Rapid Subtractieve patroonvorming van Live-Cell Lagen met een microfluïdische Probe

Het hoofddoel van de in deze video-artikel gepresenteerde methode is om snel ruimtelijk gedefinieerde celpatronen te genereren om in-situ spatiotemporele analyse van cel-celinteracties te faciliteren. De gepresenteerde strategie maakt gebruik van microfluïdische probe-technologie. De gemicrofabriceerde probekop lokaliseert nanolitervolumes van biochemische stoffen op biologische substraten om celmonolagen te patroonvormen.

Het belangrijkste voordeel van een MFP-gebaseerde patroontechniek is dat deze vrijwel onmiddellijk plaatsvindt dankzij lokale lysis, waardoor de te genereren patronen in realtime kunnen worden aangepast. We kregen het idee voor deze methode toen we merkten dat andere methoden voor het genereren van celpatronen lange, meerstaps protocollen vereisen voordat het succes van de celpatronen daadwerkelijk zichtbaar is. Om stabiele experimenten uit te voeren met een hydrodynamische stroombeperking op een celoppervlak, moeten de MFP-parameters worden geoptimaliseerd.

Hiervoor is een visuele demonstratie essentieel. Aditya Kashyap en Julien Cors zullen deze procedure demonstreren. De operationele modules van het platform bestaan uit gemotoriseerde spuiten, gemotoriseerde tafels en een controller.

De MFP is verbonden met een gemotoriseerde Z-stage om de afstand tussen de kop en het substraat te regelen, en de substraathouder is bevestigd aan de X- en Y-gemotoriseerde stages die het scanningsysteem vormen. De MFP-kop is voorzien van vloeistofdoorvoeren om verbinding te maken met het pompsysteem, montagegaten om de kop op de Z-stage te bevestigen en kanalen die uitmonden bij de gepolijste apex. De apex is coplanair ingesteld ten opzichte van het substraat voor celkweek.

Om het pompstation en de vloeistofbehandelingsapparatuur voor te bereiden, moeten de spuiten en spuitlevende zuigers vóór en na experimenten met levende cellen worden gereinigd door middel van sonicatie en een 0,5% bleekoplossing in ultrapuur water. Spoel ze grondig na met water. Vul de spuiten met water door de uiteinden volledig in een waterbad te dompelen en het water op te zuigen met de zuiger.

Verwijder de vloeistof terwijl deze zich in het waterbad bevindt, waarbij de schacht van de spuit de afdichting bij de uitgang van de spuit raakt. Blijf aspireren en purgeren totdat er geen luchtbellen meer in de spuitkolommen zichtbaar zijn. Sluit de gevulde spuiten aan op de spuitpompen met behulp van lower-lock connectoren.

Gebruik de schakelklep die op de pompen is gemonteerd om de vloeistof vanuit de spuit naar een van de twee capillairen te leiden die leiden naar respectievelijk de MFP-kop of de vloeistofreservoirs. Spoel beide capillairen door met water uit de spuiten bij een stroomsnelheid van ongeveer 10 tot 50 µL per minuut, afhankelijk van de grootte van de spuit, totdat er ongeveer 10 µL water in de spuiten overblijft. Reinig de MFP-kop door middel van sonicatie gedurende vijf minuten met glaswarenreinigingsmiddel voor standaardreiniging, of 0,5% bleekmiddel voor een grondige reiniging.

Spoel de kanalen door met water door de top in water te dompelen en een vacuüm aan te brengen op de via's. Inspecteer de kanalen onder een stereomicroscoop op mogelijke obstructies en herhaal de vorige stap indien nodig. Monteer vervolgens de gereinigde kop op de kophouder en schroef de connector op de kop.

Plaats de gespoelde capillairen in een geschikte microfluïdische connectoradapter die aansluit op de kanaalopeningen in de kop. Schroef de kophouder vast aan de Z-stage, die wordt gebruikt voor de controle van de afstand tussen de kop en de cellaag, voordat de eindpuntkalibratie wordt uitgevoerd zoals beschreven in het tekstprotocol. Bepaal een ruwe nulafstand door de MFP-kop boven een chamber-slide zonder cellen te plaatsen en langzaam af te dalen in stappen van vijf micron.

Zodra de probe het substraat raakt, moeten de ringen van Newton zichtbaar worden. Dit is een ruwe schatting. Een nauwkeurige positie wordt verkregen nadat de coplanariteit van de probe-apex ten opzichte van het substraat is aangepast.

Zorg ervoor dat de Newton-ringen symmetrisch zijn zodra ze zijn gevormd. Om de coplanariteit van de probe-apex te waarborgen, dient de kanteling van de kop te worden aangepast met behulp van een goniometer op de interface tussen de kop en de Z-stage. Verplaats de MFP-kop 20 microns van het substraat weg en stel de kanteling in met de goniometer.

Herhaal het neerlaten, het nulstellen en de kantelinstelling totdat de Newtonringen symmetrisch zijn bij contact. Wanneer de kanteling is ingesteld, stelt u de Z-positie, die symmetrische Newtonringen produceert, in op nul. Bereid vervolgens de verwerkingsvloeistof voor het binnenste injectiekanaal en de extractiebufferoplossing voor voor de buitenste injectie, zoals beschreven in het tekstprotocol.

Gebruik de afvoerlijn die is verbonden met de spuitpompen om het resterende water te spoelen en zuig de ontgaste oplossingen bij 40 µL per minuut op in de injectiespuiten totdat deze vol zijn. Dit garandeert een belvrije vulling van de spuiten, connectoren en capillairen. Om de cellagen op chamber slides voor te bereiden, worden de cellen in T-flasks uitgebreid volgens standaard protocollen voor celkweek.

Zodra de cellen in de kweekflessen confluent zijn, worden ze getrypsiniseerd en geoogst. Zaai 0,2 miljoen cellen per vierkante centimeter in elk van de tweekamer-slides voor het patroonvormen. Kweek de cellen gedurende 48 uur, waarbij de cellen in een van de kamers als controle dienen voor de celgroei en levensvatbaarheid.

Zodra de cellen op de kamerdia's confluent zijn, worden de cellen 45 minuten geïncubeerd met 500 µL cell-tracker kleuringsoplossing met een concentratie van 10 µM, bereid in serumvrij medium. Dit wordt gedaan voor de visualisatie van de cellen tijdens het patroonproces. Was de gelabelde cellen met PBS door elke kamer voorzichtig door te spoelen met een pipet.

Kweek de cellen vervolgens in medium aangevuld met serum voor de patroonexperimenten. De hydrodynamische stroombeperking lokaliseert vloeistoffen door middel van gelijktijdige injectie en aspiratie van een bewerkingsvloeistof. Bij hiërarchische beperking worden meerdere bewerkingsvloeistoffen ingesloten, waarbij de buitenste HFC het monster afschermt van de binnenste bewerkings-HFC.

Verplaats de MFP boven de cellaag tot een afstand van 50 microns vanaf het glazen objectglas. Deze afstand garandeert contact van de hiërarchische HFC en houdt rekening met variaties in het oppervlak en de dikte van de cellaag. Injecteer natriumhydroxide met een snelheid van zes of acht µL per minuut via I-twee.

Evalueer andere stroomsnelheden met behulp van de stroomregels in het tekstprotocol. Moduleer de grootte van de binnenste HFC door de verhouding van de injectiesnelheden QI-two en QI-one aan te passen met de injectiespuiten. Gebruik bijvoorbeeld een QI-one tussen 1,3 µL/min en 4 µL/min, waarbij QI-two vastgezet wordt op 8 µL/min, om een natriumhydroxide-voetafdruk van 150 tot 300 cellen te verkrijgen.

Inject volledig medium via de buitenste openingen van de MFP-kop met een stroomsnelheid van 20 microliters per minuut om rekening te houden met de verdamping van het medium en aspiratie tijdens de werking van de hHFC. Om de cellagen te patroonvormen, stelt u de software van de tafel zo in dat de probekop over de cellaag scant in door de gebruiker gedefinieerde patronen met een scansnelheid van 10 microns per seconde en een tussenafstand van 50 microns. Scan, terwijl de geneste hHFC in werking is en in contact staat met de cellaag, de MFP langs het traject van het gewenste patroon om de gepatroneerde celverwijdering te bewerkstelligen.

Zaai voor een cocultuur na de eerste verwijdering van het celtype een andere cellijn om de openingen op te vullen, zoals voorheen gedaan. Bereid het bemonsteringsstation voor de verdere analyse van het lysaat voor. Hier is een voorbeeld te zien van een bemonsteringsstation, bestaande uit een 3D-geprinte houder voor acht PCR-strips.

Veeg de buishouder af met 70% ethanol of andere oppervlaktedecontaminatiemiddelen, afhankelijk van de gewenste strengheid voor de toepassing. Gebruik een magnetische clip op de buishouder om deze aan de substraathouder te bevestigen. Positioneer na het voorbereiden van het bemonsteringsstation de MFP-kop op 100 microns van de monolaag.

Start de bediening van de hHFC met een 50 millimolaire natriumhydroxide-oplossing als verwerkingsvloeistof voor het binnenste injectiekanaal met een stroomsnelheid van één microliter per minuut voor QI-een, zes microliters per minuut voor QI-twee, minus-zeven microliters per minuut voor QA-een en minus-17,5 microliters per minuut voor QA-twee. Zodra de stroombeperking is gestabiliseerd, brengt u de probekop naar een spleetafstand van 50 microns om lokale lysis op basis van natriumhydroxide uit te voeren bij de gekozen subpopulatie cellen met de hHFC. Zodra de lysis van de subpopulatie is voltooid, richt u de kop naar de buizen in het bemonsteringsstation.

Ejecteer het verzamelde lysaat rechtstreeks in de PCR-buisjes. Nadat het lysaat is verwerkt, zoals beschreven in het tekstprotocol, wordt het lysaat in een standaard qPCR-workflow geladen zoals vastgesteld door de leverancier van het instrument. Door de verhouding van de injectievloeistoffen in de hiërarchische HFC te beheersen, wordt de grootte van de footprint in contact met het celoppervlak gemoduleerd.

De stroomsnelheden werden zodanig gekozen dat het chemische effect, in plaats van afschuiving, het dominante mechanisme voor cellyse is. Dit werd bevestigd door de afschuiving te bepalen met behulp van computationele vloeistofdynamica. Hier wordt de generatie van een raster van cel-eilandjes getoond door scanning-trajectprogrammering met de MFP.

Modulatie van de grootte van de voetafdruk met behulp van de verhouding van de injectievloeistof maakt controle over de resolutie van de celverwijdering mogelijk. Deze methode kan worden gebruikt voor de sequentiële cocultuur van meerdere celpopulaties, waardoor complexe patronen van cel-celinteracties worden gegenereerd. Het gebruik van natriumhydroxide als bewerkingsvloeistof maakt het lysaat geschikt voor PCR-gebaseerde analyse van de cellen.

Hier werd de DNA-inhoud gekwantificeerd van vijf en één footprint, gelyseerd met behulp van de beschreven methode. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in minder dan 30 minuten op cellen worden uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de kanalen en de capillairen vrij zijn van luchtbellen, aangezien dit de HFC nadelig kan beïnvloeden.

Vergeet niet dat werken met natriumhydroxide, een corrosieve chemische oplossing, extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van een veiligheidsbril en een laboratoriumjas, tijdens het uitvoeren van deze procedure. Na deze procedure kunnen we cellen lokaal analyseren via immunokleuring of DNA-RNA-sequencing door MFP-gemedieerde lysis om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke eiwitten overgeëxpresseerd worden als gevolg van geometrische opsluiting van cellen. Na de ontwikkeling kan deze techniek de weg vrijmaken voor onderzoekers in het veld van de moleculaire biologie om inter- en extracellulaire signalering tijdens weefselgeneratie en -degeneratie te onderzoeken.

Na het bekijken van deze video heeft u een goed begrip van hoe u cellagen die in MFP zijn opgezet, subtractief kunt patroonvormen voor lokale verwerking en hoe u complexe geometrieën van cocultures van cellen kunt maken.