Name: Light-gemedieerde Vorming en patroonvorming van hydrogels voor Cultuur van de Cel Applications (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Leer licht-gemedieerde vorming en patroonvorming van hydrogels voor 3D-celkweek. Deze methode maakt gebruik van fotoklikchemie voor celinkapseling en het bestuderen van celgedrag in gecontroleerde omgevingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Delaware COBRE programma&#39;s in Drug Discovery en in Advanced Biomaterials gefinancierd door Institutional Development Awards van het Nationaal Instituut voor Generals Medische Wetenschappen aan de National Institutes of Health (P20GM104316 en P30 GM110758-01, respectievelijk), de Pew Charitable Trusts (00026178), een National Science Foundation Career Award (DMR-1253906), de Burroughs Wellcome Fonds (1.006.787) en de National Science Foundation IGERT SBE2 programma aan de Universiteit van Delaware (fellowship aan L. Sawicki). De auteurs danken de Delaware Biotechnology Institute Bio-imaging Center aan de Universiteit van Delaware voor de opleiding en de toegang tot confocale microscopie, mevrouw Katherine Wiley voor begeleiding tijdens de video-shoot, de heer Matthew Rehmann voor royaal verstrekken hMSCs geïsoleerd uit beenmerg, Prof. Christopher J . Kloxin en de heer Stephen Ma voor royaal verstrekken van fotomaskers, en Prof. Wilfred Chen voor het gebruik van de geautomatiseerde plaatlezer. </p&gt;

<ol><li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry%3A+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+-+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew Chemie - Int Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).</li>
<li>Xi, W., Scott, T. F., Kloxin, C. J., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry+in+Materials+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry in Materials Science.</a> Adv Funct Mater. 24 (18), 2572-2590 (2014).</li>
<li>Azagarsamy, M. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+click+chemistry%3A+An+indispensable+tool+to+create+multifaceted+cell+culture+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Macro+Lett%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal click chemistry: An indispensable tool to create multifaceted cell culture scaffolds.</a> ACS Macro Lett. 2 (1), 5-9 (2013).</li>
<li>Adzima, B. J., Tao, Y., Kloxin, C. J., DeForest, C. A., Anseth, K. S., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+control+of+the+alkyne-azide+cycloaddition+by+photoinitiated+Cu%28II%29+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal control of the alkyne-azide cycloaddition by photoinitiated Cu(II) reduction.</a> Nat Chem. 3 (3), 256-259 (2011).</li>
<li>Hoyle, C. E., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-ene+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+-+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Thiol-ene click chemistry.</a> Angew Chemie - Int Ed. 49 (9), 1540-1573 (2010).</li>
<li>Fan, Y., Deng, C., Cheng, R., Meng, F., Zhong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+forming+hydrogels+via+catalyst-free+and+bioorthogonal+%26%2334%3Btetrazole-Alkene%26%2334%3B+photo-click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">In situ forming hydrogels via catalyst-free and bioorthogonal &#34;tetrazole-Alkene&#34; photo-click chemistry.</a> Biomacromolecules. 14 (8), 2814-2821 (2013).</li>
<li>Burdick, J. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+from+static+to+dynamic+complexity+in+hydrogel+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Moving from static to dynamic complexity in hydrogel design.</a> Nat Commun. 3, 1269(2012).</li>
<li>Rehmann, M. S., Kloxin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+and+dynamic+soft+materials+for+three-dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Tunable and dynamic soft materials for three-dimensional cell culture.</a> Soft Matter. 9 (29), 6737-6746 (2013).</li>
<li>Yang, T., Long, H., Malkoch, M., Gamstedt, K. E., Berglund, L., Hult, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+well-defined+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels+prepared+by+thiol-ene+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Polym+Sci+Part+A+Polym+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of well-defined poly(ethylene glycol) hydrogels prepared by thiol-ene chemistry.</a> J Polym Sci Part A Polym Chem. 49 (18), 4044-4054 (2011).</li>
<li>Fairbanks, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+synthetic+extracellular+matrix+mimic+via+thiol-norbornene+photopolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">A versatile synthetic extracellular matrix mimic via thiol-norbornene photopolymerization.</a> Adv Mater. 21 (48), 5005-5010 (2009).</li>
<li>Roberts, J. J., Bryant, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+photopolymerizable+thiol-ene+PEG+and+acrylate-based+PEG+hydrogels+for+cartilage+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Comparison of photopolymerizable thiol-ene PEG and acrylate-based PEG hydrogels for cartilage development.</a> Biomaterials. 34 (38), 9969-9979 (2013).</li>
<li>DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+click+reactions+for+synthesizing+and+patterning+three-dimensional+cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments.</a> Nat Mater. 8 (8), 659-664 (2009).</li>
<li>Lin, C. C., Ki, C. S., Shih, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-norbornene+photoclick+hydrogels+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Polym+Sci%22%5BJournal%5D)">Thiol-norbornene photoclick hydrogels for tissue engineering applications.</a> J Appl Polym Sci. 132 (8), (2015).</li>
<li>Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+thiol-ene+photoclick+hydrogels+using+facile+techniques+for+cell+culture+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Design of thiol-ene photoclick hydrogels using facile techniques for cell culture applications.</a> Biomater Sci. 2 (11), 1612-1626 (2014).</li>
<li>Patterson, J., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+proteolytic+degradation+of+molecularly+engineered+PEG+hydrogels+in+response+to+MMP-1+and+MMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2.</a> Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).</li>
<li>Fairbanks, B. D., Singh, S. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodegradable%2C+photoadaptable+hydrogels+via+radical-mediated+disulfide+fragmentation+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Photodegradable, photoadaptable hydrogels via radical-mediated disulfide fragmentation reaction.</a> Macromolecules. 44 (8), 2444-2450 (2011).</li>
<li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2%2C4%2C6-trimethylbenzoylphosphinate%3A+polymerization+rate+and+cytocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).</li>
<li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+incorporating+RGD+adhesive+peptide+in+polyethylene+glycol+diacrylate+hydrogel+on+osteogenesis+of+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of incorporating RGD adhesive peptide in polyethylene glycol diacrylate hydrogel on osteogenesis of bone marrow stromal cells.</a> Biomaterials. 26 (30), 5991-5998 (2005).</li>
<li>Wacker, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+migration+on+RGD-peptide-containing+PEG+hydrogels+in+the+presence+of+sphingosine+1-phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell migration on RGD-peptide-containing PEG hydrogels in the presence of sphingosine 1-phosphate.</a> Biophys J. 94 (1), 273-285 (2008).</li>
<li>Wilson, M. J., Liliensiek, S. J., Murphy, C. J., Murphy, W. L., Nealey, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+with+well-defined+peptide-hydrogel+spacing+and+concentration%3A+impact+on+epithelial+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Hydrogels with well-defined peptide-hydrogel spacing and concentration: impact on epithelial cell behavior.</a> Soft Matter. 8 (2), 390-398 (2012).</li>
<li>Qiong Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+biodegradable+polyethylene+glycol%2F+RGD+peptide+hybrid+hydrogels+for+in+vitro+chondrogenesis+of+human+mesenchymal+stern+cellsa%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Rapid+Commun%22%5BJournal%5D)">Injectable biodegradable polyethylene glycol/ RGD peptide hybrid hydrogels for in vitro chondrogenesis of human mesenchymal stern cellsa.</a> Macromol Rapid Commun. 31 (13), 1148-1154 (2010).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+biological+materials+and+their+impact+on+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Soft biological materials and their impact on cell function.</a> Soft Matter. 3 (3), 299-306 (2007).</li>
<li>Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG+hydrogels+formed+by+thiol-ene+photo-click+chemistry+and+their+effect+on+the+formation+and+recovery+of+insulin-secreting+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids.</a> Biomaterials. 32 (36), 9685-9695 (2011).</li>
<li>Khetan, S., Burdick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+encapsulation+in+3D+hydrogels+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cellular encapsulation in 3D hydrogels for tissue engineering.</a> J Vis Exp. (32), e1590(2009).</li>
<li>Bryant, S. J., Nuttelman, C. R., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytocompatibility+of+UV+and+visible+light+photoinitiating+systems+on+cultured+NIH%2F3T3+fibroblasts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomater+Sci+Polym+Ed%22%5BJournal%5D)">Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 11 (5), 439-457 (2000).</li>
<li>Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Degradation+and+Mechanical+Behavior+of+Photopolymerized+Hyaluronic+Acid+Networks+Controlled+Degradation+and+Mechanical+Behavior+of+Photopolymerized+Hyaluronic+Acid+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Society%22%5BJournal%5D)">Controlled Degradation and Mechanical Behavior of Photopolymerized Hyaluronic Acid Networks Controlled Degradation and Mechanical Behavior of Photopolymerized Hyaluronic Acid Networks.</a> Society. 6 (1), 386-391 (2005).</li>
<li>Marsano, E., Gagliardi, S., Ghioni, F., Bianchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behaviour+of+gels+based+on+%28hydroxypropyl%29+cellulose+methacrylate%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+%28Guildf%29%22%5BJournal%5D)">Behaviour of gels based on (hydroxypropyl) cellulose methacrylate.</a> Polymer (Guildf). 41 (21), 7691-7698 (2000).</li>
<li>Bryant, S. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photopolymerization+of+Hydrogel+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Scaffolding+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Photopolymerization of Hydrogel Scaffolds.</a> Scaffolding Tissue Eng. , 71-90 (2005).</li>
<li>Khetan, S., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+hydrogels+in+three+dimensions+towards+controlling+cellular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions.</a> Soft Matter. 7 (3), 830-838 (2011).</li>
<li>Mosiewicz, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+cell+manipulation+through+enzymatic+hydrogel+photopatterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">In situ cell manipulation through enzymatic hydrogel photopatterning.</a> Nat Mater. 12 (11), 1072-1078 (2013).</li>
<li>Williams, C. G., Malik, A. N., Kim, T. K., Manson, P. N., Elisseeff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+cytocompatibility+of+six+cell+lines+with+photoinitiators+used+for+polymerizing+hydrogels+and+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Variable cytocompatibility of six cell lines with photoinitiators used for polymerizing hydrogels and cell encapsulation.</a> Biomaterials. 26 (11), 1211-1218 (2005).</li>
<li>Nimmo, C. M., Owen, S. C., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNimmo%2C+CM+%22Diels+-+Alder+Click+Cross-Linked+Hyaluronic+Acid+Hydrogels+for+Tissue+Engineering%22">Diels - Alder Click Cross-Linked Hyaluronic Acid Hydrogels for Tissue Engineering</a>. , 824-830 (2011).</li>
<li>DeForest, C. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytocompatible+click-based+hydrogels+with+dynamically+tunable+properties+through+orthogonal+photoconjugation+and+photocleavage+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions.</a> Nat Chem. 3 (12), 925-931 (2011).</li>
<li>Fairbanks, B. D., Sims, E. A., Anseth, K. S., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+rates+and+mechanisms+for+radical%2C+photoinitated+addition+of+thiols+to+alkynes%2C+and+implications+for+thiol-yne+photopolymerizations+and+click+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Reaction rates and mechanisms for radical, photoinitated addition of thiols to alkynes, and implications for thiol-yne photopolymerizations and click reactions.</a> Macromolecules. 43 (9), 4113-4119 (2010).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li>
<li>Wylie, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+controlled+simultaneous+patterning+of+multiple+growth+factors+in+three-dimensional+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels.</a> Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).</li>
<li>Pompe, T., Salchert, K., Alberti, K., Zandstra, P., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+growth+factors+on+solid+supports+for+the+modulation+of+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immobilization of growth factors on solid supports for the modulation of stem cell fate.</a> Nat Protoc. 5 (6), 1042-1050 (2010).</li>
<li>Hudalla, G. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+that+regulate+growth+factor+activity+via+bioinspired+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Biomaterials that regulate growth factor activity via bioinspired interactions.</a> Adv Funct Mater. 21 (10), 1754-1768 (2011).</li>
<li>Lee, S. H., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+micropatterning+of+bioactive+hydrogels+via+two-photon+laser+scanning+photolithography+for+guided+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration.</a> Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De procedure hier gepresenteerde demonstreert technieken om cellen photoencapsulate binnen hydrogels gevormd door thiol-een klik chemie en vervolgens photopattern de gels met biochemische signalen. Het gebruik van licht aanvankelijk vormen hydrogels maakt homogene vermenging en suspensie van de cellen in de polymeeroplossing voorafgaande aan polymerisatie. Snelle polymerisatie &quot;sluizen&quot; de gel in de vorm van de gedefinieerde vorm en inkapselt gesuspendeerde cellen in de hydrogel netwerk. Gels kunnen ook worden gevormd in een groot aantal verschillende vormen (bijvoorbeeld, glasplaatjes of spuittips) afhankelijk van de gewenste eindtoepassing. Cellen ingekapseld voor 3D cultuur hydrogels gehecht aan glazen plaatjes zijn bijzonder nuttig voor beeldvorming toepassingen lichte vermindering is beperkt tot een dun monster. Injectiespuit mallen kunnen worden gebruikt voor snelle inkapselen van cellen, waardoor een groter aantal monsters te bereiden in een korte tijd (ten opzichte glasplaatjeB) die kan worden gebruikt voor experimenten die grote aantallen cellen zoals flowcytometrie of qPCR. Vervolgens deze gels kunnen vervolgens worden gevormd met biochemische signalen om gewenste cellulaire responsen zoals differentiatie of invasie te wekken. 30,31 Testen op levensvatbaarheid en de metabolische activiteit geven de overleving van cellen voor het materiaalsysteem en patroonvorming omstandigheden gepresenteerd. Merk op dat metabole activiteit werd gevolgd tot dag 3 in niet-afbreekbare gels (RGKGRK verknopen peptide) aan de eerste effecten van polymerisatie en patroonvorming voorwaarden celfunctie beoordelen. Daarnaast is er een membraan integriteit assay (live / dead levensvatbaarheid / cytotoxiciteit kleuring) van hMSCs op 1 en 6 dagen na de inkapseling in gels geformuleerd met een afbreekbare peptide crosslink (GPQGIWGQ) ondersteunt dat cellen levensvatbaar en verspreiden zich over 1 week in de cultuur blijven. De levensvatbaarheid van additionele cellijnen gerapporteerd voor photopatterning omstandigheden 32 vergelijkbaar met dehier wordt gebruikt en kan worden gecontroleerd op de beschreven hydrogelenysteem met levende / dode vlekken en metabolische activiteit assays. Hoewel we geen problemen met de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van deze materialen systeem en de bijbehorende procedures (4.2 en 4.3) hebben opgemerkt, kunnen sommige celtypen gevoelig voor vrije radicalen en / of blootstelling aan licht zijn. In dat geval kunnen gebruikers overwegen niet photoinitiated materiaalsystemen, zoals azide-alkyn, FXIII 12, 31 of Diels-based hydrogel vorming chemie. 33 Facile technieken voor het detecteren en kwantificeren patroonvorming van biochemische signalen binnen gels ook gepresenteerd (3,1 en 3,2). Ellman&#39;s test is van bijzonder belang omdat de reagentia zijn commercieel verkrijgbaar en zonder extra synthetische bewerkingsstappen of duurdere reagentia (bijvoorbeeld fluorescentie-gemerkt peptide) vereist. Ellman&#39;s test kan worden gebruikt voor de modificatie van vrije thiolen precies te bepalen biochemische signalen onder different photopatterning omstandigheden en snel patronen visualiseren. Voor het kwantificeren van peptide opname, de thiol functionele groep concentratie voor en na het vormen, als een kwantitatieve maat peptide opname, direct beoordeeld met Ellman bepaling. Hoewel dergelijke kwantificering kan met fluorescent gelabelde peptiden, 34-beeldvorming kwantificering vereist tijdrovende behandeling en analysestappen (bijvoorbeeld, synthese van een fluorescentie-gemerkt peptide en het genereren van een kalibratiecurve te relateren fluorescentie peptideconcentratie met behulp van beeldanalyse). Voor grafische peptide bijmenging kan Ellman&#39;s reagens direct toegepast op monsters onmiddellijk zichtbaar. Terwijl beperkt tot de x- en y-vlakken op patroon visualisatie, kan de techniek worden gebruikt als een eenvoudige, routinematige werkwijze om te bepalen of matrices die vrije thiolgroepen zijn gevormd. Het is belangrijk op te merken dat de Ellman bepaling niet considered cytocompatible, dus terwijl het kan worden gebruikt om photopatterns observeren en te kwantificeren, kan niet worden uitgevoerd in de aanwezigheid van cellen. Voor beeldvorming patronen driedimensionaal en in aanwezigheid van cellen, de conjugatie van fluorescente peptiden binnen hydrogel matrices blijft een krachtige en veel gebruikte aanpak. Resolutie van patronen kan worden geëvalueerd in de x-, y- en z-vlakken met behulp van confocale microscopie en deze methode is cytocompatible zodat cellen in gevormde gebieden of niet-gevormde gebieden kunnen worden geïdentificeerd. Bij elkaar genomen, Ellman&#39;s test en imaging-gebaseerde technieken zijn aanvullende instrumenten voor onderzoekers om zowel kwantitatief als kwalitatief beoordelen van de photopatterning van biochemische signalen binnen het materiaal systeem. Photoclick of ruimer photoinitiated, chemische werkwijzen voor de vorming en aanpassing van hydrogelen in aanwezigheid van cellen zijn talrijk. Het gieten, inkapseling en patroonvormende technieken die hier niet limperkt tot de beschreven materiaalsysteem en kunnen worden toegepast op andere licht gebaseerde chemie, zoals thiol-alkyn, 35 azide-alkyn, 4 en andere thiol-een chemie (bijvoorbeeld thiol-norborneen), 10,13 en met verschillende fotoinitiatoren, zoals Irgacure 2959, Eosine Y, en kamferchinon. Let op, kunnen gebruikers moeten procedure parameters aan te passen (bijvoorbeeld incubatietijden, polymerisatie tijden, celdichtheid) ervoor te zorgen dat de omstandigheden cytocompatible voor deze andere systemen blijven. Aangezien het patroonvormende proces van de diffusie-Alloc gemodificeerde peptide (n) vereist in de hydrogel (2.2.3-2.2.5), kan dit proces blijken het meest nuttig voor het toevoegen van integrine-bindende groepen (bijvoorbeeld peptiden of extracellulaire matrix eiwit fragmenten) aan de hydrogel, waarbij binding van de ligand aan het netwerk vereist is voor het genereren van trekkrachten van de cel en volledige integrine activering. 36 Noot voor biomoleculen die alis eveneens actief in oplossing of na immobilisatie (bijvoorbeeld groeifactoren of cytokinen), kan de incubatiestap eenheid diffusie (~ 1 uur) in de hydrogel tot signaleringsgebeurtenissen die patronen resultaten convoluut. Andere methoden zijn vastgesteld voor groeifactor immobilisatie of lokale opslag voor hun patronen. 37-39 Bovendien patroon resolutie wordt bepaald door de controle over de blootstelling aan licht. Hier, fotomaskers Maken van patronen door de gel diepte en in de x- en y-vlakken; echter kunnen grotere ruimtelijke controle patroonvorming van biochemische signalen binnen gels worden bereikt met alternatieve bestraling zoals het gebruik van een twee-foton confocale microscoop om patronen in de x-, y- en z-vlakken te genereren. 34,40 Tenslotte moet worden opgemerkt dat hoewel het materiaalsysteem gebruikt binnen deze procedure alleen initieel gemodificeerd met biochemische signalen, kan orthogonale Photoclick chemie worden gebruikt om alte toestaanrantsoenen in matrix eigenschappen in de tijd. 12 De procedure en de hier gepresenteerde technieken toe te voegen diversiteit aan de huidige aanpak voor het maken van synthetische matrices met goed gedefinieerde en spatiotemporeel-gecontroleerde eigenschappen. In het bijzonder zal de commerciële beschikbaarheid van reagentia en materialen die in deze werkwijze bruikbaar voor een groot aantal onderzoekers geïnteresseerd in het gebruik van hydrogel gebaseerde biomaterialen voor toepassing in gecontroleerde celkweek zijn.

Instructies chemie worden steeds meer gebruikt bij het ontwerpen van materialen voor verschillende biomedische toepassingen, waaronder drug delivery, tissue engineering en gecontroleerde celkweek door hun selectieve, efficiënt en vaak cytocompatible reactiviteiten. 1-3 Photoclick chemie die licht gebruiken om uitlokken of initiëren reacties (bijvoorbeeld azide-alkyn, 4 thiol-een, 5 en tetrazool-alkeen 6) zijn van bijzonder belang voor de vorming of wijziging van biomaterialen. Hoge snelheden onder milde omstandigheden en bepalen wanneer en waar zij plaatsvinden met oplicht deze reacties zeer geschikt voor de gebruiker gerichte controle biomateriaal eigenschappen in de aanwezigheid van cellen. 7,8 Vooral zijn thiol-een Photoclick chemie gebruikt naar hydrogel gebaseerde biomaterialen robuuste mechanische eigenschappen en 5,9 voor de inkapseling van een grote verscheidenheid aan celtypen, waaronder, maar worden er geent beperkt tot, menselijke mesenchymale stamcellen (hMSCs), fibroblasten, chondrocyten en pancreascellen, met belofte voor celcultuur en levering. 10,11 Verder zijn deze chemische gebruikt voor het ruimtelijk patroon van biochemische signalen essentiële aspecten nabootsen natieve cel microenvironments en juiste cel-matrix interacties, zoals hechting, differentiatie en invasie vergemakkelijken. 3,12 Voor de bouw van thiol-een hydrogels met licht, peptiden die cysteïnen (thiol) gewoonlijk worden omgezet met polymeren gefunctionaliseerd met acrylaten of norbornenen ( &quot;ene&quot;) voor een snelle, photoinitiated polymerisatie onder cytocompatible omstandigheden. 13 Uitbreiding deze toolbox zochten we vaststellen methoden voor het hydrogel formatie met nieuwe veelzijdige en toegankelijke bouwstenen die minimale synthetische verwerking of waren in de handel verkrijgbaar in de richting van hun brede gebruik als synthetische extracellulaire matrices.14 In het bijzonder werden peptiden gemodificeerd met allyloxycarbonyl (Alloc) -beschermde lysines: één voor hanger, integrine-bindende groepen om celadhesie [K (alloc) GWGRGDS = Pep1Alloc] of twee te bevorderen voor niet-afbreekbaar of cell-afbreekbaar crosslinks [K ( Alloc) RGKGRKGK (Alloc) G of KK (Alloc) GGPQGIWGQGK (Alloc) K = Pep2Alloc respectievelijk]. Met deze sequenties werden vastgestelde voorwaarden voor snelle reactie (1-5 min) met vierarmige thiol-gemodificeerde poly (ethyleenglycol) (PEG4SH) via cytocompatible doses van lange golflengte UV-licht (10 mW / cm2 bij 365 nm) en de foto-initiator lithium fenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP). De resulterende hydrogels waren stabiel onder celcultuur voorwaarden voor weken. Tot-cel gedreven afbraak en verbouwing mogelijk te maken, werd een enzymatisch-kliefbare peptide opgenomen in de gel crosslinks (dwz GPQGIWGQ), 15 en een model primaire cel, menselijke mesenchymale stamcellen (hMSCs), bleven zeer levensvatbaar na inkapseling en during cultuur binnen deze matrices. Verder peptiden zijn ruimtelijk patroon in deze materialen en hMSCs blijven levensvatbaar en metabolisch actief onder photopatterning omstandigheden. Alternatieve hanger peptidesequenties, hier niet getoond (bijv IKVAV, YIGSR, GFOGER, etc.) kunnen ook worden opgenomen in matrices extra cel interacties met het omringende micro sonde. Deze resultaten zijn veelbelovend voor de toepassing van deze hydrogel gebaseerde materialen voor driedimensionale (3D) celkweek en levering te bestuderen en directe cel-matrix interacties voor verschillende celtypen. Hierin werkwijzen om cellen photoencapsulate vervolgens photopattern biochemische signalen binnen het voorgestelde hydrogel systeem zijn weergegeven (figuur 1). Technieken te observeren en te kwantificeren die photopatterns ook gedemonstreerd: name i) de kwantitatieve en kwalitatieve analyse gebruik van Ellman het bepalen modificatie van vrije thiolen op gevormde substraten en ii) de complementaire kwalitatieve gebruik van fluorescente peptiden (AF488Pep1Alloc) om deze patronen te observeren in drie dimensies. Verder assays voor levensvatbaarheid (Live / dead levensvatbaarheid / cytotoxiciteit-kleuring) en metabole activiteit te bepalen (MTS 3- (4,5-dimethyl-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyfenyl) -2- (4-sulfofenyl) 2H-tetrazolium) worden gepresenteerd, zodat gebruikers de cytocompatibility van photoencapsulation en photopatterning voorwaarden voor verschillende cellijnen binnen hydrogel matrices kan bepalen. Terwijl het protocol is aangetoond voor een gemakkelijke licht gebaseerde Photoclick hydrogel systeem kunnen de technieken worden toegepast op talrijke andere radicaal-geïnitieerde hydrogelenystemen voor photoencapsulation en photopatterning in aanwezigheid van cellen.

```html
<table>
<tbody>
<tr>
<td>Custom Peptides</td>
<td>Various Vendors</td>
<td>----</td>
<td>Peptides may also be synthesized via standard SPPS techniques with materials from vendors including ChemImpex and ChemPep.</td>
</tr>
<tr>
<td>4-arm PEG Thiol, MW 20k</td>
<td>JenKem USA</td>
<td>4ARM-SH</td>
<td>Listed under Multi-arm Homofunctional PEGs. PEG4SH may also be synthesized as previously referenced.</td>
</tr>
<tr>
<td>Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate</td>
<td>Colorado Photopolymer Solutions</td>
<td>Li-TPO</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl Phenylphosphonite</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>149470</td>
<td>Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
</tr>
<tr>
<td>2,4,6-Trimethylbenzoyl Chloride</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>682519</td>
<td>Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
</tr>
<tr>
<td>Lithium Bromide</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>213225</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>2-Butanone</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>360473</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Flask, Round Bottom, 100&nbsp;ml</td>
<td>Chemglass</td>
<td>CG-1506-05</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>80 ml Filter Funnel, Buchner, Medium Frit</td>
<td>Chemglass</td>
<td>CG-1402-L-02</td>
<td>Filter paper inside a regular glass funnel may be used if desired.</td>
</tr>
<tr>
<td>Magnetic Stir Bars</td>
<td>Various Vendors</td>
<td>----</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Magnetic Stirring and Hot Plate</td>
<td>Various Vendors</td>
<td>----</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum Dessicator</td>
<td>Various Vendors</td>
<td>----</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Deuterium Oxide</td>
<td>Acros Organics</td>
<td>16630</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td>
<td>ThermoFisher Scientific</td>
<td>14190-250</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin Streptomycin</td>
<td>ThermoFisher Scientific</td>
<td>15070-063</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Fungizone</td>
<td>ThermoFisher Scientific</td>
<td>15290-018</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red</td>
<td>ThermoFisher Scientific</td>
<td>15400-054</td>
<td>Select appropriate medium and trypsin depending on cell type.</td>
</tr>
<tr>
<td>Microcentrifuge tubes</td>
<td>Various Vendors</td>
<td>----</td>
<td>1.5 or 2 ml sizes, sterile.</td>
</tr>
<tr>
<td>BD Syringe with Slip (Luer) Tips (Without Needle)</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>14-823-16H</td>
<td>Product number listed here is for a 1 ml syringe (16H), Various sizes are available (14-823-XX).</td>
</tr>
<tr>
<td>Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-544-1</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>High-Purity Silicone Rubber, 0.010" Thick, 6" x 8" Sheet, 55A Durometer (Gasket)</td>
<td>McMaster Carr</td>
<td>87315K62</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Ethanol, 200 Proof</td>
<td>Decon Labs</td>
<td>2701</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>RainX, Original</td>
<td>Amazon</td>
<td>800002243</td>
<td>May be purchased from other vendors.</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigmacote</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>SL2</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Photomasks</td>
<td>Advance Reproductions Corporation</td>
<td>----</td>
<td>Photomask Division, different designs may be printed as desired.</td>
</tr>
<tr>
<td>DTNB; Ellman's Reagent; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)</td>
<td>ThermoFisher Scientific</td>
<td>PI-22582</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>S5136</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>E6758</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Hydroxide, Pellets/Certified ACS</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>S318</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Orthophosphoric Acid</td>
<td>Alfa Aesar</td>
<td>33266</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Cysteine Hydrochloride Monohydrate</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>C7880</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
<td>ThermoFisher Scientific</td>
<td>L-3224</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay</td>
<td>Promega</td>
<td>G3582</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>Various Vendors</td>
<td>----</td>
<td>Capable of speeds at 90-110 x g.</td>
</tr>
<tr>
<td>Multiwell Plate Reader</td>
<td>Various Vendors</td>
<td>----</td>
<td>Capable of reading absorbance at 405 nm in a 96-well plate.</td>
</tr>
<tr>
<td>Epifluorescent or Confocal Microscope</td>
<td>Various Vendors</td>
<td>----</td>
<td>To visualize peptide patterns and cells within hydrogels.</td>
</tr>
<tr>
<td>Omnicure Exfo Series 2000</td>
<td>Excelitas Technologies</td>
<td>----</td>
<td>Alternate light systems may be used to polymerize hydrogels.</td>
</tr>
<tr>
<td>Zeiss Zen Lite Software</td>
<td>Zeiss</td>
<td>----</td>
<td>Available at zeiss.com; compatible with images taken on Zeiss microscopes</td>
</tr>
<tr>
<td>ImageJ</td>
<td>NIH</td>
<td>----</td>
<td>Available at imagej.nih.gov; applicable for general image analysis</td>
</tr>
</tbody>
</table>
```

light-gemedieerde vorming en patroonvorming van hydrogels voor cultuur van de cel applications

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Instructies chemische werden onderzocht voor gebruik in tal van biomaterialen toepassingen, zoals geneesmiddelafgifte, weefseltechnologie en celkweek. In het bijzonder licht-gemedieerde klik reacties zoals photoinitiated thiol-een en thiol-yn reacties, verkregen spatiotemporele controle materiaaleigenschappen en laat het ontwerp van systemen met een hoge mate van de gebruiker gerichte objecten control. Fabricage en modificatie van hydrogel gebaseerde biomaterialen met de precisie geboden door licht en de veelzijdigheid die door deze thiol-X Photoclick chemie zijn van toenemend belang, met name voor de kweek van cellen in welbepaalde, biomimetische micro-omgevingen. We beschrijven hier werkwijzen voor het photoencapsulation cellen en daaropvolgende photopatterning biochemische signalen binnen hydrogelmatrices behulp veelzijdige modulaire bouwstenen gepolymeriseerd met een thiol-een Photoclick reactie. In het bijzonder wordt een aanpak gepresenteerd voor samenwerkingnstructing hydrogelen van allyloxycarbonyl (Alloc) -functionalized peptide verknopingen en hanger peptide eenheden en thiol-gefunctionaliseerde poly (ethyleenglycol) (PEG) die snel polymeriseren bij aanwezigheid van lithium acylphosphinate fotoinitiator en cytocompatible doses van lange golflengte ultraviolet (UV) licht. Facile technieken photopatterning visualiseren en kwantificeren van de concentratie van peptiden toegevoegd worden beschreven. Daarnaast worden werkwijzen vastgesteld voor het inkapselen van cellen, specifiek menselijke mesenchymale stamcellen, en bepalen van de levensvatbaarheid en activiteit. Terwijl de vorming en patroonvorming van eerste thiol-alloc hydrogels hier getoond, deze technieken kunnen breed worden toegepast op een aantal andere lichte en radicale geïnitieerde materiaalsystemen (bijvoorbeeld thiol-norborneen, thiol-acrylaat) patroonmatig substraten genereren.

De opstelling en procedure voor cellen en vervolgens photopattern gels die ingekapselde cellen is in Figuur 1 photoencapsulate, en een voorbeeld voor het bereiden voorraadoplossingen vorming van een 10 gew% gel is opgenomen in tabel 1. Tabellen 1, de hoeveelheid monomeren (PEG4SH , Pep2Alloc, ± Pep1Alloc) en foto-initiator (LAP) nodig om hydrogels polymeriseren wordt berekend. Op basis van deze berekeningen, zijn voorraad oplossingen van PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc en LAP voorbereid en gemengd met en zonder Pep1Alloc voor het vormen en photopatterning gels, respectievelijk (figuur 1A). Vervolgens worden cellen verzameld uit platen, geteld en gecentrifugeerd in geschikte hoeveelheden inkapseling (Figuur 1B). De celpellet wordt opnieuw gesuspendeerd in gelvormende oplossing (peptide / polymeer / LAP in PBS) en cellen / monomeermengsels worden overgebracht naar glazen of spuit molds. De cellen zijn ingekapseld in de hydrogel bij toepassing van licht (1-5 minuten van 10 mW / cm2 bij 365 nm) (Figuur 1C). Voor photopatterning (figuur 1D), zijn gels doordrenkt met Pep1Alloc en LAP van 30 min tot 1 uur en 30 minuten, waardoor diffusie van peptide en initiator in de gepolymeriseerde matrix. Deze peptide-beladen gels zijn bedekt met fotomaskers met gewenste patronen en blootgesteld aan een tweede dosis licht (1 min) om de peptiden te conjugeren vrije thiolen in de matrix. Hanger aanbinden alleen covalent gebonden aan de gel in gebieden blootgesteld aan licht, vergemakkelijken juiste cel-matrix interacties en nabootsen belangrijke mechanische en biochemische eigenschappen van de natieve cel micro richting sonderen celfunctie en het lot in vitro. Ellman&#39;s test biedt een gemakkelijke en goedkope methode om de gel modificatie en peptide integratie binnen photopatte kwantificerenrned substraten. Gevormd en non-gevormde gels (dat wil zeggen, gels met of zonder peptide modificatie) worden geweekt in reactie buffer post-polymerisatie Ellman&#39;s. Vervolgens worden cysteine normen en de gelen geweekt in buffer in 48-well platen geplaatst en geïncubeerd met Ellman&#39;s reagens (Figuur 2A, links). Na 1 uur 30 minuten worden monsters van monsters die in individuele putjes van een 96-putjesplaat en de absorbantie wordt opgenomen bij 405 nm. Een kalibratiecurve (Figuur 2A, rechts) vanaf het cysteïne normen uitgezet (absorptie versus concentratie lineaire fit), en de hoeveelheid vrije thiolen in gels kunnen worden bepaald op basis van de verdunningsfactor. Deze vrije thiol concentraties van verschillende polymerisatie en photopatterning omstandigheden van een 10 gew% gel worden getoond in figuur 2B. Gels gepolymeriseerd voor 1 of 5 min zonder Pep1Alloc (blauwe balken, I = 1 min en II = 5 min) hebben statistisch gezien een soortgelijke vrije thiol concentraties, met vermelding van thoed van een snelle reactie optreedt en gelering voltooid is binnen 1 min (tweezijdige t-test, p&gt; 0,05). Zo hoeft extra blootstelling aan licht (2-5 minuten) niet tot verdere omzetting van functionele groepen. Gels gepolymeriseerd 1 min zonder Pep1Alloc doorweekt met Pep1Alloc (3 mg / ml) en LAP (2,2 mM) gedurende 30 en 90 minuten (groene balken, II = 30 min en IV = 90 min) en blootgesteld aan een tweede dosis licht gedurende 1 min. De afname van vrije thiolen (60-80% ten opzichte van de 1 min toestand) geeft doelmatige modificatie van gels hangers signalen onder deze omstandigheden. Als hogere modificatie gewenst is, kunnen verhoogde concentraties Pep1Alloc oplossing worden gebruikt als toegankelijkheid van Pep1Alloc aan vrije thiolen in meer verdunde oplossingen kunnen peptide omzetting beperken; bijvoorbeeld, hebben we gevonden dat concentraties tot 20 mg / ml Pep1Alloc produceren&gt; 90% omzetting van vrije thiolen. Uniek patronen van peptiden toegevoegd aan de hydrogel kansnel worden afgebeeld met Ellman&#39;s reagens (Figuur 3A, onder 5 min). Echter, visualisatie van het patroon verloren tijd (meer dan 5 min) vanwege diffusie van de gele TNB 2- dianion door de gel. Om beeldresolutie te verbeteren en observeren patronen in drie dimensies (x-, y- en z-vlakken) en in de aanwezigheid van cellen kunnen fluorescerend peptide toevoeging (AF488Pep1Alloc) worden gebruikt. In figuur 3B x-, y- en z-projecties van afbeeldingsstapels genomen met een confocale microscoop getoond, demonstreren patroon Resolutie (urn schaal). Ongeveer (94 ± 2)% en (94 ± 1)% van hMSCs ingekapseld in afbreekbare gels (Pep2Alloc = GPQG ↓ WGQ) levensvatbaar blijven (groen cellichamen) 1 en 6 dagen na inkapseling, respectievelijk met weinig dode cellen (rode nuclei ) waargenomen (figuur 4A). Verder hMSC spreiding wordt waargenomen na 6 dagen na inkapseling ( <st<html> rong&gt; Figuur 4A, bijvoegsel), wat aangeeft dat cellen kunnen verbouwen en interactie met deze MMP afbreekbare matrices gemodificeerd met integrine-bindende RGDS. Metabolische activiteit assays uitgevoerd op cellen ingekapseld in niet-afbreekbare gelen (Pep2Alloc = RGKGRK) 1 en 3 dagen na de inkapseling (Figuur 4B) een tweede maatregel van de levensvatbaarheid van de cellen en aantonen dat de cellen actief is voor de geteste met diverse photoencapsulation en photopatterning voorwaarden blijven Ellman&#39;s test (figuur 2B). Met name is er geen significant verschil in metabolische activiteit tussen 30 min en 90 min incubatie met Pep1Alloc + LAP (voorwaarden III en IV) en de eerste inkapseling (voorwaarden I en II), wat aangeeft dat de procedure geschikt is voor toepassingen van photopatterning in is de aanwezigheid van ingekapselde cellen (tweezijdige t-test, p&gt; 0,05). 2fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1:. Setup voor het inkapselen van cellen in hydrogels en vervolgens photopatterning met biochemische cue (A) Stock oplossingen van macromeren en de foto-initiator worden bereid en gemengd (PEG4SH = backbone, Pep2Alloc = crosslink, Pep1Alloc = hanger lijm groep (RGDS), LAP = foto-initiator ). (B) De cellen worden verzameld voor inkapseling. (C) Cellen worden macromeren gemengd met oplossingen zonder of met integrine-bindende peptiden (PEG4SH / Pep2Alloc / LAP of PEG4SH / Pep2Alloc / Pep1Alloc / LAP respectievelijk) en worden ingekapseld bij blootstelling aan licht. (D) Gels bevatten overmaat thiol groepen tijdens gelvorming (hier, PEG4SH / Pep2Alloc / LAP, gevormd met 2 mM overmaat thiol) kan worden gevormd met biochemische signalen door de latere toevoeging van peptiden gefunctionaliseerd met een enkele Alloc groep (Pep1Alloc, bijvoorbeeld, RGDS, IKVAV, etc.) om celhechting te bevorderenbinnen specifieke gebieden van de gel. Hier, het vormen van de gels met fluorescent gelabelde RGDS wordt getoond. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig2.jpg" /> Figuur 2:. Kwantitatieve Ellman&#39;s test opzet en resultaten modificatie van gevormde hydrogels evalueren (A) Gels en cysteine normen geïncubeerd in 48-well platen met Ellman&#39;s reagens. Een lineaire ijkcurve uitgezet cysteïne concentratie bepalen gelmonsters. (B) Overtollige vrije thiolen worden opgenomen in hydrogels tijdens gelvorming en geconsumeerd bij patroonvorming met een hanger Alloc-peptide (I = 1 min polymerisatie; II = 5 min polymerisatie; III = 30 min incubatie met Pep1Alloc; IV = 90 min incubatie wi<html> th Pep1Alloc; zowel III en IV gepolymeriseerd en gedessineerde met licht voor 1 min). De getoonde gegevens illustreren de gemiddelde (n = 3) met fout bars met de standaard fout. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig3.jpg" /> Figuur 3:. Ellman&#39;s test en fluorescerende beelden naar photopatterned hydrogels visualiseren (A) Ellman&#39;s reagens kan worden gebruikt om snel patronen (lijnen) in de x- en y-vlakken (geel = unpatterned regio Schaal bar = 1 mm) te detecteren. (B) Fluorescente peptiden kunnen worden gebruikt om patronen te ontdekken in de x-, y- en z-vlakken (groen = gevormde regio; 200 urn schaalbalk, 10X water dompelen doelstelling; Ex / Em 488/525 nm).large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig4.jpg" /> . Figuur 4: Leefbaarheid en metabole activiteit van cellen in niet-afbreekbare photopatterned hydrogels (A) Voorbeeld confocale z-stack (z-projectie, 10X water dompelen objectief) van levensvatbare (groen; Ex / Em 488/525 nm) en dode hMSCs (rood; Ex / Em 543/580 nm) ingekapseld in hydrogels 24 uur na inkapseling (Schaal bar = 200 pm). Cellen verspreid binnen deze hydrogels 6 dagen na (afbeelding bijvoegsel, Schaal bar = 50 pm) inkapseling. (B) De cellen zijn metabolisch actief 1 en 3 dagen (donker en licht bars, respectievelijk) post-inkapseling voor de verschillende polymerisatie (I = 1 min polymerisatie; II = 5 min polymerisatie) en patroonvorming omstandigheden (III = 30 min incubatie met Pep1Alloc ; IV = 90 min broen met Pep1Alloc; zowel gepolymeriseerd en gedessineerde met licht voor 1 min). De getoonde gegevens illustreren de gemiddelde (n = 3) met fout bars met de standaard fout. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="tafel 1" src="/files/ftp_upload/54462/54462tbl1.jpg" /> Tabel 1: Voorbeeld setup te bepalen hoeveel voorraad oplossingen te berekenen voor het maken van hydrogels cellen in de spreadsheet die blauw zijn gemarkeerd geven de gebruiker gedefinieerde parameters;. de overige hoeveelheden worden berekend op basis van deze instellingen. De laatste volumes voor elke voorraad oplossing om een ​​gel te worden gemarkeerd oranje. De witte bloedcellen bevatten formules voor de laatste delen op basis van door de gebruiker gedefinieerde parameters berekenen. Merk op dat een concentratie van 2,2 mM LAP is gelijk aan 0,067 gew%.

We beschrijven een sequentieel proces voor lichtgemedieerde vorming en daaropvolgende biochemische patroonvorming van synthetische hydrogelmatrices voor toepassingen in driedimensionale celcultuur. De constructie en modificatie van hydrogels met cytocompatibele fotoclick-chemie wordt gedemonstreerd. Bovendien worden eenvoudige technieken gepresenteerd om patronen te kwantificeren en observeren en de celviabiliteit binnen deze hydrogels te bepalen.

Light-gemedieerde Vorming en patroonvorming van hydrogels voor Cultuur van de Cel Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Het algemene doel van deze procedure is het vormen, patroonvormen en inkapselen van cellen binnen synthetische polymeergebaseerde extracellulaire matrices. Deze methode kan worden gebruikt om kritische biologische vragen te beantwoorden met betrekking aan de identificatie van extracellulaire signalen die celresponsen reguleren binnen heterogene micro-omgevingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er een robuuste synthetische matrix wordt gegenereerd voor celinkapseling en -kweek met behulp van protocollen en toegankelijke materialen.Deze methode kan worden gebruikt voor gecontroleerde celkweek en om de celrespons in vitro te bestuderen. Het kan worden toegepast op andere systemen, waaronder geneesmiddelentoediening en tissue engineering. Bereid de materialen voor hydrogelvorming voor zoals beschreven in het tekstprotocol.Bevestig een collimatielens aan het uiteinde van de vloeistofgevulde lichtgeleider om een relatief gelijkmatige lichtintensiteit over alle monsters te waarborgen. Pas de afstand van de lichtgeleider tot de monsters aan om een spotgrootte te bereiken die de betreffende monsters volledig beslaat. Om niet-gepatroneerde hydrogels te maken, bereid dikke hydrogels voor die in spuitpuntjes zijn gegoten door 10 tot 20 µL van de gelprecursorsolutie in het puntje van een steriele, afgesneden spuit te pipetteren.Maak per spuit één enkele gel met een dikte van ongeveer 0,5 tot 1,5 millimeter, afhankelijk van het volume en de diameter van de spuit. Bereid dunne hydrogels voor in mallen van glazen objectglazen door de rubberen pakking rond de randen van het ongecoate objectglas te plaatsen. Pipetteer vervolgens vijf tot 10 µL van de gel-precursoroplossing op het ongecoate objectglas.Plaats vervolgens het glazen dekglas, gecoat met een anti-adhesief, bovenop de geloplossing. Zet de glazen dekglazen vast met kleine klemmen ter stabilisatie. Stel de lampintensiteit zo in dat er 10 milliwatt per vierkante centimeter op het geloppervlak komt voor spuitnaaldtip-mallen of glazen dekglas-mallen.Gebruik een radiometer om de intensiteit te bepalen. Plaats de vormpjes onder de lamp. Bestraal gedurende één tot vijf minuten om volledige polymerisatie van de gels mogelijk te maken.Gebruik een kortere polymerisatietijd voor gels met een hoger gehalte aan polyethyleenglycoltereftalaat. Gebruik een langere tijd voor gels met een lager gehalte om volledig gepolymeriseerde hydrogels te produceren met moduli binnen het bereik van zachte weefsels. Plaats de gels uit de spuitnaaldvormen in een steriele, onbehandelde 48-wells plaat en plaats de glazen objectglazen in een steriele schaal.Om gepatroneerde hydrogels te bereiden, wordt de precursoroplossing klaargemaakt zoals beschreven in het tekstprotocol en wordt de oplossing krachtig gepipetteerd om een gelijkmatige menging te garanderen. Bedek vervolgens de vooraf gevormde gels met een oplossing van penton-peptide in lithiumfosfaat-foto-initiator en incubeer deze gedurende één uur bij 37 °C. Verwijder na incubatie de overtollige oplossing.Als gels in een spuitpunt zijn gegoten, gebruik dan een spatel om ze voorzichtig van de 48-wells plaat over te brengen naar een steriel glazen objectglas voor het patroonproces. Plaats een fotomasker met het gewenste patroon direct bovenop de in de spuitpunt en op het glazen objectglas gegoten gels. Zorg ervoor dat het bedrukte deel van het masker de gel raakt voor een optimale getrouwheid van het patroon.Plaats de monsters onder de lamp en bestraal deze gedurende één minuut. Plaats na het patroonvormen de met een spuit gevormde gels in een steriele 48-well plaat die niet is behandeld voor weefselkweek. Plaats de op glazen slides gevormde gels die aan de slides kleven in een steriele schaal.Spoel drie keer gedurende 15 minuten met kweekmedium of de geschikte buffer, afhankelijk van de geplande experimenten. Om de detectie en kwantificering van vrije thiolen in fotopatroon-hydrogels uit te voeren, moeten eerst de oplossingen worden bereid en de berekeningen worden uitgevoerd zoals beschreven in het tekstprotocol. Vorm dunne hydrogels voor het patroon aan zoals voorheen.Maak specifiek gels met een overmaat aan vrije thiolen en patroneer de helft van deze monsters met het penton-peptide door een helder dekglas te gebruiken om de gehele gel volledig bloot te stellen aan licht. Plaats de gepatroneerde en niet-gepatroneerde gels in de putjes van een 48-wellplaat. Spoel drie keer gedurende 15 minuten met Ellman's reactiebuffer, om diffusie van de aan het einde gereageerde species uit de gel en equilibrium zwelling mogelijk te maken.Voeg extra Ellman-reactiebuffer toe aan de gespoelde gels, zodat het gezwollen gelvolume met de reactiebuffer een veelvoud van 20 microliters is. Als het voorspelde gezwollen gelvolume bijvoorbeeld 15 microliters is, voeg dan vijf microliters reactiebuffer toe. En als het voorspelde gezwollen gelvolume 30 microliters is, voeg dan 10 microliters reactiebuffer toe.Pipetteer de sistine-standaarden in individuele putjes van een 48-wells plaat in veelvouden van 20 µL, afhankelijk van het volume dat in de vorige stap is gebruikt. Als de vorige stap bijvoorbeeld een gezwollen gelvolume bevatte, plus extra reactiebuffer gelijk aan 40 µL, voeg dan 40 µL van elke standaard toe aan individuele lege putjes.Verdun vervolgens het Ellman-reagens en de reactiebuffer. Voeg het verdunde Ellman-reagens toe aan de wells die standaarden en monsters bevatten. Voeg bij monsters van 20 µL 183,6 µL van de oplossing toe aan elke well.Incubeer of plaats op een schudapparaat gedurende één uur en dertig minuten, of tot de kleur van de oplossing bij visuele inspectie overeenkomt met de kleur van de gels, om voldoende diffusie van het gele 2-nitro-5-thiobenzozuur-dianion te waarborgen, dat wordt gegenereerd bij de reactie van Ellman's reagens met vrije thiolen uit de gel. Neem 100 µL oplossing van de monsters en standaarden en breng deze aan in de putjes van een 96-wells plaat. Meet de absorptie bij 405 nm met een plaatlezer.Om de fotopatronen te visualiseren, verwijdert u het overtollige reactiebuffer door voorzichtig langs de randen van de hydrogel met een tissue te vegen. Pipetteer het reagens van Ellman direct op het oppervlak van de gel. Beeld het onmiddellijk af met een lichtmicroscoop bij 10x of met een stereomicroscoop uitgerust met een kleurencamera.Verzamel de cellen en bereid ze voor op inkapseling zoals beschreven in het tekstprotocol. Suspendeer de gepelletteerde cellen direct na het aspireren van PBS in de precursoroplossing tot een uiteindelijke concentratie van vijfduizend cellen per µL. Laat een passende concentratie vrije thiolgroepen over voor de latere reactie met het penton-peptide.Indien fotopatronering gewenst is: vorm, polymeriseer en patroneer de hydrogels zoals voorheen. Spoel de gels na de patronering drie keer gedurende 10 minuten in groeimedium om ongereageerde stoffen en overtollige lithiumfosfaat-foto-initiator te verwijderen.Incubeer de gels in groeimedium bij 37 °C en vijf procent CO2 tot het gewenste tijdstip voor verdere analyse. Vul het medium elke 48 uur aan, of zoals bepaald door de toepassingen. Om de levensvatbaarheid van de ingekapselde cellen te bepalen, verwijdert u eerst het groeimedium uit de gels en spoelt u deze drie keer gedurende 15 minuten met PBS om de diffusie van het medium uit de gels mogelijk te maken.Voeg twee µL van de ontdooide 2 mM ethidium homodimer-1 en 0,5 µL van de ontdooide 4 mM calcium AN-oplossingen toe aan één mL steriele PBS. Vortex om volledige menging te garanderen. Voeg 300 µL van de standoplossing toe aan elke spuitvormgel in de 48-well platen, of voldoende om het oppervlak van de gel op een glazen objectglas in een steriele schaal te bedekken.Incubeer vervolgens gedurende 45 minuten. Verwijder de overtollige oplossing en spoel om de resterende kleurstof uit de gels te verwijderen. Beeld de cellen af met een confocale microscoop.Of op een epifluorescentiemicroscoop met een 10x objectief, en 488 nanometer excitatie en 525 nanometer emissie. De vrije thiolconcentratie van niet-gepatroneerde en gepatroneerde hydrogels, gekwantificeerd met de methode van Ellman, toonde aan dat hydrogels die aanvankelijk één minuut en vijf minuten polymeriseerden statistisch vergelijkbare vrije thiolconcentraties hebben, wat duidt op een snelle reactie en volledige gelering binnen één minuut.Vervolgwijze bulkpatronering van de gels die 30 minuten en 1 uur en 30 minuten waren geïncubeerd met penton-peptiden, vertoonden een reductie van 60 tot 80 procent in de vrije thiolconcentratie, wat duidt op een efficiënte modificatie van de overtollige thiol. Fotopatronen, gevormd door licht te schijnen door monsters die bedekt waren met maskers (hier geprint met lijnen), kunnen in twee dimensies worden waargenomen met behulp van het reagens van Ellman. Of in drie dimensies door de incorporatie van fluorescerende peptiden bij daaropvolgende beeldvorming.Volwassen menselijke stamcellen, ingekapseld in hydrogels, werden behandeld met kleurstoffen voor viabiliteit en hydrotoxiciteit. Vervolgens werden deze gevisualiseerd met confocale microscopie. Levensvatbare cellen zonder membraanschade zijn groen gelabeld, wat duidt op het overleven van de cellen één dag na inkapseling.Cellen beginnen zich zes dagen na inkapseling in de matrix te verspreiden, zoals getoond in de inzetafbeelding. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om steriele en zorgvuldige hanteringsprocedures te handhaven om schade aan de cellen na inkapseling door de introductie van contaminanten of mechanische afschuifkrachten te voorkomen.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals immunokleuring, flowcytometrie en genexpressie-analyses, worden uitgevoerd om de celfunctie en het lot van cellen in reactie op de extracellulaire omgeving te bestuderen. Deze techniek biedt onderzoekers in de velden biologie, bio-engineering en geneeskunde de mogelijkheid om weefselregio-erosie of ziekteprogressie te bestuderen in synthetische extracellulaire matrices met door de gebruiker gedefinieerde eigenschappen, met als doel de ontwikkeling van nieuwe behandelstrategieën. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u cellen kunt inkapselen en zachte matrices kunt patroonen voor gecontroleerde celkweekstudies.

light-mediated-formation-patterning-hydrogels-for-cell-culture

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We presenteren protocollen voor de 3-dimensionale (3D) het inkapselen van de cellen binnen synthetische hydrogels. De inkapseling procedure is beschreven voor de twee meest gebruikte methodes van verknoping (michael-type naast en licht geïnitieerde vrije radicalen mechanismen), evenals een aantal technieken voor het beoordelen van ingekapselde cel gedrag.

Cellulaire Encapsulation in 3D Hydrogelen voor Tissue Engineering

In dit protocol, tonen we de fabricage van een Microactuator reeks van verticaal verschoven berichten op de technologie gebaseerd is, en hoe deze basistechnologie kunnen worden gewijzigd om high-throughput mechanisch dynamische celkweek te voeren in zowel twee-dimensionale en drie-dimensionale cultuur paradigma's.

Microfabricated Platforms voor Mechanisch Dynamic Cel Cultuur

Eenvoudige technieken worden beschreven voor de snelle productie van microfabricated neurale cultuur systemen met behulp van een digitale microspiegeltjes voor dynamische masker projectie lithografie op regelmatige celcultuur substraten. Deze cultuur systemen kunnen meer representatief zijn voor natuurlijke biologische architectuur, en de beschreven technieken kan worden aangepast voor tal van toepassingen.

Fabricage van micropatterned Hydrogelen voor Neurale Cultuur Systems met behulp van Dynamic Mask Projectie Fotolithografie

Een bioprinter werd gebruikt om gevormde hydrogelen gebaseerd op een offer mal maken. De poloxamer mal werd opgevuld met een tweede hydrogel en vervolgens geëlueerd, waardoor holtes die gevuld waren met een derde hydrogel. Deze methode maakt gebruik van snelle elutie en goede bedrukbaarheid van poloxameer om complexe architecturen uit biopolymeren genereren.

Afdrukken warmteresponsieve Reverse Mallen voor de schepping van Patterned Hydrogelen Twee-component voor 3D Cell Culture

We beschrijven de fabricage van microgepatternde hydrogelvellen met behulp van een eenvoudig proces, dat kan worden geassembleerd en gemanipuleerd in een zelfstandige vorm. Met behulp van deze modulaire hydrogelvellen kan een eenvoudig macro-geschaald 3D-celkweeksysteem worden gegenereerd met een gecontroleerde cellulaire micro-omgeving.

Bouw van modulaire Hydrogel Sheets voor micropatterned Macro-schaal 3D Cellular Architecture

Förster resonance energy transfer (FRET) beeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor real-time celbiologie studies. Hier een werkwijze voor FRET beeldvorming cellen in fysiologische driedimensionale (3D) hydrogel microenvironments middels conventionele epifluorescentie microscopie wordt gepresenteerd. Een analyse voor ratiometrische FRET probes die lineaire verhoudingen over de activering bereik oplevert wordt beschreven.

FRET Imaging in Driedimensionale Hydrogels

Dit is een methode om een ​​3-dimensionale celcultuur scaffold aan pulmonale extracellulaire matrix te creëren. Intact long verwerkt tot hydrogelen die de groei van cellen in drie dimensies kan ondersteunen.

Tunable Hydrogels van Pulmonary extracellulaire matrix voor 3D-Cell Culture

Verschillende methoden voor het manipuleren van driedimensionale architectuur in hydrogels op basis van eiwitten zijn hier geëvalueerd met betrekking tot de eigenschappen van het materiaal. De macroporeuze netwerken zijn matiemaatschappij met een peptide cel-lijm, en hun haalbaarheid in celkweek wordt geëvalueerd met behulp van twee verschillende model cellijnen.

Gemakkelijke manipulatie van platforms in op basis van eiwitten Hydrogels voor cel cultuur toepassingen

Bij deze methode, wij gebruiken photopolymerization en klik op chemie technieken proteïne of peptide om patronen te creëren op het oppervlak van polyethyleenglycol (PEG) hydrogels, verstrekken geïmmobiliseerd bioactieve signalen voor de studie van cellulaire reacties in vitro .

Patronen van bioactieve eiwitten of peptiden op Hydrogel Fotochemie voor biologische toepassingen gebruiken

Het gebruik van fotoafbreekbare hydrogels om bacteriële cellen te isoleren door gebruik te maken van een lichtpatiteringstool met hoge resolutie wordt gerapporteerd. Essentiële experimentele procedures, resultaten en voordelen van het proces worden beoordeeld. De methode maakt een snelle en goedkope isolatie mogelijk van gerichte bacteriën met zeldzame of unieke functies uit heterogene gemeenschappen of populaties.

Fotoafbreekbare hydrogelinterfaces voor screening, selectie en isolatie van bacteriën

Het huidige protocol beschrijft een experimenteel platform om de effecten van mechanische en biochemische signalen op chemotherapeutische reacties van patiënt-afgeleide glioblastoomcellen in 3D matrix-mimetische culturen te beoordelen met behulp van een op maat gemaakt UV-verlichtingsapparaat dat high-throughput photocrosslinking van hydrogels met instelbare mechanische kenmerken mogelijk maakt.

Hydrogel-arrays maken een verhoogde doorvoer mogelijk voor screeningseffecten van matrixcomponenten en therapeutica in 3D-tumormodellen

Leer licht-gemedieerde vorming en patroonvorming van hydrogels voor 3D-celkweek. Deze methode maakt gebruik van fotoklikchemie voor celinkapseling en het bestuderen van celgedrag in gecontroleerde omgevingen.

Light-gemedieerde Vorming en patroonvorming van hydrogels voor Cultuur van de Cel Applications

Meer video's verkennen