Name: Induceren van een Site Specific Replication Verstopping in E. coli Met behulp van een TL-repressor aandrijfsysteem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Leer hoe u een replicatievork in E. coli kunt blokkeren met een TetR-YFP-systeem om DNA-structuren te bestuderen. Deze methode maakt reversibele blokkades mogelijk voor onderzoek naar DNA-reparatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Australian Research Council [DP11010246].

1. Het blokkeren van replicatie met FROS <ol><li> Induceren van de Replication Verstopping <ol><li> Verdun een frisse &#39;s nachts cultuur van een E. coli stam die een tetO array en pKM1 18 OD 600 nm = 0,01 in een verdunde complex medium (0,1% trypton, 0,05% gistextract, 0,1% NaCl, 0,17 M KH 2PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4) met antibiotica behoefte voor selectie. Opmerking: Weet tetracycline niet toe te voegen voor de selectie, omdat het niet compatibel is met dit systeem. Maak het volume van de kweek equivalent aan 10 ml per monster nodig. Bijvoorbeeld, de kweekvolume voor proefopzet in figuur 1 is 60 ml. </li><li> Groeien bij 30 ° C onder schudden totdat OD 600 nm = 0,05-0,1. Verwijderen van een 10 ml monster te dienen als de geïnduceerde controle en voeg 0,1% arabinose om de resterende cultuur aan de productie van TetR-YFP van pKM1 induceren. Blijven zowel de niet-geïnduceerde en geïnduceerde te groeienculturen. Na 1 uur, controleren op de aanwezigheid van één centraal punt binnen elke cel van de geïnduceerde cultuur met behulp van fluorescentie microscopie (zie hoofdstuk 2). </li><li> Als de geïnduceerde cellen bevestigd geblokkeerd (meer dan 70% van de cellen een enkele focus), noteer de OD 600 nm en neem een 7,5 ml monster voor analyse door 2-D gels (zie paragraaf 3). Neem een ​​gelijkwaardig monster van de niet-geïnduceerde controle cultuur. </li></ol></li><li> Het loslaten van de Replication Verstopping <ol><li> Om de replicatie blok los, voeg 100 ng ml -1 van de onnodige inducerende anhydrotetracycline (AT) om een 10 ml monster van de geblokkeerde cellen. Verder groeien bij 30 ° C gedurende 10 minuten en monsters voor celdichtheid (1 ml), microscopie analyse (10 ui) en neutraal neutraal 2-dimensionale agarosegels (7,5 ml). </li></ol></li><li> Inducerende Instorting van de replisome <ol><li> Als de cellen bevatten een temperatuurgevoelige allel zoals dnaB ts of dnaC ts dat deactiva vereisttie, verplaats de kolf die de geblokkeerde cellen tot 42 ° C. Monsters nemen voor analyse op tijdstippen vereist (bijv, 1 uur na incubatie). Nadat de cellen bij 42 ° C gedurende 1 uur geïncubeerd hebben, verschuiven de cellen tot 30 ° C gedurende 10 minuten (zie figuur 1). Opmerking: De cellen kunnen opnieuw voor analyse worden verschoven naar 30 ° C. </li></ol></li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54434/54434fig1.jpg" /> Figuur 1:. Overzicht van de FROS Replication Block and Release Experimentele procedure E. coli stammen die de tetO matrix worden gekweekt bij 30 ° C. Wanneer de cellen een OD 600 nm van meer dan 0,05 te bereiken, is TetR-YFP productie geïnduceerd met arabinose (ara; 0,1%). Blijven groeien een subpopulatie van geïnduceerde cellen om als controles bij 30 ° C. Een monster van de geïnduceerde cellen geanalyseerd via fluorescentiemicroscopie na 1-2 uur (zie 2.1). Als replicatiebevestigd worden geblokkeerd, worden monsters voor 2-D gel analyse gaf de reageerbuizen (zie 3.1) en testen op levensvatbaarheid (optioneel). De replicatie verstopping kan worden verwijderd met anhydrotetracycline (AT, 0,1 gg / ml) en cellen geanalyseerd 10 minuten later. Als cellen dragen een temperatuurgevoelig allel (bijv dnaB ts), kan deze worden geïnactiveerd door het verschuiven van de geblokkeerde cellen tot 42 ° C voor de juiste analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 2. fluorescentiemicroscopie <ol><li> Bereid een agarose pad pipetteren 500 ul van gesmolten agarose (1% in water) op een microscoopglaasje; overlay het dekglaasje onmiddellijk vóór de agarose stolt. Bewaar de schuif (s) in vochtige doekjes bij 4 ° C totdat het nodig is. </li><li> Wanneer de agar is gestold, verwijder de dekglaasje uit de agarose pad en pipet 10 ul van bacteriëlecultuur op het midden van het kussen om beweging van de cellen tijdens visualisatie voorkomen. Zodra het monster is opgedroogd (ongeveer 5 min), vervang dan de dekglaasje. Breng een druppel immersie olie op de cover slip en plaats de dia onder optiek. </li><li> Visualiseer de cellen met behulp van Phase Microscopy bij 100X vergroting. <ol><li> In het dialoogvenster Acquire vak in het imaging software, ingesteld belichtingstijd tot 100 msec. Leg het beeld door het selecteren van Acquire. Niet bewegen het podium. In het dialoogvenster Acquire selecteert YFP als de verlichting voor de externe Shutter Gekoppeld aan Camera. Stel de exporsure tijd tot 1000 msec. Schakel het podium in het licht. Leg het beeld fluorescentie door het selecteren van Acquire. Opmerking: De tijd kan variëren afhankelijk van de lichtbron, microscoop en gebruikte camera. </li><li> Om de fase en fluorescerende beelden overlay, selecteer Color Combineer vanuit het menu Weergave. In de Color Combineer dialoogvenster selecteert u de YFP afbeelding als de fase afbeelding als de bl de groene component enue component. Klik op kleur te combineren. Bepaal of de bevolking had replicatie met succes geblokkeerd door vast te stellen of de meerderheid van de cellen hebben één doel per cel. Opmerking: Vergelijking met een monster van de controle zonder toegevoegde arabinose is zeer handig zijn het verschil in EYFP productie identificeren. </li></ol></li></ol> 3. DNA Extraction / agarosestukjes <ol><li> Voeg natriumazide (eindconcentratie 0,1%) aan de kweek monsters 7,5 ml van stap 1.1.3 en 1.2.1. Incubeer op ijs gedurende tenminste 5 min. Opmerking: Natriumazide is uiterst giftig. Raadpleeg het veiligheidsinformatieblad alvorens te beginnen werken en hoeft het niet aan nadat u alle veiligheidsvoorschriften gelezen en begrepen. </li><li> Centrifugeer de cellen 5000 xg gedurende 10 minuten om de cellen te pelleteren. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 200 pl Pett IV (PIV) buffer (10 mM Tris HCl (pH 8,0), 1 M NaCl). Microcentrifuge (13, 000 xg gedurende 2 minuten) om cellen te pelleteren. discard de bovenstaande vloeistof. In deze fase, de werkwijze verder de pellets of bewaar bij -20 ° C. </li><li> Resuspendeer de cellen met de laagste celdichtheid in 50 gl PIV en plaats bij 50 ° C. Voor alle andere monsters, stel het volume van PIV zodat de uiteindelijke celdichtheid is hetzelfde in elke buis (bijvoorbeeld Voorbeeld 1 (OD 600 nm = 0,128) geresuspendeerd in 50 pl; Monster 2 (OD 600 nm = 0,138) geresuspendeerd in 54 ui). <ol><li> Voeg een gelijk volume van vers bereide 0,8% agarose oplossing PIV (eindconcentratie 0,4%, bijv. Voorbeeld 1 50 pl, Sample 2 54 pi). Waarborgen dat de monsters, agarose en PIV boven 50 ° C om stolling te voorkomen. </li></ol></li><li> Behandel een microscoop dia met 40 ul van een geschikt glas waterafstotend of silicone oplossing. Wrijf de dia met een tissue totdat het droog is. Opmerking: Dit kan van tevoren de behandelde objectglaasjes opgeslagen op lange termijn bij kamertemperatuur. </li><li> Plaats 20 ul druppels tHij cel / agarose ophanging op de dia te pluggen die halfronde te produceren. Opmerking: De eerste monster (gesuspendeerd in 50 ui PIV) zal 5 stekkers produceren op één dia. </li><li> Wanneer de pluggen gestold, schuif ze zachtjes in een microfugebuis en voeg 1 ml lysis buffer (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1 M NaCl, 100 mM Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 0,2% natriumdeoxycholaat, 0,5% N-lauroylsarcosine-natriumzout (Sarkosyl), 100 ug ml - 1 lysozym, 50 ug ml - 1 RNase A). Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur. </li><li> De cel lysis buffer en voeg / oplossing 1 ml EDTA Sarcosyl / Proteinase K (ESP) (0,5 M EDTA, 1% N-lauroylsarcosine-natriumzout (Sarkosyl), 1 mg ml - 1 proteinase K). Incubeer bij 50 ° C geïncubeerd of totdat de pluggen transparant. Als er een tweede incubatie gedurende de nacht nodig is, vervangt u de ESP-oplossing met verse buffer na ongeveer 18 uur. </li><li> Verwijder deESP buffer en was de pluggen 5 maal met 12 ml Tris-EDTA (TE) -buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0), waardoor een 30 min equilibreren bij elke wasbeurt. Bewaren bij 4 ° C in 1 ml TE-buffer. </li></ol> 4. Neutraal neutraal 2-dimensionale gel elektroforese <ol><li> Transfer een agarose stekker uit stap 3.8 een nieuwe microfugebuis en voeg 150 ul restrictie-enzym buffer (1x concentratie). 25-100 eenheden van restrictie-enzym (bijvoorbeeld 60 eenheden EcoRV, (zie figuur 3A)). Digest bij 37 ° C gedurende 6-8 uur. </li><li> Bij 4 ° C, giet een 0,4% agarosegel (300 ml) in 1 x Tris / boraat / EDTA (TBE) in een gel schaal van ongeveer 25 x 25 cm. Plaats een kam om putjes ongeveer dezelfde breedte als de diameter van de plug maken. Wanneer de gel wordt verwijderd, de kam en zet de gel tot kamertemperatuur. </li><li> Schuif een van de gedigereerde agarose pluggen in een put, het positioneren van de vlakke schuif van de plug tegen de zijde van de put waarbij tHij DNA zal de gel in te voeren. Steek één stekker op dezelfde manier in elk tweede put. </li><li> Pipetteer 0,4% gesmolten agarose aan de putjes om de stekkers verzegelen positie. </li><li> Laad 1 kb DNA ladder in een lege put, wederom met een afstand tussen de ladder en monsters en een nacht laat de gel (16 uur, 55 V) in 1 x TBE bij kamertemperatuur. </li><li> Vlekken op de gel in een waterbad met ethidiumbromide (0,3 ug ml-1) gedurende 20 min. Opmerking: Ethidiumbromide wordt beschouwd als een sterk mutageen en een toxine. Raadpleeg het veiligheidsinformatieblad alvorens te beginnen werken en hoeft het niet aan nadat u alle veiligheidsvoorschriften gelezen en begrepen. </li><li> Visualiseren van het DNA met een langegolf UV transilluminator en knip elke rij fragment met een rechte, zelfs gesneden, minimaliseert het opnemen van overtollige agarose aan weerszijden van de baan. Opmerking: Als bijvoorbeeld het fragment van belang is 5,5 kb, snijd een 7,5 cm fragment DNA fragmenten omvatten van 5 kb tot approximatEly 12 kb (zie figuur 3A). </li><li> Plaats de uitgesneden gel baan in een gel lade 90 ° Richtingsafhankelijke DNA migratie. Opmerking: Twee rijen van 3 gel fragmenten kunnen passen in een 25 x 25 cm 2 gel lade. De eerste rij gel lanes is bovenaan van de bak, de tweede rij 12,5 cm. </li><li> Bereid 300 ml agarose voor de tweede dimensie gel (0,9% in 1x TBE met 0,3 ug ml-1 ethidiumbromide). Wanneer de agarose is afgekoeld tot 50 ° C, pipet gesmolten agarose rond de gelplakjes hun positie te versterken. Giet de resterende agarose in de lade een diepte die tenminste gelijk met de gelplakjes. </li><li> Zodra de gel stolt, Electrophorese bij 4 ° C in 1 x TBE met 0,3 ug ml-1 ethidiumbromide bij 220 V totdat het DNA ongeveer 10 cm is gemigreerd. Opmerking: 4 uur is voldoende voor een 5,5 kb fragment maar een kleiner fragment minder tijd nodig. </li><li> Uitsnijden de blokken waar de genomische DNA aanwezig uzingen de rand van een metalen liniaal, waaronder de gel erboven om het DNA die niet zichtbaar is (zie figuur 3C) omvatten. </li></ol> 5. Southern hybridisatie <ol><li> oplossingspreparaat <ol><li> Bereid depurinering buffer (0,125 M HCl oplossing). Opmerking: Deze buffer kan worden hergebruikt en is stabiel bij kamertemperatuur gedurende 1 maand. </li><li> Bereid denaturatie buffer (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH). Opmerking: denaturatie buffer kan één keer worden hergebruikt en stabiel tot 3 maanden bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid Neutralisatie buffer (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris). Op pH 7,5 met HCl. Opmerking: Neutralisatie buffer kan één keer worden hergebruikt en stabiel tot 3 maanden bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid 10x Saline natriumcitraat (SSC) buffer (0,15 M trinatriumcitraat, 1,5 M NaCl, pH 7-8) voor gebruik in stappen 5.2.4 en 5.2.6. Vanuit deze buffer, maak een 2x SSC voorraad (voor gebruik in stap 5.2.9). Opmerking: 10x SSC en 2x SSC eenopnieuw stabiel bij kamertemperatuur gedurende 3 maanden. </li><li> Bereid Gemodificeerde Church en Gilbert Hybridization Buffer 19 (0,5 M fosfaatbuffer [pH 7,2], 7% (w / v) natriumdodecylsulfaat (SDS), 10 mM EDTA). Reactie bij 65 ° C grondig vóór gebruik op te lossen. </li></ol></li><li> Overdracht <ol><li> Spoel de gel uitgesneden blokken depurinering oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een rocker of rondschudapparaat. Houd de roersnelheid laag om te voorkomen dat schade aan de agarose blokken. </li><li> Spoel de gel blokken kort met gedestilleerd water en daarna met denaturatie buffer gedurende 30 min. Spoel opnieuw kort in gedestilleerd water en vervolgens incubeer de gel blokken neutralisatie buffer gedurende 30 minuten onder zacht schudden bij kamertemperatuur. </li><li> Snijd een nylonmembraan de exacte grootte van de gel (s). Snijd een inkeping in de rechter bovenhoek om te helpen bij het oriënteren van de membraan in de toekomst stappen. Noot: Twee gel blokken (6 monsters) kan worden gevisualiseerd op een membraan. </li><li> Giet genoeg 10x SSC in een tray, zodat het zal niet &#39;s nachts uitdrogen. Een platform ongeveer 5 cm boven het niveau van de buffer. Verzadigen 3 vellen 3MM chromatografie papier met 10x SSC en leg ze op het platform. Snijd de chromatografie papier, zodat het lang genoeg om te worden ondergedompeld in buffer aan beide uiteinden en breed genoeg om het membraan gel op passen. </li><li> Plaats de gel (s) bovenop de verzadigde chromatografiepapier. Frame van de gel met plasticfolie om de buffer te voorkomen door-het passeren van de gel tijdens de overdracht. Zorgvuldig lag de cut membraan op de top van de gel (s). Verwijder luchtbellen tussen het membraan en de gel door het werpen van een fles of serologische pipet zachtjes over het membraan. </li><li> Snijd drie vellen 3MM chromatografiepapier dezelfde grootte als het membraan. Verzadigen chromatografie papiervellen met 10x SSC en bovenop het membraan. Verwijder eventuele luchtbellen die zijn gevormd. </li><li> Stapel papieren handdoeken tenminste 5 cm boven het vloeipapier gevolgd door een vaste drager (voorkomendximate gewicht van 1 kg voor een 23 x 16 cm membraan). Laat de overdracht aan &#39;s nachts te gaan. </li><li> Expose het membraan (DNA-kant boven) tot 1200 J / m2 UV tot het DNA aan het membraan te verknopen. Niet uitspoelen voorafgaand aan deze stap. </li><li> Spoel het membraan grondig in 2x SSC te hoog achtergrondinformatie over de vlek foto&#39;s te voorkomen. Gebruik de vlek onmiddellijk voor hybridisatie (zie 5.3) of drogen bij kamertemperatuur, wikkel in plasticfolie en bewaar bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Hybridisatie <ol><li> Verwarm hybridisatieoven en flessen 55 ° C. </li><li> Voeg 100 ug ml -1 runderserumalbumine (BSA) en 10 ug ml-1 niet-specifiek DNA (bijvoorbeeld zalmsperma DNA) aan de voorverwarmde hybridisatiebuffer. </li><li> Met het oog op gelijkmatige verspreiding van de hybridisatiebuffer wanneer het membraan wordt opgerold, plaatst de blot op een vergelijkbare grootte kwadraat van nylon mesh met het DNA gebonden zijde van het membraan naar boven. Rol de vlek langs de lange zijde. glijbaande vlek / gaas in een hybridisatie fles. Voeg een geschikte hoeveelheid voorverwarmde hybridisatiebuffer de blot ontrollen (bijvoorbeeld 30 ml voor een 23 x 16 cm2 membraan). </li><li> Incubeer in een voorverwarmde oven roteren de flessen voor 1 uur. </li><li> Bereid de sonde door 50 ng gezuiverd PCR product homoloog aan het gebied van belang, 150 ng van willekeurige hexameer primers, Klenow fragment van buffer en H 2 O tot een volume van 13 pl maken. Kook gedurende 3 minuten plaats dan onmiddellijk op ijs. Voeg 1 ui 1 mM dCTP / dGTP / dTTP mix, 1 pl Klenow-fragment (5U) en 50 uCi deoxyadenosine 5&#39;-trifosfaat radiolabeled op de alfa fosfaat (α 32 P-dATP). </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Voeg 1 pl 1 mM dNTP mix en 1 pl Klenow-fragment. Incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Kook probe voor 5 min en voeg onmiddellijk hybridisatie buizen. Hybridiseren gedurende de nacht bij 55 ° C met rotatie. </li><li> Schenk de probe van membraan. Opmerking: De probe kan eenmaal worden hergebruikt. </li><li> Spoel het membraan kort voorverwarmde lage stringentie wasbuffer (2x SSC, 0,1% (w / v) SDS). Voeg frisse lage stringentie wasbuffer en incubeer gedurende 5 minuten bij 55 ° C met rotatie. Herhaling. </li><li> Was tweemaal matige stringentie wasbuffer (1 x SSC, 0,1% (w / v) SDS) gedurende 10 minuten bij 55 ° C met rotatie. </li><li> Was tweemaal in hoge stringentie wasbuffer (0,1 x SSC, 0,1% (w / v) SDS) gedurende 5 minuten bij 55 ° C met rotatie. </li><li> Verwijder het membraan en deppen met tissue om overtollige vloeistof te verwijderen. Wikkel in plasticfolie zodat er geen resterende vocht op de plastic omslag en plaats in de blootstelling cassette met een pre-blanked opslag fosforscherm. Sluit de cassette en blootgesteld gedurende ten minste 2 uur voor beeldvorming met een fosforbeeldvormer. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+stalling+at+natural+impediments%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Replication fork stalling at natural impediments.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 71 (1), 13-35 (2007).</li>
<li>Gupta, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-DNA+complexes+are+the+primary+sources+of+replication+fork+pausing+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7252-7257 (2013).</li>
<li>McGlynn, P., Guy, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+forks+blocked+by+protein-DNA+complexes+have+limited+stability+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro.</a> J Mol Biol. 381 (2), 249-255 (2008).</li>
<li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+fork+dynamics+in+Escherichia+coli+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of fork dynamics in Escherichia coli DNA replication.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (2), 170-176 (2008).</li>
<li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457 (7227), 336-339 (2009).</li>
<li>Rudolph, C. J., Upton, A. L., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+stalling+and+cell+cycle+arrest+in+UV-irradiated+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Replication fork stalling and cell cycle arrest in UV-irradiated Escherichia coli.</a> Genes Dev. 21 (6), 668-681 (2007).</li>
<li>Jeiranian, H. A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+replication+reduces+RecA-mediated+repair+of+UV-damaged+plasmids+introduced+into+competent+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Inefficient replication reduces RecA-mediated repair of UV-damaged plasmids introduced into competent Escherichia coli.</a> Plasmid. 68 (2), 113-124 (2012).</li>
<li>Le Masson, M., Baharoglu, Z., Michel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ruvA+and+ruvB+mutants+specifically+impaired+for+replication+fork+reversal%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">ruvA and ruvB mutants specifically impaired for replication fork reversal.</a> Mol Microbiol. 70 (2), 537-548 (2008).</li>
<li>Wang, X., Liu, X., Possoz, C., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+Escherichia+coli+chromosome+arms+locate+to+separate+cell+halves%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The two Escherichia coli chromosome arms locate to separate cell halves.</a> Genes Dev. 20 (13), 1727-1731 (2006).</li>
<li>Lau, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+organization+of+replicating+Escherichia+coli+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal organization of replicating Escherichia coli chromosomes.</a> Mol Microbiol. 49 (3), 731-743 (2003).</li>
<li>Gordon, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+and+low+copy+plasmid+segregation+in+E.+coli%3A+visual+evidence+for+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosome and low copy plasmid segregation in E. coli: visual evidence for distinct mechanisms.</a> Cell. 90 (6), 1113-1121 (1997).</li>
<li>Possoz, C., Filipe, S. R., Grainge, I., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+of+controlled+Escherichia+coli+replication+fork+stalling+and+restart+at+repressor-bound+DNA+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Tracking of controlled Escherichia coli replication fork stalling and restart at repressor-bound DNA in vivo.</a> EMBO J. 25 (11), 2596-2604 (2006).</li>
<li>Payne, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+blockage+by+transcription+factor-DNA+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Replication fork blockage by transcription factor-DNA complexes in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 34 (18), 5194-5202 (2006).</li>
<li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+localization+of+replication+origins+on+ARS+plasmids+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The localization of replication origins on ARS plasmids in S. cerevisiae.</a> Cell. 51 (3), 463-471 (1987).</li>
<li>Jeiranian, H. A., Schalow, B. J., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+UV-induced+replication+intermediates+in+E.+coli+using+two-dimensional+agarose-gel+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of UV-induced replication intermediates in E. coli using two-dimensional agarose-gel analysis.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li>
<li>Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+specific+sequences+among+DNA+fragments+separated+by+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.</a> J Mol Biol. 98 (3), 503-517 (1975).</li>
<li>Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage-induced+replication+fork+regression+and+processing+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA damage-induced replication fork regression and processing in Escherichia coli.</a> Science. 299 (5609), 1064-1067 (2003).</li>
<li>Mettrick, K. A., Grainge, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+blocked+replication+forks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stability of blocked replication forks in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li>
<li>Church, G. M., Gilbert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genomic sequencing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (7), 1991-1995 (1984).</li>
<li>Michel, B., Grompone, G., Flores, M. J., Bidnenko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathways+process+stalled+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple pathways process stalled replication forks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12783-12788 (2004).</li>
<li>Michel, B., Boubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+proteins+and+rescue+of+arrested+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Recombination proteins and rescue of arrested replication forks.</a> DNA Repair (Amst). 6 (7), 967-980 (2007).</li>
<li>Carl, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+mutants+with+temperature-sensitive+synthesis+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli mutants with temperature-sensitive synthesis of DNA.</a> Mol Gen Genet. 109 (2), 107-122 (1970).</li>
<li>Nawotka, K. A., Huberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+gel+electrophoretic+method+for+mapping+DNA+replicons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional gel electrophoretic method for mapping DNA replicons.</a> Mol Cell Biol. 8 (4), 1408-1413 (1988).</li>
<li>Cole, R. S., Levitan, D., Sinden, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+psoralen+interstrand+cross-links+from+DNA+of+Escherichia+coli%3A+mechanism+and+genetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Removal of psoralen interstrand cross-links from DNA of Escherichia coli: mechanism and genetic control.</a> J Mol Biol. 103 (1), 39-59 (1976).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Tijdens chromosoom duplicatie, zal de replicatiemachinerie verschillende belemmeringen tegenkomen die zijn voortgang verhinderen. Om ervoor te zorgen dat de gehele chromosoom met één oorsprong wordt gerepliceerd, hebben bacteriën talrijke paden voor reparatie van het DNA waardoor het replisoom vervolgens kan worden herladen20,21. Lesies, eenstrengs breuken, dubbelstrengs breuken en eiwitten die stevig aan het DNA zijn gebonden, kunnen elk worden behandeld met een specifiek pad, hoewel er waarschijnlijk een aan...

Tijdens DNA-replicatie, de replisome geconfronteerd obstakels op het DNA die de progressie beïnvloeden. DNA-schade met inbegrip van letsels en hiaten evenals afwijkende structuren kunnen voorkomen dat de replisome voortzetting 1. Recentelijk is gevonden dat eiwitten gebonden aan het DNA zijn de meest voorkomende bron van belemmering vork progressie 2 replicatie. De kennis van de gebeurtenissen na de ontmoeting van de replisome met een nucleoproteïne blok eerder beperkt door het onvermogen om zo&#39;n blok in het chromosoom van een levende cel te induceren op een bekende locatie. In vitro onderzoek heeft ons begrip van de kinetisch gedrag verbeterd een actieve replisome wanneer aan een nucleoproteïne blokkade 3, alsmede de mechanische details van de replisome zelf 4,5. Huidige kennis van de reparatie van replicatie wordt gewoonlijk uitgevoerd met UV als beschadigende middel en onderzocht met behulp van nucleïnezuren in vivo 6-8 </sup&gt;. Terwijl de eiwitten die betrokken kunnen zijn bij reparatie van DNA na het tegenkomt in vivo kerneiwitten blok algemeen verstaan ​​van deze onderzoeken of er verschillen in de moleculaire gebeurtenissen binnen de herstelmechanismen vanwege de duidelijke oorzaak van de replicatie blok blijft nog nader te bepalen. We beschrijven hier een systeem waarmee een nucleoproteïne blok op een specifieke locatie van het chromosoom met behulp van een TL-repressor operatorsysteem (FROS) worden vastgesteld. Wij gebruiken een stam van E. coli die een reeks van 240 tetO-plaatsen opgenomen in het chromosoom 9 heeft. TetO elke plaats in de array een 10 bp willekeurige sequentie flankerende om de stabiliteit van de matrix te verhogen door het voorkomen RecA-gemedieerde recombinatie in de array. Deze array, en variaties daarvan, werden oorspronkelijk gebruikt om E. begrijpen coli chromosoom dynamiek 10,11, maar werden vervolgens aangepast aan prevent in vivo replicatie 12. De matrix is gevonden stabiel worden gehandhaafd en naar blok dicht bij 100% van replicatievorken wanneer gebonden TetR 10,12. Het gebruik van de vergelijkbare lacO array in vitro is gevonden zo weinig als 22 plaatsen voldoende om 90% van replicatie geblokkeerd waren, hoewel kortere matrix minder effectief in vivo 13 was. De matrix aan te passen aan een nucleoproteïne verstopping maken dient de repressor eiwit zeer op overproductie onder geoptimaliseerde omstandigheden waar het dan bindt aan de array een wegversperring maken. De vorming van de blokkering en de daaropvolgende afgifte, kan worden gemonitord met behulp van fluorescentiemicroscopie of een fluorescent gelabeld variant van het Tet-repressor wordt gebruikt. De status van replicatie in elke cel wordt aangeduid door het aantal foci gezien, waarbij een enkel brandpunt betekent maar een kopie van de matrix aanwezig in de cel en meerdere foci zijn indicatief voor actieve replicatie. Deze actieve replicatie wordt ingeschakeld wanneer het nucleoproteïne blokkade wordt omgekeerd door de toevoeging van de inducer onnodig dat de bindingsaffiniteit van het TetR operatorplaats afneemt voldoende voor replisome te gaan door de matrix. De repressor proteïne nog kan binden aan het DNA met hoog genoeg affiniteit die de nu meerdere kopieën van de matrix kan worden gevisualiseerd. Meer ingewikkelde details van de gebeurtenissen bij de nucleoproteïne blokkade kan worden ontdekt met behulp van neutrale-neutrale tweedimensionale agarosegelelektroforese en Southern hybridisatie 14-16. Deze technieken laten de analyse van DNA tussen de diverse populatie. De replicatie tussenproducten die gevormd worden tijdens het evenement, en mogelijk nog niet herstelde, kan worden gevisualiseerd. Door het variëren van de restrictie-enzym en probe gebruikt, kunnen de tussenproducten worden gevisualiseerd niet alleen in de matrix gebied maar ook stroomopwaarts van de matrix bij de replicatievork regresses 17,18. Deregressie heeft plaatsgevonden na de replisome dissociatie; de leidende en ontluikende strengen te scheiden van de template strengen en hybridiseren met elkaar als de matrijs strengen tegelijkertijd opnieuw gloeien resulteert in een vierweg DNA-structuur (a Holliday kruising). Met dit systeem is aangetoond dat de replicatie vork niet stabiel wanneer dit blok 18 stuit. Daarnaast kunnen derivaten van temperatuurgevoelige replisome componenten worden gebruikt om te voorkomen dat het herladen van de replicatievork eenmaal is ingestort. Zodra een blok wordt ingesteld, kan de spanning worden verschoven naar een niet-permissieve temperatuur voor een synchrone deactivering van de replisome en een gecontroleerd preventie herladen waarborgen. Deze temperatuur veroorzaakte deactivering zorgt alle vorken binnen de populatie ingestort op een bepaalde tijd en maakt de beoordeling van wat gebeurt wanneer de replisome instort, hoe het DNA wordt verwerkt, wat nodig is om restart het proces van DNA-replicatie. Een voordeel van het beschreven systeem is dat het nucleoproteïne blok is volledig omkeerbaar; Daarom werd het vermogen van de cellen om te herstellen van het nucleoproteïne blok kan volgen. De toevoeging van anhydrotetracycline aan de cellen zal verlichten de sterke binding van de repressor, waardoor een replicatie vork om door te gaan en de cel om de levensvatbaarheid te herwinnen. De verlichting van de blokkering kan worden gevisualiseerd door neutrale neutraal tweedimensionale agarosegelelektroforese na 5 min en met behulp van microscopie binnen 10 minuten. Bovendien kan levensvatbaarheid van het vermogen van de stam om van de replicatie blokkade en blijven prolifereren onthullen. Door het veranderen van de genetische achtergrond van de stammen die in de experimentele hier beschreven, kan de herstelmechanismen voor dergelijke blokkade worden toegelicht.

<table><tbody><tr><td>Tryptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16922</td><td>Groeimediumcomponent</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>VWR</td><td>27810.364</td><td>Groeimediumcomponent</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92144</td><td>Groeimediumcomponent</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>Groeimediumcomponent; Kaliumbuffercomponent</td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td>Groeimediumcomponent; Kaliumbuffercomponent</td></tr><tr><td>L-Arabinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td>Voor inductie van TetR-YFP-productie</td></tr><tr><td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td>Vrijlating van replicatieblokkering</td></tr><tr><td>Axioskop 2 Fluorescerende microscoop</td><td>Zeiss</td><td>452310</td><td>Visualisatie van cellen</td></tr><tr><td>eYFP-filterset</td><td>Chroma Technology</td><td>41028</td><td>Visualisatie van YFP</td></tr><tr><td>CCD-camera</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca-AG</td><td>Visualisatie van cellen</td></tr><tr><td>MetaMorph&nbsp; Software (Molecular Devices)</td><td>SDR Scientific</td><td>31282</td><td>Versie 7.8.0.0 gebruikt bij de voorbereiding van dit manuscript</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td>Voor agarosepluggen en gelelektroforese</td></tr><tr><td>Original Glass Water Repellent (Rain-X)</td><td>Autobarn</td><td>DIO1470</td><td>Voor de vervaardiging van agarosepluggen</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>VWR</td><td>VWRC103157P</td><td>TE-, TBE-buffercomponent</td></tr><tr><td>Ethylene diaminetetraacetic acid</td><td>Ajax Finechem</td><td>AJA180</td><td>0,5 M EDTA-dinatriumzout-oplossing aangepast naar pH 8,0 met NaOH.</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Bacteriostatisch middel</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>TE-buffercomponent</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>Cellysebuffercomponent</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5125</td><td>Cellyse- en ESP-buffercomponent</td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Cellysebuffercomponent</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Amresco</td><td>6300</td><td>Cellysebuffercomponent</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Amresco</td><td>AM0706</td><td>ESP-buffercomponent</td></tr><tr><td>Sub-Cell Model 192 Cell</td><td>BioRad</td><td>1704507</td><td>Elektroforesesysteem</td></tr><tr><td>UV transilluminator 2000</td><td>BioRad</td><td>1708110</td><td>Visualisatie van DNA</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>BioRad</td><td>1610433</td><td>Visualisatie van DNA</td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>VWR</td><td>PROL20185.360</td><td>TBE-component</td></tr><tr><td>Hybond-XL nylon memrbane</td><td>Amersham</td><td>RPN203S</td><td>Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) kan ook worden gebruikt</td></tr><tr><td>3MM Whatman-chromatografiepapier</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3030690</td><td>Southern blotting</td></tr><tr><td>HL-2000 Hybrilinker</td><td>UVP</td><td>95-0031-01/02</td><td>Crosslinking van DNA en hybridisatie</td></tr><tr><td>Deoxyribonucleic acid from salmon sperm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31149</td><td>Hybridisatiebuffercomponent</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>Denaturatiebuffercomponent</td></tr><tr><td>Trisodium citrate dihydrate</td><td>VWR</td><td>PROL27833.363</td><td>Transferbuffer</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulphate (SDS)</td><td>Amresco</td><td>227</td><td>Wasbuffercomponent</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>Hybridisatiebuffercomponent</td></tr><tr><td>Random Hexamer Primers</td><td>Bioline</td><td>BIO-38028</td><td></td></tr><tr><td>Klenow fragment</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&rsquo;-triphosphate-32P-ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td></td></tr><tr><td>Storage Phosphor Screen</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>GEHE28-9564-76</td><td>BAS-IP MS 3543 E multifunctionele standaard 35 cm x 43 cm-scherm</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9558-09</td><td>Visualisatie van blot</td></tr><tr><td>Hybridisatiefles</td><td>UVP</td><td>07-0194-02</td><td>35 mm x 300 mm</td></tr></tbody></table>

induceren van een site specific replication verstopping in<i&gt; e. coli</i&gt; met behulp van een tl-repressor aandrijfsysteem

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

Obstakels van DNA, met inbegrip strak gebonden eiwitten en verscheidene laesies, kan ernstig de progressie van de cel replicatieapparatuur remmen. De blokkering van een replisome kan leiden tot de dissociatie van het chromosoom, hetzij gedeeltelijk of volledig, wat leidt tot de ineenstorting van de replicatie vork. Het herstel van deze val is een noodzaak voor de cel nauwkeurig volledige chromosomale duplicatie en vervolgens verdelen. Daarom, wanneer de instorting optreedt, de cel geëvolueerd diverse mechanismen die plek om de DNA vork te herstellen en laat replicatie neem aan te vullen met high fidelity. Eerder zijn deze replicatie herstel pathways in bacteriën bestudeerd met behulp van UV-schade, die het nadeel van het niet gelokaliseerd op een bekende plaats heeft. Dit manuscript beschrijft een systeem met behulp van een fluorescentie-repressor Operator System (FROS) om een ​​site-specifiek eiwit blok dat de stalling en de ineenstorting van de replicatie fo kan induceren creërenrks in Escherichia coli. Protocollen detail hoe de status van replicatie kan worden gevisualiseerd in enkelvoudige levende cellen middels fluorescentiemicroscopie en DNA replicatie tussenproducten kunnen worden geanalyseerd door 2-dimensionale agarose gelelektroforese. Temperatuurgevoelige mutanten van replisome componenten (bijv DnaBts) kunnen in het systeem worden opgenomen om een synchrone ineenstorting van de replicatievorken induceren. Bovendien kan de rol van de recombinatie eiwitten en helicases die betrokken zijn bij deze processen worden onderzocht met behulp van genetische knockouts in dit systeem.

De FROS een induceerbare, plaatsspecifieke nucleoproteïne blok dat replicatie-intermediairen mogelijk maakt worden gevisualiseerd in levende cellen 12,18. Een algemene experimentele opzet voor het bemonsteren cellen wordt geïllustreerd in figuur 1. De timing van de bemonstering en verschillen in genetische achtergrond maken dit een veelzijdig systeem voor het bestuderen van het herstel van een dergelijk blok. Het schema illustreert hoe temperatuurgevoelige mut...

We beschrijven hier een systeem dat gebruikmaakt van een locatie-specifieke, omkeerbare in vivo eiwitblokkering om replicatievorken in Escherichia coli te stoppen en te laten instorten. De totstandkoming van de replicatieblokkering wordt geëvalueerd door middel van fluorescentiemicroscopie en neutrale-neutrale 2-dimensionale agarosegelelektroforese wordt gebruikt om replicatie-intermediaten te visualiseren.

Induceren van een Site Specific Replication Verstopping in<i&gt; E. coli</i&gt; Met behulp van een TL-repressor aandrijfsysteem

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication ...

Het algemene doel van dit experiment is om een replicatievork te blokkeren bij een nucleoproteïneblok en de DNA-structuren op de plek van de blokkade te observeren om DNA-reparatiepaden te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over DNA-replicatie en -reparatie, zoals de wijze waarop DNA wordt verwerkt wanneer het replicatieapparaat van de cel een eiwitblokkade tegenkomt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we een replicatievork reversibel kunnen blokkeren op een specifieke locatie op het chromosoom in een volledige populatie levende cellen.Deze procedure zal worden gedemonstreerd door de volgende leden van mijn laboratorium: Dr. Karla Mettrick en promovendi Georgia Weaver en Tayla-Ann Corocher. Voor deze procedure wordt een E.coli-stam gebruikt die een tetracycline-operator-array in het pKM1-plasmide bevat. pKM1 codeert voor TetR-YFP, een induceerbaar tetracycline-repressor-eiwit dat is gelabeld met een geel fluorescerend eiwit.Verdun een verse overnight-kweek van deze E.coli-stam tot een optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,01 in een verdund complex medium met antibiotica zoals vereist voor selectie. Kweek de cultuur bij 30 graden celsius onder schudcondities tot een optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,05 tot 0,1. Neem een monster van 10 milliliter om te dienen als niet-geïnduceerde controle.Voeg 0,01% arabinose toe aan de resterende cultuur om de productie van TetR-YFP vanuit pKM1 te induceren. Laat zowel de niet-geïnduceerde als de geïnduceerde culturen verder groeien bij 30 °C onder schudcondities. Controleer na één uur met fluorescentiemicroscopie op de aanwezigheid van een enkel brandpunt (focal point) binnen elke cel van de geïnduceerde cultuur.Als wordt bevestigd dat de geïnduceerde cellen geblokkeerd zijn, wat wordt aangegeven door het feit dat meer dan 70% van de cellen één enkel focus vertoont, noteer dan de optische dichtheid en neem 7,5 milliliters van het monster af voor analyse via tweedimensionale gelelektroforese. Neem een gelijkwaardig monster af van de niet-geïnduceerde controlecultuur. Bereid vóór de fluorescentiemicroscopie de agarosepads voor om beweging van de cellen tijdens de visualisatie te voorkomen.Pipetteer voor elk agarosekussentje 500 µL gesmolten agarose op een objectglas en plaats onmiddellijk het dekglas voordat de agarose stolt. Bewaar de objectglazen tussen vochtige tissues bij 4 °C tot gebruik. Wanneer de cellen gecontroleerd moeten worden, verwijder dan het dekglas van het agarosekussentje en pipetteer 10 µL bacteriële cultuur op het midden van het kussentje.Na ongeveer vijf minuten, wanneer het agarose-kussen is opgedroogd, plaatst u het dekglas terug. Breng een druppel immersie-olie aan op het dekglas en plaats het preparaat onder de optiek. Visualiseer de cellen met behulp van fasemicroscopie bij een vergroting van 100x.Stel in het dialoogvenster 'Acquire' van de imaging-software de belichtingstijd (Exposure Time) in op 100 milliseconden. Selecteer Acquire om het beeld vast te leggen. Beweeg de tafel niet.Selecteer in het dialoogvenster Acquired YFP als de belichting voor de externe sluiter die aan de camera is gekoppeld. Stel de belichtingstijd (Exposure Time) in op 1 000 milliseconden. Schakel de tafelverlichting uit en selecteer Acquire om het fluorescentiebeeld vast te leggen.Om deze procedure te starten, voegt u natriumazide toe aan eerder verzamelde cultuurmonsters tot een eindconcentratie van 0,1% en incubeert u deze gedurende ten minste vijf minuten op ijs. Centrifugeer de cellen bij 5.000 ×g gedurende tien minuten. Verwijder het supernatant.Resuspendeer elk celpellet in 200 µL PIV-buffer en breng de cellen over naar een microcentrifugebuisje. Centrifugeer kort om de cellen te pelletteren en verwijder het supernatant. Behandel een microscopisch objectglas met 40 µL van een geschikte waterafstotende glascoating of siliconenoplossing.Wrijf het objectglas met een tissue schoon tot het droog is. Resuspendeer de cellen met de laagste celdichtheid in 50 µL PIV en plaats deze bij 50 °C in een heat block. Pas voor alle overige monsters de volumes PIV aan, zodat de uiteindelijke celdichtheid in elke buis gelijk is.Voeg een gelijk volume vers bereide 0,8% agarose-oplossing in PIV toe aan de monsters. Houd de monsters in het warmteblok om ervoor te zorgen dat ze boven de 50 °C blijven om stolling te voorkomen. Plaats druppels van 20 µL van de cel-agarose-suspensie op de behandelde objectglasplaat om hemisferische plugs te vormen.Zodra de pluggen zijn gestold, schuift u voorzichtig alle pluggen van één monster in een enkele microcentrifugebuis en voegt u één milliliter cellysisbuffer toe. Incubeer gedurende twee uur bij 37 °C. Verwijder na twee uur de cellysisbuffer en voeg 1 milliliter EDTA-Sarkosyl-Proteïnase K of ESP-oplossing toe.Incubeer gedurende de nacht bij 50 °C of totdat de plugs transparant zijn. Zodra de plugs transparant zijn, verwijdert u de ESP-buffer en brengt u de plugs over naar een buis van 15 ml. Voeg 12 ml TE-buffer toe en laat dit 30 minuten staan.Was de plugs in totaal vijf keer met TE-buffer. Bewaar de plugs bij vier graden celsius in één milliliter TE-buffer. Om de replicatie-intermediairen te analyseren, wordt het DNA in de agarose plugs gedigesteerd met een passend restrictie-enzym voor het gebied van belang.In dit voorbeeld knipt EcoRV het DNA direct vóór de array, binnen de array en na de array, om fragmenten van 5,5 kb en 6,7 kb in het gebied van interesse te verkrijgen. Om deze procedure te starten, brengt u een agaroseplug over naar een nieuwe microcentrifugebuis en voegt u 150 µL restrictie-enzymbuffer toe. Voeg 25 tot 100 units restrictie-enzym toe en verteer bij 37 °C gedurende zes tot acht uur.Bereid een 0,4% agarosegel voor bij vier graden celsius. Giet 300 milliliters gesmolten agarose in een geltray van ongeveer 25 bij 25 centimeters. Plaats een kam om putjes te maken met een breedte die ongeveer gelijk is aan de diameter van de plug.Zodra de gel is gestold, verwijdert u de kam en laat u de gel op kamertemperatuur komen. Schuif met een inoculatielus een van de verteerde agarose-plugs in een putje, waarbij de platte zijde van de plug tegen de wand van het putje wordt geplaatst waar het DNA de gel in zal treden. Plaats op dezelfde wijze in elk tweede putje één enkele plug.Pipette gesmolten 0,4% agarose in de putjes om de pluggen op hun plaats te verzegelen. Laad een 1 kb DNA-ladder in een leeg putje, waarbij een tussenruimte tussen de ladder en de monsters wordt gelaten. Laat de gel overnight lopen in 1xTBE bij kamertemperatuur.Kleur de gel op de volgende dag gedurende 20 minuten in een waterbad dat 0,3 microgram per milliliter ethidiumbromide bevat. Visualiseer het DNA met een UV-transilluminator voor lange golflengten en snijd elk lane-fragment met een rechte, gelijkmatige snede, waarbij het meenemen van overtollige agarose aan weerszijden van de lane tot een minimum wordt beperkt. Plaats de uitgesneden gel-lane in een geltray onder een hoek van 90 graden ten opzichte van de richting van de DNA-migratie.De volgende stap is het voorbereiden van 300 milliliter agarose voor de tweede dimensie gel. Wanneer de agarose is afgekoeld tot 50 °C, pipetteer dan de gesmolten agarose rondom de gelplakjes om hun positie te fixeren. Giet de resterende agarose in de tray tot een diepte die ten minste gelijk is aan die van de gelplakjes.Zodra de gel is gestold, wordt deze geëlektroforeseerd in 1xTBE bevattend 0,3 microgram per milliliter ethidiumbromide bij vier graden celsius totdat het DNA ongeveer 10 centimeter is gemigreerd. Snijd de blokken uit waarin het genomisch DNA aanwezig is, inclusief de gel erboven, om ook het DNA mee te nemen dat niet zichtbaar is. Het DNA in de gel wordt vervolgens gevisualiseerd via Southern hybridisatie zoals beschreven in het tekstprotocol.In dit systeem werd een replicatieblok bevestigd door een meerderheid van cellen die één focus bevatten, wat overeenkomt met één kopie van het array binnen de cel. De toevoeging van anhydrotetracycline hief het blok op, waarna de daaropvolgende duplicatie van het array werd gevisualiseerd als de accumulatie van cellen met meerdere foci. Cellen met een geblokkeerde replicatie vertoonden ook groeiremming, die werd opgeheven door daaropvolgende groei in de aanwezigheid van anhydrotetracycline.Om de replicatie-intermediairen te analyseren, werd het DNA in de eerste dimensie geëlektroforeerd. Het DNA van belang werd vervolgens uitgesneden en een tweede dimensie elektroforese resulteerde in een diagonaal van lineair DNA. Southern-hybridisatie van het array-DNA onthulde in het niet-geblokkeerde monster twee spots die overeenkwamen met de verwachte fragmenten van 5,5kb en 6,7kb van de array.Het geblokkeerde monster vertoonde een afname van de 5,5kb spot en de toevoeging van een elliptisch signaal, wat wijst op een accumulatie van Y-vormig DNA. Toevoeging van anhydrotetracycline elimineerde het Y-vormige DNA-signaal. Een ander veelvoorkomend intermediair is de Holliday-junction, gevisualiseerd als een kegelvormig signaal aan de bovenkant van de Y-boog en een piek vanuit het lineaire DNA aan het uiteinde van de Y-boog.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in acht dagen worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Hoewel het een 2D-procedure betreft, is het belangrijk om te onthouden dat de kwaliteit van de DNA-plugs cruciaal is voor de optimale visualisatie van de DNA-structuren.

inducing-site-specific-replication-blockage-e-coli-using-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een snelle en efficiënte methode om vreemd DNA van belang te integreren in pre-en-klare acceptor stammen, aangeduid als landingsplaats stammen, beschreven. De methode maakt het mogelijk site-specifieke integratie van een DNA-cassette in de gemanipuleerde landingsplaats locus van een bepaalde stam, door middel van conjugatie en de expressie van de ΦC31 integrase.

Site-specifieke bacteriële chromosoom Engineering: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Systematische, grootschalige synthetische genetische (gen-gen of epistase) interactie schermen kunnen worden gebruikt om genetische redundantie en route overspraak verkennen. Hier hebben we een high-throughput kwantitatieve synthetische genetische scala screening technologie te beschrijven, genoemd eSGA door ons ontwikkelde voor het ophelderen van epistatisch relaties en het verkennen van genetische interactie netwerken...

Het in kaart brengen Bacteriële Functionele Netwerken en Wegen in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Gebruik van synthetische Genetische Arrays

Het ontwerp van een synthetische operon codeert voor zowel de secretoire inrichting en de structurele monomeren Curli vezels beschreven. Overproductie van deze amyloïden en hechtende polymeren kan een meetbare versterking van de hechting van...

Techniek Adherent Bacteriën door het creëren van een synthetische Curli Operon

Source: Lea-Smith, D. J., et al. Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species. J. Vis. Exp. (2016)The video demonstrates a method for generating antibiotic-marked mutants in cyanobacteria. The protocol begins with culturing cyanobacteria, followed by centrifugation and washing steps that preserve surface pili. A plasmid carrying an antibiotic resistance gene flanked by homologous sequences is then introduced. During incubation, the plasmid is internalized via pili...

Generation of Antibiotic-Marked Mutants in Cyanobacteria via Homologous Recombination

Source: Mettrick, K. A., Lawrence, et al., Inducing a Site-Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates site-specific replication fork blockage in Escherichia coli using arabinose-induced expression of yellow fluorescent protein-tagged TetR that binds chromosomal tetO arrays.

Fluorescently Tagged Repressor Protein-Mediated Replication Blockage in Escherichia coli

This video demonstrates an in vivo assay in bacteria to study the interaction of RNA-binding proteins (RBPs) with RNA. The bacterial cells are transformed with two plasmid constructs — a binding-site plasmid encoding an mRNA containing a fluorescent reporter gene downstream of an RBP-binding site — while an RBP plasmid expresses the RBP proteins under the control of an inducer. Upon inducer-mediated increase in RBP production, the RBPs bind to the mRNA, resulting in translational repression of...

Reporter Gene Repression Assay to Study Translational Regulation of a Target Gene

We beschrijven een werkwijze fluorescentiemicroscopie, co-translationele activering door splitsing (CoTrAC), het afbeelden van de productie van eiwitmoleculen in levende cellen met enkele molecule precisie zonder verstoren van het eiwit functionaliteit. Deze methode is gebruikt om de expressie stochastische dynamiek van een transcriptiefactor, de λ repressor CI...

Single-molecule Imaging van genregulatie<em&gt; In vivo</em&gt; Met behulp van Cotranslational Activering door splitsing (CoTrAC)

Het introduceren van meerdere genomische veranderingen in cyanobacteriën is een essentieel hulpmiddel bij de ontwikkeling van stammen voor industrieel en fundamenteel onderzoek. We beschrijven een systeem voor het genereren van ongemarkeerde mutanten in de model cyanobacteriënsoort Synechocystis sp. PCC6803 en gemarkeerde mutanten in Synechococcus sp. PCC7002.

Generatie van Marked en markerless Mutanten in Model cyanobacteriën Species

Hier presenteren we een experimentele methode om te testen van de rol van zelfkopiërende plasmiden in de ontwikkeling van resistentie tegen antibiotica.

De rol van zelfkopiërende plasmiden testen in de ontwikkeling van resistentie tegen antibiotica

Hier wordt beschreven, is een methode voor het analyseren van bacteriële genexpressie in dierlijke weefsels op een cellulair niveau. Deze methode biedt een bron voor de studie van de fenotypische verscheidenheid die zich voordoen binnen een bacteriële bevolking in antwoord op het milieu weefsel tijdens een infectie.

Een fluorescentie gebaseerde methode om te studeren van bacteriële genregulatie in geïnfecteerde weefsels

Leer hoe u een replicatievork in E. coli kunt blokkeren met een TetR-YFP-systeem om DNA-structuren te bestuderen. Deze methode maakt reversibele blokkades mogelijk voor onderzoek naar DNA-reparatie.

Induceren van een Site Specific Replication Verstopping in

Meer video's verkennen