Induceren van een Site Specific Replication Verstopping in

Het algemene doel van dit experiment is om een replicatievork te blokkeren bij een nucleoproteïneblok en de DNA-structuren op de plek van de blokkade te observeren om DNA-reparatiepaden te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over DNA-replicatie en -reparatie, zoals de wijze waarop DNA wordt verwerkt wanneer het replicatieapparaat van de cel een eiwitblokkade tegenkomt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we een replicatievork reversibel kunnen blokkeren op een specifieke locatie op het chromosoom in een volledige populatie levende cellen.

Deze procedure zal worden gedemonstreerd door de volgende leden van mijn laboratorium: Dr. Karla Mettrick en promovendi Georgia Weaver en Tayla-Ann Corocher. Voor deze procedure wordt een E.coli-stam gebruikt die een tetracycline-operator-array in het pKM1-plasmide bevat. pKM1 codeert voor TetR-YFP, een induceerbaar tetracycline-repressor-eiwit dat is gelabeld met een geel fluorescerend eiwit.

Verdun een verse overnight-kweek van deze E.coli-stam tot een optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,01 in een verdund complex medium met antibiotica zoals vereist voor selectie. Kweek de cultuur bij 30 graden celsius onder schudcondities tot een optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,05 tot 0,1. Neem een monster van 10 milliliter om te dienen als niet-geïnduceerde controle.

Voeg 0,01% arabinose toe aan de resterende cultuur om de productie van TetR-YFP vanuit pKM1 te induceren. Laat zowel de niet-geïnduceerde als de geïnduceerde culturen verder groeien bij 30 °C onder schudcondities. Controleer na één uur met fluorescentiemicroscopie op de aanwezigheid van een enkel brandpunt (focal point) binnen elke cel van de geïnduceerde cultuur.

Als wordt bevestigd dat de geïnduceerde cellen geblokkeerd zijn, wat wordt aangegeven door het feit dat meer dan 70% van de cellen één enkel focus vertoont, noteer dan de optische dichtheid en neem 7,5 milliliters van het monster af voor analyse via tweedimensionale gelelektroforese. Neem een gelijkwaardig monster af van de niet-geïnduceerde controlecultuur. Bereid vóór de fluorescentiemicroscopie de agarosepads voor om beweging van de cellen tijdens de visualisatie te voorkomen.

Pipetteer voor elk agarosekussentje 500 µL gesmolten agarose op een objectglas en plaats onmiddellijk het dekglas voordat de agarose stolt. Bewaar de objectglazen tussen vochtige tissues bij 4 °C tot gebruik. Wanneer de cellen gecontroleerd moeten worden, verwijder dan het dekglas van het agarosekussentje en pipetteer 10 µL bacteriële cultuur op het midden van het kussentje.

Na ongeveer vijf minuten, wanneer het agarose-kussen is opgedroogd, plaatst u het dekglas terug. Breng een druppel immersie-olie aan op het dekglas en plaats het preparaat onder de optiek. Visualiseer de cellen met behulp van fasemicroscopie bij een vergroting van 100x.

Stel in het dialoogvenster 'Acquire' van de imaging-software de belichtingstijd (Exposure Time) in op 100 milliseconden. Selecteer Acquire om het beeld vast te leggen. Beweeg de tafel niet.

Selecteer in het dialoogvenster Acquired YFP als de belichting voor de externe sluiter die aan de camera is gekoppeld. Stel de belichtingstijd (Exposure Time) in op 1 000 milliseconden. Schakel de tafelverlichting uit en selecteer Acquire om het fluorescentiebeeld vast te leggen.

Om deze procedure te starten, voegt u natriumazide toe aan eerder verzamelde cultuurmonsters tot een eindconcentratie van 0,1% en incubeert u deze gedurende ten minste vijf minuten op ijs. Centrifugeer de cellen bij 5.000 ×g gedurende tien minuten. Verwijder het supernatant.

Resuspendeer elk celpellet in 200 µL PIV-buffer en breng de cellen over naar een microcentrifugebuisje. Centrifugeer kort om de cellen te pelletteren en verwijder het supernatant. Behandel een microscopisch objectglas met 40 µL van een geschikte waterafstotende glascoating of siliconenoplossing.

Wrijf het objectglas met een tissue schoon tot het droog is. Resuspendeer de cellen met de laagste celdichtheid in 50 µL PIV en plaats deze bij 50 °C in een heat block. Pas voor alle overige monsters de volumes PIV aan, zodat de uiteindelijke celdichtheid in elke buis gelijk is.

Voeg een gelijk volume vers bereide 0,8% agarose-oplossing in PIV toe aan de monsters. Houd de monsters in het warmteblok om ervoor te zorgen dat ze boven de 50 °C blijven om stolling te voorkomen. Plaats druppels van 20 µL van de cel-agarose-suspensie op de behandelde objectglasplaat om hemisferische plugs te vormen.

Zodra de pluggen zijn gestold, schuift u voorzichtig alle pluggen van één monster in een enkele microcentrifugebuis en voegt u één milliliter cellysisbuffer toe. Incubeer gedurende twee uur bij 37 °C. Verwijder na twee uur de cellysisbuffer en voeg 1 milliliter EDTA-Sarkosyl-Proteïnase K of ESP-oplossing toe.

Incubeer gedurende de nacht bij 50 °C of totdat de plugs transparant zijn. Zodra de plugs transparant zijn, verwijdert u de ESP-buffer en brengt u de plugs over naar een buis van 15 ml. Voeg 12 ml TE-buffer toe en laat dit 30 minuten staan.

Was de plugs in totaal vijf keer met TE-buffer. Bewaar de plugs bij vier graden celsius in één milliliter TE-buffer. Om de replicatie-intermediairen te analyseren, wordt het DNA in de agarose plugs gedigesteerd met een passend restrictie-enzym voor het gebied van belang.

In dit voorbeeld knipt EcoRV het DNA direct vóór de array, binnen de array en na de array, om fragmenten van 5,5 kb en 6,7 kb in het gebied van interesse te verkrijgen. Om deze procedure te starten, brengt u een agaroseplug over naar een nieuwe microcentrifugebuis en voegt u 150 µL restrictie-enzymbuffer toe. Voeg 25 tot 100 units restrictie-enzym toe en verteer bij 37 °C gedurende zes tot acht uur.

Bereid een 0,4% agarosegel voor bij vier graden celsius. Giet 300 milliliters gesmolten agarose in een geltray van ongeveer 25 bij 25 centimeters. Plaats een kam om putjes te maken met een breedte die ongeveer gelijk is aan de diameter van de plug.

Zodra de gel is gestold, verwijdert u de kam en laat u de gel op kamertemperatuur komen. Schuif met een inoculatielus een van de verteerde agarose-plugs in een putje, waarbij de platte zijde van de plug tegen de wand van het putje wordt geplaatst waar het DNA de gel in zal treden. Plaats op dezelfde wijze in elk tweede putje één enkele plug.

Pipette gesmolten 0,4% agarose in de putjes om de pluggen op hun plaats te verzegelen. Laad een 1 kb DNA-ladder in een leeg putje, waarbij een tussenruimte tussen de ladder en de monsters wordt gelaten. Laat de gel overnight lopen in 1xTBE bij kamertemperatuur.

Kleur de gel op de volgende dag gedurende 20 minuten in een waterbad dat 0,3 microgram per milliliter ethidiumbromide bevat. Visualiseer het DNA met een UV-transilluminator voor lange golflengten en snijd elk lane-fragment met een rechte, gelijkmatige snede, waarbij het meenemen van overtollige agarose aan weerszijden van de lane tot een minimum wordt beperkt. Plaats de uitgesneden gel-lane in een geltray onder een hoek van 90 graden ten opzichte van de richting van de DNA-migratie.

De volgende stap is het voorbereiden van 300 milliliter agarose voor de tweede dimensie gel. Wanneer de agarose is afgekoeld tot 50 °C, pipetteer dan de gesmolten agarose rondom de gelplakjes om hun positie te fixeren. Giet de resterende agarose in de tray tot een diepte die ten minste gelijk is aan die van de gelplakjes.

Zodra de gel is gestold, wordt deze geëlektroforeseerd in 1xTBE bevattend 0,3 microgram per milliliter ethidiumbromide bij vier graden celsius totdat het DNA ongeveer 10 centimeter is gemigreerd. Snijd de blokken uit waarin het genomisch DNA aanwezig is, inclusief de gel erboven, om ook het DNA mee te nemen dat niet zichtbaar is. Het DNA in de gel wordt vervolgens gevisualiseerd via Southern hybridisatie zoals beschreven in het tekstprotocol.

In dit systeem werd een replicatieblok bevestigd door een meerderheid van cellen die één focus bevatten, wat overeenkomt met één kopie van het array binnen de cel. De toevoeging van anhydrotetracycline hief het blok op, waarna de daaropvolgende duplicatie van het array werd gevisualiseerd als de accumulatie van cellen met meerdere foci. Cellen met een geblokkeerde replicatie vertoonden ook groeiremming, die werd opgeheven door daaropvolgende groei in de aanwezigheid van anhydrotetracycline.

Om de replicatie-intermediairen te analyseren, werd het DNA in de eerste dimensie geëlektroforeerd. Het DNA van belang werd vervolgens uitgesneden en een tweede dimensie elektroforese resulteerde in een diagonaal van lineair DNA. Southern-hybridisatie van het array-DNA onthulde in het niet-geblokkeerde monster twee spots die overeenkwamen met de verwachte fragmenten van 5,5kb en 6,7kb van de array.

Het geblokkeerde monster vertoonde een afname van de 5,5kb spot en de toevoeging van een elliptisch signaal, wat wijst op een accumulatie van Y-vormig DNA. Toevoeging van anhydrotetracycline elimineerde het Y-vormige DNA-signaal. Een ander veelvoorkomend intermediair is de Holliday-junction, gevisualiseerd als een kegelvormig signaal aan de bovenkant van de Y-boog en een piek vanuit het lineaire DNA aan het uiteinde van de Y-boog.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in acht dagen worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Hoewel het een 2D-procedure betreft, is het belangrijk om te onthouden dat de kwaliteit van de DNA-plugs cruciaal is voor de optimale visualisatie van de DNA-structuren.