Name: Multimodaal Quantitative Fase Imaging met de Digitale Holografische Microscopie Beoordeelt Nauwkeurig darmontsteking en epitheliale wondheling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Leer digitale holografische microscopie voor kwantitatieve beeldvorming van darmontsteking en epitheliale wondheling in Caco-2-cellen en colontweefsel. Deze kleurvrije methode biedt objectieve analyse van fysische celparameters.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Faekah Gohar voor het correct lezen van het manuscript. We danken Sonja Dufentester en Elke Weber voor deskundige technische assistentie.

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de regionale toetsingscommissie (het Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, Duitsland) volgens de Duitse Animal Protection Law. De lokale ethische commissie van de Universiteit van Münster keurde het gebruik van menselijke weefsels voor histologische en microscoop analyse. 1. Dieren en Materialen <ol><li> Gebruik vrouwelijke of mannelijke muizen van de vereiste DSS-gevoelige stam die wegen 20 tot 25 g, en het huis volgens de plaatselijke verzorging van dieren wetgeving. Zorg voor speciale chow voor knaagdieren en geautoclaveerd drinkwater ad libitum. </li><li> Induceren acute DSS colitis door toedienen 3% w / v dextran sulfaat natrium (DSS, molecuulgewicht: 36,000-50,000 Da) in geautoclaveerd kraanwater gedurende 5 dagen. LET OP: De potentie van DSS is zeer variabel, afhankelijk van de fabrikant en batch. Test uw-leverancier verstrekt DSS eerste voor de inductie van de ziekte-activiteit, waarvoor daily lichaamsgewicht is een betrouwbare en objectieve indicator. </li><li> Voor histologische evaluatie van colon weefselmonsters, euthanaseren muizen door CO 2 insufflatie (of welke door nationale en institutionele richtlijnen) aan het einde van het experiment. </li></ol> 2. experimentele opstelling voor DSS-colitis en In-vitro Wound Healing Testen <ol><li> Celcultuur en oprichting van wondgenezing assay. <ol><li> Kweek Caco-2-cellen in een vochtige 95% en 5% CO2 omgeving bij 37 ° C. Gebruik RPMI medium met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine. </li><li> Zaad Caco-2-cellen bij een dichtheid van 4 x 10 5 cellen / cm2 op 35 mm petrischalen met hoge cultuur-inzetstuk (zie figuur 4A). LET OP: Het insert genereert twee cel bedekt gebieden die met een bepaalde cel vrije ruimte die de gewonde gebied te analyseren zijn gescheiden. </li><li> Verander medium twee dagen na seeding. Uitvoeren door eerst resterende medium met celafval afzuigen met behulp van een automatische pipet, spoelen met 100 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) vervangen door vers RPMI medium of medium-serum beroofd. </li><li> Kweekcellen voor 24 uur in serum onthouden medium (0,1% FBS) aangevuld met 20 ng EGF / ml serum of 2 ug mitomycine c / ml serum wordt aangetast wondgenezing activiteiten op te sporen. Voeg normaal RPMI medium met controle cellen gedurende 24 uur. </li><li> Na 24 uur van de cultuur, te verwijderen en gooi cultuur inserts zoals beschreven in stap 3.4 en het uitvoeren van DHM. </li></ol></li><li> Inductie van acute DSS colitis <ol><li> Los 3 g DSS in 100 ml geautoclaveerd water om 3% te krijgen (w / v) oplossing DSS. Zorg voor deze oplossing in plaats van drinkwater aan muizen ad libitum gedurende 7 dagen. Bereken 5 ml van DSS-oplossing per muis / dag. Zorg voor geautoclaveerd water zonder DSS voor controle muizen ad libitum. </li></ol></li><li> Bereiding van cryostatic delen van muis en humane colon<ol><li> Euthanaseren muizen door CO 2 insufflatie aan het einde van het experiment. </li><li> Ontleden de buik van de dieren door laparotomie 23. Verwijder de gehele dikke darm voorzichtig met een pincet en snijd de ileale en rectale end met behulp van chirurgische schaar. Snijd de dikke darm met een schaar lengterichting van de blindedarm naar de rectale uiteinde en open de colon. Verwijderen uitwerpselen uit het monster met een pincet, gevolgd door wassen met PBS 24. </li><li> Bereid Zwitserse rollen door het oprollen van de gehele dikke darm met een katoenen lengterichting knop van de blindedarm naar de rectale einde met het slijmvlies naar binnen gebogen. Insluiten colon monsters optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding en blijven ingevroren bij -80 ° C tot verder gebruik. </li><li> Insluiten menselijke colon weefsel van chirurgische specimen optimale snijtemperatuur oktober verbinding blijven en ingevroren bij -80 ° C tot verder gebruik. </li><li> Cut secties van 7 urn dikte van de oktober-verbinding ingebedde monsters met de hulp van een cryotome enkel voorafgaand aan het onderzoek. NB: De optimale dikte van de monsters is afhankelijk van de persistentie en de verstrooiing eigenschappen van het type weefsel dat onderzocht. Voor de beschreven experimenten met colonweefsel, plakdikte&gt; 10 urn veroorzaken aanzienlijke toename van ruis door lichtverstrooiing kwantitatief DHM fasecontrastbeelden, terwijl monsters met een dikte &lt;5 urn hebben een hogere kans op beschadiging geïnduceerde artefacten uit het cryo snijproces. </li><li> Transfer secties op een glazen carrier object dia. </li></ol></li></ol> 3. Technische apparatuur, software en procedures voor acquisitie en evaluatie van Digital Hologrammen <ol><li> Digitale holografische microscoop voor kwantitatieve cellen en weefsel imaging <ol><li> Gebruik een off-as Mach-Zehnder digitale holografische microscopie voor live cell imaging 25, zie figuur 1. Controleer of de microscoop is uitgerust met een10X microscoop lens, een microscoop podium met een houder voor glazen objectdrager objectglaasjes en petrischalen met een diameter van 35 mm, een droogstoof fysiologische temperatuur op 37 ° C en software voor kwantitatieve fase beeldvorming 25 behouden. Opmerking: Zoals bijvoorbeeld beschreven in Kemper et al 26 en Langehanenberg et al 27... OPMERKING: Of gebruik een soortgelijk systeem dat kan uitvoeren helderveld microscopie en kwantitatieve fase beeldvorming van levende cellen en weefsels dia ontleed is. </li><li> Schoon microscooplens en koeler met lensreinigingspapier en een reinigingsmiddel (bijvoorbeeld ethanol) zoals aanbevolen door de fabrikant van de microscoop stof of andere verontreinigingen te verwijderen. </li><li> Start het beeld acquisitie software van de DHM microscoop, selecteer &quot;bright field&quot; imaging-modus en switch &quot;op&quot; wit licht verlichting. Zorgen voor Köhler-verlichtinatie van het monster zoals aanbevolen door de fabrikant microscoop met inachtneming van het monster in de live-imaging venster van het beeld acquisitie software (als alternatief een standaard afbeelding acquisitie software kan worden gebruikt in deze stap). OPMERKING: De beeldintensiteit moet homogeen verdeeld in het gezichtsveld en de monsterpositie mag niet bewegen bij optische heroriëntatie met de focus aandrijving van de microscoop. </li><li> Selecteer &quot;DHM&quot; imaging-modus, zet &quot;off&quot; wit licht verlichting en schakelaar &quot;aan&quot; het laserlicht. Controleer of de belichting met laserlicht homogeen is (dat wil zeggen, dat de lichtintensiteit homogeen verdeeld in de live-imaging raam van de imaging-acquisitie software van de DHM microscoop) en constateren dat de off-as carrier interferentierand patroon lijkt met voldoende contrast in de vastgelegde beelden (digitale hologrammen). </li></ol></li><li> Bereiding van cryostaat secties voor beeldvormingmet DHM <ol><li> Neem het monster (cryostaatsectie op een glazen objectdrager en een dikte van 7 urn, zoals beschreven in 2.3) uit de vriezer. Ontdooi het monster gedurende ongeveer 5 minuten bij kamertemperatuur en normale atmosfeer. </li><li> Voeg 50-100 pl fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor de inbedding op de weefselsectie met een pipet totdat deze volledig bedekt met buffer. Bedek het monster met een schone glazen afdekplaat slip (glasdikte 170 pm). OPMERKING: Over-drogen kan sterk veranderen de brekingsindex en verstrooiing eigenschappen van het monster te induceren. </li><li> Controleer of de bodem van de glazen drager en het dekglaasje worden gereinigd van stof en andere verontreinigingen die lichtverstrooiing kan veroorzaken. Het monster is klaar voor onderzoek met heldere veld microscopie en DHM. </li></ol></li><li> Kwantitatieve fase beeldvorming van weefsel secties met DHM <ol><li> Schakel de digitale holografische microscoop, kies de 10X microscoop lens voor de beeldvorming. Start de image acquisitie software van de DHM microscoop en selecteer heldere bestand imaging-modus. </li><li> Plaats het weefsel dia zoals beschreven in 2) in de microscoop diahouder, met het deksel slip tegenover de microscoop doelstelling. </li><li> Switch &quot;op&quot; de heldere veld verlichting van de DHM microscoop. Plaats het monster met de microscoop podium en ervoor te zorgen dat het weefsel gebied van belang is zichtbaar in het live bewaking venster. Het verbeteren van de scherpte van het beeld met behulp van de microscoop focus rijden. OPMERKING: Naast het interessegebied, dient een gebied van dia zonder weefsel ook in het gezichtsveld worden. </li><li> Leg een heldere veld afbeelding van de scherp monster met behulp van het beeld acquisitie software. </li><li> Selecteer &quot;DHM&quot; imaging-modus, zet &quot;off&quot; het witte licht verlichting en &quot;aan&quot; het laserlicht verlichting. Selecteer de &quot;exposure time&quot; voor hologram opname onder de 3 msec, constateren dat holographic off-axis interferentie franjes verschijnen met voldoende contrast in de live-imaging raam van de imaging-acquisitie software en het veroveren van een digitaal hologram. </li><li> Herhaal stap 3.3.3 - 3.3.5 totdat er een voldoende aantal heldere veld beelden en digitale hologrammen van verschillende sample gebieden zijn opgenomen. Hologram overname is nu voltooid. </li></ol></li><li> Bereiding van wondheling assays voor DHM beeldvorming <ol><li> Schakel de petrischaal verwarmingskamer van de DHM microscoop ongeveer 1-3 uur voor aanvang van het experiment te waarborgen stabiele temperatuur tijdens de metingen DHM. </li><li> Bereid werkbank met de gewenste uitrusting (petrischaal voor wondgenezing assay wordt beschreven in 2.3): pipetten, pincet, glazen deksel petrischaal, 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) gebufferde celkweekmedium met fysiologische temperatuur (37 ° C) gedurende voorbehandeling steriele omgeving. LET OP: </strong&gt; Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) bestaat uit 10% foetaal kalf serum (FCS), 20 mM HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur) en 850 mg / l NaHCO3. </li><li> Verwijder het plastic deksel van de petrischaal en verwijder het celkweekmedium met een pipet. Verwijder het inzetstuk uit de petrischaal bodem met een pincet. </li><li> Was het monster 1-2 maal met 1 ml HEPES gebufferd celkweekmedium om dode cellen en de resterende cellulaire componenten (bijvoorbeeld serum) in de wond gebied te verwijderen. Voeg 2 ml HEPES gebufferd celkweekmedium en dop de petrischaal met de glazen deksel. </li><li> Controleer of de glazen deksel en de bodem petrischaal werden ontdaan van stof en andere verontreinigingen. Monster is klaar voor time lapse observatie met DHM. </li></ol></li><li> Continue multimodale controle van de wondgenezing in vitro met DHM <ol><li> Schakel de petrischaal verwarmingskamer van de DHM microscoop ongeveer 1-3 uur voorafgaandde start van het experiment te waarborgen stabiele temperatuur tijdens de metingen DHM. </li><li> Switch &quot;op&quot; de digitale holografische microscoop, selecteer de 10X microscoop lens voor de beeldvorming. Start het beeld acquisitie software van de DHM microscoop en selecteer &quot;helder gebied&quot; imaging-modus. Controleer of de verwarmingskamer voor de petrischaal werkt een fysiologische temperatuur (37 ° C). </li><li> Plaats de petrischaal met wondgenezing assay, bereid zoals in 4) in de verwarmingskamer van de DHM microscoop. </li><li> Selecteer helderveld imaging-modus en de positie van het monster met de microscoop podium, terwijl het waarnemen in de live bewaking raam van het beeld acquisitie software van de DHM microscoop. Merk op dat het gewenste gebied van het monster scherp scherp is onder wit licht verlichting. </li><li> Leg heldere veld beelden van verschillende delen van het monster (wond en de omliggende gebieden met samenvloeiende cellen) onder witlicht verlichting met het beeld acquisitie software en documenten uiterlijk, celdichtheid en homogeniteit. </li><li> Selecteer &quot;bright field&quot; imaging-modus van de DHM microscoop. Kies een geschikte wond gebied onder wit licht verlichting in de live bewaking venster met het beeld acquisitie software van de DHM microscoop. Zorg ervoor dat de wond gebied is vrij van dode cellen en geen serum overblijfselen, en ervoor te zorgen dat beide zijden zijn voorzien van een enkele homogene cellaag, bij voorkeur met rechte randen. </li><li> Het veroveren van een wit licht beeld van de oorspronkelijke wond gebied in heldere field imaging-modus met het beeld acquisitie software van de DHM microscoop. </li><li> Turn &quot;off&quot; wit licht verlichting, selecteer &quot;DHM&quot; mode en switch &quot;op&quot; laser verlichting. Selecteer een belichtingstijd van 3 hieronder msec hologramopname (constateren dat holografische as af interferentiebanden verschijnen voldoende contrast in het levende beeldvorming raam van de beeldacquisitie software tHij DHM microscoop) en het veroveren van een digitaal hologram. </li><li> Leg een monster hologram in DHM-modus met het beeld acquisitie software en reconstrueren van een beeld kwantitatieve fase met de reconstructie software van de DHM microscoop om de beeldkwaliteit te controleren. </li><li> Kies een geschikte tijdvertraging (bv 3-5 min) voor time-lapse hologram overname met het beeld acquisitie software van de DHM microscoop. </li><li> Selecteer de time-lapse overname modus van de afbeelding acquisitie software waarin het monster alleen met laserlicht wordt verlicht tijdens het hologram acquisitie. </li><li> Start de time-lapse DHM observatie van de wondgenezing assay. </li><li> Stop de time-lapse acquisitie na de beoogde tijd in, selecteer helderveld imaging-modus en documenteren van de uiteindelijke verschijning van het monster onder wit licht imaging. </li></ol></li><li> Reconstrueren digitale hologrammen van ontleed weefsel en bepaal de gemiddelde brekingsindex als parameter te kwantificerenweefsel dichtheid <ol><li> Reconstrueren kwantitatieve fase beelden van digitale hologrammen van ontleed weefsel met de software van de DHM microscoop, bijvoorbeeld zoals beschreven in Kemper et al. 26 en Langehanenberg et al. 27. </li><li> Bepaal de gemiddelde fase contrast Δφ in verschillende weefsel lagen (epitheel, submucosa, stroma) in geschikt gekozen regio&#39;s van belang (ROI) 19. </li><li> Bepaal de brekingsindex van het inbeddingmedium door een refractometer of als alternatief met behulp van een juiste waarde in de literatuur. (brekingsindex waarden voor typische inbedding media: n water = 1,334 28, n fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) = 1,337 29, n celkweekmedium = 1,337-1,339 29,30). </li><li> Bereken de brekingsindex van verschillende weefsel lagen van de gemiddelde fase contrast waarden 19 <img alt="vergelijking 1"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54460 / 54460eq1.jpg&quot; /&gt; (1) NB: In Eq. 1 λ de golflengte van het laserlicht (hier: λ = 532 nm), d de dikte van de ontleed weefsel (hier: 7 urn) en n medium is de brekingsindex van het inbeddingsmedium (hier: n medium = n PBS = 1,337, bepaald door een Abbe-refractometer). </li></ol></li><li> Reconstrueren en digitale hologrammen evalueren van de time-lapse wondgenezing serie observatie <ol><li> Reconstrueren kwantitatieve fase beelden van de time lapse hologram serie verkregen tijdens wondgenezing observatie met de microscoop DHM software 26,27. </li><li> Normaliseren elke reeks kwantitatieve fase beelden naar de afbeelding met een maximale fase contrast. </li><li> Bepaal het oppervlak Sc dat wordt gedekt door de cellen in de kwantitatieve DHM fasebeelden door beeldsegmentatie Dit kunnen pergevormd met behulp van de gratis software cel profiler (www.cellprofiler.org 31). </li><li> Bereken de gemiddelde fasecontrast van de cellen Δφ cel in het gebied Sc. </li><li> Haal de cellulaire drooggewicht DM uit de gemiddelde fase contrast Δφ cel in het gebied S c 15 <img alt="vergelijking 2" src="/files/ftp_upload/54460/54460eq2.jpg" /> (2) Opmerking: In Vergelijking 2 DM geeft de cellulaire drooggewicht, Sc presenteert het gebied dat wordt ingenomen door de cellen en α = 0,002 m 2 / kg. </li><li> Bepaal de integrale cellulaire brekingsindex n cel en de brekingsindex van het celkweekmedium n medium. Bepaal n cel afzonderlijk experimenteel van gesuspendeerde cellen, zoals beschreven in 30 en meet n medium met een refractometer. Alternatief gebruiken literatuur waarden voor n cel 30 en n gemiddeld 29,30. </li><li> Bereken de gemiddelde cel dikte d cel λ, Δφ cel, n cel en n gemiddeld 26,32 <img alt="vergelijking 3" src="/files/ftp_upload/54460/54460eq3.jpg" /> (3) NB: In Eq. 3 de parameter d cel de gemiddelde celdikte, λ duidt de licht golflengte van het laserlicht, Δφ cel staat voor de gemiddelde fasecontrast en n cel en n medium zijn de integrale cellulaire brekingsindex en de brekingsindex van het omringende medium. </li></ol></li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We laten zien dat DHM zorgt voor een nauwkeurige evaluatie van de histologische schade in muizen colitis modellen en colon weefselmonsters menselijk ex vivo. Verder hebben we aangetoond DHM kan continu monitoren epitheliale wondgenezing en tegelijkertijd multimodale informatie over cellulaire veranderingen. In DHM, is de reconstructie van digitaal vastgelegde hologrammen numeriek 32 uitgevoerd. Daarom is in vergelijking met helderveld microscopie, Zernike fase contrast en differentieel interferentie ...

Inflammatoire darmziekte (IBD), dat wil zeggen, colitis ulcerosa (UC) en de ziekte van Crohn (CD) zijn idiopathische inflammatoire aandoeningen van het maagdarmkanaal 1. Onderzoek naar de onderliggende pathofysiologie van IBD en de evaluatie van potentiële nieuwe geneesmiddelen of nieuwe diagnostische benaderingen is bijzonder belangrijk. In zowel fundamenteel onderzoek en de klinische behandeling van IBD patiënten, heeft het darmslijmvlies een aandachtspunt 2,3 geworden. De mucosa vertegenwoordigt een anatomische grens, waarbij de interactie tussen commensale bacteriën, epitheelcellen en diverse cellulaire componenten van het immuunsysteem intestinale homeostase 4,5 orkestreren darm. Echter, in IBD patiënten, ongecontroleerde en hardnekkige darmontsteking leidt tot schade, detecteerbaar als zweren of stenose, die uiteindelijk kan leiden tot afbraak van epitheliale barrièrefunctie, die zelf verergert lokale ontsteking 6 mucosale. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; epitheliale wondheling is daarom cruciaal voor epitheliale regeneratie na de ontsteking, maar is ook een basisvereiste voor de genezing van gastro-intestinale ulcera of naadlekkage na gastro-intestinale chirurgie 7. Epitheliale wondgenezing kan worden gesimuleerd in in vitro assays en wondgenezing in muismodellen van darmontsteking 8,9. Zowel in vitro als in vivo benaderingen hebben nadelen, die de nauwkeurigheid van de experimentele evaluatie beperken. In vitro assays, zoals klassieke scratch testen vereisen langdurige kleuring procedures of transfectie met fluorescerende chromoforen. Ze worden vaak beperkt door hun discontinue controle van celproliferatie en migratie die niet kan worden geautomatiseerd 10. In vivo modellen, zoals dextran natrium sulfaat (DSS) geïnduceerde colitis, vaak niet robuust uitlezen, mede door de grote variatie gezien in het laboratorium markers, making dergelijke markers ongeschikt colitis ernst 11,12 evalueren. Histologische analyse van het ontstoken slijmvlies is nog steeds de meest valide benadering colitis ernst bepalen, maar dit, zoals in vitro epitheliale wondgenezing assays vereist kleuring en is afhankelijk onderzoeker kennis 13. Onlangs digitale holografische microscopie (DHM), een variant van kwantitatieve fase microscopie 14, werd geïdentificeerd als nuttig hulpmiddel voor de beoordeling van epitheliale wondgenezing in vitro en in vivo 15. DHM kan een oordeel weefseldichtheid door het meten van optische weglengte vertraging (OPD) , die de vooruitzichten roman kankerdiagnose 16-18 en kwantificering van ontsteking gerelateerde weefsel veranderingen 19. Daarnaast DHM zorgt voor de opvolging van de morfologie van de cel dynamiek door het bepalen cel dikte, mobiele overdekte oppervlakte en intracellulaire (eiwit) gehalte hoeveelheid <sup&gt; 15,20. In in vitro testen, DHM maakt ook de analyse van fysiologische processen, bijvoorbeeld cellulaire waterpermeabiliteit door het evalueren van veranderingen in celvolume en dikte 21,22. Bovendien kunnen DHM metingen worden geautomatiseerd die-onderzoeker verbonden steekproef vertekening voorkomt. Hier tonen we het gebruik van DHM in een muizenmodel van darmontsteking en ook DHM gelden voor analyse van menselijke weefsels monsters voor kwantitatieve controle van wondgenezing als label-free in vitro assay. Ten eerste, we evalueren inflammatoire veranderingen van verschillende colon muur-lagen in colitic muizen en secties weefsel van mensen met IBD. Na een beschrijving van de DHM kwantitatieve fase imaging procedure, bieden we gedetailleerde instructies voor het gebruik van de microscoop componenten, de voorbereiding van het weefsel secties en beschrijven ook de evaluatie van de verworven kwantitatieve fase beelden. Vervolgens laten we zien dat DHM uti kan wordenseerd voor continue multimodale monitoring van epitheliale wondheling in vitro, en beschrijven de analyse van cellulaire kenmerken zoals mobiele laagdikte drooggewicht en cellulaire volume geven inzicht in geïnduceerde drug en fysiologische cel veranderingen.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azoxymethane (AOM)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>A5486</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Flask</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>Costar Stripette</td><td>Corning Inc., New York, USA</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulphate sodium (DSS)</td><td>TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden</td><td>DB001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12</td><td>PAA Laboratories - Pasching - Austria</td><td>E15-813</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>SPR3196</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>E 9884</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 50 ml</td><td>BD Biosciences, Erembodegem, Belgium</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane (2-Methylbutane)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>M32631-1L</td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1159430025</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>M4287</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>G. Menzel, Braunschweig, Germany</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Tissue Tek compound&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Sakura, Zoeterwonde, Netherlands</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep/Amphotericin B</td><td>Lonza, Verviers, Belgium</td><td>1558</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline, PBS</td><td>Lonza, Verviers, Belgium</td><td>4629</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza, Verviers, Belgium</td><td>3626</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride 0.9%</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>5/12211095/0411</td><td></td></tr><tr><td>Standard diet</td><td>Altromin, Lage, Germany</td><td>1320</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, Leiden, Netherlands</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Lonza, Verviers, Belgium</td><td>7815</td><td></td></tr><tr><td>Vitro &ndash; Clud</td><td>R. Langenbrinck, Teningen, Germany</td><td>04-0002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&micro;-Dish 35 mm with Culture-Insert, high</td><td>ibidi GmbH, Munich, Germany</td><td>81176</td><td></td></tr><tr><td>DIC Lid for &micro;-Dishes, with a glass insert</td><td>ibidi GmbH, Munich, Germany</td><td>80050</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROM HM550</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA</td><td>46320</td><td></td></tr><tr><td>Digital holographic microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Component</td><td>Model</td><td>Company</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>iMIC</td><td>Till Photonics, Graefelfing, Germany</td><td></td></tr><tr><td>Laser</td><td>Compass 315M</td><td>Coherent GmbH, Luebeck, Germany</td><td></td></tr><tr><td>Microscope lens</td><td>Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3</td><td>Zeiss, Goettingen, Germany</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>DMK 41BF02</td><td>The Imaging Source, Bremen, Germany</td><td></td></tr></tbody></table>

multimodaal quantitative fase imaging met de digitale holografische microscopie beoordeelt nauwkeurig darmontsteking en epitheliale wondheling

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

De incidentie van inflammatoire darmziekte, dat wil zeggen, de ziekte van Crohn en Colitis ulcerosa, is sterk toegenomen in het afgelopen decennium. De etiologie van IBD onbekend blijft en Huidige therapeutische strategieën gebaseerd op de niet-specifieke onderdrukking van het immuunsysteem. De ontwikkeling van behandelingen die specifiek darmontsteking en epitheliale wondgenezing zou een belangrijke beheer van IBD, maar dit vereist een nauwkeurige detectie van inflammatoire veranderingen. Momenteel worden potentiële kandidaat-geneesmiddelen meestal geëvalueerd met behulp van diermodellen in vivo of met celkweek gebaseerde technieken in vitro. Histologisch onderzoek vereist meestal de cellen of weefsels van belang te worden gemerkt, dat het monster kenmerken kunnen veranderen en bovendien kan de interpretatie van de resultaten verschillen per onderzoeker deskundigheid. Digitale holografische microscopie (DHM), gebaseerd op de detectie van optische weglengte vertraging maaktvlek-free kwantitatieve fase contrast beeldvorming. Hierdoor kan de resultaten direct worden gecorreleerd met absolute biofysische parameters. We zien hoe het meten van veranderingen in weefseldichtheid met DHM, op ​​basis van brekingsindex meting kan inflammatoire veranderingen kwantificeren zonder kleuring in verschillende lagen van dikke weefselmonsters van muizen en mensen met colitis. Daarnaast tonen we continue multimodaal label-free monitoring van epitheliale wondheling in vitro, mogelijk met behulp van DHM door het eenvoudige geautomatiseerde bepaling van de gewonde gebied en de gelijktijdige bepaling van de morfologische parameters zoals droge massa en laagdikte van migrerende cellen. Concluderend DHM een waardevolle, nieuwe en kwantitatieve hulpmiddel voor de beoordeling van darmontsteking met absolute waarden van parameters mogelijk vereenvoudigd kwantificering van epitheliale wondgenezing in vitro en daarom aanzienlijk kunnen bijdragen translationele diagnostische use.

Typische Setup voor DHM Imaging voor Digitale Holografische Microscopie (DHM) Om helderveld imaging en kwantitatief fasecontrast DHM uitvoeren, pasten we een omgekeerde microscoop zoals in figuur 1 B. Het systeem werd gemodificeerd door het aanbrengen van een DHM module, zoals eerder 25 beschreven. Digitale hologrammen werden gegenereerd door belich...

Accurate beoordeling van ontstekingsremmende effecten is van het grootste belang voor de evaluatie van potentiële nieuwe geneesmiddelen voor de behandeling van inflammatoire darmziekte. Digitale holografische microscopie biedt beoordeling van ontsteking in muis- en menselijke colonweefselmonsters evenals geautomatiseerde multimodale evaluatie van epitheel wondgenezing in vitro.

Multimodaal Quantitative Fase Imaging met de Digitale Holografische Microscopie Beoordeelt Nauwkeurig darmontsteking en epitheliale wondheling

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

Het algemene doel van dit onderzoek is om digitale holografische microscopie of DHM te gebruiken om geautomatiseerde kleurvrije kwantitatieve fasecontrastbeelden te leveren van inflammatoire darmweefselmonsters voor de multi-modale beoordeling van epitheelwondgenezing in vitro. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van gastro-intestinale ontsteking en wondgenezing over de ziekteactiviteit ontstoken menselijke en mariene. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de detectie en kwantificering van cellen en weefsel door fysische parameters mogelijk maakt op een kleurvrije en objectieve manier. Het demonstreren van de procedures zal Fittest Ketelhut, een technicus, van het Biomedical Technology Center zijn.Stel de celcultuur op, incubeer vier keer tien tot de vijfde, Caco twee cellen per centimeter vierkant in 35 millimeter petrischalen uitgerust met hoge cultuurinvoegingen in RPMI-medium aangevuld met FBS en antibiotica bij 37 graden Celsius in 95% vochtigheid en vijf procent koolstofdioxide. Behandel de cellen na twee dagen met het middel van belang en plaats de culturen weer in de incubator voor nog eens 24 uur. De volgende dag aspireert u het supernatant en gebruikt u een pincet om de invoegingen te verwijderen.Was de cultuur één tot twee keer met één milliliter HEPES gebufferd celkweekmedium om eventuele dode cellen en overblijvende cellulaire componenten uit het wondgebied te verwijderen. Voeg vervolgens twee milliliter vers HEPES gebufferd medium toe en sluit de schaal. Plaats nu de petrischaal in de digitale holografische microscoop en selecteer het 10 x objectief.Open de software voor beeldacquisitie en selecteer de modus voor helderveldbeelden. Stel de verwarmingskamer in op 37 graden Celsius en plaats de cultuur in de verwarmingskamer. Beweeg vervolgens het kijkveld totdat een geschikte wond met een enkele enorme cel laag en rechte randen aan beide zijden zonder dode cellen of serum kan worden gevisualiseerd in het live monitoring venster.Maak een wit lichtbeeld van het initiële wondgebied. Draai vervolgens de witte lichtverlichting uit en selecteer de modus voor digitale holografische microscopie. Schakel de laserverlichting in en selecteer een belichtingstijd van minder dan drie milliseconden voor de hologramopname.Als de holografische off-access interferentielijnen met een adequate contrast verschijnen, maakt u een steekproefhologram en reconstrueert u een kwantitatief fasebeeld met de reconstructiesoftware om de beeldkwaliteit te controleren. Begin vervolgens met een tijdsverlopen DHM observatie van de wond, stop de opname bij het juiste eindpunt en verkrijg een laatste beeld van het monster onder wit lichtverlichting. Voor Acute Dextran Sodium Sulfaat, of DSS colitis inductie, bied drie gram DSS opgelost in 100 milliliter gesteriliseerde water aan muizen ablibidim.Na zeven dagen verkrijgt u zeven micrometer dikke secties van Zwitsers opgerolde colon monsters van de controle- en behandelde dieren. Dompel elke sectie in 50 tot 100 microliters PBS en dek de monsters af met afzonderlijke glazen deksels. Bevestig dat de bodems van de dia's vrij zijn van stof en andere verontreinigingen.Plaats vervolgens de eerste dia op het microscoopplatform en pas het gezichtsveld aan tot het weefselgebied van belang zichtbaar is. Breng het monster scherp in focus en maak een helderveldbeeld in de software voor beeldacquisitie. Selecteer vervolgens de DHM-beeldmodus en schakel over naar de laserlichtverlichting.Stel een belichtingstijd in van minder dan drie milliseconden en bevestig dat de holografische off-access interferentielijnen met een adequate contrast in het live beeldvenster verschijnen. Maak vervolgens een digitaal hologram van het weefsel. Endoscopisch omvat het bewijs van matige tot ernstige colitis verdikking van de colonwand, veranderingen van het vasculaire patroon, vezel neduoties, en oppervlaktegranulariteit van de mucosa.Conventionele histologische evaluatie van de colon secties toont een duidelijke oedeem in de colonwand van DSS behandelde versus de controle dieren, voornamelijk gelokaliseerd in de submucosa. Overeenkomstige kwantitatieve DHM fasecontrastbeelden en gerelateerde brekingsindex kaarten tonen ook aan dat deze weefselveranderingen zonder zichtbare verschillen in de dichtheden van epitheelmenstroma vooral duidelijk zijn in de niet-gekleurde weefselmonsters. De brekingsindex is significant verminderd in het epitheel, submucosa en stroma van de colitische muizen in vergelijking met de gezonde controles met een significante correlatie tussen de relatieve verlies van lichaamsgewicht en de brekingsindex in de experimentele dieren.Hier wordt de representatieve continue monitoring van een wondgenezingsassay door digitale holografische microscopie over 45 uur getoond. Door de berekeningen van het celbedekte oppervlaktegebied, gemiddelde celdikte en cellulaire droge massa gedurende het genezingsproces mogelijk te maken. We hebben aangetoond dat DHM continue monitoring van epitheel wondgenezing mogelijk maakt terwijl het tegelijkertijd bio-kerninformatie levert over cytokine-geïnduceerde celveranderingen.Bovendien demonstreren we de nauwkeurige beoordeling van histologisch schade in colitis modellen en menselijke colonweefselmonsters door DHM door meting van veranderingen in de brekingsindex. Aangezien DHM gebaseerd is op de detectie van de optische padlengtevertraging, kunnen absolute biofysische parameters, zoals weefseldichtheid, droge massa of cellulaire dikte, worden geanalyseerd door kleurvrije kwantitatieve fasecontrastbeeldvorming. De combinatie van DHM met gangbare onderzoeksmicroscopen en de robuustheid van de techniek baant de weg voor routinetoepassingen van deze methode in celbiologie en digitale pathologie.Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u digitale holografische microscopie kunt gebruiken voor de analyse van weefsels van levende celculturen in de biomedische laboratoriumomgeving. Concluderend creëert DHM een waardevol, nieuw en kwantitatief hulpmiddel voor de beoordeling van absolute ontstekingsparameters, evenals voor de vereenvoudigde kwantificering van epitheel vrijwillig in vitro met een groot potentieel voor translationeel diagnostisch gebruik.

multimodal-quantitative-phase-imaging-with-digital-holographic

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

De driedimensionale locaties van zwak-verstrooiende objecten kan uniek worden geïdentificeerd middels inline digitale holografische microscopie (Dihm), die een geringe wijziging betreft een standaard microscoop. De software gebruikt een eenvoudige weergave heuristische combinatie met Rayleigh-Sommerfeld back-overdracht naar de driedimensionale positie en geometrie van een microscopische fase-object verkregen.

Digitale Inline Holographic Microscopy (Dihm) van zwak-verstrooiing onderwerpen

We beschrijven het gebruik van een standaard optisch microscoop om kwantitatieve metingen van cellulaire massa, volume en dichtheid uit te voeren door een combinatie van lichtveld en differentiële interferentiecontrast beeldvorming.

Kwantitatieve Optische Microscopie: Meting van Cellulaire biofysische eigenschappen met een standaard optische microscoop

Klein dier beeldvormende technieken laten seriële diagnostische onderzoeken en therapeutische interventies in vivo. Onlangs heeft de reikwijdte van de toepassingen aanzienlijk verbreed en omvat momenteel de beoordeling van het colon tumor ontwikkeling, wondgenezing en de monitoring van de ontsteking. Dit protocol illustreert deze diverse mogelijke toepassingen van muizen endoscopie.

Muizen Endoscopie voor In Vivo Multimodal Imaging van Carcinogenese en Evaluatie van intestinale wondgenezing en ontsteking

Doelgroepen gerichte sondes vertegenwoordigen een vernieuwend hulpmiddel voor het analyseren van de moleculaire mechanismen, zoals eiwituitdrukking in verschillende soorten ziekten (b.v., ontsteking, infectie en tumorvorming). In deze studie beschrijven we een kwantitatieve driedimensionale tomografische beoordeling van intestinale macrofaag infiltratie in een lymfkliertest model van colitis met F4/80-specifieke fluorescentie-gemedieerde tomografie.

Fluorescentie-gemedieerde tomografie voor de detectie en kwantificering van macrofaag-gerelateerde lymfkliertest darmontstekingen

We beschrijven een methode om GFP-gelabeld γδ IELs met behulp van intravital Imaging van muizen dunne darm te visualiseren door omgekeerde spinnen schijf confocale microscopie. Deze techniek maakt het bijhouden van levende cellen in het slijmvlies voor maximaal 4 uur en kan worden gebruikt om een verscheidenheid van intestinale immuun-epitheel interacties te onderzoeken.

Intravital beeldvorming van epitheliale lymfocyten in muizen dunne darm

Gebruikmakend van intravitale microscopie, maakt de hier gepresenteerde methode real-time visualisatie van darmeppitheelcelvergieten bij levende dieren mogelijk. Daarom is geigreerd darmslijmvlies (acriflavine en rhodamineB-dextran) van verdoofde muizen afgebeeld tot eencellige resolutie met behulp van confocale microscopie.

Een intravitale microscopie-gebaseerde benadering om darmdoorlatendheid en epitheelcelvergieten prestaties te beoordelen

Systematische scoring van darmontsteking met behulp van een gratis computerondersteund systeem is een krachtig hulpmiddel om histopathologische veranderingen in colitismodellen kwantitatief te vergelijken, gekenmerkt door de aanwezigheid van zweren en ontstekingsveranderingen. Histologische colitis score evaluatie versterkt klinische observaties en vergemakkelijkt de interpretatie van gegevens.

Systematische scoringsanalyse voor darmontsteking in een muriene dextran natriumsulfaat-geïnduceerde colitismodel

Hier presenteren we een methode om beelden van de darm te verkrijgen bij laser-geïnduceerde verwonding. Door de darm van de muis bloot te stellen aan een multifotonenlaser, wordt het verlies van een enkele of meerdere crypt(en) lokaal geïnduceerd. Door het beschadigde gebied gedurende maanden herhaaldelijk in beeld te brengen, wordt de real-time dynamiek van darmherstel vastgelegd.

Laserablatie en intravitale microscopie om intestinale remodellering te bestuderen

We presenteren een stapsgewijs protocol voor hoge-resolutie, labelvrije en driedimensionale beeldvorming van organoïden met behulp van low-coherence holotomografie. Dit protocol beschrijft de voorbereiding van de organoïdecultuur, de beeldvorming en de computationele beeldanalyse, waardoor real-time visualisatie van structurele dynamiek en geneesmiddelresponsen in levende organoïden mogelijk is.

Labelvrije 3D-beeldvorming met hoge resolutie en machine learning-analyse van darmorganoïden via holotomografie met lage coherentie

Deze studie presenteert een 3D-beeldvormingsmethode met behulp van darmweefsel en multi-fotonmicroscopie om uitgescheiden slijm te kwantificeren, waardoor nauwkeurige volumetrische analyse en visualisatie van slijmdynamiek mogelijk is als reactie op stimuli zoals carbamoylcholinechloride.

Driedimensionale kwantificering van darmslijm met behulp van beeldvorming van het hele weefsel

Leer digitale holografische microscopie voor kwantitatieve beeldvorming van darmontsteking en epitheliale wondheling in Caco-2-cellen en colontweefsel. Deze kleurvrije methode biedt objectieve analyse van fysische celparameters.

Multimodaal Quantitative Fase Imaging met de Digitale Holografische Microscopie Beoordeelt Nauwkeurig darmontsteking en epitheliale wondheling (Video) | JoVE Journal

Multimodaal Quantitative Fase Imaging met de Digitale Holografische Microscopie Beoordeelt Nauwkeurig darmontsteking en epitheliale wondheling

Meer video's verkennen