Rapid Subtractieve patroonvorming van Live-Cell Lagen met een microfluïdische Probe

Het primaire doel van de methode die in dit videoartikel wordt gepresenteerd, is om snel ruimtelijk gedefinieerde celpatronen te genereren om in-situ ruimte-tijdelijke analyse van cel-tot-cel-interacties mogelijk te maken. De gepresenteerde strategie maakt gebruik van de microfluïdische sondetechnologie. De microfabricage sondekop lokaliseert nanoliter volumes van biochemische stoffen op biologische substraten om celmonolagen te patroon.

Het belangrijkste voordeel van een MFP-gebaseerde patroontechniek is dat deze bijna onmiddellijk is, dankzij lokale lysis, waardoor real-time aanpassing van de te genereren patronen mogelijk is. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we merkten dat andere methoden om celpatronen te genereren lange, meertrapsprotocollen vereisen voordat de succes van de celpatronen daadwerkelijk worden gezien. Om stabiele experimenten uit te voeren met een hydrodynamische stromingsbeperking op een celoppervlak, moeten de MFP-parameters worden geoptimaliseerd.

Voor dit doel is visuele demonstratie van cruciaal belang. Aditya Kashyap en Julien Cors zullen deze procedure demonstreren. De operationele modules van het platform omvatten gemotoriseerde spuiten, gemotoriseerde trappen en een controller.

De MFP is verbonden met een gemotoriseerde Z-trap om de afstandsopening tussen de kop en het substraat te regelen, en de substraathouder is bevestigd aan de gemotoriseerde X- en Y-trappen die het scansysteem vormen. De MFP-kop heeft vloeistofdoorvoeren om verbinding te maken met de pompstation, montagegaten om de kop op de Z-trap te monteren en kanalen die uit de gepolijste apex komen. De apex is ingesteld coplanair met het celkweeksubstraat.

Om de pompstation en vloeistofbehandelingsapparaat voor te bereiden, reinig spuiten en spuitkolven door sonicatie en 0,5% bleekmiddeloplossing in ultrapuur water voor en na live-celexperimenten. Spoel ze grondig met water. Vul de spuiten met water door hun uiteinden volledig in een waterbad te dompelen en te aspireren met behulp van de zuiger.

Zuig het vocht af terwijl het in het waterbad is met de spuitschacht die contact maakt met de afdichting aan de uitgang van de spuit. Blijf aspireren en zuigen tot er geen luchtbellen meer in de spuitkolommen zijn. Verbind de gevulde spuiten met de spuitpompen met behulp van laagslotverbindingen.

Gebruik de schakelklep gemonteerd op de pompen om het vocht van de spuit naar een van de twee capillairen te leiden die leiden naar de MFP-kop of naar de vloeistofreservoirs. Zuig beide capillairen met water uit de spuiten af met een stroomsnelheid van ongeveer 10 tot 50 microliter per minuut, afhankelijk van de grootte van de spuit, tot er ongeveer 10 microliter water overblijft in de spuiten. Reinig de MFP-kop door sonicatie met behulp van glaswerkdetergent voor standaardreiniging, of 0,5% bleekmiddel voor strenge reiniging, gedurende vijf minuten.

Zuig de kanalen af met water door de apex in water te dompelen en een vacuüm toe te passen op de doorvoeren. Inspecteer de kanalen onder een stereomicroscoop op mogelijke obstakels en herhaal de vorige stap, indien nodig. Monteer vervolgens de gereinigde kop op de kophouder en schroef de connector op de kop.

Plaats de gezuigde capillairen in een geschikte microfluïdische connectoradapter die interface met de kanaaldoorvoeren in de kop. Schroef de kophouder op de Z-trap, die wordt gebruikt voor de controle van de afstandsopening tussen de kop en de celmonolaag, voordat u de eindkalibratie uitvoert zoals beschreven in het tekstprotocol. Verkrijg een ruwe nul-afstandsopening door de MFP-kop over een kamerslide zonder cellen te brengen en langzaam te dalen in stappen van vijf micrometer.

Bij contact van de sonde met het substraat, zouden Newton's ringen moeten worden waargenomen. Dit is een ruwe schatting. Een nauwkeurige positie moet worden verkregen na aanpassing van de coplanariteit van de sondetop naar het substraat.

Wanneer gevormd, zorg ervoor dat de Newton's ringen symmetrisch zijn. Om de coplanariteit van de sondetop te waarborgen, pas de kant van de kop aan met behulp van een goniometer op het kruispunt van de kop en de Z-trap. Verplaats de MFP-kop 20 micron van het substraat en pas de kant aan met behulp van de goniometer.

Herhaal de daling, nulstelling en kantcorrectie tot de Newton's ringen symmetrisch zijn bij contact. Met de aangepaste kant, stel de Z-positie in, die symmetrische Newton's ringen produceert, op nul. Bereid vervolgens de verwerkingsvloeistof voor voor de binnenste injectiekanaal en de extractiebufferoplossing die vereist is voor de buitenste injectie, zoals beschreven in het tekstprotocol.

Gebruik de afvoerleiding die is aangesloten op de spuitpompen, zuig het resterende water af en aspireer de ontgaste oplossingen in de injectiespuiten met 40 microliter per minuut totdat de spuiten vol zijn. Dit zorgt voor bellen-vrije vulling van de spuiten, connectoren en capillairen. Om de celmonolagen op kamerslides voor te bereiden, gebruik standaard celkweekprotocollen om cellen uit te breiden in T-flessen.

Bij het bereiken van celconfluëntie in de kweekflessen, trypsiniseren en verzamel cellen. Zaai 0,2 miljoen cellen per vierkante centimeter in elk van de twee-kamer slides voor patroon. Kweek de cellen gedurende 48 uur met behulp van de cellen in een van de kamers als controle voor celgroei en levensvatbaarheid.

Bij het bereiken van celconfluëntie op de kamerslides, incubeer de cellen gedurende 45 minuten met 500 microliter cel-tracker kleurstofoplossing met een concentratie van 10 micromolar, bereid in serumvrij medium. Dit wordt gedaan voor celvisualisatie tijdens patroon. Was de gelabelde cellen met PBS door elke kamer voorzichtig te spoelen met behulp van een pipette.

Kweek vervolgens de cellen in serum-aanvullend medium voor de patroonexperimenten. De hydrodynamische stromingsbeperking lokaliseert vloeistoffen door gelijktijdige injectie en aspiratie van een verwerkingsvloeistof. In de hiërarchische beperking worden meerdere verwerkingsvloeistoffen beperkt, waarbij de buitenste HFC het monster beschermt tegen de binnenste verwerkings-HFC.

Verplaats de MFP over de celmonolaag naar een afstandsopening van 50 micron van