Latente Groei Remming Assay aan de kwantificering van bacteriën afgeleide Antimicrobials over het mededingingsbeleid

Het algemene doel van dit protocol is om de competitie tussen twee bacteriële isolaten zowel kwantitatief als kwalitatief te onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen met betrekking tot onderzoek naar competitieve exclusie binnen bacteriële gemeenschappen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een weerspiegeling is van wat er in een bacteriële gemeenschap plaatsvindt.

Binnendringende isolaten moeten in staat zijn om de remmende effecten van gevestigde isolaten te overleven om de invasie te doen slagen. Emma Crank, een promovendus van de afdeling ziekenhuisbiologie, zal de procedure demonstreren. Begin met het bereiden van brain heart infusion of BHI-agar volgens de instructies van de fabrikant.

Autoclaveer de agar bij 121 °C bij 15 psi gedurende 20 minuten om te steriliseren. Giet steriele aliquots van 15 ml BHI-agar in steriele petrischalen en laat de agar stollen. Bereid BHI-bouillon voor volgens de instructies van de fabrikant en breng aliquots van 10 ml over in glazen universele flesjes van 28 ml.

Autoclaveer vervolgens het BHI-bouillon voor 20 minuten. Begin bij de voorbereiding van de verdampingsflessen met het demonteren van de flessen. Spuit een 5% oppervlakteactief reinigingsmiddel door de verdamper om interne verontreinigingen te elimineren.

Week vervolgens de vaporizerfles, de dop en de vaporizer een nacht in het reinigingsmiddel. Droog de vaporizer, de dop en de flessen de volgende dag onder de steriele luchtstroomkap. Vul de flessen daarna met 70% ethanol.

Sluit vervolgens de vaporizer opnieuw aan en spuit wat ethanol door de vaporizer. Plaats het deksel op de vaporizer en bewaar deze met ethanol erin tot gebruik. Spoel de fles voor gebruik aseptisch met steriel BHI-bouillon en spuit de bouillon door de vaporizer.

Om bacteriële overnight-culturen voor te bereiden, strijkt u de competitor- en inhibitor-stammen uit op een steriele BHI-agarplaat en incubeert u deze ongeveer 18 uur aeroob bij 37 graden Celsius. Inoculeer 10 milliliter steriel BHI-bouillon in een universele fles van 28 milliliter met een enkele kolonie van de benodigde competitor-bacteriestam. Incubeer de cultuur overnight in een universele orbitale schudkerf bij 37 graden Celsius en 250 RPM.

Zorg de volgende dag ervoor dat de agarplaat volledig droog zijn en dat er geen condensatie op het deksel aanwezig is, om te voorkomen dat de inoculatie zich over de plaat verspreidt. Pipetteer 25 µL van de overnight-cultuur op het midden van de agarplaat; voorkom dat de zuiger van de pipet volledig wordt ingedrukt om luchtbellen te vermijden die de cultuur over de agar kunnen spuiten. Laat de cultuur op kamertemperatuur drogen om de verspreiding van de cultuur te beperken.

Incubeer vervolgens de agarplaten gedurende een nacht aeroob bij 37 °C. Nadat de cultuur een nacht is gegroeid, wordt de cultuur met BHI-bouillon tienvoudig verdund om ongeveer vier keer tien tot de zesste CFU per milliliter te verkrijgen, waarbij wordt gewerkt in een veiligheidskast niveau 2 die is bekleed met absorberend papier. Giet vervolgens de verdunde cultuur in een steriel plastic parfumvernevelingsflesje.

Om een assay voor uitgestelde groeiremming uit te voeren, spuit u de cultuur via elke vernevelaarsfles om er zeker van te zijn dat de cultuur in het spuitmechanisme is geladen voordat u deze op de agar spuit. Spuit vanuit een afstand van ongeveer 15 centimeter boven de agar ongeveer 250 microliters verdunde cultuur over het gehele agaroppervlak. Incubeer de platen aerobisch gedurende de nacht bij 37 graden Celsius.

Om vertraagde groeiremming te interpreteren, wordt de groeiremmingszone van de gespoten concurrerende stam in millimeters gemeten, waarbij de diameter van de centrale plek van de remmingsproducent wordt afgetrokken. Noteer tot slot de helderheidsscore voor de remmingszones volgens het tekstprotocol. Zoals in deze figuur wordt getoond, moeten de assayresultaten waarneembaar zijn als een verschil in de overlappende concurrerende stam nabij de centraal gespotte remmingsproducerende stam.

De verschillen kunnen bestaan uit volledige remming, gedeeltelijke remming, geen remming of een positieve associatie. Deze grafiek vergelijkt de remmingszones tussen inhibitor-producerende isolaten, wat het resultaat kan zijn van de hoeveelheid geproduceerd antimicrobieel middel, het vermogen van de inhibitor om door het medium te diffunderen, het type geproduceerde inhibitor of het resistentieniveau van de concurrerende stam voor de inhibitoren. Dit voorbeeld laat zien dat wanneer de testcultuur van de concurrent te verdund is, de remmingszone groter lijkt en een minder duidelijk gedefinieerde rand heeft dan gewoonlijk wordt waargenomen.

Als de plek van de inhibitor-producerende stam niet volledig was opgedroogd vóór de incubatie gedurende de nacht, zal de inhibitorstam uitspreiden en geen volledig gedefinieerde plek vormen. Als de concurrerende stam daarentegen niet gelijkmatig is gesproeid, kan dit leiden tot een ongelijkmatige verspreiding van bacteriën. Ten slotte kan de concurrerende stam, indien deze te geconcentreerd is, over de inhibitorstam heen groeien, wat in extreme gevallen kan leiden tot een omkering van de rollen tussen de concurrerende stam en de inhibitorstam.

Zodra deze techniek onder de knie is, kost deze één uur, verdeeld over vier dagen per getest isolatenpaar. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om gelijkmatig te spuiten en te zorgen voor een goede replicatie tussen de assays. Na deze procedure kunnen inhibitiegegevens worden overgelegd aan taxonomische gegevens over de aanwezigheid of afwezigheid van een bacteriële soort binnen een gemeenschap.

Het is vervolgens mogelijk om te bepalen of inhiberende effecten de kolonisatiecapaciteit van een soort in een omgeving beïnvloeden. Na de ontwikkeling van deze techniek kunnen onderzoekers op het gebied van gemeenschapsmicrobiomen de effecten van trait-variantie, zoals de voorspelling van antimicrobiële peptiden, onderzoeken op de gemeenschapsstructuur bij competitieve exclusie. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht gekregen in hoe u de capaciteit van een bacterieel isolaat om de groei van een ander competitief te inhiberen, zowel op kwalitatieve als kwantitatieve wijze kunt vergelijken.

Vergeet niet dat werken met aerosoliserede bacteriën extreem gevaarlijk kan zijn; voorzorgsmaatregelen, zoals werken in een veiligheidskast klasse II en het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, moeten altijd worden getroffen tijdens het uitvoeren van deze procedure.