp;</td></tr><tr><td>Flow cytometry software</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Diva</td></tr></tbody></table>

urineweginfectie in een kleine diermodel: transuretrale catheterisatie van mannelijke en vrouwelijke muizen

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Infecties van de urinewegen (UTI) zijn zeer gemeenschappelijk wereldwijd, significante morbiditeit en gezondheidszorg-geassocieerde kosten oplopen. Kleine dierlijke modellen, die nauwkeurig vestiging van de ziekte en de progressie, toestaan dat dissectie van gastheer-pathogeen interacties en generatie van immuniteit tegen infectie. Bij muizen, intravesicale instillation van uropathogenic E. coli, de verwekker in meer dan 85% van de communautaire verworven UTI, recapituleert veel van de stadia van de infectie bij de mens in acht genomen. Tot voor kort echter kon UTI alleen worden gemodelleerd bij vrouwelijke dieren. Deze beperking heeft belemmerd de studie van sex-gerelateerde verschillen in UTI, evenals andere blaas aandoeningen, zoals kanker. Hier beschrijven we een methode voor het indruppelen van mannelijke muizen waarmee directe vergelijking tussen vrouwelijke en mannelijke dieren en bieden een gedetailleerd protocol om te beoordelen van blaas weefsel door stroom cytometry als een middel om host reacties op infectie beter te begrijpen. Deze benaderingen zullen samen, hulp bij de identificatie van gastheer factoren die aan seksuele vooroordelen waargenomen in UTI en andere blaas-geassocieerde ziekten bijdragen.

In de ontwikkeling van dit protocol leeftijd cohorten van vrouwelijke en mannelijke C57Bl/6 muizen 6 tot 8 weken werden bijgebracht, en bacteriële belasting geëvalueerd in blazen op tijdstippen, variërend van 1 uur tot 30 dagen. De resultaten van deze studies zijn gedetailleerd elders (Zychlinsky Scharff et al., in behandeling). Hier presenteren we representatieve gegevens uit 24 hr infecties. Met name, was bacteriële belasting gelijk tussen mannelijke en vrouwelijke muizen op 24...

De gevestigde model van transuretrale catheterisatie van muizen kan de studie blaas aandoeningen, met inbegrip van infectie van de urinewegen, maar kan alleen worden uitgevoerd bij vrouwtjes. Een nieuw model van mannelijke transuretrale instillation, gepresenteerde, kan onderzoek op een gebied dat gekenmerkt door sterke klinische en epizoötiologische verschillen tussen de geslachten.

Urineweginfectie in een kleine diermodel: transuretrale catheterisatie van mannelijke en vrouwelijke muizen

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

Het algemene doel van deze experimentele aanpak is om de immuunrespons op urineweginfectie te onderzoeken en directe vergelijking tussen mannelijke en vrouwelijke dieren te voorkomen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen over mucosale immunologie te beantwoorden die betrekking hebben op hoe mannen en vrouwen reageren op urineweginfectie. Het belangrijkste voordeel is dat infectie wordt gevestigd via de natuurlijke wortel.We hadden eerst het idee voor deze methode na te hebben opgemerkt hoe vaak wordt vermeld dat de installatie van de blaas van de mannelijke muizen onmogelijk is. Hoewel deze methode inzicht zal geven in urineweginfectie, kan deze ook worden toegepast op andere ziektestudies, zoals blaaskanker. Om te beginnen, bereid voor elke groep muizen die moet worden geïnfecteerd een pediatrische intraveneuze toegangskatheter voor.Gebruik het ingebouwde veermechanisme om elke katheter van zijn naald te ontdoen zoals voorgeschreven door de fabrikant. Gooi de naalden weg en bewaar alleen de plastic intraveneuze katheter. Steriliseer de katheters in een laminar flow-hood voor een UV-cyclus van ongeveer 25 tot 30 minuten.Na een nachtcultuur van uropathogene e coli, of UPEC, volgens het tekstprotocol, centrifugeert u de bacteriesuspensie in een tafelmicrocentrifuge bij 17.000 keer g gedurende één minuut en suspendeert u de resulterende bacteriepellet twee keer 10 tot de achtste CFU per milliliter in PBS. Verdun een aliquot van suspensie en plateer op LB-agar met antibiotica indien gepast, om de exacte inoculum voor elke infectie te bepalen. Trek het bacteriële inoculum op in een een milliliter spuit, en bevestig de katheter aan het uiteinde van de spuit.Tik op de spuit om lucht te verwijderen en druk de plunjer in om de dode luchtruiimte in de katheter te vullen voordat u begint met instillatie. Nadat u een vrouwelijke muis volgens een goedgekeurd protocol hebt verdoofd, plaatst u het dier op zijn rug en oefent u gemiddelde druk uit op de onderbuik om de blaas van urine te ontdoen. Volle blaasjes voelen aan als een erwt onder de huid, tussen de iliacale kammen.Wanneer de blaas leeg is, plaatst u met de niet-dominante hand de duim op de staart en een vinger van dezelfde hand op de buik van de muis, en oefent u zachte druk uit in tegengestelde richtingen om de muis stevig op zijn plaats te houden. Plaats vervolgens de punt van de katheter loodrecht op de muis bij de urethrale opening en glijd de katheter met zachte druk in de urethra tot de hub de urethrale opening ontmoet, terwijl u gelijktijdig de spuit laat zakken zodat deze parallel is aan het werkoppervlak. Zodra de katheter op zijn plaats zit, gebruikt u een vinger van de niet-dominante hand die op de buik van de muis rust om zeer zachtjes de buikhuid naar de kop van de muis te trekken.Merk op dat de urethrale opening niet zal bewegen. Als de katheter echter in de vagina zit, zal het weefsel omhoog en weg van de katheter bewegen. Met de hub van de katheter tegen de urethrale opening, doseert u langzaam 15 microliters van de bacteriële inoculum.Een langzame instillatiesnelheid minimaliseert vesicoureterale reflux in de nier. Verwijder de katheter langzaam om lekkage te voorkomen. Plaats vervolgens het dier in zijn kooi in een liggende positie.Om mannelijke muizen te inoculeren, plaatst u twee duimklemmen kraniaal en caudaal aan de externe geslachtsdelen van de muis. Trek de voorhuid terug om de penisklieren volledig bloot te leggen. Zodra de penis extern is gepositioneerd, laat u de duimklemmen los.Positioneer de klem opnieuw om de uitstaande penis loodrecht op het dier te stabiliseren, en houd het orgaan zachtjes maar strak vast. Breng vervolgens door de kleine opening in de punt van de uretrale vleesboel voorzichtig de katheter aan en leid deze voorzichtig in de penis met behulp van de klem om voorzichtig de spanning te handhaven. Zodra de hub van de katheters de punt van de penis ontmoet, doseert u zeer langzaam 50 microliters van het inoculum, terwijl u de positie van de penis handhaaft.Let op de kwaliteit van de instillatie volgens een vooraf bepaalde instillatiekwaliteitsscore, zoals degene die hier wordt getoond. Trek de katheter langzaam over vijf seconden terug om lekkage van het inoculum te voorkomen. Plaats de muis in zijn kooi in een liggende positie.Het dier zou 30 tot 45 minuten na toediening van het anestheticum moeten beginnen te herstellen. Nadat u muizen volgens een goedgekeurd protocol hebt geofferd, gebruikt u 70% Epinal om de buik grondig te bevochtigen om besmetting door het haar te minimaliseren. Gebruik schaar om een snede van twee centimeter te maken in het onderste derde deel van de buik van de muis, en verwijder aseptisch de blaas en eventuele andere gewenste organen.Breng de organen over in vijf milliliter polypropyleen snap-cap buisjes, die elk één milliliter steriel PBS bevatten en bewaar alle monsters op ijs. Homogeniseer de organen met een handbediende homogenisator tot er bijna geen vast weefsel meer over is. Gooi eventueel glanzend beige-wit vetweefsel weg dat niet goed homogeniseert.Gebruik vervolgens Epinal, gevolgd door PBS om de homogenisator tussen elke experimentele of orgaangroep te wassen. Nadat u seriële verdunningen van gehomogeniseerde orgaansuspensie hebt bereid, plateer verdunningen op LB-agar platen, met antibiotica indien gepast, en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende een nacht. Om flowcytometrie op blaasweefsel uit te voeren, na het isoleren van de blaas zoals eerder in deze video is gedemonstreerd, gebruikt u schaar om het weefsel goed te hakken.Voeg één gehakt blaasje toe per buisje met spijsverteringsbuffer. Schud vervolgens het buisje om het gehakte weefsel in de spijsverteringsbuffer te wassen, en bewaar het op ijs totdat alle blaasjes zijn gedisseceerd en gehakt. Incubeer de gehakte blaasjes bij 37 graden Celsius, gedurende 60 tot 75 minuten met krachtig handmatig schudden gedurende vijf seconden, elke 15 minuten.Wanneer het weefsel een glassachtig transparant uiterlijk heeft dat lijkt op nat tissuepapier, is de spijsvertering voltooid.

urinary-tract-infection-small-animal-model-transurethral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze video zal aantonen methoden om transurethrally veroorzaken muis infecties van de urinewegen en kwantificeren van de omvang van de resulterende infecties.

Transurethrale Inductie van Mouse urineweginfectie

Source: Luyts, N., et al. Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the induction and tracking of urinary tract infection in a mouse model using bioluminescent E. coli injected into the bladder, where bacterial adhesion, invasion, and intracellular replication occur. The emitted light from the bioluminescent operon serves as a real-time marker of bacterial load during infection...

Visualization of Urinary Tract Infection in a Mouse Model Using Bioluminescence

Source: Conover, M. S., et al., J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the procedure for assembling and implanting a transurethral catheter in a female mouse, followed by bacterial inoculation to establish catheter-associated urinary tract infection and investigate biofilm-mediated host-pathogen interactions.

Catheter-Associated Urinary Tract Infection in a Mouse Model

In this video, we describe the technique for the intravesical administration of uropathogenic bacteria to generate a urinary tract infection model in mice. This model can be used to understand the spread of uropathogenic bacterial infection within the urinary system and the mechanisms that determine UTI susceptibility.

Generating Urinary Tract Infection Model: A Technique to Administer Uropathogenic Bacteria in Mouse to Develop Urinary Tract Infection Model

This video demonstrates the establishment of uropathogenic Escherichia coli infection in a female mouse bladder through transurethral catheter instillation. The injected bacteria successfully establish a urinary tract infection within the bladder, providing a valuable platform for studying healthcare-associated diseases related to the urinary tract.

Transurethral Catheterization and Bacterial Inoculation to Generate a Urinary Tract Infection Model in Male Mice

Establishment of a Urinary Tract Infection Model in Female Mice

This video demonstrates a technique to assess the anti-tumor activity of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein, or HP-NAP, in a mouse bladder cancer model. HP-NAP interacts with tumor-cell neutrophils to produce pro-inflammatory cytokines, inducing the differentiation of naïve T cells into type 1 T helper (Th1) and type 1 cytotoxic (Tc1) T cell phenotypes. The Th1 and Tc1 cells secrete interferon-gamma, inhibiting tumor angiogenesis and promoting cytotoxic T cell-mediated tumor...

Evaluating the Anti-Tumor Efficacy of a Bacterial Immunomodulatory Protein in a Murine Model

De mogelijkheid om urineweginfecties (UTI) te modelleren is cruciaal om bacteriële pathogenese te begrijpen en de ontwikkeling van nieuwe therapeutische methoden te stimuleren. Het doel van dit werk is om muismodellen van experimentele UTI en katheter-geassocieerde UTI te demonstreren die bevindingen naspelen en voorspellen die bij mensen worden gezien.

Oprichting en karakterisering van UTI en Cauti in een muismodel

Transuretrale instillatietest is een uitdagende procedure en is niet goed beschreven in de literatuur. Het doel van dit manuscript is om een techniek voor transuretrale inbrengen van een katheter voor intravesicale levering van vloeistoffen met werkzame stoffen in de urineblaas en/of de prostaat bij volwassen mannelijke muizen te beschrijven.

Transuretrale Instillation Procedure in volwassen mannelijke muis

Een muismodel van uropathogene E. coli (UPEC) transurethrale inenting om latente intracellulaire blaasreservoirs en daaropvolgende blaasblootstelling aan G. vaginalis vast te stellen om terugkerende UPEC-UTI te induceren, wordt aangetoond. Ook aangetoond zijn de opsomming van bacteriën, urinecytologie en in situ blaasfixatie en -verwerking voor scanningelektronenmicroscopie.

Terugkerende Escherichia coli urineweginfectie veroorzaakt door Gardnerella vaginalis blaasblootstelling bij muizen

Dit manuscript beschrijft de intravesicale toediening van uropathogene bacteriën met een lux operon om een urineweginfectie bij muizen te induceren en de daaropvolgende longitudinale in vivo analyse van de bacteriële belasting met behulp van bioluminescentie beeldvorming.

Longitudinale follow-up van urineweginfecties en hun behandeling bij muizen met behulp van bioluminescentiebeeldvorming

Leer transurethrale catheterisatie bij mannelijke en vrouwelijke muizen voor onderzoek naar urineweginfecties. Deze methode maakt vergelijkende studies van geslachtsverschillen in immuunrespons mogelijk.

Urineweginfectie in een kleine diermodel: transuretrale catheterisatie van mannelijke en vrouwelijke muizen

Meer video's verkennen