Name: Beschermende werkzaamheid en Pulmonale immuunrespons na subcutane en intranasale BCG Administration in Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Ontdek de beschermende werkzaamheid van intranasaal versus subcutaan BCG-vaccinatie bij muizen. Deze methode evalueert pulmonale IL17-gemedieerde immuunrespons en identificeert specifieke immuunparameters die correleren met bescherming tegen tuberculose.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het "Spaanse Ministerie van Economie en Concurrentievermogen" [subsidienummer BIO2014-5258P], "Europese Commissie" door de H2020 programma's [subsidienummers TBVAC2020 643381].

Alle muizen werden onder gecontroleerde omstandigheden gehouden en geobserveerd op tekenen van ziekte. Experimentele werk werd uitgevoerd in overeenstemming met de Europese en nationale richtlijnen voor de bescherming van proefdieren en met goedkeuring van de bevoegde plaatselijke ethische comités. 1. Bereiding van gekwantificeerde glycerol voorraden van BCG Deense en Mycobacterium tuberculosis H37Rv LET OP: Alle beschreven protocollen werden uitgevoerd onder BSL3 omstandigheden. <ol><li> Ontdooi bevroren glycerol voorraden BCG Deens of H37Rv stammen en beënt 100 pl in 10 ml van 7H9 medium 10 aangevuld met Tween-80 0,05% (v / v) en ADC (Albumine, dextrose, katalase) 10% (v / v). </li><li> Incubeer onder statische omstandigheden gedurende één week bij 37 ° C totdat de kweek in log-fase groei. </li><li> Schalen bacteriekweek in door de kweek 10 ml tot 200 ml vers medium. Incubeer gedurende 20 aanvullendedagen onder statische omstandigheden. </li><li> Overbrengen naar 50 ml centrifugebuizen en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 2500 x g. </li><li> Gooi supernatant en resuspendeer bacteriële pellet in het restvolume. Voeg aan elke buis steriele 3 mm diameter glaskralen (10-15 per buis). </li><li> Vortex krachtig gedurende 1 minuut om bacteriële klonten distantiëren. Resuspendeer elk pellet in 10 ml PBS met Tween-80 0,05% (v / v). </li><li> Laat buizen gedurende 10 minuten zodat de grootste bacteriële aggregaten en glazen kralen om te settelen. </li><li> Herstel 9,5 ml supernatant uit elk van de 4 buizen met kleine klontjes en enkele bacteriën en overdracht volumes om een ​​nieuwe 50-ml centrifugebuis (uiteindelijk teruggewonnen volume 38 ml). Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 400 x g. </li><li> Herstel 35 ml supernatant (die hoofdzakelijk één bacteriën) in een verse 50 ml centrifugebuis en voeg 15 ml PBS met glycerol 50% (v / v), het verkrijgen van een uiteindelijke glycerolconcentratie van 15% (v / v). </li><li> meng voorzichtigen distribueren in 1 ml monsters in geschikte buizen voor het invriezen. Bewaren bij -80 ° C (een perceel biedt ongeveer 50 porties glycerol voorraad). </li><li> Glycerol voorraden kwantificeren ontdooien een glycerol de dag na invriezen en uitvoeren zeven tienvoudige seriële verdunningen in afzonderlijke 1,5 ml buisjes met 900 pl PBS. </li><li> Plaat 100 pi van elke verdunning in 7H10 vaste agar medium gesupplementeerd met 10 ADC 10% (v / v) bereid in 55-mm diameter petrischalen. </li><li> Voeg voorzichtig 3 mm diameter glasparels (. ca. 10 per bord) en schud plaat op gelijke volume verdelen over agarplaat. Gooi kralen en verzegelen agar plaat met parafilm. </li><li> Incubeer gedurende 21 dagen bij 37 ° C en bepaal bacteriële concentratie tellen kolonievormende eenheden (CFU) in verdunningen waarin enkelvoudige kolonies nauwkeurig kunnen worden onderscheiden. </li></ol> 2. Mouse Vaccinatie <ol><li> Ontdooi een pre-gekwantificeerde BCG glycerol en verdunnen in PBS om preptwee suspensies. Bereken uiteindelijke volume gezien de dosis per dier 100 ul voor subcutane toediening (10 7 CFU per ml voor subcutane vaccinatie) en 40 ul voor intranasale toediening (2,5 x 10 7 CFU voor intranasale vaccinatie). </li><li> Gebruik een gespecialiseerde anesthesiewerkstation Knaagdieren muizen verdoven met een mengsel van zuurstof en isofluraan. Gebruik 5% isofluraan anesthesie en 2% induceert de muizen in de kamer anesthesie te handhaven. (Andere aanvaarde verdovingsprocedure worden gebruikt). </li><li> Voor subcutane toediening van het vaccin Vul een 1 ml spuit met een 26 G naald met 1 ml bacteriesuspensie (10 7 CFU / ml). Verwijder luchtbellen. </li><li> Plaats een verdoofde muis op een vlak oppervlak buikligging in een laminaire stroming kap en beënt subcutaan 100 pl (10 6 CFU / dosis) van het vaccin in een flank van de muis weer. Zet de muis om de kooi en de gaten houden zodat zij properly herstelt van anesthesie. </li><li> Vervang de naald tussen elke toediening muis. Luchtbellen verwijderd zoals hierboven beschreven. </li><li> Voor intranasale toediening, het plaatsen van een verdoofde muis in rugligging in de kap. </li><li> Met een micropipet nemen 20 ul van de suspensie met 2,5 x 10 7 CFU / ml. Plaats de entstof drop-door-drop tussen de twee neusgaten totdat het hele volume is gedeponeerd, waardoor de tijd tussen de druppels om de muis te ademen het volume in. Opmerking: muizen kan tijdens deze procedure last hebben van ademhalingsproblemen, zodat ze moet worden overgelaten aan assimileren elke druppel voor de volgende deze zoveel mogelijk te voorkomen beheren. </li><li> Re-fill de micropipet met nog eens 20 ul en herhaal de handeling. Als de muis begint te ontwaken uit de narcose na de eerste inenting, plaats hem in de anesthesie kamer voorafgaand aan de tweede. Zet de muis naar de kooi en ervoor te zorgen dat deze goed hersteltvan anesthesie. </li></ol> 3. Mouse Intranasale Challenge met H37Rv Strain <ol><li> Ontdooi een pre-gekwantificeerde H37Rv glycerol en verdunnen in PBS om een ​​bacteriële suspensie van 2500 CFU per ml te bereiden. Bereken uiteindelijke volume gezien de dosis per dier is 40 pi. </li><li> H37Rv wordt intranasaal geënt, zoals beschreven in 2,5-2,7. Laatste uitdaging dosis per muis 10 2 CFU / 40 pi. </li></ol> 4. Analyse van geïnduceerde immuunrespons in longen <ol><li> Lung celsuspensie OPMERKING: Evaluatie van vaccin geïnduceerde adaptieve immuunrespons in de longen vereist het genereren van enkele celsuspensie. Hiervoor maken we gebruik van een tissue dissociator zoals gentleMACS. <ol><li> Offer de muis door cervicale dislocatie (of een andere aanvaarde humane methode) en zorgen voor de muis is dood aanraken van de oogbol te bevestigen afwezig van knipperreflex. </li><li> Binnen een laminaire stroming kap, pak het lungs met steriele schaar en pincet en leg ze op een schone ondergrond. Schone longen verwijderen luchtpijp en bindweefsel en de longen te dragen aan een 1,5 ml-buis met PBS (handhaven op ijs tot verwerking). </li><li> Aan een celsuspensie gegenereerd, plaatst longen juiste buis orgel dissociatie (C-dissociator buis) met 5 ml 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2 en 1,8 mM CaCl2 buffer. </li><li> Voeg 100 gl Collagenase D 100 mg / ml (2 mg / ml eindconcentratie) en 40 pl DNAse I 20.000 IU / ml (160 IU / ml eindconcentratie. OPMERKING: Voorraadoplossingen van Collagenase D of DNaseI worden bereid oplossen van gelyofiliseerd enzymen in PBS en glycerol 50% (v / v), 20 mM Tris-HCl pH 7,5 y MgCl2 1 mM, respectievelijk. </li><li> Plaats de buis in het weefsel dissociator en gebruik de vooraf gedefinieerde programma m_lung_01 long- fragmentatie. Incubeer de buis bij 37 ° C in een waterbad gedurende 30 min. </li><li> plaats the buis in de dissociator en het gebruik van de vooraf gedefinieerde programma m_lung_02 voor volledige long homogenisering in enkele cellulaire suspensie. </li><li> Voorbij de celsuspensie door een 70 pm nylon celzeef gemonteerd op een 50 ml centrifugebuis. Was de zeef met 10 ml RPMI 1640 medium. </li><li> Centrifugeer cellen gedurende 5 minuten bij 400 x g en verwijder het supernatant. </li><li> Voeg 1 ml erytrocyten lysisbuffer, door vortexen gemengd en incubeer gedurende 1 min bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 10 ml van RPMI 1640 medium en centrifugeer cellen gedurende 5 minuten bij 400 x g. </li><li> Resuspendeer cellen in 0,5 ml compleet RPMI 1640 medium aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal kalfsserum (FCS), 2 mM L-glutamine, 100 ug / ml streptomycine, 100 IU / ml penicilline en 50 pM 2-mercaptoethanol. OPMERKING: FCS wordt geïnactiveerd door incubatie bij 56 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Tellen cellen en voeg volledig RPMI 1640-medium tot de uiteindelijke cellulaire dichtheid van 10 7 cellen / ml te bereiken. LET OP: Voor celgetal, maken we gebruik van de geautomatiseerde cel teller. </li><li> Verdeel 100 ul van cellulaire suspensie in U-bodem 96-well steriele plaat (10 6 cellen / putje). </li><li> Voeg 50 ul / putje volledig RPMI 1640 medium met 15 ug / ml commercieel H37Rv gezuiverd eiwitderivaat (PPD) (5 ug / ml eindconcentratie). </li></ol></li><li> Supernatant collectie voor cytokine bepaling door ELISA <ol><li> Incubeer plaat uit 4.1.14 gedurende 48 uur bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Centrifuge dienblad 5 min bij 400 xg en herstellen 100 pl supernatant. </li><li> Bewaar bij -80 ° C. </li><li> Verdun supernatanten 10/01 en 1/2 in assay buffer voor IFNy en IL17A vastberadenheid, respectievelijk. Bepaal cytokine concentraties met commerciële ELISA-kits, volgens de instructies van de fabrikant (ELISA Development kits). </li></ol></li><li> Intracellulaire kleuring voor de bepaling van cytokineproducerende CD4 + cellen door flowcytometrie <ol><li> Incubeer plaat uit 4.1.14 gedurende 18 uur bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Voeg 1,5 gl Brefeldine A 1 mg / ml (stock opgelost in DMSO) aan elk putje (10 ug / ml eindconcentratie) en incubeer gedurende zes extra uren. </li><li> Centrifugeer de plaat uit 4.3.2 gedurende 1 min bij 3200 x g en verwijder het supernatant. </li><li> Resuspendeer cellen in 50 ul anti-muis CD4-FITC verdund in RPMI 1640 met 10% FCS (1/500) en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C. </li><li> Centrifugeer de plaat uit 4.3.4 gedurende 1 min bij 3200 xg, verwijder het supernatant en voeg 100 ul / putje van fixeeroplossing. Incubeer bij 4 ° C gedurende 20 min. </li><li> Was de cellen tweemaal met 150 ul / was van permeabilisatie oplossing. LET OP: 10x geconcentreerd voorraad wordt verdund in gedeïoniseerd water om 1x werk te bereiden. </li><li> Resuspendeer cellen in 50 ul anti-muis IFNy-APC en anti-muis-IL17A APC.Cy7 verdund in permeabilordening oplossing (1/250 beide antilichamen). </li><li> Incubeer gedurende 1 uur bij KT. </li><li> Was de cellen tweemaal met 150 ul / was van permeabilisatie oplossing. </li><li> Resuspendeer cellen in 200 pl PBS voor flowcytometrie verkrijgen. </li></ol></li></ol> 5. Analyse van immunoglobulinen in bronchoalveolaire lavage (BAL) <ol><li> Verkrijgen van BAL monsters <ol><li> Offer de muis door cervicale dislocatie (of een andere aanvaarde humane methode) en zorgen voor de muis is dood aanraken van de oogbol te bevestigen afwezig van knipperreflex. </li><li> Expose de luchtpijp met de juiste precisie steriel pincet en een schaar en het uitvoeren van een kleine snede in de luchtpijp, waardoor zeker niet om het volledig te snijden. Zorg ervoor dat u bloeden dat BAL monster kan verontreinigen veroorzaken. </li><li> Breng in de trachea een canule verbonden met een steriele 1 ml spuit met 800 ul ijskoude PBS. </li><li> Inoculeer langzaam de PBS in de longen en dan recover BAL volume terugtrekken van de zuiger van de spuit is heel langzaam om longcollaps vermijden. OPMERKING: Herstel van 500 tot 600 pi is bevredigend. </li><li> Transfer BAL volume in een 1,5 ml buis en bevestig BAL blijft ongekleurde, wat aangeeft dat is niet besmet met bloed (houden op ijs tot verwerking). </li><li> Centrifugeer BAL monsters 5 min bij 400 xg en overdragen supernatant naar een nieuwe buis. </li><li> WINKEL supernatanten bij -80 ° C. </li></ol></li><li> Bepaling van IgA in BAL supernatanten LET OP: Alle toegepaste reagentia zijn bij RT. <ol><li> Coat hoge eiwitbinding polystyreen platte bodem 96-putjesplaten met 100 ui PPD verdund in PBS (10 ug / ml) voor M. tuberculosis-specifieke IgA bepaling, of met 100 ul van BAL supernatant verdund 10 keer in PBS voor de totale IgA bepaling. </li><li> Incubeer overnacht bij 4 ° C. </li><li> Gooi supernatant en tik op de plaat op keukenpapier om dry. Wassen met 200 ul / putje PBS. </li><li> Blok met 200 gl / putje van een runderserumalbumine (BSA) 1% (w / v) in PBS-Tween-80 0,05% (v / v) (Blocking buffer). </li><li> Incubeer 1 uur bij KT. </li><li> Was eenmaal met 200 ui / putje PBS-Tween-80 0,05% (v / v) (wasbuffer). </li><li> Voeg 100 ul onverdund supernatant BAL in het PPD-beklede putjes. Incubeer twee uur bij kamertemperatuur. Opmerking: Als de totale IgA bepaling gebeurt parallel met de PPD-specifieke IgA, IgA reactie totale putjes met 100 ui wasbuffer Tijdens deze incubatie. </li><li> Was driemaal met 200 ul / putje wassen buffer.0170004 </li><li> Voeg 100 ul van mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd anti-muis IgA verdund in blokkerende buffer (1 / 10.000). </li><li> Incubeer 1 uur RT. </li><li> Was vijfmaal met 200 ul / putje wasbuffer. </li><li> Voeg 100 ul / putje van 3,3 &#39;, 5,5&#39; tetramethylbenzidine (TMB). Incubeer 20 min bij kamertemperatuur in thij donker. </li><li> Voeg 100 ul / putje van H 2 SO 4 0,5 N. Lees de plaat in een spectrofotometer bij een golflengte van 450 nm. </li></ol></li></ol> 6. Bacteriële belasting bepaling in de longen <ol><li> Lung homogenisering en plating <ol><li> Vier weken na challenge, offeren de muis door cervicale dislocatie (of een andere aanvaarde humane methode) en zorgen voor de muis is dood aanraken van de oogbol te bevestigen afwezig van knipperreflex. </li><li> Plaats de muis in rugligging op een vlakke ondergrond en ontsmet in een laminaire stroming kap vast. </li><li> Maak een incisie en de huid te verwijderen uit de borst regio zichtbaar te vertrekken de thoracale gebied. </li><li> Knip de ribben en de oogst van de longen en het hart met behulp van een steriele schaar en pincet. Plaats organen op een schoon oppervlak. </li><li> Reinig longen door het verwijderen van het hart, trachea en bindweefsel en de longen te dragen aan een 1,5 ml-buis met 1 ml gedeïoniseerd water(Houden op ijs tot verwerking). </li><li> Gebruik steriele tang om de longen van elke muis brengen in een geschikte buis voor homogeniseren orgaan (M - dissociator buis), die 1 ml gedeïoniseerd water. </li><li> Plaats de buis in het weefsel dissociator en gebruik de voorgedefinieerde programma RNA_1 de longen gehomogeniseerd. </li><li> Maak vijf tienvoudige seriële verdunningen in 1,5 ml buizen, beginnend met 100 gl longweefselhomogenaat verdund in 900 ul. </li><li> Plaat verdunningen zoals beschreven in 1,11-1,14. </li></ol></li><li> Differentiatie tussen BCG en H37Rv door PCR Opmerking: In de platen van 6.1.6 correspondeert met de groep gevaccineerd met BCG via de intranasale route, analyseerden wij een representatief aantal kolonies door een PCR onderscheiden tussen BCG en H37Rv dat de CFU als beoordeling vaccin toegekend beschermende werking overeen uniek te H37Rv. Dit PCR doelen versterking van RD9, een genomische regio verschillend in BCG en M. tuberculosis, waardoor een fragment van 2618 bp voor H37Rv en 465 bp voor BCG 11. <ol><li> Bereid een master mix voorraad voor alle monsters met volumes per monster zoals aangegeven, en vervolgens verdelen in PCR-buizen (9 ul / monster). LET OP: Buffer 5x: 2 pl. Voorwaartse primer 25 uM (GTGTAGGTCAGCCCCATCC): 0,32 ul, Reverse primer 25 pm (GCCCAACAGCTCGACATC): 0,32 pl, Taq-polymerase 5 eenheden / ul: 0,04 ui, Gedeïoniseerd H 2 O: 6.32 pl. </li><li> Raak een kolonie met een steriele tandenstoker en dompel de tandenstoker met het monster in een PCR-buis met daarin de master mix. </li><li> Voer het PCR met het volgende programma: 10 min 95 ° C (deze stap is om bacteriële verstoring veroorzaken), 10 min 95 ° C (deze stap is om bacteriële verstoring veroorzaken), 35 cycli (30 seconden bij 95 ° C, 1 min bij 58 ° C en 4 min bij 72 ° C). </li><li> Laad de PCR monsters in een 1% agarosegel met ethidiumbromide en run monsters om de fragmenten te visualiseren. </li&gt; </ol></li></ol>

<ol><li>Zumla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WHO+2014+global+tuberculosis+report--further+to+go%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Glob+Health%22%5BJournal%5D)">The WHO 2014 global tuberculosis report--further to go.</a> Lancet Glob Health. 3 (1), e10-e12 (2015).</li>
<li>Mangtani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+by+BCG+vaccine+against+tuberculosis%3A+a+systematic+review+of+randomized+controlled+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Protection by BCG vaccine against tuberculosis: a systematic review of randomized controlled trials.</a> Clin Infect Dis. 58 (4), 470-480 (2014).</li>
<li>Aguilo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+confers+dose-dependent+superior+protection+compared+to+that+of+subcutaneous+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pulmonary Mycobacterium bovis BCG vaccination confers dose-dependent superior protection compared to that of subcutaneous vaccination.</a> Clin Vaccine Immunol. 21 (4), 594-597 (2014).</li>
<li>Chen, L., Wang, J., Zganiacz, A., Xing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+intranasal+mucosal+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+confers+improved+protection+compared+to+subcutaneous+vaccination+against+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Single intranasal mucosal Mycobacterium bovis BCG vaccination confers improved protection compared to subcutaneous vaccination against pulmonary tuberculosis.</a> Infect Immun. 72 (1), 238-246 (2004).</li>
<li>Giri, P. K., Verma, I., Khuller, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+efficacy+of+intranasal+vaccination+with+Mycobacterium+bovis+BCG+against+airway+Mycobacterium+tuberculosis+challenge+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect%22%5BJournal%5D)">Protective efficacy of intranasal vaccination with Mycobacterium bovis BCG against airway Mycobacterium tuberculosis challenge in mice.</a> J Infect. 53 (5), 350-356 (2006).</li>
<li>Lagranderie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCG-induced+protection+in+guinea+pigs+vaccinated+and+challenged+via+the+respiratory+route%5BTitle%5D)+AND+%22Tuber+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">BCG-induced protection in guinea pigs vaccinated and challenged via the respiratory route.</a> Tuber Lung Dis. 74 (1), 38-46 (1993).</li>
<li>Gopal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-17-dependent+CXCL13+mediates+mucosal+vaccine-induced+immunity+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-17-dependent CXCL13 mediates mucosal vaccine-induced immunity against tuberculosis.</a> Mucosal Immunol. 6 (5), 972-984 (2013).</li>
<li>Khader, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-23+and+IL-17+in+the+establishment+of+protective+pulmonary+CD4%2B+T+cell+responses+after+vaccination+and+during+Mycobacterium+tuberculosis+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-23 and IL-17 in the establishment of protective pulmonary CD4+ T cell responses after vaccination and during Mycobacterium tuberculosis challenge.</a> Nat Immunol. 8 (4), 369-377 (2007).</li>
<li>Aguilo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+but+Not+Subcutaneous+Delivery+of+BCG+Vaccine+Confers+Protection+to+Tuberculosis-Susceptible+Mice+by+an+Interleukin+17-Dependent+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pulmonary but Not Subcutaneous Delivery of BCG Vaccine Confers Protection to Tuberculosis-Susceptible Mice by an Interleukin 17-Dependent Mechanism.</a> J Infect Dis. , (2015).</li>
<li>Middlebrook, G., Cohn, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriology+of+tuberculosis%3A+laboratory+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Public+Health+Nations+Health%22%5BJournal%5D)">Bacteriology of tuberculosis: laboratory methods.</a> Am J Public Health Nations Health. 48 (7), 844-853 (1958).</li>
<li>Brosch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+evolutionary+scenario+for+the+Mycobacterium+tuberculosis+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3684-3689 (2002).</li>
<li>Kaushal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+vaccination+with+attenuated+Mycobacterium+tuberculosis+induces+strong+central+memory+responses+and+protects+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mucosal vaccination with attenuated Mycobacterium tuberculosis induces strong central memory responses and protects against tuberculosis.</a> Nat Commun. 6, 8533(2015).</li>
<li>Lochhead, J. J., Thorne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+of+biologics+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery of biologics to the central nervous system.</a> Adv Drug Deliv Rev. 64 (7), 614-628 (2012).</li>
<li>Lochhead, J. J., Wolak, D. J., Pizzo, M. E., Thorne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+transport+within+cerebral+perivascular+spaces+underlies+widespread+tracer+distribution+in+the+brain+after+intranasal+administration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Rapid transport within cerebral perivascular spaces underlies widespread tracer distribution in the brain after intranasal administration.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 35 (3), 371-381 (2015).</li>
<li>Griffiths, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholera+toxin+enhances+vaccine-induced+protection+against+Mycobacterium+tuberculosis+challenge+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cholera toxin enhances vaccine-induced protection against Mycobacterium tuberculosis challenge in mice.</a> PLoS One. 8 (10), e78312(2013).</li>
<li>Hirota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+Th17+cells+in+Peyer%27s+patches+is+responsible+for+the+induction+of+T+cell-dependent+IgA+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of Th17 cells in Peyer's patches is responsible for the induction of T cell-dependent IgA responses.</a> Nat Immunol. 14 (4), 372-379 (2013).</li>
<li>Jaffar, Z., Ferrini, M. E., Herritt, L. A., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+lung+mucosal+Th17-mediated+responses+induce+polymeric+Ig+receptor+expression+by+the+airway+epithelium+and+elevate+secretory+IgA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: lung mucosal Th17-mediated responses induce polymeric Ig receptor expression by the airway epithelium and elevate secretory IgA levels.</a> J Immunol. 182 (8), 4507-4511 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hoewel het huidige vaccin tegen tuberculose, BCG, het meest toegepaste vaccin in de geschiedenis is, blijft tuberculose een van de belangrijkste doodsoorzaken en ziekten door infectieziekten wereldwijd. Dit paradox wordt verklaard door het gebrek aan bescherming van dit vaccin tegen pulmonale tuberculose, de verantwoordelijke vorm van overdracht. Nieuwe vaccinatiebenaderingen die effectief zijn tegen pulmonale vormen van de ziekte zijn dringend nodig, omdat deze de grootste impact zouden hebben op de overdracht van de zi...

Tuberculose (tbc) is een van de toonaangevende infectieziekten veroorzaken meer geassocieerd doden dan HIV in de wereld en in combinatie met de stijgende toename van multidrug-resistente stammen maakt TB een alarmerend wereldwijd gezondheidsprobleem 1. Nieuwe diagnostische hulpmiddelen, effectiever en minder giftige medicijnen, en de nieuwe veilige en effectieve tbc-vaccins zijn dringend noodzakelijk, vooral in de ontwikkelingslanden. Leef verzwakt Bacille Calmette-Guerin (BCG) is momenteel de enige in licentie vaccin tegen tbc, die intradermaal werd toegediend bij de geboorte sinds 1970 wereldwijd. BCG is effectief in het voorkomen van ernstige vormen van de ziekte (meningitis en miliaire TB) bij kinderen beschouwd, maar inconsistente werkzaamheid tegen longtuberculose verantwoordelijk ziekteoverdracht 2 getoond. Pulmonale vaccinatie, die de natuurlijke route van tuberculose-infectie nabootst, vertegenwoordigt een aantrekkelijke benadering voor het vullen van lokale host immuunresponss. In dit verband hebben verschillende preklinische werken in verschillende relevante TB diermodellen groter vaccineffectiviteit na pulmonaire immunisatie aangetoond in vergelijking met de subcutane of intradermale route 3-6. Toch is de beschermingsmechanismen veroorzaakt door pulmonale vaccinatie zijn niet goed begrepen. In de afgelopen jaren hebben een aantal werken wees naar-IL17 gemedieerde respons als een belangrijke factor van TB-specifieke mucosale immuunrespons, zoals in muismodellen deficiënte voor IL17 mucosale vaccingeïnduceerde beschermende werking in het gedrang 7,8. Onlangs toonden we voor de eerste keer dat intranasale toediening BCG beschermd DBA / 2 muizen, een muizenstam gekenmerkt door het ontbreken van bescherming na subcutane BCG immunisering 9. Deze resultaten suggereren dat de luchtwegen TB vaccinatie meer effectief in het verminderen tarief van tuberculose in endemische landen, waar de intradermale BCG ineffectief tegen pulmón wordt beschouwd zou kunnen zijnAry TB.

<table><tbody><tr><td>Middlebrook 7H9 broth</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook ADC Enrichment</td><td>BD</td><td>211887</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Scharlau</td><td>TW00800250</td><td></td></tr><tr><td>3-mm diameter Glass Beads</td><td>Scharlau</td><td>038-138003</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 Agar</td><td>BD</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>1-ml syringe 26GA 0.45 x 10 mm</td><td>BD</td><td>301358</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>C tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>M tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Applichem</td><td>A3778,0100</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 &micro;m Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood Cell Lysing Buffer</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100x geconcentreerd</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>100x geconcentreerd</td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter</td><td>Millipore</td><td>PHCC20040</td><td></td></tr><tr><td>Scepter Cell Counter Sensors, 40 &micro;m</td><td>Millipore</td><td>PHCC40050</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium Tuberculosis - Tuberculin PPD</td><td>Statens Serum Institut (SSI)</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IFN-&gamma; ELISA development kit&nbsp;</td><td>Mabtech</td><td>3321-1H</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL17A ELISA development kit&nbsp;</td><td>Mabtech</td><td>3521-1H</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse CD4</td><td>BD</td><td>553047</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Kit</td><td>BD</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Rat Anti-mouse IL-17A</td><td>BD</td><td>560821</td><td></td></tr><tr><td>APC Mouse Anti-mouse IFNg</td><td>BD</td><td>554413</td><td></td></tr><tr><td>LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0.60 x 30 mm. 23G x 1 1/4&rdquo;</td><td>UNIMED</td><td>27.134</td><td>Gebaat als trachea canule voor BAL</td></tr><tr><td>high-protein binding polystyrene flat-bottom 96-well plates MAXISORP</td><td>NUNC</td><td>430341</td><td></td></tr><tr><td>Albumin, from bovine serum</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgA (&alpha;-chain specific)&minus;Peroxidase antibody</td><td>Sigma</td><td>A4789</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;,5,5&prime;-Tetramethylbenzidine (TMB)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td></td></tr><tr><td>MyTaq DNA Polymerase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21107</td><td>Het kit bevat Buffer 5x</td></tr></tbody></table>

beschermende werkzaamheid en pulmonale immuunrespons na subcutane en intranasale bcg administration in muizen

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Ondanks de wereldwijde dekking van intradermale BCG-vaccinatie, blijft tuberculose een van de meest prevalente infectieziekten ter wereld. Preklinische gegevens hebben longtuberculosevaccins als een veelbelovende strategie aangemoedigd om longaandoeningen te voorkomen, die verantwoordelijk zijn voor de overdracht. In dit werk beschrijven we de methodologie die we gebruikten om in het muismodel de voordelen van intranasale BCG-vaccinatie aan te tonen in vergelijking met subcutaan. Onze gegevens onthulden een grotere beschermende werkzaamheid na intranasale BCG-toediening. Bovendien geven onze resultaten aan dat pulmonale vaccinatie een hogere immuunrespons in de longen veroorzaakt, inclusief Th1- en Th17-responsen, evenals een toename van de immunoglobuline A (IgA)-concentratie in de luchtwegen. Onze gegevens tonen een correlatie aan tussen beschermende werkzaamheid en de aanwezigheid van IL17-producerende cellen in de longen na Mycobacterium tuberculosis uitdaging, wat wijst op een rol voor deze cytokine in de beschermende respons die wordt geboden door pulmonale vaccinatie. Ten slotte beschrijven we de globale workflow die we hebben ontwikkeld om respiratoire vaccinatie in het muismodel te bestuderen, die kan worden geextrapoleerd naar andere tuberculosevaccins, afgezien van BCG, die zich richten op de mucosale respons of andere pulmonale toedieningsroutes zoals de intratracheale of aerosol.

Dit werk beschrijft de vergelijking van de twee routes van toediening van BCG: subcutane en intranasale. Subcutane route vergelijkbaar met de intradermale, de huidige klinische route BCG wereldwijd. Intranasale weg van de vaccinatie heeft als doel om de natuurlijke route van infectie van M. na te bootsen tuberculose, met als doel immuunreactie direct in de longen te induceren, het primaire doelorgaan deze ziekteverwekker. <p class="jove_content" fo:keep-together.wit...

Wij beschrijven hierin de methodologie die we hanteerden om de beschermende werkzaamheid en longimmuunrespons te vergelijken die werd geïnduceerd door intranasale en subcutane immunisatie met BCG in een muismodel. Onze resultaten tonen de voordelen van longvaccinatie aan en suggereren een rol voor IL17-gemedieerde respons in vaccin-geïnduceerde bescherming.

Beschermende werkzaamheid en Pulmonale immuunrespons na subcutane en intranasale BCG Administration in Muizen

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Het algemene doel van deze procedure is om de immuunresponsen in de longen na immunisatie tegen tuberculose te bestuderen, inclusief de beschermende werkzaamheid van het vaccin tegen een intranasale challenge en de lokale, door het vaccin geïnduceerde immuunrespons in de longen. Deze methodologie kan helpen bij het beantwoorden van onze kernvragen op het gebied van tuberculosevaccins, waaronder de identificatie van de defensieve immuunresponsen in de longen die worden opgewekt door pulmonale vaccins voor een optimale immuunbescherming van de longen. Een voordeel van deze methodologie is dat de immuunrespons in de longen van elk dier individueel wordt beoordeeld, parallel aan de beschermende werkzaamheid.waardoor de specifieke immuunparameters die correleren met bescherming kunnen worden geïdentificeerd. Vul voor subcutane toediening van het BCG-vaccin eerst een spuit van één milliliter, uitgerust met een naald van 26 gauge, met één milliliter van de BCG-vaccinsuspensie en verwijder de luchtbellen. Plaats vervolgens een geanestheseerde muis in buikligging in een laminaire flowkast en inoculeer het dier subcutaan met 100 µL bacteriën in een achterste flank.Voor intranasale toediening vult u een micropipet met 20 µL van de BCG-suspensie en plaatst u de geanestheseerde muis in rugligging in de zuurkast. Dien het inoculum druppelsgewijs toe tussen de twee neusgaten totdat het volledige volume van 20 µL is toegediend, waarbij u tussen de druppels door tijd laat zodat de muis de suspensie kan inademen. Vul vervolgens de micropipet opnieuw met nog eens 20 µL bacteriën en herhaal de toediening.Voor een intranasale challenge met de H37Rv-stam van Microbacterium tuberculosis vaccineert u de dieren op het juiste experimentele tijdstip na vaccinatie door intranasale toediening van 40 microliters van de H37Rv-bacteriesuspensie, zoals zojuist gedemonstreerd. Om het bronchoalveolaire lavage of het monster uit de longblaasjes te verkrijgen, gebruikt u eerst steriele pincetten en een schaar om de trachea bloot te leggen. Maak vervolgens een kleine incisie in de trachea, waarbij u er zorg voor draagt dat het weefsel niet volledig wordt weggesneden, en voer een canule in die is verbonden met een steriele spuit van 1 mL, gevuld met 800 microliters ijskoud PBS.Wanneer de canule op zijn plaats zit, vult u de longen voorzichtig met de PBS en trekt u vervolgens langzaam aan de zuiger om ten minste 500 tot 600 microliter lavagevloeistof op te vangen. Breng de vloeistof over in een 1,5 mL buisje op ijs en bevestig dat de suspensie kleurloos is, wat duidt op de afwezigheid van bloedcontaminatie. Bewaar de monsters op ijs tot de verwerking van de ballen.Om de bacteriële load en de immuunrespons in de longen te bepalen, wordt de muis met naalden in rugligging vastgezet op een vlak en gedesinfecteerd oppervlak in de laminaire flowkast, waarna een incisie in de bovenhuid over de borst wordt gemaakt. Pel vervolgens de huid terug om het borstgebied bloot te leggen en snijd de longen open. Gebruik steriele scharen en pincetten om de longen en het hart te oogsten en plaats de organen op een schoon oppervlak.Verwijder vervolgens het hart, de luchtpijp en het bindweefsel. Plaats elke long in een aparte 1,5 mL buis met 1 mL gedeïoniseerd water op ijs voor de verdere bepaling van de bacteriële belasting en cellulaire immuunresponsen. In vergelijking met de subcutane route biedt de intranasale vaccinatieroute een veel grotere beschermende effectiviteit in de longen.Analyse van een representatief aantal kolonies uit de intranasale BCG-vaccingroep via PCR specifiek voor de RD9-genoomregio toont aan dat alle kolonies een fragment van 0,4 kilobasenparen opleveren dat correspondeerde met H37Rv. Intranasale BCG induceert hogere IL17- en interferon-gamma-productie in de longen, wat een correlatie onthult tussen de beschermende effectiviteit van de intranasale BCG-vaccinatie en de door het vaccin geïnduceerde immuunrespons in de longen vóór de challenge, waarbij een hogere concentratie van zowel het totale als het H37Rv-gezuiverde proteïnederivaat-specifieke IgA in de lavage-monsters werd waargenomen bij de ontvangers van het intranasale vaccin. Verdere analyse van cytokine-producerende cellen in de longen na de tuberculose-challenge onthulde dat, terwijl interferon-gamma-producerende cellen in alle geïnfecteerde groepen werden gedetecteerd, IL17A-producerende CD4+-cellen alleen werden gevonden in de intranasale BCG-groep, wat een significante correlatie aantoont tussen de aanwezigheid van IL17 en de reductie van de bacteriële last in de longen.Door deze procedure te volgen, is het mogelijk om de lokale immuunresponsen in de longen te vergelijken bij het gebruik van biodiverse tuberculosevaccins, evenals verschillende toedieningsroutes en tijdspunten na challenge. Daarnaast kan deze methodologie worden gebruikt om de immunogeniciteit na vaccinatie gevolgd door challenge te evalueren. Dit zou de identificatie van immuunresponsen die correleren met bescherming mogelijk kunnen maken.Belangrijk is dat het werken met Mycobacterium Tuberculosis BCL-vrije laboratoriumfaciliteiten vereist, en er moeten altijd de juiste voorzorgsmaatregelen worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.

protective-efficacy-pulmonary-immune-response-following-subcutaneous

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In this video, we describe a protocol to test the efficacy of an acellular pertussis vaccine against Bordetella pertussis infection in mice. Post-vaccination, the mice were subjected to infection, and their tissue homogenate was cultured to analyze the bacterial colonies as a readout of the vaccine-induced protective immunity.

Evaluation of Vaccine-Induced Immunity Against Bacterial Infection in a Mouse Model

This video demonstrates intranasal BCG immunization in mice, activating both innate and adaptive immune responses, leading to the development of lung-resident memory T cells and effector B cells, thus enhancing protection against Mycobacterium infections.

Intranasal Immunization with BCG in a Mouse Model

Profylactische en therapeutische vaccinatie vaak niet sterke immuunrespons stimuleren door week afvoer van het vaccin knooppunten en daardoor slechte medewerking van immuuncellen lymfe. Door directe injectie van vaccin lymfeklieren, zogenaamde intralymfatische injectie vaccindoeltreffendheid sterk worden verbeterd en vaccindoses worden verminderd.

Intralymfatische Immunotherapie en Vaccinatie in Muizen

Het huidige werk illustreert het gemak van het gebruik van sublinguale immunotherapie om de aangeboren immuunrespons in de longen te versterken en bescherming te bieden tegen acute pneumokokkenpneumonie bij muizen.

Sublinguale immunotherapie als een alternatief voor bescherming tegen acute luchtwegeninfecties Induce

Lange-termijn gekweekte interferon-γ enzymgebonden immunospot assay wordt gebruikt als maat voor centraal geheugen responsen en correleert met beschermende anti-mycobacteriële vaccinresponsen. Met deze assay worden perifeer bloed mononucléaire cellen gestimuleerd met mycobacteriële antigenen en interleukine-2 voor 14 dagen, waardoor differentiatie en expansie van centrale geheugen T-cellen.

Toepassing van Lange-termijn gekweekte interferon-γ Enzyme-linked immunospot Assay voor het beoordelen van effector en geheugen T cel responsen in Vee

Een nieuwe techniek voor snelle antigeen weergave op een bacteriële oppervlak wordt gepresenteerd, waarbij het oppervlak biotinylation gevolgd door blootstelling aan proteïnen van belang in fusie met monomere avidin. Laden van BCG met geselecteerde antigenen met succes verbetert de immunogeniciteit, suggereren dat oppervlakte decoratie traditionele genetische benaderingen kan vervangen.

Expressie van exogene antigenen in de Mycobacterium bovis -BCG-vaccin via niet-genetische oppervlak decoratie met het systeem Avidin-Biotine

De ontwikkeling van de interferon-gamma ELISpot assay voor cavia PBMCs kunt de karakterisatie van T-cel reacties in dit zeer relevant model voor het bestuderen van besmettelijke ziekten. Wij hebben de test voor het meten van de T cel reacties gekoppeld intradermale levering van vaccin dat DNA toegepast.

Geoptimaliseerde Interferon-gamma ELISpot Assay maatregel T cel antwoorden in het Model van de cavia na vaccinatie

Hier presenteren we een elegante protocol voor in vivo evaluatie van vaccin effectiviteit en host immuunrespons. Dit protocol kan worden aangepast voor vaccin modellen die studeren virale, bacteriële of parasitische ziekteverwekkers.

Evaluatie van de Host-Pathogen reacties en werkzaamheid van het vaccin in muizen

Dit protocol beschrijft de verrijking van inheemse mycobacteriële extracellulaire vesikels (mEV's) uit axenische culturen van Mycobacterium smegmatis (Msm) en hoe mCherry (een rode fluorescerende reporter)-bevattende recombinante MsmEV's kunnen worden ontworpen en verrijkt. Ten slotte verifieert het de nieuwe aanpak met de verrijking van MsmEV's die het EsxA-eiwit van Mycobacterium tuberculosis bevatten.

Verrijking van inheemse en recombinante extracellulaire blaasjes van mycobacteriën

Hier presenteren we een alternatief protocol om actief experimentele auto-immuun encefalomyelitis te induceren bij C57BL / 6-muizen, met behulp van het immunogene epitoop myeline oligodendrocyte glycoproteïne (MOG) 35-55 gesuspendeerd in onvolledig Freund's adjuvans met de hitte-gedode Mycobacterium avium ondersoort paratuberculosis.

Adjuvante activiteit van mycobacterium paratuberculosis bij het verbeteren van de immunogeniciteit van autoantigenen tijdens experimentele auto-immune encefalomyelitis

De bepaling van kolonievormende eenheden (CFU) is de gouden standaardtechniek voor het kwantificeren van bacteriën, waaronder Mycobacterium tuberculosis, die weken nodig heeft om zichtbare kolonies te vormen. Hier beschrijven we een micro-CFU voor CFU-bepaling met verhoogde tijdsefficiëntie, lagere laboratoriumruimte en reagenskosten, en schaalbaarheid voor experimenten met gemiddelde en hoge doorvoer.

Microkolonievormende eenheidstest voor evaluatie van de werkzaamheid van vaccins tegen tuberculose

Ontdek de beschermende werkzaamheid van intranasaal versus subcutaan BCG-vaccinatie bij muizen. Deze methode evalueert pulmonale IL17-gemedieerde immuunrespons en identificeert specifieke immuunparameters die correleren met bescherming tegen tuberculose.

Beschermende werkzaamheid en Pulmonale immuunrespons na subcutane en intranasale BCG Administration in Muizen

Meer video's verkennen