Induceren van een Site Specific Replication Verstopping in E. coli Met behulp van een TL-repressor aandrijfsysteem
August 21st, 2016
We beschrijven hier een systeem dat gebruikmaakt van een locatie-specifieke, omkeerbare in vivo eiwitblokkering om replicatievorken in Escherichia coli te stoppen en te laten instorten. De totstandkoming van de replicatieblokkering wordt geëvalueerd door middel van fluorescentiemicroscopie en neutrale-neutrale 2-dimensionale agarosegelelektroforese wordt gebruikt om replicatie-intermediaten te visualiseren.
Het algemene doel van dit experiment is om een replicatievork op een nucleoproteïneblok te vertragen en de DNA-structuren op de plaats van het blok te observeren met als doel DNA-reparatieroutes te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over DNA-replicatie en -reparatie, zoals hoe het DNA wordt verwerkt wanneer het replicatieapparaat van de cel een eiwitobstakel tegenkomt. Het grote voordeel van deze techniek is dat we een replicatievork op een specifieke locatie op het chromosoom in een hele populatie levende cellen reversibel kunnen vertragen.
Dit proces wordt gedemonstreerd door de volgende leden van mijn laboratorium, Dr. Karla Mettrick, en afgestudeerde student Georgia Weaver en Tayla-Ann Corocher. Voor deze procedure wordt een E.coli-stam gebruikt die een tetracycline-operatorarray in het pKM1-plasmide draagt. pKM1 codeert voor TetR-YFP, een inductibel geel fluorescent gelabeld tetracycline-repressor-eiwit.
Verdun een verse overnachtelijke cultuur van deze E.coli-stam tot een optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,01 in een verdund complex medium met antibiotica zoals vereist voor selectie. Laat de cultuur groeien bij 30 graden Celsius met schudden tot een optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,05 tot 0,1. Verwijder een monster van 10 milliliter om als niet-geïnduceerde controle te dienen.
Voeg 0,01%arabinose toe aan de resterende cultuur om de productie van TetR-YFP vanuit pKM1 te induceren. Laat zowel de niet-geïnduceerde als geïnduceerde culturen bij 30 graden Celsius met schudden groeien. Controleer na een uur op de aanwezigheid van een enkele focale punt binnen elke cel van de geïnduceerde cultuur met behulp van fluorescentiemicroscopie.
Als de geïnduceerde cellen bevestigd zijn geblokkeerd, aangegeven door meer dan 70%van de cellen met een enkele focus, noteer de optische dichtheid en verwijder 7,5 milliliter van het monster voor analyse door tweedimensionale gelelektroforese. Verwijder een gelijkwaardig monster uit de niet-geïnduceerde controlecultuur. Bereid vóór fluorescentiemicroscopie de agarosepads voor om beweging van de cellen tijdens visualisatie te voorkomen.
Pipet voor elke agarosepad 500 microliter gesmolten agarose op een microscoopglaasje en leg onmiddellijk de dekglas op voordat de agarose stolt. Bewaar de glijbanen tussen natte tissues op vier graden Celsius tot ze nodig zijn. Wanneer het tijd is om de cellen te controleren, verwijder het dekglas van de agarosepad en pipet 10 microliter bacteriecultuur op het midden van de pad.
Na ongeveer vijf minuten, wanneer de agarosepad is opgedroogd, vervang het dekglas. Plaats een druppel immeersiolies op het dekglas en plaats de glijbaan onder de optiek. Visualiseer de cellen met fasecontrastmicroscopie bij 100x vergroting.
Stel in het Acquisitiedialoogvenster in de beeldverwerkingssoftware de Belichtingstijd in op 100 milliseconden. Selecteer Acquisitie om het beeld vast te leggen. Beweeg de tafel niet.
Selecteer in het Aangeschafte dialoogvenster YFP als de verlichting voor de externe sluiter gekoppeld aan de camera. Stel de Belichtingstijd in op 1.000 milliseconden. Schakel het tafellicht uit en selecteer Acquisitie om het fluorescentiebeeld vast te leggen.
Voeg om dit proces te beginnen natriumazid toe aan eerder verzamelde cultuurmonsters tot een eindconcentratie van 0,1%en incubeer op ijs gedurende minimaal vijf minuten. Centrifugeer de cellen bij 5.000 keer g gedurende tien minuten. Gooi het supernatant weg.
Resuspendeer elke celpellet in 200 microliter PIV-buffer en breng de cellen over in een microcentrifugebuisje. Microcentrifugeer om de cellen te pelletten en gooi het supernatant weg. Behandel een microscoopglaasje met 40 microliter van een geschikte waterafstotende of siliconenoplossing voor glas.
Wrijf het glaasje met een tissue droog. Resuspendeer de cellen met de laagste celdichtheid in 50 microliter PIV en plaats op 50 graden Celsius in een hitteblok. Pas voor alle andere monsters de volumes van PIV aan zodat de uiteindelijke celdichtheid in elk buisje hetzelfde is.
Voeg een gelijk volume vers bereide 0,8%Agarose-oplossing in PIV toe aan de monsters. Houd de monsters in het hitteblok om ervoor te zorgen dat ze boven de 50 graden Celsius zijn om stollen te voorkomen. Plaats 20 microliter druppels van de cel-agarose-suspensie op het behandelde glaasje om pluggen te produceren die halfbolvormig zijn.
Wanneer de pluggen zijn gestold, schuif voorzichtig alle pluggen van één monster in een enkele microcentrifugebuis en voeg een milliliter cellysebuffer toe. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende twee uur. Verwijder na twee uur de cellysebuffer en voeg 1 milliliter EDTA-Sarkosyl-Proteinase K of ESP-oplossing toe.
Incubeer bij 50 graden Celsius overnacht of tot de pluggen transparant zijn. Zodra de pluggen transparant zijn, verwijder de ESP-buffer en breng de pluggen over naar een 15-milliliterbuis. Voeg 12 milliliter TE-buffer toe en laat 30 minuten staan.
Was de pluggen in totaal vijf keer met TE-buffer. Bewaar de pluggen bij vier graden Celsius in één milliliter TE-buffer. Om de replicatie-intermediaten te analyseren, wordt het DNA in de agarose-pluggen verteerd met een geschikt restrictie-enzym voor het gebied van belang.
In dit voorbeeld snijdt EcoRV het DNA onmiddellijk vóór de array, binnen de array en na de array om 5,5 kb en 6,7 kb fragmenten in het gebied van belang te geven. Om dit proces te beginnen, breng een agarose-plug over naar een verse microcentrifugebuis en voeg 150 microliter restrictie-enzymbuffer toe. Voeg 25 tot 100 eenheden restrictie-enzym toe en verteer bij 37 graden Celsius gedurende zes tot acht uur.
Bereidt een 0,4%agarosegel voor bij vier graden Celsius. Giet 300 milliliter gesmolten agarose in een gellade van ongeveer 25 bij 25 centimeter. Plaats een kam om de putjes ongeveer even breed te maken als de diameter van de plug.
Wanneer de gel is gestold, verwijder de kam en breng de gel naar kamertemperatuur. Schuif met een inoculatielus een van de verteerde agarose-pluggen in een putje, waarbij de platte kant van de plug
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een methode om replicatievorken in Escherichia coli te vertragen en te laten instorten met behulp van een specifiek, omkeerbaar in vivo eiwitblok. De techniek maakt het mogelijk om DNA-structuren op de plaats van het blok te observeren, waardoor inzichten in DNA-reparatiepaden worden verkregen.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Moleculairbiologie
- Genetica
Achtergrond
- Begrip van DNA-replicatie is cruciaal voor inzichten in cellulaire processen.
- Replicatievorken kunnen obstakels tegenkomen die de DNA-integriteit beïnvloeden.
- Bestuderen hoe cellen reageren op deze blokken kan mechanismen van DNA-reparatie onthullen.
- Escherichia coli dient als modelorganisme voor deze studies.
Doel van het onderzoek
- Om een replicatievork te vertragen op een nucleoproteïneblok.
- Om DNA-structuren op de plaats van het blok te observeren.
- Om de verwerking van DNA tijdens replicatie te onderzoeken bij het tegenkomen van een eiwitobstakel.
Gebruikte methoden
- Fluorescentiemicroscopie om de vestiging van de replicatieblok te evalueren.
- Neutrale-neutrale 2-dimensionale agarose gelelektroforese om replicatie-intermediaten te visualiseren.
- Gebruik van een E. coli-stam met een tetracycline-operatorarray in het pKM1-plasmide.
- Induceerbaar geel fluorescent eiwit-gelabeld tetracycline-repressoreiwit (TetR-YFP) voor visualisatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vertraging van replicatievorken op specifieke locaties.
- Visualisatie van DNA-structuren op de replicatieblok.
- Inzichten in de cellulaire respons op replicatiestress.
- Demonstratie van de effectiviteit van de methode in een populatie van levende cellen.
Conclusies
- De methode biedt een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van DNA-replicatie en -reparatie.
- Omkeerbare vertraging van replicatievorken maakt gedetailleerde analyse van DNA-verwerking mogelijk.
- Deze benadering kan ons begrip van cellulaire reacties op DNA-schade verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables site-specific, reversible stalling of replication forks in living bacterial cells, providing a controlled system to study DNA repair mechanisms under defined replication stress. By visualizing replication intermediates and fork collapse events, it supports mechanistic de-risking of DNA-targeting therapeutics and enhances predictive confidence in early-stage target validation. The approach offers a scalable, quantitative platform for probing genomic stability pathways relevant to antimicrobial and anticancer drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by inducing defined replication fork stalling to assess DNA damage response pathways.
- Operational Value: Provides a reversible, inducible system for consistent induction of replication stress across cell populations.
- Predictive Value: Supports target confidence by linking protein-DNA interactions to functional outcomes in fork stability and repair.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable replication intermediate profiles via 2D gel electrophoresis for compound-induced DNA structural changes.
- Operational Value: Standardizes detection of Y-shaped DNA and Holliday junction formation as biomarkers of replication stress.
- Assay Readiness: Uses fluorescence microscopy to confirm block establishment (>70% single foci) as a quantitative gate for downstream analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates study of recombination proteins and helicases in fork recovery using genetic knockouts, informing target prioritization.
- Operational Value: Integrates temperature-sensitive replisome mutants (e.g., DnaBts) for synchronous fork collapse to improve reproducibility.
- Translational Continuity: Connects bacterial replication stress responses to conserved eukaryotic DNA repair mechanisms relevant to preclinical modeling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows by enabling hypothesis-driven interrogation of replication-associated targets before lead identification, with outputs informing mechanistic de-risking and assay readiness for screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of protein-DNA interactions as replication obstacles and their impact on fork progression.
- Screening: Enables development of fluorescence-based and gel-based assays to quantify replication block establishment and reversal.
- Analytics: Produces measurable outputs including focal point accumulation, Y-arc signals, and cone/spike intermediates for comparative condition analysis.
- Translational Research: Links bacterial fork recovery mechanisms to eukaryotic repair pathways, supporting cross-species target validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for inducible, site-specific replication stress applicable across multiple target classes and strain backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of targets through direct visualization of replication fork processing and repair intermediate formation.
- Operational Value: Reversible induction via arabinose/TetR-YFP and anhydrotetracycline enables washout and recovery studies in synchronized populations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by quantifying target engagement effects on genomic stability and repair pathway activation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of DNA-associated targets based on functional validation in a living-cell replication stress model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, 2D gel electrophoresis, and molecular cloning for plasmid maintenance.
- Dependent on agarose plug preparation quality and restriction enzyme selection for region-of-interest analysis.
- Necessitates standardization of induction timing, OD monitoring, and focal point quantification across replicates.
- Adaptation to other model systems requires functional orthologs of TetR operator arrays and compatible replisome components.
- Practical limitations include plug preparation time and sensitivity of 2D gel resolution to DNA integrity and agarose purity.
