Multimodaal Quantitative Fase Imaging met de Digitale Holografische Microscopie Beoordeelt Nauwkeurig darmontsteking en epitheliale wondheling

Het algemene doel van dit onderzoek is om digitale holografische microscopie of DHM te gebruiken om geautomatiseerde kleurvrije kwantitatieve fasecontrastbeelden te leveren van inflammatoire darmweefselmonsters voor de multi-modale beoordeling van epitheelwondgenezing in vitro. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van gastro-intestinale ontsteking en wondgenezing over de ziekteactiviteit ontstoken menselijke en mariene. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de detectie en kwantificering van cellen en weefsel door fysische parameters mogelijk maakt op een kleurvrije en objectieve manier. Het demonstreren van de procedures zal Fittest Ketelhut, een technicus, van het Biomedical Technology Center zijn.

Stel de celcultuur op, incubeer vier keer tien tot de vijfde, Caco twee cellen per centimeter vierkant in 35 millimeter petrischalen uitgerust met hoge cultuurinvoegingen in RPMI-medium aangevuld met FBS en antibiotica bij 37 graden Celsius in 95% vochtigheid en vijf procent koolstofdioxide. Behandel de cellen na twee dagen met het middel van belang en plaats de culturen weer in de incubator voor nog eens 24 uur. De volgende dag aspireert u het supernatant en gebruikt u een pincet om de invoegingen te verwijderen.

Was de cultuur één tot twee keer met één milliliter HEPES gebufferd celkweekmedium om eventuele dode cellen en overblijvende cellulaire componenten uit het wondgebied te verwijderen. Voeg vervolgens twee milliliter vers HEPES gebufferd medium toe en sluit de schaal. Plaats nu de petrischaal in de digitale holografische microscoop en selecteer het 10 x objectief.

Open de software voor beeldacquisitie en selecteer de modus voor helderveldbeelden. Stel de verwarmingskamer in op 37 graden Celsius en plaats de cultuur in de verwarmingskamer. Beweeg vervolgens het kijkveld totdat een geschikte wond met een enkele enorme cel laag en rechte randen aan beide zijden zonder dode cellen of serum kan worden gevisualiseerd in het live monitoring venster.

Maak een wit lichtbeeld van het initiële wondgebied. Draai vervolgens de witte lichtverlichting uit en selecteer de modus voor digitale holografische microscopie. Schakel de laserverlichting in en selecteer een belichtingstijd van minder dan drie milliseconden voor de hologramopname.

Als de holografische off-access interferentielijnen met een adequate contrast verschijnen, maakt u een steekproefhologram en reconstrueert u een kwantitatief fasebeeld met de reconstructiesoftware om de beeldkwaliteit te controleren. Begin vervolgens met een tijdsverlopen DHM observatie van de wond, stop de opname bij het juiste eindpunt en verkrijg een laatste beeld van het monster onder wit lichtverlichting. Voor Acute Dextran Sodium Sulfaat, of DSS colitis inductie, bied drie gram DSS opgelost in 100 milliliter gesteriliseerde water aan muizen ablibidim.

Na zeven dagen verkrijgt u zeven micrometer dikke secties van Zwitsers opgerolde colon monsters van de controle- en behandelde dieren. Dompel elke sectie in 50 tot 100 microliters PBS en dek de monsters af met afzonderlijke glazen deksels. Bevestig dat de bodems van de dia's vrij zijn van stof en andere verontreinigingen.

Plaats vervolgens de eerste dia op het microscoopplatform en pas het gezichtsveld aan tot het weefselgebied van belang zichtbaar is. Breng het monster scherp in focus en maak een helderveldbeeld in de software voor beeldacquisitie. Selecteer vervolgens de DHM-beeldmodus en schakel over naar de laserlichtverlichting.

Stel een belichtingstijd in van minder dan drie milliseconden en bevestig dat de holografische off-access interferentielijnen met een adequate contrast in het live beeldvenster verschijnen. Maak vervolgens een digitaal hologram van het weefsel. Endoscopisch omvat het bewijs van matige tot ernstige colitis verdikking van de colonwand, veranderingen van het vasculaire patroon, vezel neduoties, en oppervlaktegranulariteit van de mucosa.

Conventionele histologische evaluatie van de colon secties toont een duidelijke oedeem in de colonwand van DSS behandelde versus de controle dieren, voornamelijk gelokaliseerd in de submucosa. Overeenkomstige kwantitatieve DHM fasecontrastbeelden en gerelateerde brekingsindex kaarten tonen ook aan dat deze weefselveranderingen zonder zichtbare verschillen in de dichtheden van epitheelmenstroma vooral duidelijk zijn in de niet-gekleurde weefselmonsters. De brekingsindex is significant verminderd in het epitheel, submucosa en stroma van de colitische muizen in vergelijking met de gezonde controles met een significante correlatie tussen de relatieve verlies van lichaamsgewicht en de brekingsindex in de experimentele dieren.

Hier wordt de representatieve continue monitoring van een wondgenezingsassay door digitale holografische microscopie over 45 uur getoond. Door de berekeningen van het celbedekte oppervlaktegebied, gemiddelde celdikte en cellulaire droge massa gedurende het genezingsproces mogelijk te maken. We hebben aangetoond dat DHM continue monitoring van epitheel wondgenezing mogelijk maakt terwijl het tegelijkertijd bio-kerninformatie levert over cytokine-geïnduceerde celveranderingen.

Bovendien demonstreren we de nauwkeurige beoordeling van histologisch schade in colitis modellen en menselijke colonweefselmonsters door DHM door meting van veranderingen in de brekingsindex. Aangezien DHM gebaseerd is op de detectie van de optische padlengtevertraging, kunnen absolute biofysische parameters, zoals weefseldichtheid, droge massa of cellulaire dikte, worden geanalyseerd door kleurvrije kwantitatieve fasecontrastbeeldvorming. De combinatie van DHM met gangbare onderzoeksmicroscopen en de robuustheid van de techniek baant de weg voor routinetoepassingen van deze methode in celbiologie en digitale pathologie.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u digitale holografische microscopie kunt gebruiken voor de analyse van weefsels van levende celculturen in de biomedische laboratoriumomgeving. Concluderend creëert DHM een waardevol, nieuw en kwantitatief hulpmiddel voor de beoordeling van absolute ontstekingsparameters, evenals voor de vereenvoudigde kwantificering van epitheel vrijwillig in vitro met een groot potentieel voor translationeel diagnostisch gebruik.