Name: Rapid Subtractieve patroonvorming van Live-Cell Lagen met een microfluïdische Probe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Leer snelle subtractieve patroonvorming van levende celmonolagen met een microfluïdische probe. Deze methode maakt lokale cellyse mogelijk voor moleculaire profilering en real-time aanpassing van celpatronen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de European Research Council (ERC) Starting Grant, in het kader van het 7de Framework Programma (Projectnr. 311122, BioProbe). We danken Dr. Julien Autebert en Marcel Buerge voor technische assistentie en discussies tijdens de ontwikkeling van het protocol en de platform. Prof. Petra Dittrich (ETH Zürich), Prof. Bradley Nelson (ETH Zürich), Dr. Bruno Michel en Dr. Walter Riess worden erkend voor hun voortdurende ondersteuning.

1. MFP Head en Platform Reiniging en voorbereiding LET OP: Dit protocol maakt gebruik van verticaal georiënteerde silicium-glas hybride MFP hoofd 15,16. De siliciumcomponent van de kop bevat de microkanalen die geëtst tot een diepte van 100 urn zijn. De geëtste silicium gebonden aan glas gebruikt anodische binding. Het kanaal ontwerp bestaat uit een patroon van zes kanalen, twee elk voor injectie en aspiratie, en twee voor het injecteren van de immersievloeistof (figuur 1). De kanalen worden gebruikt voor het injecteren van onderdompeling vloeistof vullen de media rondom het biologisch monster, waardoor de verliezen als gevolg van aspiratie en verdamping vermeden. De binnenste en buitenste kanalen kanalen die gebruikt worden in de huidige werkzaamheden zijn 100 x 100 micrometer en 200 × 100 micrometer respectievelijk. Bericht fabricage en verwerking, MFP hoofden met duidelijke kanalen en gepolijste toppen worden verkregen. <ol><li> Voorbereiding van het pompstation en de vloeistof-handlinginrichting <ol><li> Gebruik capillairen met een 1/16 &#39;&#39; (1,59 mm) buitendiameter en 0,02 &quot;(0,51 mm) binnendiameter alle slangen aangesloten op de spuiten. Variëren capillaire afmeting gebaseerd op de toepassing en het verkrijgen van de juiste connectors en accessoires voor de interface van de MFP hoofd met de spuiten. Gebruik ultrapuur water waar verdunningen nodig zijn. </li><li> Schone spuiten (250-500 pi volume) en spuit plunjers door sonicatie in 0,5% bleekwater oplossing in ultrapuur water voorafgaand to-en post-live cell experimenten. Spoel ze grondig met water. Vullen met water door het volledig onderdompelen van de uiteinden in een waterbad en aanzuigen via de zuiger. Spoel de vloeistof, terwijl binnen het waterbad met de spuit as contact opnemen met de afdichting bij de uitgang van de spuit. Herhaal aspireren en spoelen tot er geen luchtbellen worden gezien in de spuit kolommen. </li><li> Sluit injectiespuiten aan de spuit pompen met behulp van Luer lock-connectors. Gebruik een schakelklep aangebracht op depompen om de vloeistof van de spuit direct naar één van twee capillairen die ofwel de MFP hoofd of de vloeistofreservoirs (figuur 6). (Als er geen switch afsluiter is beschikbaar zie paragraaf 1.4.4). Purge beide capillairen met water uit de spuiten met een debiet van ongeveer 10-50 pl / min, afhankelijk van de grootte van de injectiespuit tot ongeveer 10 pl water achterblijft in de spuiten. </li><li> Pre-steek de gespoeld haarvaten in een geschikte microfluïdische connector / adapter die raakvlakken met het kanaal via&#39;s in het hoofd (bv M1 connector - zie materialen). </li></ol></li><li> MFP hoofd voorbereiding <ol><li> Reinig de MFP hoofd door sonicatie behulp glaswerk wasmiddel voor het standaard reiniging of 0,5% bleekmiddel voor strenge schoonmaak, gedurende 5 minuten. Purge kanalen met water door onderdompeling van de apex in water en onder vacuüm brengen van de via. </li><li> Inspecteer kanalen onder een stereomicroscoop voor potentiële obstakels (verstopping) en opnieuwturf de vorige stap indien nodig. </li><li> Monteer het schone kop op de kophouder en schroef de connector met de vooraf geplaatst en gespoeld slang op de weg. Schroef de kophouder de Z-fase, die wordt gebruikt voor de bestrijding van openingsafstand tussen de kop en de cel monolaag. </li></ol></li><li> Kalibreren van de scanning stadia van de MFP-platform <ol><li> Voer eindpunt kalibratie van de X-, Y- en Z-fasen voorafgaand aan het verbinden van de kop naar het platform, volgens het protocol van de fabrikant met een geschikte software-interface. Gekalibreerde etappes zorgen voor nauwkeurigheid bij het positioneren van de MFP hoofd. </li><li> Het verkrijgen van een ruwe nul openingsafstand (op nul zetten) door aanpassing van de MFP hoofd over een kamer dia zonder cellen en langzaam dalen in 5 micrometer stappen. Bij probe contact met het substraat, dient Newton ringen worden waargenomen. Dit is een ruwe schatting. Een nauwkeurige positie te verkrijgen na aanpassing coplanarity de probe apex naar het substraate. </li><li> Om coplanarity de sonde apex waarborgen, past de kanteling van de kop met een goniometer (op het grensvlak van het hoofd en de Z platform). Wanneer gevormd opdat de ringen van Newton symmetrisch (figuur 1). Beweeg de MFP hoofd 20 urn uit de buurt van de ondergrond en stel tilt met behulp van de goniometer. Herhaal de afdaling, op nul zetten en kantelverstelling tot ringen van de Newton&#39;s zijn symmetrisch op contact. Met tilt bijgesteld, stel de Z-positie die symmetrisch Newton ringen produceert als nul. OPMERKING: De Z-fase regelt de head-to-substraat afstand, terwijl de kruistafel regelt het scannen van het substraat (figuur 2). Een gedetailleerde uitleg kunt u vinden in onze eerdere werk 14. </li></ol></li><li> Chemische producten voor de lokale verwijdering van cellagen Let op: In voorkomend geval, de veiligheid van het gebruik apparatuur (bijvoorbeeld, nitril handschoenen, een veiligheidsbril) voor de chemicaliën die worden voorbereid. Gebruik een fume hood zonodig voor het bereiden van oplossingen. Bereid alle chemicaliën en buffers met ultrapuur water als oplosmiddel. <ol><li> Bereid 50 mM NaOH oplossing de behandelingsvloeistof voor de binnenste injectiekanaal (i2 met stroom I2 Q in figuur 1). </li><li> Bereid de extractiebuffer oplossing nodig voor de buitenste injectie (i1 met stroming Q I1 in figuur 1), bestaande uit 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 0,5% Tween 20, en 10 uM rhodamine B in 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethaan bij pH 8. Voor zuivering, water gebruiken in het streven spuiten. </li><li> Filtreer alle oplossingen met een 0,2 urn spuitfilter. Ontgas alle gefilterde oplossingen met behulp van een exsiccator totdat de opgeloste lucht stop opborrelen. </li><li> Met behulp van de afvoerleiding aangesloten op de spuit pompen, zuiveren de rest water en zuig de ontgaste oplossingen in de injectiespuiten op 40 pl / min tot het spuiten zijn volledige (250 of 500 pi).Hierdoor luchtbellen vullen van de spuiten, connectoren en capillairen. De spuit-switch ventiel-twee-capillaire systeem maakt het vullen van de spuiten mid-experiment. Bij het ontbreken van een dergelijke switch klep, koppel de haarvaten van het hoofd en de haarvaten en de spuit te vullen door het opzuigen van de ontgaste oplossingen voor hen opnieuw aan te sluiten op het hoofd. </li><li> Opzuigen verwerking en afscherming vloeistoffen door de capillairen maakt het gebruik van kleine volumes tijdens bedrijf. Indien de chemicaliën kunnen worden bereid in grote hoeveelheden, vullen injectiespuiten met de vereiste oplossingen direct. Zo kan de aspiratie spuiten die water bevatten worden gevuld met deze benadering. </li><li> Spoel de haarvaten van de MFP hoofd met de voor elk kanaal, zoals omschreven in 1.4.1 en 1.4.2 toegewezen vloeistoffen. OPMERKING: De extractie bufferoplossing schermt het NaOH in de binnenste opsluiting en rhodamine component in de buffer maakt de visualisatie van de hHFC tijdens het gebruik. </li><li> Als de cellen zijn over-confluent, met mobiele aggregaten die op het gekweekte oppervlak, een aanvulling op de extractie buffer met 10% Proteinase K. Deze aanvulling op de werking van NaOH op deze aggregaten door het oplossen van gedenatureerde eiwitten als het lysaat komt in de aspiratie kanalen. Dit voorkomt verstopping van de kanalen tijdens bedrijf. </li></ol></li><li> Bereiding van celmonolagen op kamer objectglaasjes Let op: Gebruik een celkweek kap voor het kweken van de cellen en verwerken apparatuur volgens de geldende voorschriften door de bioveiligheid officer van het laboratorium in te stellen. Let op speciale eisen van specifieke cellijnen en het protocol en de uitrusting aan te passen. <ol><li> Gebruik celkweek incubator (5% CO2 en 37 ° C) voor kweek en uitbreiding van cellen worden gevormd. Voer de uitbreiding van het gebruik van standaard celkweek protocollen 17,18 in T-kolven. Gebruik het kweken van media als per eisen van de specifieke cell lijn (bv serum en antibiotica aangevuld DMEM voor het kweken van MCF7 en MDAMB 231). </li><li> Bij het ​​bereiken celconfluentie in de kweekkolven, trypsinize en laat cellen en zaden 2 x 10 5 cellen / cm2 in elk van de 2-kamer glijbanen voor patroonvorming en cultuur dan 48 uur. Gebruik de cellen in een van de kamers als controle voor celgroei en levensvatbaarheid. </li><li> Bij het ​​bereiken celconfluentie op de kamer slides, incubeer de cellen gedurende 45 min met 500 ul cel tracker kleurstofoplossing (bijvoorbeeld groen - CMFDA of oranje - CMRA) en 10 uM concentratie bereid in serumvrij medium. Dit wordt gedaan voor mobiele visualisatie tijdens de patroonvorming. Was de gemerkte cellen met PBS door zachtjes spoelen elke kamer met een pipet, en vervolgens de cellen te kweken in serum-aangevuld medium voor patroonvorming experimenten. </li><li> een referentiebeeld van het cel-tracker gekleurde celoppervlak verkrijgen ten behoeve van celtellingen. Dit wordt gewaarborgdconfluentie van de cellaag. Daarnaast dient het als een hulpmiddel voor de kwantificering experimenten als monster herstel en DNA-analyse zijn doelstellingen. LET OP: In het geval dat de levensvatbaarheid van de cellen is om tijdens de patroonvorming worden beoordeeld, kunnen de cellen worden gekleurd met een Live / Dead cytotoxiciteit kit volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol></li></ol> 2. Het creëren van de hiërarchische Hydrodynamische Flow Opsluiting (hHFC) <ol><li> Beweeg de MFP via cel monolaag een spleetafstand van 50 urn van het glaasje. Deze kloof afstand en tegelijkertijd contact van de hHFC verklaart ook monolaag oppervlak en de dikte variatie. </li><li> Injecteer NaOH op 6 of 8 ul / min door i2. Evalueer andere debieten (dat wil zeggen, Q I1, Q en Q A1 A2) met behulp van de stroom regels in figuur 3. </li><li> Moduleren omvang van de binnenste HFC door de verhouding van Q I2 / I1 Q met de injectiespuiten.Gebruik bijvoorbeeld een Q I1 tussen 1,3 pl / min en 4 pl / min, met de Q I2 in 8 pl / min, waardoor een NaOH voetafdruk van 150 vaste - 300 cellen (100 - 200 pm 2 / cel) ( figuur 3D). </li><li> Injecteer volledig medium van de buitenste grootste openingen op de MFP kop met een stroomsnelheid van 20 pl / min te verklaren verdamping van de media en aspiratie tijdens de operatie van de hHFC. </li></ol> 3. patroonvorming celmonolagen behulp hHFC Opmerking: Het aftastpatroon bepaalt de gebieden van de cel monolaag waarbij de cellen worden gewonnen (subtractieve patronen), waarbij de resterende cellen tot specifieke biologische vragen bestuderen. Dit patroon kan worden rechte lijnen of een array van spots, bijvoorbeeld. Complexe patronen vereisen ontwerp van een geschikte scanning van de bal. Bijvoorbeeld, een geblokte aftast trajectorie verschaft een raster van celgebieden (getoond bijvoorbeeld op Figuur 4A </strong&gt;), hetgeen mogelijk bestuderen van het effect van verschillende stimuli op cellen in verschillende vierkanten terwijl u vlak. Deze patronen kunnen worden gemaakt met behulp van de controle over de XY stadia van het platform, waar de besturingssoftware maakt scripting scan trajecten voor de MFP hoofd over de cel monolaag. <ol><li> De weg geëffend software om de meetkop via eencellige laag in gebruikerseenheden patronen scannen (door X, Y en Z-coördinaten) bij een scansnelheid van 10 pm / s op een openingsafstand van 50 urn. </li><li> Met de geneste hHFC in bedrijf en in contact met de monolaag, scant de MFP met een baan van het gewenste patroon tot patroon celverwijdering bewerkstelligen. </li><li> Voor een co-cultuur na de eerste celtype verwijdering, zaad een andere cel lijn om de leemtes op te vullen, met behulp van methoden in paragraaf 1.5 beschreven. Verplaatsen tussen geneste en kneep modi (door groeiende kloof afstand, bijvoorbeeld) naar cel verwijdering beheersen. LET OP: De scan snelheid kan zijn onderzoeksprocedure te zijngated voor de andere cellijnen. De scan snelheid gebruikt in deze demonstratie effecten volledige cel verwijdering over de gescande regio&#39;s voor de gebruikte cellijnen. </li></ol> 4. downstream processing voor monsterneming en DNA Amplification <ol><li> Bereid de bemonstering station voor downstream-analyse van het lysaat. Voor de bemonstering station, gebruik maken van een 3D geprint 8-strip PCR buishouder. Alternatief Kies een geschikte buishouder om als deze adapter, die kunnen worden binnen het scanbereik van het hoofd buiten het substraat aangebracht is. Veeg de buishouder met 70% ethanol of een ander oppervlak ontsmettingsmiddelen basis van de gewenste stringentie voor de toepassing. Gebruik een magnetische clip op de buis houder om het te hechten op het substraat houder. </li><li> Na bereiding van de bemonstering station, plaatst u de MFP hoofd 100 micrometer uit de monolaag. Beginnen werken de hHFC met 50 mM NaOH oplossing de behandelingsvloeistof voor de binnenste injectiekanaal met stroomsnelheden van 1, 6, -7 En -17,5 pl / min Q respectievelijk I1, I2 Q, Q Q A1 en A2. <ol><li> Zodra de stroom opsluiting (ongeveer 10 seconden) is gestabiliseerd, dalen de meetkop een spleetafstand van 50 urn tot NaOH gebaseerde lokale lysis van de gekozen subpopulatie van cellen met de hHFC voeren. Zodra lysis van de subpopulatie voltooid (ongeveer 30 sec per footprint), richt de richting van de buizen in het monsternemingsstation. Verwijder de verzamelde lysaat in de PCR buisjes direct (figuur 6). </li></ol></li><li> Voor verdere verwerking van het lysaat eerst de pH van de oplossing te neutraliseren door het mengen van het lysaat met Tris buffer (1: 1). Na neutralisatie Verhit het lysaat aan 95 ° C gedurende 30 min. Vervolgens direct het lysaat laden in een standaard qPCR workflow zoals vastgesteld door leverancier van het instrument. </li></ol>

<ol><li>Théry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> J. Cell Sci. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).</li>
<li>Goubko, C. A., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+multiple+cell+types+in+co-cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Sci.+Eng.+C%22%5BJournal%5D)">Patterning multiple cell types in co-cultures: A review.</a> Mater. Sci. Eng. C. 29 (6), 1855-1868 (2009).</li>
<li>Kaji, H., Camci-Unal, G., Langer, R., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+systems+for+the+generation+of+patterned+co-cultures+for+controlling+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Engineering systems for the generation of patterned co-cultures for controlling cell-cell interactions.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810 (3), 239-250 (2011).</li>
<li>Cho, C. H., Park, J., Tilles, A. W., Berthiaume, F., Toner, M., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layered+patterning+of+hepatocytes+in+co-culture+systems+using+microfabricated+stencils%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Layered patterning of hepatocytes in co-culture systems using microfabricated stencils.</a> Biotechniques. 48 (1), 47-52 (2010).</li>
<li>Schütze, K., Lahr, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+expressed+genes+by+laser-mediated+manipulation+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification of expressed genes by laser-mediated manipulation of single cells.</a> Nat. Biotechnol. 16 (8), 737-742 (1998).</li>
<li>Salazar, G. T. A., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropallet+arrays+for+the+separation+of+single%2C+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Micropallet arrays for the separation of single, adherent cells.</a> Anal. Chem. 79 (2), 682-687 (2007).</li>
<li>Guillaume-Gentil, O., Zambelli, T., Vorholt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+single+mammalian+cells+from+adherent+cultures+by+fluidic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Isolation of single mammalian cells from adherent cultures by fluidic force microscopy.</a> Lab Chip. 14 (2), 402-414 (2014).</li>
<li>Iwata, F., Adachi, M., Hashimoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+scraper+based+on+an+atomic+force+microscope+for+detaching+a+living+cell+from+a+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">A single-cell scraper based on an atomic force microscope for detaching a living cell from a substrate.</a> J. Appl. Phys. 118 (13), (2015).</li>
<li>Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+wound-healing+assays+for+probing+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration.</a> J. Lab. Autom. 17 (1), 59-65 (2012).</li>
<li>Juncker, D., Schmid, H., Delamarche, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipurpose+microfluidic+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Multipurpose microfluidic probe.</a> Nat. Mater. 4 (8), 622-628 (2005).</li>
<li>Kaigala, G. V., Lovchik, R. D., Delamarche, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+in+the+%26%2334%3Bopen+space%26%2334%3B+for+performing+localized+chemistry+on+biological+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Microfluidics in the &#34;open space&#34; for performing localized chemistry on biological interfaces.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51 (45), 11224-11240 (2012).</li>
<li>Qasaimeh, M. A., Gervais, T., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+quadrupole+and+floating+concentration+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Microfluidic quadrupole and floating concentration gradient.</a> Nat. Commun. 2 (May), 464(2011).</li>
<li>Christ, K. V., Turner, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+hydrodynamically+confined+microfluidics%3A+controlling+flow+envelope+and+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Design of hydrodynamically confined microfluidics: controlling flow envelope and pressure.</a> Lab Chip. 11 (8), 1491-1501 (2011).</li>
<li>Autebert, J., Kashyap, A., Lovchik, R. D., Delamarche, E., Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+hydrodynamic+flow+confinement%3A+efficient+use+and+retrieval+of+chemicals+for+microscale+chemistry+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Hierarchical hydrodynamic flow confinement: efficient use and retrieval of chemicals for microscale chemistry on surfaces.</a> Langmuir. 30 (12), 3640-3645 (2014).</li>
<li>Kaigala, G. V., Lovchik, R. D., Drechsler, U., Delamarche, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Vertical+Microfluidic+Probe%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">A Vertical Microfluidic Probe.</a> Langmuir. 27 (9), 5686-5693 (2011).</li>
<li>Cors, J. F., Lovchik, R. D., Delamarche, E., Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compact+and+versatile+microfluidic+probe+for+local+processing+of+tissue+sections+and+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">A compact and versatile microfluidic probe for local processing of tissue sections and biological specimens.</a> Rev. Sci. Instrum. 85 (3), 034301(2014).</li>
<li>Pollard, J. W., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPollard%2C+JW+%22Basic+Cell+Culture+Protocols%22">Basic Cell Culture Protocols</a>. , Humana Press. (1997).</li>
<li>Mitry, R. R., Hughes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cell+culture+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol.+Springer%22%5BJournal%5D)">Human cell culture protocols.</a> Methods Mol. Biol. Springer. 531 (1), (2012).</li>
<li>Sakai, K., Ushida, T., Nagase, T., Nakamigawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+cell+detachment+by+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Sci.+Eng.+C%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of cell detachment by shear stress.</a> Mater. Sci. Eng. C. 17 (1-2), 55-58 (2001).</li>
<li>Rodriguez, N. M., Desai, R. A., Trappmann, B., Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterned+multicolor+dynamically+adhesive+substrates+to+control+cell+adhesion+and+multicellular+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Micropatterned multicolor dynamically adhesive substrates to control cell adhesion and multicellular organization.</a> Langmuir. 30 (5), 1327-1335 (2014).</li>
<li>Tasoglu, S., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+for+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bioprinting for stem cell research.</a> Trends Biotechnol. 31 (1), 10-19 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We presenteren een veelzijdig protocol voor de subtractieve patroonvorming van celmonolagen die korte generatietijd van bepaalde omtrek celpatronen maakt. Selectieve lysis van celmonolagen wordt uitgevoerd met NaOH als behandelingsvloeistof in hHFC. NaOH gedenatureerd onmiddellijk de eiwitten in de celmembraan. Wij raden het gebruik van 50 mM concentratie van NaOH tot downstream processing van het lysaat te waarborgen. Deze concentratie kan worden verhoogd voor snellere celverwijdering, ontvangen lysaat downstream processing is geen doelstelling. De hHFC zorgt dat de verwerkte aangrenzende plaatsen van de cel monolaag onaangetast en zijn beschikbaar voor zowel uitbreiding van de patroon of probing andere eigenschappen van de cellen. De snelheid van cel verwijderen is een functie van zowel de chemie en afschuiving door de stroming. We kiezen voor een bereik van debieten chemie dominante cel verwijdering hebben. Scannen snelheden van 10 - 20 en #181; m / sec met een NaOH injectie stroomsnelheid van 6-8 pl / min gebruikt om &#39;snelle&#39; subtractieve patroon vergemakkelijken. Het snelle tempo van de cel verwijderd wordt een aantal uitdagingen voor het oppervlak printen op basis patronen benadert 20,21. Deze werkwijzen vereisen een mechanisme om de groei van cellen in ruimtelijk gedefinieerde gebieden te beperken, bijvoorbeeld door selectieve afzetting van celadhesie-eiwitten via micro-contact drukken en daaropvolgende zaaien van cellen om het patroon te verkrijgen. Zij worden beperkt door lage doorvoer en vereisen een aantal opeenvolgende stappen op patroon generatie en een nieuw sjabloon / stempel voor elk patroon. De beschreven methode maakt geen selectieve groei van cellen op bepaalde gebieden vereisen en overwint verscheidene beperkingen door het uitvoeren van subtractieve patroonvorming in tegenstelling tot het drukken, zonder dat enige extra behandeling van de celkweek substraat. Met de in deze paper protocol, de doorvoer van patroonvorming celmonolagenis toegenomen, terwijl het verkrijgen van onmiddellijke visuele feedback van de gegenereerde patroon. Dit vergemakkelijkt realtime modificatie van de patronen. Dergelijke controle zou cruciaal scenario&#39;s waarin cellevensvatbaarheid op een bepaald oppervlak niet homogeen. Een ander voordeel van de werkwijze is dat dezelfde kop en chemie kan worden gebruikt om meerdere patronen te genereren, waardoor het aantal stappen voor het genereren van een gevormde cel monolaag verminderen. De afmetingen van de kanalen in het hoofd en de geometrie kan worden geschaald volgens de vereisten van de toepassing, waardoor controle over de resolutie van het patroon. Alle experimenten in de huidige werkzaamheden werden uitgevoerd met een MFP kop met vaste afmetingen diafragma, specifiek binnenste openingen 100 x 100 urn en buitenste openingen 200 x 100 urn. Dit ontwerp met grotere buitendiameter openingen gekozen om continue werking van de hHFC waarborgen zonder verstopping van de openingen doorverdwaalde celresten. We hebben hoofden getest met innerlijke opening afmetingen 50 x 50 micrometer en 50 micrometer afstand tussen hen, met succesvolle resultaten in cel verwijderen. Gebruik van kleinere openingen naar 10 x 10 urn met 10 urn afstand, zou schaling toelaten om een ​​kleinere voetafdruk grootte (~ 30 x 30 micrometer), waardoor een hogere resolutie in patroonvorming. We zagen operationele problemen met de opening die kleiner zijn dan 10 micrometer als gevolg van verstopping van de deeltjes. Vanwege deze operationele problemen, 100 urn is de stroombegrenzing resolutie en daarmee een beperking van de beschreven techniek. Maar we kunnen dit aan te pakken met behulp van de vloeibare vormgeving vermogen van de hHFC. We hebben aangetoond dat de oplossing van celverwijdering voor een bepaalde reeks van diafragma afmetingen kunnen gevarieerd worden door het regelen Q I2 / I1 Q (figuur 4b) en de top-tot-substraat gap 10,14. De stappen die in het huidige werk een minimale stapgrootte van 100 nm.Een combinatie van deze bestuurbare parameters kan de ruimtelijke resolutie van celverwijdering wat betreft de grootte en footprint scanafstand verbeteren. Als gevormde co-kweken worden gewenst specifieke cel-cel interacties tussen verschillende celtypen te bestuderen, kunnen opeenvolgende zaaien en patroonvorming worden uitgevoerd met het beschreven protocol. Tenslotte kan amplificeerbaar DNA van hoge kwaliteit worden verkregen bij het ​​lysaat, zoals blijkt door de enkelvoudige piek in het DNA te smelten kromme (zie figuur 7). We evalueerden een DNA hoeveelheid ongeveer 1,6 ng van een voetafdruk (ongeveer 300 cellen) gebruikt qPCR, dat dicht bij de theoretische verwachting (6-8 pg / cel). Dit duidt op een hoeveelheid van het geëxtraheerde DNA geschikt voor meerdere stroomafwaartse processen tijdens gebruik wegnemen van elke DNA isolatie werkwijzen. Dit opent mogelijkheden voor DNA-analyse op basis van lokale sonderen van gekweekte cellen. Het vermogen van hHFC vloeistoffen vormen kunnen ook worden gebruikt om levende cellen en eiwitten op ac deponerenveerd oppervlakken, die in combinatie met de subtractieve patronen en sequentiële co-kweken in dit protocol maakt de creatie van complexe cel en cel-matrix patronen op cultuur substraten. De veelzijdigheid en de controle door hHFC gebaseerde subtractieve patroonvorming van celmonolagen en de mogelijkheid van het uitvoeren van DNA-analyse van het geëxtraheerde cellen, een krachtig nieuw instrument ingesteld biologen ruimtelijk opgeloste studies met cel interacties voeren.

In hun eigen omgeving, cellen in biologische weefsels waarnemen verschillende biochemische en fysische signalen waarbij hun groei, organisatie en ontwikkeling. Inzicht in deze signalen vereist selectief onderzoeken van cel-cel en cel-matrix interacties. Dit vereist de ontwikkeling van methoden voor patroonvorming celmonolagen. Methoden om geometrisch scheiden verschillende celtypen in kweek (patronen) inschakelen brede studies van fysische en chemische signalen in de celbiologie. De meeste van de huidige benaderingen voor patroonvorming cellagen 1-4 afhankelijk afzetten cel-adhesie-eiwitten op oppervlakken of via microfabricated sjablonen voor selectieve groei op substraten. Daarentegen Hier presenteren we een methode om snel patroon celmonolagen in situ, dat wil zeggen, cellen in kweek, door het verwijderen van cellen in geselecteerde zones van de monolaag. Methoden die dergelijke subtractieve patronen 5 uit te voeren - 9 usually vereisen gespecialiseerde substraten, oppervlaktebehandeling, complexe operatie, fysiek contact of ablatie met behulp van een laser, per ongeluk waardoor de levende cellen. We gebruiken hier een microfluïdische sonde (MFP) 10,11, een contactloze scanning microfluïdische technologie die hydrodynamisch beperkt een vloeistof op een substraat. Een belangrijk onderdeel van de MFP is de op microschaal vervaardigde kop met microkanalen (figuur 1). De bijbehorende platform bestaat uit spuitpompen voor vloeibare controle fasen voor het scannen van controle en een omgekeerde microscoop voor visualisatie en feedback (figuur 2). In de basisconfiguratie de MFP kop omvat twee microkanalen met openingen aan de top, een voor inspuiten van een behandelingsvloeistof en de andere voor het aan elkaar aanzuigen de geïnjecteerde behandelingsvloeistof enkele immersievloeistof (Figuur 3A). MFP tijdens gebruik, de punt zich op een vaste afstand van het substraat. Wanneer de aspiratie debiet (QA) is sufficiently hoger dan de injectie debiet (Qi), dwz Qa: Q i ≥ 2,5, de behandelingsvloeistof beperkt op het substraat. Dit resulteert in een hydrodynamische stroming bevalling (HFC). De regio waar de behandelingsvloeistof in direct contact met het substraat wordt genoemd de voetafdruk. Voor normale bedrijfsomstandigheden wordt de stroming van de behandelingsvloeistof binnen de HFC gekenmerkt door een lage Reynolds (Re ≈ 10 -2) en een hoge Péclet getal (Pe ≈ 10 2). Dit impliceert vloeistofstromen in laminaire regime met convectie wordt de primaire functie van de massa-overdracht van chemische stoffen. De numerieke en analytische modellen voor stroming opsluiting zijn elders beschreven 12-14. In dit artikel gebruiken we de aanpak van gelijktijdig opsluiten van meerdere verwerkingseenheden vloeistoffen, die wordt genoemd hiërarchische HFC (hHFC) 14. Voor de uitvoering van hHFC met de MFP, twee additional openingen zijn nodig om een ​​secundaire bron van injectie en te zuigen. Dit stelt ons in staat om een ​​vloeistof te beperken binnen een tweede vloeistof. De binnenste (verwerking) vloeistof profiteert van zijn afgeschermd van verdwaalde puin op het substraat door de buitenste (afscherming) vloeistof. Bovendien hHFC is bedrijf in twee modi: (i) de geneste stand, waarbij de behandelingsvloeistof in de binnenste HFC het oppervlak raakt (figuur 3B), en (ii) de geknepen stand, waarbij de inwendige vloeistof verliest contact en alleen de buitenste vloeistof in contact met het substraat (Figuur 3C). Schakelen tussen de twee modi kunnen gebruikers bewerkstelligen of stoppen met het verwerken van het substraat en wordt bereikt door regeling van de kop-oppervlak opening of door de verhouding tussen de stromen injectie (Q i2 / Q i1). Voor een gegeven geometrie kanaal, kan de voetafdruk van de behandelingsvloeistof op het substraat worden geregeld door het moduleren stromingscondities (Figuur 3D). natrium hydroxide (NaOH) wordt gebruikt als de binnenste behandelingsvloeistof om de cellen te lyseren en het lysaat wordt continu afgezogen van het oppervlak. Omdat de chemische werking van de behandelingsvloeistof worden gelokaliseerd in het binnenste HFC footprint, de aangrenzende cellen blijven onverstoord die spatiotemporele studies van cel-cel interacties toelaat. Het scannen functionaliteit van de MFP laat de oprichting van door de gebruiker gedefinieerde geometrieën van de cel patronen (Figuur 4). Verder is de keuze van NaOH als behandelingsvloeistof geschikt stroomafwaartse DNA-analyse (Figuur 7).

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materialen</td></tr><tr><td>Microfluidic Probe (MFP)</td><td></td><td></td><td>Silicon/glas hybride sondekop met in silicon gevormde kanalen. Fabricage gebeurde in eigen beheer bij IBM Research - Zürich</td></tr><tr><td>Lab Tek II Chamber slides met 2 kamers</td><td>ThermoFisher scientific, USA</td><td>154461</td><td>2 kamer kamer slides voor celcultuur waarbij elke kamer een oppervlakte van 4 cm2 biedt en geschikt is voor maximaal 3 ml mediavolume</td></tr><tr><td colspan="4">Chemicaliën en cellijnen</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide, Tris-Cl, Ethyleendiaminetetraazijnzuur, Rhodamine B</td><td>SigmaAldrich chemicaliën, USA</td><td>S5881, 252859,&nbsp; E9884, R6626</td><td>Chemicaliën gebruikt voor het verwerken en afschermen van vloeistoffen</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen, Duitsland</td><td>19131</td><td>protease om gedenatureerde eiwitten te verteren</td></tr><tr><td>Deconex 16 Plus</td><td>Bohrer Chemie, Zwitserland</td><td></td><td>Universeel reinigingsmiddel voor laboratoriumverbruiksartikelen. Gebruikt voor niet strenge reiniging.</td></tr><tr><td>DNA away&nbsp;</td><td>ThermoFisher scientific, USA</td><td>7010</td><td>Oppervlakteontsmettingsmiddel dat DNA en DNAasen denatureert.</td></tr><tr><td>DMEM, hoge glucose, GLUTAMAX supplement</td><td>ThermoFisher scientific, USA</td><td>10566-016</td><td>Kweekmedium voor epitheelcellen.</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA kleurstof</td><td>ThermoFisher scientific, USA</td><td>C7025</td><td>Membraan doorlatende live cellabeling kleurstof. Kleurstof actief gedurende 72 uur.</td></tr><tr><td>CellTracker Orange CMRA kleurstof</td><td>ThermoFisher scientific, USA</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-actine genomische primers voor qPCR</td><td>Integrated DNA technologies, USA</td><td></td><td>Aangepaste oligo's gebruikt voor DNA kwaliteitsvalidatie en qPCR.</td></tr><tr><td>MCF7 borstcarcinoom cellen</td><td>ATCC, USA</td><td>ATCC HTB-22</td><td>Cellijnen gebruikt om co-culturen te produceren.</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 borstcarcinoom cellen</td><td>ATCC, USA</td><td>ATCC HTB-26</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Apparatuur en vloeistofverbindingen</td></tr><tr><td>Gemotoriseerde hoge precisie stages</td><td>Op maat gemaakte componenten.&nbsp; Lineaire asmotoren van LANG GmBH, Duitsland</td><td>Aangepaste lineaire as stages uit de LT-serie</td><td>3 &times; LT voor 3 assen. LSTEP controller gebruikt voor interface van stages en PC via RS 232 poort.</td></tr><tr><td>Spuiten</td><td>Hamilton, Zwitserland</td><td>1700 TLLX serie</td><td>Uitwisselbaar met spuiten geleverd door andere fabrikanten met een 250-500 &micro;l bereik.</td></tr><tr><td>Nemesys lagedruk spuitpompen</td><td>cetoni GmbH, Duitsland</td><td></td><td>Onderdeel van de pompinstallatie.</td></tr><tr><td>Circulaire M1-connector</td><td>Dolomite microfluidics, Verenigd Koninkrijk&nbsp;</td><td>3000051</td><td>Interface tussen vias in MFP-kop en buis</td></tr><tr><td>Kanteling/rotatiestandaard Goniometer</td><td>OptoSigma, USA</td><td>KKD-25C</td><td>Goniometer om coplanariteit van MFP-top aan te passen</td></tr><tr><td>DS Fi2 HD kleurencamera (CCD)&nbsp;</td><td>Nikon, Zwitserland</td><td></td><td>Gestuurd met DS-U3 controller unit</td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>Win - Commander</td><td>LANG GmBH, Duitsland</td><td></td><td>Stage besturingssoftware.</td></tr><tr><td>Qmix Elements</td><td>cetoni GmbH, Duitsland</td><td></td><td>Pompbesturingssoftware.</td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon, Zwitserland</td><td></td><td>Basisonderzoeksmodule voor beeldverwerving en analyse.</td></tr></tbody></table>

rapid subtractieve patroonvorming van live-cell lagen met een microfluïdische probe

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

De microfluïdische sonde (MFP) vergemakkelijkt het uitvoeren van lokale chemie van biologische substraten door beperken nanoliter volumes van vloeistoffen. Via een bepaalde implementatie van de MFP, de hiërarchische hydrodynamische stroming opsluiting (hHFC), worden meerdere vloeistoffen tegelijkertijd in contact gebracht met een substraat. Lokale chemische werking en vloeibare vormen van het gebruik van de hHFC, wordt benut om de cel patronen te creëren door het plaatselijk lyseren en het verwijderen van cellen. Door gebruik het scannen vermogen van de MFP, worden willekeurige patronen van celmonolagen werden aangemaakt. Dit protocol maakt een snelle, real-time en ruimtelijk gecontroleerde cel patronen, die selectieve cel-cel en cel-matrix interactie studies kan toestaan.

De beschreven protocol voor snelle subtractieve patroonvorming van celmonolagen wordt aangetoond met meerdere componenten MFP platform (figuren 1 en 2). Het protocol maakt gebruik van de hiërarchische hydrodynamische stroom opsluiting (hHFC; figuur 3) ter plaatse te behandelen en cellen te verwijderen uit celmonolagen, met behulp van NaOH als de verwerking vloeistof. De hHFC configuratie bestaat uit een innerlijke HFC en een buitenste HFC. De opgesloten NaOH in de binnenstad hHFC introduceert chemische werking en afschuiving op de cellen in contact. Binnen deze footprint worden de cellen homogeen blootgesteld aan de chemische werking van NaOH vanwege convectie aangedreven massaoverdracht binnen en met verwaarloosbare diffusie naar het gebied buiten de bevalling. De schuifspanning op de cellen anderzijds, kan worden veranderd door het variëren van de stroomsnelheid van NaOH. Operationele parameters vereenvoudigen, kozen we om chemische werking maken het dominante mechanisme van cel verwijderd in vergelijking met de schaar. naarschatten de kracht afschuiving door de hHFC aangebracht op het oppervlak, werd een eindige elementen model gemaakt met Comsol Multiphysics 5,0. Simulaties werden uitgevoerd met behulp van de CFD-module voor laminaire stromingen. Twee inlaat randvoorwaarden aan de injectie openingen van de geometrie en twee uitlaat randvoorwaarden om aspiratie openingen (figuur 5) werden toegepast voor het bereik van stroomsnelheden en diafragma afmetingen in de huidige demonstratie. In het verkregen model, de stroming de regels bepaald shear profiel, terwijl de stroomsnelheden de grootte van de afschuiving op het oppervlak gedefinieerd. Praktisch, een combinatie van beide bepaalt of de hHFC het oppervlak raakt. Houden van deze factoren in het achterhoofd hebben we besloten om een ​​reeks debieten voor bedrijf te vinden om chemisch dominante cel verwijdering te verkrijgen. Om een ​​hHFC te maken, gebruiken we de stroom regel van een totaal streven naar injectie stroomsnelheid verhouding van 3,5. De andere stroom regels gebruikt werden gedefinieerd om te minimaliseren verstopping binnen de aspiratie kanalen,die kan worden veroorzaakt door gedenatureerde eiwitten vasthouden aan de kanaaloppervlakken. Met gebruikmaking van dit model hebben wij debieten van 5 tot 10 pl / min vertalen naar een schuifspanning tussen 1 en 3 N / m 2. Zonder chemisch effect NaOH, bijvoorbeeld in het geval van de extractiebuffer, de schuifspanning niet hoog genoeg om de cellen te 19 verwijderen. Binnen de waargenomen bereik, merken we op dat de werking bij hogere stroomsnelheden is praktischer als gevolg van verstoringen in de stroom weg bij lage aspiratie debieten (dat wil zeggen, Q I2 &lt;4 pl / min) als gevolg van celresten in de kanalen. Gezien de bestudeerde shear profiel en praktische overwegingen, NaOH debiet (Q I2) van 6 en 8 pl / min worden toegepast voor de patroonvorming experimenten en Q I1, Q A1 en Q A2 moet het stroomdiagram regels figuur 3. De verhouding injectie stromen (Q I2 / I1 Q) U kuntop verdere moduleren de grootte van de hHFC voetafdruk (figuur 3D en figuur 4B), waarbij het ​​onderliggende principe uitgewerkt door Autebert et al. 14. Als liquid-shaping vermogen van de hHFC combinatie met een hoge-resolutie scanning vermogen van MFP platform demonstreren wij levende cellen raster generatie op meerdere schalen en bovendien de toepassing van het protocol gegeven in ontwikkeling co-kweken (figuur 4C) tonen. Het platform maakt het ook mogelijk ons ​​te proeven lysaat ophalen uit te voeren voor downstream-analyse. Om de kwaliteit van het verkregen lysaat tonen we probeerden lokaal gelyseerde cellen uit een en vijf voetafdrukken in twee onafhankelijke experimenten, die de variatie in hoeveelheden DNA verkregen uit het lysaat (Figuur 7). Hier hebben we geamplificeerde DNA in het lysaat met behulp van β-actine primers (voorwaarts: GGATGCAGAAGGAGATCACT en achteruit: CGATCCACACGGAGTACTTG<html> ) Via 4 pl van het geneutraliseerde lysaat in elke PCR-reactie. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig1.jpg" /> Figuur 1. Modules van de MFP platform en de kop. (A) De operationele modules van het platform omvatten gemotoriseerde spuiten, gemotoriseerde fase en een regelaar. De MFP is verbonden met een gemotoriseerde Z-fase naar de spleet afstand tussen de kop en het substraat controle en de substraathouder is om de X- en Y-gemotoriseerde fasen waaruit het scansysteem bevestigd. (B) De MFP kop heeft fluidic vias naar het pompstation aan te sluiten, montagegaten aan het hoofd op de Z-stage te monteren, en kanalen die de gepolijste apex verlaat. De punt is ingesteld coplanaire aan de celkweek substraat. Symmetrische Newton ringen kunnen worden waargenomen wanneer de top en het substraat zijn coplanair en in contact.<html> p_upload / 54447 / 54447fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig2.jpg" /> Figuur 2. MFP platform. De hoge-resolutie scanning platform is voorzien van een bewerkt kophouder interfacing met de hoge precisie gemotoriseerde Z-fase. De substraathouder is verbonden met de XY podium voor het scannen. Voor de recuperatie van het lysaat voor downstream analyse, wordt een 3D geprint monsternemingsstation magnetisch geknipt aan de zijde van de substraathouder (zie detail). Spuitpompen, een omgekeerde microscoop, controllers en displays bevinden zich rond het platform. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 3 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54447 / 54447fig3.jpg &quot;/&gt; Figuur 3. Hiërarchisch hydrodynamische stroming opsluiting (hHFC) voor ruimtelijke en temporele controle celverwijdering. (A) Schematische voorstelling van een HFC. (B) Geneste en (C) geknepen modus hHFC werking. (D) Afbeelding van de voetafdruk voor twee verschillende injectie / aspiratie stroom ratio&#39;s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig4.jpg" /> Figuur 4. Patronen van celmonolagen met behulp van de MFP. (A) Cell-grid generatie door geprogrammeerde aftasten van de MFP op een MDA-MB-231 cel monolaag. De cellen werden gekleurd met groene cel-tracker kleurstof. (B) De voetafdruk voor de verschillende injectieverhoudingen (n) Op MCF7 cel monolaag. Het schema toont de verwachte variatie in de vorm van de binnenste HFC met een verandering in n. (C) Patterned co-cultuur door subtractieve patroonvorming van MCF7 monolaag gevolgd door het zaaien van MDA-MB-231 cellen in de afgetrokken regio&#39;s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig5.jpg" /> Figuur 5. afschuifspanning op de ondergrond na het aanbrengen hHFC. De schuifspanning op het oppervlak lineair toeneemt met de binnenste injectie stroomsnelheid. Het hoogste scheer piek wordt gevonden tussen de twee binnenste openingen (rechtsonder inzet), wanneer de verwerking vloeistof wordt beperkt (rood stroom lijnen, linksboven inzet). Het diafragma afmetingen die in het eindige elementen model zijn 200, 100, 100 en 200 urn voor i1, i2, a1en A2, respectievelijk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 6" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig6.jpg" /> Figuur 6. Bedrijfsmodi van de MFP platform naar cel verwijdering en patronen uit te voeren. (A) Schematische weergave van de stroming pad voor subtractieve patroonvorming door cellysis. Eenvoudigheidshalve slechts één van elke injectie en aspiratie stroompaden getoond. De spuiten zijn gevuld met de afvoerklep in de pomp. i1 en i2 worden gebruikt voor het injecteren extractiebuffer en NaOH, respectievelijk. (B) Schematische voorstelling van stroomweg voor lysaat herstel. Deze stromingsweg wordt geactiveerd na verzameling cellysaat voor analyse via de stromingsbaan in (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig6large.jpg" target="_blank">Gelieve clic</a>k hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="figuur 7" src="/files/ftp_upload/54447/54447fig7.jpg" /> Figuur 7. Downstream analyse van DNA uit cellysaat met behulp van qPCR. (A) Versterking percelen van DNA in lysaat geëxtraheerd uit 5 footprints (5 fp) en 1 footprint (1 fp). Controles werden geëxtraheerd na lysaat collectie voor beide zaken. (B) smelt curven van DNA geamplificeerd uit het lysaat met de kwaliteit van het geëxtraheerde DNA. qPCR werd uitgevoerd (N = 2, n = 3) om de β-actine-gen te versterken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuren" src="/files/ftp_upload/54447/54447figS.jpg" /> Figuur S1. Een geschaalde beeld van kanaal ontwerp voor de 6-kanaals MFP headvoor patroonvorming experimenten. Channels uitvoeren van de hHFC zijn 200, 100, 100, 200 urn breed en 100 um diep. De twee buitenste kanalen, die onderdompeling vloeistof te vullen zijn 500 micrometer breed en 100 micrometer diep. Een GDS-bestand voor het zelfde ontwerp is voorzien als een aanvulling op dit artikel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54447/54447figSlarge.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

We presenteren een protocol om subtractieve patterning van levende celmonolagen op een oppervlak uit te voeren. Dit wordt bereikt door lokale en selectieve lysis van adherende cellen met behulp van een microfluïdische sonde (MFP). Het cellysaat dat uit lokale gebieden wordt verkregen, kan worden gebruikt voor downstream-analyse, waardoor moleculaire profileringsstudies mogelijk worden.

Rapid Subtractieve patroonvorming van Live-Cell Lagen met een microfluïdische Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Het hoofddoel van de in deze video-artikel gepresenteerde methode is om snel ruimtelijk gedefinieerde celpatronen te genereren om in-situ spatiotemporele analyse van cel-celinteracties te faciliteren. De gepresenteerde strategie maakt gebruik van microfluïdische probe-technologie. De gemicrofabriceerde probekop lokaliseert nanolitervolumes van biochemische stoffen op biologische substraten om celmonolagen te patroonvormen.Het belangrijkste voordeel van een MFP-gebaseerde patroontechniek is dat deze vrijwel onmiddellijk plaatsvindt dankzij lokale lysis, waardoor de te genereren patronen in realtime kunnen worden aangepast. We kregen het idee voor deze methode toen we merkten dat andere methoden voor het genereren van celpatronen lange, meerstaps protocollen vereisen voordat het succes van de celpatronen daadwerkelijk zichtbaar is. Om stabiele experimenten uit te voeren met een hydrodynamische stroombeperking op een celoppervlak, moeten de MFP-parameters worden geoptimaliseerd.Hiervoor is een visuele demonstratie essentieel. Aditya Kashyap en Julien Cors zullen deze procedure demonstreren. De operationele modules van het platform bestaan uit gemotoriseerde spuiten, gemotoriseerde tafels en een controller.De MFP is verbonden met een gemotoriseerde Z-stage om de afstand tussen de kop en het substraat te regelen, en de substraathouder is bevestigd aan de X- en Y-gemotoriseerde stages die het scanningsysteem vormen. De MFP-kop is voorzien van vloeistofdoorvoeren om verbinding te maken met het pompsysteem, montagegaten om de kop op de Z-stage te bevestigen en kanalen die uitmonden bij de gepolijste apex. De apex is coplanair ingesteld ten opzichte van het substraat voor celkweek.Om het pompstation en de vloeistofbehandelingsapparatuur voor te bereiden, moeten de spuiten en spuitlevende zuigers vóór en na experimenten met levende cellen worden gereinigd door middel van sonicatie en een 0,5% bleekoplossing in ultrapuur water. Spoel ze grondig na met water. Vul de spuiten met water door de uiteinden volledig in een waterbad te dompelen en het water op te zuigen met de zuiger.Verwijder de vloeistof terwijl deze zich in het waterbad bevindt, waarbij de schacht van de spuit de afdichting bij de uitgang van de spuit raakt. Blijf aspireren en purgeren totdat er geen luchtbellen meer in de spuitkolommen zichtbaar zijn. Sluit de gevulde spuiten aan op de spuitpompen met behulp van lower-lock connectoren.Gebruik de schakelklep die op de pompen is gemonteerd om de vloeistof vanuit de spuit naar een van de twee capillairen te leiden die leiden naar respectievelijk de MFP-kop of de vloeistofreservoirs. Spoel beide capillairen door met water uit de spuiten bij een stroomsnelheid van ongeveer 10 tot 50 µL per minuut, afhankelijk van de grootte van de spuit, totdat er ongeveer 10 µL water in de spuiten overblijft. Reinig de MFP-kop door middel van sonicatie gedurende vijf minuten met glaswarenreinigingsmiddel voor standaardreiniging, of 0,5% bleekmiddel voor een grondige reiniging.Spoel de kanalen door met water door de top in water te dompelen en een vacuüm aan te brengen op de via's. Inspecteer de kanalen onder een stereomicroscoop op mogelijke obstructies en herhaal de vorige stap indien nodig. Monteer vervolgens de gereinigde kop op de kophouder en schroef de connector op de kop.Plaats de gespoelde capillairen in een geschikte microfluïdische connectoradapter die aansluit op de kanaalopeningen in de kop. Schroef de kophouder vast aan de Z-stage, die wordt gebruikt voor de controle van de afstand tussen de kop en de cellaag, voordat de eindpuntkalibratie wordt uitgevoerd zoals beschreven in het tekstprotocol. Bepaal een ruwe nulafstand door de MFP-kop boven een chamber-slide zonder cellen te plaatsen en langzaam af te dalen in stappen van vijf micron.Zodra de probe het substraat raakt, moeten de ringen van Newton zichtbaar worden. Dit is een ruwe schatting. Een nauwkeurige positie wordt verkregen nadat de coplanariteit van de probe-apex ten opzichte van het substraat is aangepast.Zorg ervoor dat de Newton-ringen symmetrisch zijn zodra ze zijn gevormd. Om de coplanariteit van de probe-apex te waarborgen, dient de kanteling van de kop te worden aangepast met behulp van een goniometer op de interface tussen de kop en de Z-stage. Verplaats de MFP-kop 20 microns van het substraat weg en stel de kanteling in met de goniometer.Herhaal het neerlaten, het nulstellen en de kantelinstelling totdat de Newtonringen symmetrisch zijn bij contact. Wanneer de kanteling is ingesteld, stelt u de Z-positie, die symmetrische Newtonringen produceert, in op nul. Bereid vervolgens de verwerkingsvloeistof voor het binnenste injectiekanaal en de extractiebufferoplossing voor voor de buitenste injectie, zoals beschreven in het tekstprotocol.Gebruik de afvoerlijn die is verbonden met de spuitpompen om het resterende water te spoelen en zuig de ontgaste oplossingen bij 40 µL per minuut op in de injectiespuiten totdat deze vol zijn. Dit garandeert een belvrije vulling van de spuiten, connectoren en capillairen. Om de cellagen op chamber slides voor te bereiden, worden de cellen in T-flasks uitgebreid volgens standaard protocollen voor celkweek.Zodra de cellen in de kweekflessen confluent zijn, worden ze getrypsiniseerd en geoogst. Zaai 0,2 miljoen cellen per vierkante centimeter in elk van de tweekamer-slides voor het patroonvormen. Kweek de cellen gedurende 48 uur, waarbij de cellen in een van de kamers als controle dienen voor de celgroei en levensvatbaarheid.Zodra de cellen op de kamerdia's confluent zijn, worden de cellen 45 minuten geïncubeerd met 500 µL cell-tracker kleuringsoplossing met een concentratie van 10 µM, bereid in serumvrij medium. Dit wordt gedaan voor de visualisatie van de cellen tijdens het patroonproces. Was de gelabelde cellen met PBS door elke kamer voorzichtig door te spoelen met een pipet.Kweek de cellen vervolgens in medium aangevuld met serum voor de patroonexperimenten. De hydrodynamische stroombeperking lokaliseert vloeistoffen door middel van gelijktijdige injectie en aspiratie van een bewerkingsvloeistof. Bij hiërarchische beperking worden meerdere bewerkingsvloeistoffen ingesloten, waarbij de buitenste HFC het monster afschermt van de binnenste bewerkings-HFC.Verplaats de MFP boven de cellaag tot een afstand van 50 microns vanaf het glazen objectglas. Deze afstand garandeert contact van de hiërarchische HFC en houdt rekening met variaties in het oppervlak en de dikte van de cellaag. Injecteer natriumhydroxide met een snelheid van zes of acht µL per minuut via I-twee.Evalueer andere stroomsnelheden met behulp van de stroomregels in het tekstprotocol. Moduleer de grootte van de binnenste HFC door de verhouding van de injectiesnelheden QI-two en QI-one aan te passen met de injectiespuiten. Gebruik bijvoorbeeld een QI-one tussen 1,3 µL/min en 4 µL/min, waarbij QI-two vastgezet wordt op 8 µL/min, om een natriumhydroxide-voetafdruk van 150 tot 300 cellen te verkrijgen.Inject volledig medium via de buitenste openingen van de MFP-kop met een stroomsnelheid van 20 microliters per minuut om rekening te houden met de verdamping van het medium en aspiratie tijdens de werking van de hHFC. Om de cellagen te patroonvormen, stelt u de software van de tafel zo in dat de probekop over de cellaag scant in door de gebruiker gedefinieerde patronen met een scansnelheid van 10 microns per seconde en een tussenafstand van 50 microns. Scan, terwijl de geneste hHFC in werking is en in contact staat met de cellaag, de MFP langs het traject van het gewenste patroon om de gepatroneerde celverwijdering te bewerkstelligen.Zaai voor een cocultuur na de eerste verwijdering van het celtype een andere cellijn om de openingen op te vullen, zoals voorheen gedaan. Bereid het bemonsteringsstation voor de verdere analyse van het lysaat voor. Hier is een voorbeeld te zien van een bemonsteringsstation, bestaande uit een 3D-geprinte houder voor acht PCR-strips.Veeg de buishouder af met 70% ethanol of andere oppervlaktedecontaminatiemiddelen, afhankelijk van de gewenste strengheid voor de toepassing. Gebruik een magnetische clip op de buishouder om deze aan de substraathouder te bevestigen. Positioneer na het voorbereiden van het bemonsteringsstation de MFP-kop op 100 microns van de monolaag.Start de bediening van de hHFC met een 50 millimolaire natriumhydroxide-oplossing als verwerkingsvloeistof voor het binnenste injectiekanaal met een stroomsnelheid van één microliter per minuut voor QI-een, zes microliters per minuut voor QI-twee, minus-zeven microliters per minuut voor QA-een en minus-17,5 microliters per minuut voor QA-twee. Zodra de stroombeperking is gestabiliseerd, brengt u de probekop naar een spleetafstand van 50 microns om lokale lysis op basis van natriumhydroxide uit te voeren bij de gekozen subpopulatie cellen met de hHFC. Zodra de lysis van de subpopulatie is voltooid, richt u de kop naar de buizen in het bemonsteringsstation.Ejecteer het verzamelde lysaat rechtstreeks in de PCR-buisjes. Nadat het lysaat is verwerkt, zoals beschreven in het tekstprotocol, wordt het lysaat in een standaard qPCR-workflow geladen zoals vastgesteld door de leverancier van het instrument. Door de verhouding van de injectievloeistoffen in de hiërarchische HFC te beheersen, wordt de grootte van de footprint in contact met het celoppervlak gemoduleerd.De stroomsnelheden werden zodanig gekozen dat het chemische effect, in plaats van afschuiving, het dominante mechanisme voor cellyse is. Dit werd bevestigd door de afschuiving te bepalen met behulp van computationele vloeistofdynamica. Hier wordt de generatie van een raster van cel-eilandjes getoond door scanning-trajectprogrammering met de MFP.Modulatie van de grootte van de voetafdruk met behulp van de verhouding van de injectievloeistof maakt controle over de resolutie van de celverwijdering mogelijk. Deze methode kan worden gebruikt voor de sequentiële cocultuur van meerdere celpopulaties, waardoor complexe patronen van cel-celinteracties worden gegenereerd. Het gebruik van natriumhydroxide als bewerkingsvloeistof maakt het lysaat geschikt voor PCR-gebaseerde analyse van de cellen.Hier werd de DNA-inhoud gekwantificeerd van vijf en één footprint, gelyseerd met behulp van de beschreven methode. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in minder dan 30 minuten op cellen worden uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de kanalen en de capillairen vrij zijn van luchtbellen, aangezien dit de HFC nadelig kan beïnvloeden.Vergeet niet dat werken met natriumhydroxide, een corrosieve chemische oplossing, extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van een veiligheidsbril en een laboratoriumjas, tijdens het uitvoeren van deze procedure. Na deze procedure kunnen we cellen lokaal analyseren via immunokleuring of DNA-RNA-sequencing door MFP-gemedieerde lysis om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke eiwitten overgeëxpresseerd worden als gevolg van geometrische opsluiting van cellen. Na de ontwikkeling kan deze techniek de weg vrijmaken voor onderzoekers in het veld van de moleculaire biologie om inter- en extracellulaire signalering tijdens weefselgeneratie en -degeneratie te onderzoeken.Na het bekijken van deze video heeft u een goed begrip van hoe u cellagen die in MFP zijn opgezet, subtractief kunt patroonvormen voor lokale verwerking en hoe u complexe geometrieën van cocultures van cellen kunt maken.

rapid-subtractive-patterning-live-cell-layers-with-microfluidic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Beschrijven we een protocol voor de fabricage van microfluïdische apparaten die cel te vangen en cultuur kunnen inschakelen. In deze benadering patroon microstructuren, zoals groeven in microfluïdische kanalen worden gebruikt om lage shear stress regio's waarbinnen de cel kan dock te creëren.

Een microfluïdische apparaat met Groove patronen voor het bestuderen van Cellular Gedrag

In deze video presenteren we de microfluïdische...

De Microfluïdische Probe: Werking en gebruik voor plaatselijke Surface Processing

We een eenvoudige methode om microfluïdische inrichtingen kunnen toepassen soortgelijke dynamische omstandigheden meerdere verschillende stammen produceren zonder de noodzaak van een clean room of zachte lithografie.

Een microfluïdische apparaat voor het bestuderen van meerdere, afzonderlijke stammen

Source: Pioli, R., et al., Patterning of Microorganisms and Microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the method of capturing single fluorescently tagged Escherichia coli (E. coli) cells in microfluidic traps using a carbon-free suspension and controlled flow, followed by nutrient addition to trigger growth and fluorescence imaging of microcolonies.

Microfluidic Patterning and Fluorescence-Based Tracking of Single-Cell Bacterial Growth

In dit artikel presenteren we een microfluïdische chip voor single cell analyse. Het maakt de kwantificering van intracellulaire eiwitten, enzymen, cofactoren, en tweede boodschappers via fluorescentie assays of immunoassays.

Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen

We demonstreren een-microfluidics gebaseerde test om de termijn voor de cellen om de doorvoer te meten door middel van een opeenvolging van micron-schaal vernauwingen.

Een Microfluïdische Techniek om Cell Vervormbaarheid Probe

We tonen een microfluïdische platform met een geïntegreerde oppervlakte-elektrode netwerk resistieve pulse sensing (RPS) met code division multiple access (CDMA) combineert, om detectie en afmeting van deeltjes in meerdere microkanalen multiplexen.

Microfluïdische Platform met multiplexverzending elektronische detectie voor ruimtelijke Tracking van Deeltjes

Dit rapport beschrijft een eenvoudige, gemakkelijk uit te voeren techniek, met behulp van lagedrukvacuüm, om microfluïdische kanalen te vullen met cellen en substraten voor biologisch onderzoek.

Een veelzijdige methode van patroonvorming Eiwitten en cellen

De hier gepresenteerde methode maakt gebruik van micropatterning samen met kwantitatieve beeldvorming om de ruimtelijke ordening binnen de zoogdier culturen te onthullen. De techniek is gemakkelijk vast te stellen in een standaard laboratorium voor celbiologie en biedt een Tractable systeem om patronen in vitro te bestuderen.

De opkomende ruimtelijke ordening van zoogdiercellen in kaart brengen met behulp van micro patronen en kwantitatieve beeldvorming

We presenteren een methode voor het verkrijgen van fluorescentie reporter tijdcursussen van enkele cellen met behulp van micropatterned arrays. Het protocol beschrijft de voorbereiding van eencellige arrays, de installatie en werking van live-cell scanning time-lapse microscopie en een open-source beeldanalysetool voor geautomatiseerde voorselectie, visuele controle en tracking van celgeïntegreerde fluorescentietijdcursussen per adhesieplaats.

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - een veelzijdige techniek om cellulaire kinetiek te kwantificeren

We presenteren een technologie die capillariteitsondersteunde assemblage in een microfluïdisch platform gebruikt om microgrote objecten die in een vloeistof zijn gesuspendeerd, zoals bacteriën en colloïden, te modelleren in voorgeschreven arrays op een polydimethylsiloxaansubstraat.

Patroonvorming van micro-organismen en microdeeltjes door sequentiële capillariteitsondersteunde assemblage

Leer snelle subtractieve patroonvorming van levende celmonolagen met een microfluïdische probe. Deze methode maakt lokale cellyse mogelijk voor moleculaire profilering en real-time aanpassing van celpatronen.

Rapid Subtractieve patroonvorming van Live-Cell Lagen met een microfluïdische Probe

Meer video's verkennen