Light-gemedieerde Vorming en patroonvorming van hydrogels voor Cultuur van de Cel Applications

Het algemene doel van deze procedure is om cellen te vormen, te patrooneren en te omhullen binnen synthetische polymeer gebaseerde extracellulaire matrices. Deze methode kan worden gebruikt om kritische biologische vragen aan te pakken die verband houden met de identificatie van extracellulaire signalen die celreacties reguleren binnen een heterogeen micro-omgeving. Het grootste voordeel van deze techniek is dat een robuuste synthetische matrix wordt gegenereerd voor celinkapsling en -kweek met behulp van protocollen en toegankelijke materialen.

Deze methode kan worden gebruikt voor gecontroleerde celkweek en om celreacties in vitro te bestuderen. Het kan worden toegepast op andere systemen, inclusief geneesmiddelafgifte en weefselengineering. Bereid de materialen voor voor hydrogelvorming zoals beschreven in het tekstprotocol.

Bevestig een collimating lens aan het uiteinde van de met vloeistof gevulde lichtgeleider om een relatief gelijkmatige lichtintensiteit over alle monsters te garanderen. Pas de afstand van de lichtgeleider tot de monsters aan om een spotgrootte te bereiken die de gewenste monsters zal bedekken. Om niet-gepatroonde hydrogels te maken, bereid dikke hydrogels gegoten in spuittips voor door 10 tot 20 microliters van de gelprecursoroplossing in de punt van een steriele gesneden spuit te pipetten.

Maak een enkele gel per spuit om deze ongeveer 0,5 tot 1,5 millimeter dik te maken, op basis van volume en spuitdiameter. Bereid dunne hydrogels in glasplaatmatrijzen voor door de rubberen afdichting rond de randen van de niet-gecoate glasplaat te plaatsen. Pipet vervolgens vijf tot tien microliters van de gelprecursoroplossing op de niet-gecoate glasplaat.

En plaats de glasplaat bedekt met antikleeflaag bovenop de geloplossing. Bevestig de glasplaten met kleine bindklemmen om te stabiliseren. Stel de lampintensiteit in om 10 milliwatt per vierkante centimeter te bereiken op het geloppervlak voor spuittipmatrijzen of glasplaatmatrijzen.

Gebruik een radiometer om de intensiteit te detecteren. En plaats de matrijzen onder de lamp. Breng licht aan gedurende één tot vijf minuten om volledige polymerisatie van gels mogelijk te maken.

Gebruik een kortere polymerisatietijd voor gels met een hoger gehalte aan polyethyleenglycoltereftalaat. En een langere tijd voor gels met een lager gehalte om volledig gepolymeriseerde hydrogels met moduli binnen het bereik van zachte weefsels te produceren. Plaats de gels uit de spuittipmatrijzen in een steriele niet-behandelde 48-wellplaat, en plaats de glasplaten in een steriele schaal.

Om gepatroonde hydrogels te bereiden, bereid de precursoroplossing voor zoals beschreven in het tekstprotocol en pipet de oplossing krachtig om een gelijkmatige menging van de oplossing te garanderen. Bedek vervolgens voorgevormde gels met een pentonpeptide in een lithiumfosfaat foto-initiatoroplossing en incubeer gedurende één uur bij 37 graden Celsius. Na incubatie verwijdert u een overtollige oplossing.

Als gels in een spuittip worden gegoten, gebruik dan een spatel om voorzichtig over te brengen van de 48-wellplaat naar een steriele glasplaat voor patroonvorming. Plaats een fotomasker met het gewenste patroon direct bovenop gegoten gels in de spuit en glasplaat. Zorg ervoor dat het bedrukte deel van het masker het gel raakt voor optimale patroongetrouwheid.

Plaats de monsters onder de lamp en bestraal gedurende één minuut. Na patroonvorming, plaats de spuit gegoten gels in een steriele 48-well niet-weefselkweek behandelde plaat. Plaats de glasplaat gegoten gels die zijn vastgemaakt aan de glasplaten in een steriele schaal.

Spoel drie keer, 15 minuten met gekweekt medium of de juiste buffer op basis van de geplande experimenten. Om te presteren voor de detectie en kwantificering van vrije thiolen in fotogepatroonde hydrogels, bereid eerst de oplossingen voor en voer de berekeningen uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Vorm dunne hydrogels voor patroonvorming zoals eerder.

Maak specifiek gels met overtollige vrije thiolen en patroon de helft van deze monsters met het pentonpeptide met behulp van een heldere dekglas om het hele gel volledig bloot te stellen aan licht. Plaats gepatroonde en niet-gepatroonde gels in putjes van een 48-wellplaat. Spoel gedurende 15 minuten, drie keer met Ellman's reactiebuffer, om diffusie van de eindreactieve soorten uit het gel en evenwichtszwelling mogelijk te maken.

Voeg extra Ellman's reactiebuffer toe aan de spoelgels, zodat het gezwollen gelvolume met de reactiebuffer een veelvoud van 20 microliters is. Als de voorspelde gezwollen gelvolume 15 microliters is, voeg dan vijf microliters reactiebuffer toe. En als het voorspelde gezwollen gelvolume 30 microliters is, voeg dan 10 microliters reactiebuffer toe.

Pipet de sistinestandaarden in individuele putjes van een 48-wellplaat in veelvouden van 20 microliters. Afhankelijk van het volume dat in de vorige stap is gebruikt. Als de vorige stap bijvoorbeeld een gezwollen gelvolume had, plus extra reactiebuffer gelijk aan 40 microliters, voeg dan 40 microliters van elke standaard toe aan individuele lege putjes.

Verdun vervolgens Ellman's reagens en reactiebuffer. Voeg het verdunde Ellman's reagens toe aan putjes met standaarden en monsters. Voor monsters van 20 microliters, voeg 183,6 microliters oplossing toe aan elk putje.

Incubeer of plaats op een schudder gedurende één uur en dertig minuten, of tot de kleur van de oplossing overeenkomt met de kleur van de gels door visuele inspectie, om voldoende diffusie van de gele 2-Nitro-5-thiobenzoic dianion te garanderen, die wordt gegenereerd bij reactie van Ellman's reagens met vrije thiolen uit het gel. Neem 100 microliters oplossing van de monsters en standaarden en plaats deze in putjes van een 96-wellplaat. Lees de absorptie bij 405 nanometer op een platelezer.

Om de fotopatronen te visualiseren, verwijder overtollig reactiebuffer door voorzichtig rond de randen van de hydrogel te wrijven met een tissue. Pipet Ellman's reagens direct op het oppervlak van het gel. Beeld onmiddellijk af op een lichtmicroscoop bij 10x of op