Name: Laser-assisted Cytoplasmatische Micro-injectie in Livestock Zygotes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Leer laserondersteunde cytoplasmatische micro-injectie in vee-zygoten voor genoombewerking met CRISPR Cas9. Deze methode maakt efficiënte levering van oplossingen mogelijk voor transgene dierproductie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Werk met betrekking tot deze techniek wordt ondersteund door NIH/NICHD RO1 HD070044 en USDA/NIFA Hatch projecten W-3171 en W-2112.

1. Micropipet Production <ol><li> injectie micropipet <ol><li> Plaats een borosilicaat glazen capillair (buitendiameter (OD): 1,0 mm, binnendiameter (ID): 0,75 mm) in een micropipet trekker (in het midden van de houders rechter en linker capillaire) en vergrendelen. </li><li> Gebruik een geschikte programma om de glazen capillair trekken, zodat het resulteert in een dunne tip met een lange tapper. (Voorbeeld: Heat: 825; Trek: 30; Velocity: 120; Tijd: 200; Pressure: 500). </li><li> Haal de getrokken pipetten uit het apparaat en plaats het op een microforge in een horizontale positie. </li><li> Breng de getrokken pipet en de microforge verwarming filament met zijn glazen kralen in beeld. Gebruik het oculair reticule tot de gewenste dikte te meten en zet de pipet horizontaal totdat het verhitterfilament het doel binnendiameter (5 pm) bereikt. </li><li> Pas de warmte tot ongeveer 45% en voorzichtig breng de pipet naar beneden, zodat het de gloeidraad raakt. Activeer even de kachel. dit wziek enigszins smelt de pipet, zodat het voldoet aan de gloeidraad en bij afkoeling, zal de pipet te breken bij het contactpunt het genereren van een rechte snede. Opmerking: de juiste temperatuurinstelling sleutel in deze stap, omdat te hoge temperaturen de pipet bocht maakt en dus een rechte snede niet mogelijk en temperatuur te laag niet voldoende om de pipet (figuur 1A) smelten. </li><li> Maak een geschatte hoek van 30 ° in de buurt van de pipet tip door het plaatsen van het ongeveer 10 micrometer uit de buurt van de verwarming filament. Stel de temperatuur in op 60% en de verwarming activeert. Opmerking: Dit zal de pipet buigen over de gloeidraad. Deze hoek is gewenst dat de punt van de naald parallel aan het oppervlak van de injectieplaat bij montage in de injector (Figuur 1B). </li><li> Handvat micro-injectie pipetten met de nodige voorzichtigheid als ze zijn zeer scherp en kwetsbaar. </li></ol></li><li> Holding micropipet <ol><li> Plaats een borosilicat glazen capillair (OD: 1,0 mm, ID: 0,75 mm) in een micropipet trekker (in het midden van de houders rechter en linker capillaire) en vergrendelen. </li><li> Gebruik een geschikte programma om de glazen capillair trekken, zodat het resulteert in een dunne tip met een lange, zelfs taps en parallelle wanden (Voorbeeld: Heat: 815; Trek: 20; Velocity: 140; Tijd: 175; Pressure: 200). </li><li> Haal de getrokken pipet uit de trekker apparaat en plaats het op de microforge houder in een horizontale positie. Pas de focus op de verwarming filament en pipet. </li><li> Gebruik het oculair vizier naar de pipet diameter meten en beweeg de pipet totdat de diameter over de gloeidraad 180 pm bereikt. </li><li> Op de aangegeven maten, merk de glazen capillair met een diamant tip pen, en dan zachtjes druk op de trok tip om het glas te breken. Dit moet resulteren in een rechte snede (figuur 1C). </li><li> Verplaats de pipet om verticaal met de punt dicht bij de gloeidraad. Stel de temperatuur<html> van de microforge tot 60%. </li><li> Brand-polish de punt van de pipet met standaardtechnieken 7 tot deze een ID van 40 urn bereikt. Gebruik het oculair vizier om de ID (figuur 1D) te controleren. </li><li> Maak een hoek op de pipet. <ol><li> Breng de pipet naar een horizontale positie ongeveer 10 urn van het filament en 5 mm van de punt. Stel de temperatuur tot ongeveer 60% en activeren van de verwarming de pipet via filament buigen. Verhit tot een gewenste hoek (ongeveer 30 °) bereikt. Controleer de hoek visueel (figuur 1E). Opmerking: De pipet is meestal gemonteerd op de microinjector in een hoek van circa 60 ° ten opzichte van de bodem van de schotel injectie. De punt van de pipet wordt gebogen, zodat het evenwijdig aan de bodem van de schaal, die nodig is voor de juiste injectie van het embryo in het middenvlak is. </li></ol></li></ol></li></ol>le &quot;&gt; 2. micromanipulator Setup <ol><li> Controleer of de microinjectors volledig geladen met olie en dat er geen luchtbellen in het systeem (bellen in het microinjector voorkomen fijne controle van de injectie). </li><li> Controleer of de micromanipulators zijn in de middelste stand. Dit zal zorgen voor een breed scala van de beweging van de pipetten. </li><li> Plaats de pipet die in de micromanipulator houder linker en de injectie pipet in de juiste micromanipulation houder. </li><li> Laat de olie in de pipetten te gaan door capillaire werking en controleer of het systeem goed werkt door op en neer bewegen van olie in de pipet met behulp van de microinjector controles. Let op: Als er geen beweging van olie in de naalden, kan er een klomp te zijn. In dit geval, gebruik dan een nieuwe naald. </li><li> Gebruik de micromanipulator controles om de pipetten in het centrum van het gezichtsveld van de microscoop brengen. Met behulp van 4X vergroting, controleren of de micropipet tips zijn in de juiste hoek (parallel naar de bodem van de schaal). Opmerking: Een correcte opstelling van de naalden is de sleutel voor een succesvolle injectie en voor resultaten consistentie. </li><li> IJk het lasersysteem na kalibratie van de fabrikant handleiding. </li></ol> 3. Bereiding van Injectie Dish (figuur 2) <ol><li> Plaats een 50 ul druppel verwarmd (37 ° C) SOF-HEPES (samenstelling beschreven in de paragraaf materialen) aangevuld met 20% foetaal runderserum (FBS) op het midden van het deksel van een 100 mm petrischaal. Plaats een 1-2 ul druppel van de oplossing te injecteren dicht bij de injectie druppel. Zorg ervoor dat de embryo&#39;s niet af te koelen onder de RT. Opmerking: In dit protocol zullen we de Dextran rode kleurstof toevoegen injectie oplossing kunnen de injectieplaats visualiseren en volgen later. </li><li> Bedek de druppels in de injectie plaat met behulp van ongeveer 10 ml van minerale olie. </li><li> Plaats de injectie schotel op het stadium van het omgekeerde microscoop en breng de pipEttes in de injectie druppel. Controleer of de naalden zijn in focus in de drop. Passen hun hoogte indien nodig met de micromanipulator controles. </li><li> Met een microdispenser, laadt ongeveer 20-30 zygoten (17-20 uur na bevruchting (HPF)) in de bovenzijde van de injectie druppel. Voer injectie op kamertemperatuur zodat het aantal embryo&#39;s in de druppel injectie wordt bepaald door de snelheid waarmee de persoon die kan injecteren. Niet meer embryo niet laden dan degene die in 30 minuten kan worden geïnjecteerd. <ol><li> Om de embryo&#39;s in de microdispenser te laden, op de zuiger volledig en dompel de punt in de oplossing die de embryo&#39;s. Raak de embryo&#39;s om te worden opgehaald met de punt van de glazen capillair (één op het moment) en langzaam los van de zuiger, zodat elk embryo komt in de capillaire. Herhaal dit totdat alle embryo&#39;s worden opgenomen of de microdispenser capaciteit is vol. </li><li> Om de geladen embryo&#39;s vrij te geven, drukt u de zuiger voorzichtig tot het gehele volume containing de embryo vrijkomt uit het capillair. </li></ol></li></ol> 4. Micro-injectie <ol><li> Met behulp van de 4X doel, laadt u de oplossing in de injectie pipet worden geïnjecteerd door het toepassen van negatieve druk (opzuigen). Laad afdoende oplossing te injecteren 2-3 zygoten. Ga dan naar de injectie druppel. </li><li> Binnen de injectie drop, verplaatsen de holding pipet, zodat de tip komt dicht bij een zygote. Solliciteer negatieve druk (aspireren) samen met het bedrijf microinjector zodat de zygote wordt bevestigd aan het bedrijf pipet en wijziging van een 20x doelstelling. </li><li> Zodra de zygote het aanhouden pipet is bevestigd, controleert de kwaliteit ervan met behulp van het injecteren pipet om voorzichtig te bewegen het embryo zonder los te maken. Een goede kwaliteit zygote dienen beide polaire lichamen (hoewel soms slechts één zichtbaar) en een homogeen cytoplasma. Niet injecteren abnormale zygoten (figuur 3A). </li><li> Indien nodig, de positie van de embryo voor een goede injectielocatie. Een goede positionering zou zijn dat waar er enige ruimte tussen de ZP en PM, zodat de PM niet beschadigd door de laser. </li><li> Controleer of de injectiepipet wordt op het embryo middenvlak door voorzichtig de zygote op de injectieplaats raken. Als het niet op het middenvlak, de naald de neiging om het embryo te roteren in plaats van de punctie. De hoogte van de injectiepipet indien nodig. </li><li> Een gat in de ZP behulp van een laser (figuur 3B). <ol><li> Met de laser software plaats de laser dradenkruis in de ZP waar het gat wordt gemaakt (aan de kant waar het embryo tot het bedrijf pipet bevestigd). Met behulp van de laser controle venster klik op de vuurknop. Blijft de grootte van het gat groot genoeg is om een ​​opening in de ZP van de naald maken te passeren zonder schade aan de PM (Voorbeeld: 0,662 msec pulsduur / 6,9 um gat grootte). </li></ol></li><li> Steek de injectienaalddoor het gat in de ZP en contact maken met de PM. Ga door het indrukken van de pipet naar voren totdat de naald is ¾ van de weg naar het embryo (Figuur 3C). </li><li> Op de positie van de meniscus bij de oplossing interfase-olie, omdat dit wordt gebruikt om consistent injectievolume regelen. </li><li> Toepassen onderdruk (aspiraat) op de injectie pipet, wat zal resulteren in PM en cytoplasma wordt ingeademd in de injectienaald. Doorgaan tot het verkeer van cytoplasma in de naald versnelt of wanneer cytoplasma inhoud mengen met injectieoplossing te zien. Deze zullen breuk van de PM (figuur 3D) te geven. </li><li> Injecteer terug de cytoplasmatische inhoud gevolgd door de oplossing in het cytoplasma van de zygote door toepassing van positieve druk (injecterende), totdat de meniscus aan de oplossing-olie interfase is geavanceerd equivalente diameter een zygote verleden uitgangspunt. Let op: Onder onze voorwaarden, deze vertegenwoordigt ongeveer 7 pl van geïnjecteerde oplossing (figuur 3E). </li><li> Wijziging van een 4X doelstelling en verplaats de geïnjecteerde embryo / s aan de onderkant van de injectie druppel. Laat het embryo door het toepassen van positieve druk op het bedrijf microinjector. Houd de niet-geïnjecteerde embryo&#39;s aan de bovenzijde en de geïnjecteerde die op de onderzijde van de druppel te helpen houden van de geïnjecteerde / niet-geïnjecteerde embryo en efficiënt werken. </li></ol> 5. Embryo Herstel en Injection Resultaten <ol><li> Voeg 3 druppels van ongeveer 200 pi in een nieuwe schaal met voorverwarmd SOF-HEPES. Verzamel de geïnjecteerde embryo&#39;s met een microdispenser (zoals hierboven beschreven). Was de geïnjecteerde embryo&#39;s door ze te verplaatsen door middel van de 3 SOF-HEPES daalt. </li><li> Tel de embryo&#39;s gelyseerd tijdens micro-injectie en gooi ze weg. Opmerking: Een gelyseerd zygote kan gemakkelijk te onderscheiden van een intact zijn, want de eerste doorschijnende verschijnt, vul het hele ZP, en het heeft meestal cytoplasmainhoud lekken naar de buitenzijde van het embryo. </li><li> Optioneel, controleer dan de micro-injectie-efficiëntie met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Wees ervan bewust dat blootstelling aan UV-licht embryo schade die van invloed kan zijn verdere ontwikkeling kan induceren. </li><li> Cultuur groepen van 25 geïnjecteerde embryo&#39;s in 50 pl druppels kalium simplex optimalisatie medium (KSOM) aangevuld met 4 mg / ml runderserumalbumine (BSA) onder minerale olie bij 38,5 ° C, 5% CO2 in lucht en vocht tot verzadiging. </li><li> Vul het kweekmedium met 5% FBS twee dagen na de injectie. </li><li> Controleer blastocyst (BL) tarieven 7 dagen na de injectie. Bereken BL tarieven als het totale aantal blastocyst embryo&#39;s / totaal aantal embryo&#39;s gekweekt in die druppel. </li></ol>

<ol><li>McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+composition+of+lipids+in+immature+cattle%2C+pig+and+sheep+oocytes+with+intact+zona+pellucida%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida.</a> J Reprod Fertil. 118 (1), 163-170 (2000).</li>
<li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li>
<li>Ross, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parthenogenetic+activation+of+bovine+oocytes+using+bovine+and+murine+phospholipase+C+zeta%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta.</a> BMC Dev Biol. 8 (1), (2008).</li>
<li>Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jumonji+domain-containing+protein+3+regulates+histone+3+lysine+27+methylation+during+bovine+preimplantation+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2400-2405 (2012).</li>
<li>Bogliotti, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4+Developmental+outcomes+and+effiency+of+two+CRISPR%2FCas9+microinjection+methods+in+bovine+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Fertil+Dev%22%5BJournal%5D)">4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes.</a> Reprod Fertil Dev. 27 (1), 94-94 (2015).</li>
<li>Bakhtari, A., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DPPA3+prevents+cytosine+hydroxymethylation+of+the+maternal+pronucleus+and+is+required+for+normal+development+in+bovine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos.</a> Epigenetics. 9 (9), 1271-1279 (2014).</li>
<li>Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+process+of+polishing+borosilicate+glass+capillaries+used+for+fabrication+of+in-vitro+fertilization+%28iVF%29+micro-pipettes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes.</a> Biomed Microdevices. 10 (1), 123-128 (2008).</li>
<li>Sutter Instrument. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pipette+Cookbook+2015+P-97+%26+P-1000+Micropipette+Pullers%22">Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers</a>. , Sutter Instrument. 
 <a target="_blank" href="www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf">www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf</a> (2015).</li>
<li>Sutter Instrument. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22P-97+Flaming%2FBrownTM+Micropipette+Puller+Operation+Manual+Rev.+2.30+-+DOM+%2820140825%29%22">P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825)</a>. , 
 <a target="_blank" href="www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf">www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf</a> (2014).</li>
<li>Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCibelli%2C+JB+%22Principles+of+cloning%22">Principles of cloning</a>. , Academic Press. (2002).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+reporter+gene+after+microinjection+of+mammalian+artificial+chromosomes+into+pronuclei+of+bovine+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes.</a> Mol Reprod Dev. 60 (4), 433-438 (2001).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Micro-injectie van zygoten is een bekende methode voor het introduceren van oplossingen in zoogdierlijke embryo. Bij sommige variaties afhankelijk van de soort en het doel van het experiment, kan deze techniek ruimer toegepast. We zien hoe intracytoplasmatische microinjectie uitvoeren aan laser naar de ingang van een stompe uiteinden micropipet staan. Zygoten van sommige diersoorten (zoals runderen, schapen en varkens) een donkere cytoplasma, belemmeren de visualisatie van de injectiepipet eenmaal in het embryo. Ook hun...

Cytoplasmatische micro-injectie van 1-cel embryo is een zeer krachtige techniek. Het kan worden gebruikt voor het afleveren van elke oplossing in het embryo, bijvoorbeeld, produceren gen knock-outs voor bestudering van genfunctie of gen aangepast dieren te genereren. De meeste landbouw-relevante boerderijdier zygoten hebben een zeer hoge vetzuursamenstelling dat hun cytoplasma ondoorzichtig en donker 1 maakt. Ze hebben ook een vrij elastisch plasmamembraan (PM). Deze eigenschappen maken van micro-injectie met behulp van conventionele pronucleaire / cytoplasmatische injectie zoals gebruikt in knaagdieren uitdagende en vaak onnauwkeurig. Cytoplasmatische micro-injectie heeft voordelen ten opzichte pronucleaire microinjectie omdat het makkelijker uit te voeren en veroorzaakt ook minder schade aan de geïnjecteerde embryo, wat resulteert in hogere levensvatbaarheid 2. Het algemene doel van dit protocol is om een ​​succesvolle methode te demonstreren voor het leveren van oplossingen in het cytoplasma van de boerderij dierlijke zygoten. Om te kunnen presterencytoplasmatische micro-injectie met een hoge efficiëntie op vee embryo wordt een laser gebruikt om een ​​gat in de zona pellucida (ZP) en vervolgens een stompe uiteinden glazen naald wordt gebruikt voor de micro-injectie genereren. Deze strategie is gericht op de mechanische schade afgedrukt op het embryo tijdens de injectie te verminderen. Vervolgens aspiratie cytoplasmatische inhoud binnen de injectienaald maakt een efficiënte en zekere breuk van de PM verzekeren dat de oplossing in het cytoplasma van de embryo wordt geleverd. Deze techniek werd reeds met succes toegepast in runderembryo&#39;s naar siRNA geven in de zygotische cytoplasma 3,4 en mutaties met de geclusterde regelmatig op afstand van elkaar korte palindroom repeats (CRISPR) / CRISPR systeemcomponent 9 (Cas9) systeem 5 genereren. Het is ook geschikt (met kleine wijzigingen) aan runder-cumulus ingesloten oöcyten 6 injecteren. Hier hebben we onze injectieprotocol leveren van een kleurstof beschreven, kunnen die welke voor het injecteren van elke des teIRED oplossing in de zygote, en laten zien dat met deze techniek geeft vrijwel geen lysis en heeft geen invloed op de vroege embryonale ontwikkeling.

<table><tbody><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Sutter instruments</td><td>B100-75-10</td><td>Deze capillairen worden gebruikt voor het maken van de houd- en injectiepipetten. Elke dik/standaardwandige borosilicaatbuis zonder gloeidraad kan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-9</td><td>Uitgerust met een 10X vergrotingslens.</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Nikon/ Narishige</td><td>NT88-V3</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde microscoop</td><td>Nikon</td><td>TE2000-U</td><td>Uitgerust met 4X, 20X lenzen en met een lasersysteem.</td></tr><tr><td>Laser</td><td>Research Instruments</td><td>7-47-500</td><td>Saturn 5 Active laser.</td></tr><tr><td>Microdispenser</td><td>Drummond</td><td>3-000-105</td><td>De microdispenser wordt gebruikt om de embryo's te verplaatsen. Een p10 pipet kan ook worden gebruikt, maar met zo min mogelijk volume.</td></tr><tr><td>100 x 15 mm kweekschaal</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>Gebruik het deksel van de schaal om de injectieplaat te maken, omdat ze lagere wanden hebben en het positioneren en verplaatsen van de micromanipulator gemakkelijker maken. Het deksel van een 60 mm kweekschaal kan ook worden gebruikt.</td></tr><tr><td>35 mm kweekschaal</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>Deze schalen worden gebruikt voor het kweken van de embryo's in druppels van 50 µl bedekt met minerale olie. Alternatief kan ook een 4-kamerschaal worden gebruikt. Ongeacht de schotel die wordt gekozen om de embryo's te kweken, ze moeten altijd minstens 4 uur in de incubator worden geëquilibreerd voordat de embryo's erin worden overgebracht.</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td>Elke incubator die kan worden ingesteld op 38,5 °C, 5% CO2-omstandigheden kan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td>Gebruikt voor het visualiseren van de embryo's in de kweekdruppels en tijdens het wassen. Elke stereomicroscoop met een 10X vergroting kan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Control Unit HT</td><td>Minitube</td><td>12055/0400</td><td>Verwarmingssysteem bevestigd aan de stereomicroscoop.</td></tr><tr><td>Verwarmde microscooptafel</td><td>Minitube</td><td>12055/0003</td><td>Verwarmingssysteem bevestigd aan de stereomicroscoop.</td></tr><tr><td>Dextran-Red</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1828</td><td>Een steriele oplossing van 10 mg/ml wordt gebruikt om te injecteren.</td></tr><tr><td>Minerale olie</td><td>sigma</td><td>M8410</td><td>Bewaar de minerale olie op kamertemperatuur en beschermd tegen licht met aluminiumfolie.</td></tr><tr><td>KSOMaa Evolve Bovine</td><td>Zenit</td><td>ZEBV-100</td><td>Aangevuld met 4 mg/ml BSA. KSOM-platen voor embryocultuur moeten minstens 4 uur in een incubator worden geëquilibreerd voor gebruik.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-525</td><td>Gebruik een stamcel gekwalificeerd FBS.</td></tr><tr><td>Zygoten</td><td></td><td></td><td>Zygoten worden geïnjecteerd 17 - 20 hpf en kunnen in-vitro- of in-vivo-afkomstig zijn.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>Eindconcentratie: 107,7 mM. Component van SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Eindconcentratie: 7,16 mM. Component van SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Eindconcentratie: 1,19 mM. Component van SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>Eindconcentratie: 0,49 mM. Component van SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Natrium DL-lactaat</td><td>Sigma</td><td>L4263</td><td>Eindconcentratie: 5,3 mM. Component van SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>CaCl2-2H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>Eindconcentratie: 1,71 mM. Component van SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>D-(&minus;)-Fructose&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F3510</td><td>Eindconcentratie: 0,5 mM. Component van SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Eindconcentratie: 21 mM. Component van SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>Eindconcentratie: 1x. Component van SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>BME-EAA</td><td>Sigma</td><td>B6766</td><td>Eindconcentratie: 1x. Component van SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Eindconcentratie: 4 mM. Component van SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Sigma</td><td>P4562</td><td>Eindconcentratie: 0,33 mM. Component van SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050</td><td>Eindconcentratie: 1 mM. Component van SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-3311</td><td>Eindconcentratie: 1 mg/ml. Component van SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Gentamycine</td><td>Sigma</td><td>G-1397</td><td>Eindconcentratie: 5 µg/ml. Component van SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Water voor embryo-overdracht</td><td>Sigma</td><td>W1503</td><td>Component van SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>SOF-HEPES medium</td><td>Gemaakt in het lab</td><td></td><td>pH 7,3 - 7,4, 280 ± 10 mOs. Filter gesteriliseerd door een 22 µm filter kan 1 maand in de koelkast bij 4 °C worden bewaard. Warm in 37 °C waterbad voor gebruik.</td></tr></tbody></table>

laser-assisted cytoplasmatische micro-injectie in livestock zygotes

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmatische micro-injectie in eencellig-embryo's is een zeer krachtige techniek. Als voorbeeld, maakt het de levering van genoombewerkingstools mogelijk die genetische modificaties kunnen creëren die aanwezig zullen zijn in elke cel van een volwassen organisme. Het kan ook worden gebruikt om siRNA, mRNA's of blokkerende antilichamen af te leveren om genfunctie in preimplantatie-embryo's te bestuderen. De conventionele techniek voor het micro-injecteren van embryo's die bij knaagdieren wordt gebruikt, bestaat uit een zeer dunne micropipet die rechtstreeks het plasmamembraan penetreert wanneer deze in het embryo wordt voortgeduwd. Wanneer deze techniek wordt toegepast op vee, resulteert dit meestal in een lage efficiëntie. Dit komt voornamelijk omdat in tegenstelling tot muizen en ratten, bovine, ovine en porcine zygoten een zeer donker cytoplasma en een zeer elastisch plasmamembraan hebben, waardoor visualisatie tijdens injectie en penetratie van het plasmamembraan moeilijk te bereiken is. In dit protocol beschrijven we een geschikte micro-injectiemethode voor de aflevering van oplossingen in het cytoplasma van runder-zygoten die ook succesvol is gebleken voor schapen- en varkensembryo's. Eerst wordt een laser gebruikt om een gat in de zona pellucida te maken. Vervolgens wordt een stomp eind glas micropipet door het gat geïntroduceerd en geavanceerd tot de punt van de naald ongeveer 3/4 in het embryo bereikt. Dan wordt het plasmamembraan gebroken door aspiratie van cytoplasmatisch materiaal in de naald. Ten slotte wordt het afgezogen cytoplasmatisch materiaal gevolgd door de oplossing van belang, teruggeïnjecteerd in het embryonale cytoplasma. Dit protocol is met succes gebruikt voor de aflevering van verschillende oplossingen in boviene en ovine zygoten met 100% efficiëntie, minimale lysis en normale blastocysten ontwikkelingssnelheden.

Laser-assisted cytoplasmatische microinjectie is een krachtige en betrouwbare protocol oplossingen in het cytoplasma van vee zygoten. Figuur 3 toont een algemeen overzicht van de zygoten voor en na injectie en de totale omtrek van de techniek. Dextran-rood wordt toegepast als injecteren oplossing volgstation van injectie en injectie efficiëntie en nauwkeurigheid mogelijk. Succesvolle levering van de oplossing is geïllustreerd in figuur 4 toont een recent...

Dit protocol laat zien hoe cytoplasmatische micro-injectie in zygoten van boerderijdieren kan worden uitgevoerd. Deze techniek kan worden gebruikt om elke oplossing in de eencellige embryo te brengen, zoals genoombewerkingstools om knock-out dieren te genereren.

Laser-assisted Cytoplasmatische Micro-injectie in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Het algemene doel van deze procedure is om met behulp van een laser en een stompe naald effectief oplossingen in het cytoplasma van zygote van vee te injecteren. Deze methode wordt gebruikt in onderzoek en in het veld van dierlijke transgenese; aangezien deze kan worden gecombineerd met een genoombewerkingsinstrument, zoals een CRISPR Cas9-systeem, kunnen er op een zeer eenvoudige en betrouwbare manier nieuwe koeien worden gecreëerd om genfuncties en transgene dieren te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden gebruikt om elke willekeurige oplossing in het cytoplasma van zygote van grote dieren te brengen.Met een bekwame uitvoering van de injectie-efficiëntie worden de percentages lever-lomotil bij dieren geminimaliseerd. Bereid eerst de injectiemicropipet voor door een borosilicaatglascapillair in een micropipet-trekker te plaatsen en deze te vergrendelen. Gebruik een geschikt programma om het capillair te trekken, zodat een dunne tip met een lange taps toelopende vorm ontstaat.Verwijder vervolgens voorzichtig de uitgetrokken pipetten uit het apparaat en plaats deze horizontaal op een microforge. Stel de uitgetrokken pipet en het verwarmingsfilament van de microforge, inclusief de glaskraal, scherp. Gebruik het oculairretikel om de gewenste dikte te meten en verplaats de pipet horizontaal totdat het verwarmingsfilament de doelbinnendiameter van 5 µm bereikt.Stel de warmte in op ongeveer 45% en breng de pipet voorzichtig naar beneden zodat deze de filament raakt. Activeer vervolgens kort de verwarming. Hierdoor smelt de pipet lichtjes waardoor deze aan de filament hecht, en bij het afkoelen zal de pipet op het contactpunt breken, wat resulteert in een rechte snede.Het instellen van de juiste temperatuur is cruciaal in deze stap. Te hoge temperaturen zullen de pipet doen buigen, terwijl te lage temperaturen onvoldoende zullen zijn om de pipet door te snijden. Maak vervolgens een hoek van ongeveer 30 graden nabij de pipetpunt door de punt op ongeveer 10 micrometers afstand van het verwarmingsfilament te positioneren.Stel de temperatuur in op 60% en activeer de verwarmer zodat de pipet over de filament buigt tot de gewenste hoek. Trek met de hier getoonde instellingen een glazen capillair om een micropipet te verkrijgen met een dunne tip, een lange, gelijkmatige taps toelopende vorm en parallelle wanden. Verwijder de getrokken pipet voorzichtig uit het trekapparaat en plaats deze in horizontale positie op de houder van de microforge.Gebruik het oculairretikel om de diameter van de pipet te meten en verplaats de pipet totdat de diameter boven de filament 180 micrometers bedraagt. Markeer de glazen capillair met een diamantpen en druk vervolgens voorzichtig op de uitgetrokken tip om het glas te breken. Dit moet resulteren in een rechte snede.Breng vervolgens de pipet in een verticale positie, waarbij de punt dicht bij de filament bevindt. Stel de temperatuur van de microforge in op 60% en vuurpolis de punt van de pipet met standaardtechnieken totdat de binnendiameter de doelmaat bereikt. Meet de binnendiameter van de pipet, welke 40 micrometers moet zijn.Buig de punt in een hoek van 30 graden met dezelfde procedure als voorheen. Plaats de vasthoudpipet in de linker houder van de micromanipulator en de injectiepipet in de rechter houder van de micromanipulator. Vul vervolgens de injectiepipet met olie.Gebruik de bedieningselementen van de micromanipulator om de pipetten in het centrum van het gezichtsveld van de microscoop te brengen. Controleer bij een 4X vergroting of de punten van de micropipetten onder de juiste hoek staan, zodat ze parallel lopen aan de bodem van de schaal. Plaats een druppel van 50 µL SOF-HEPES-oplossing van 37 °C, aangevuld met 20% FBS, op het midden van het deksel van een petrischaal van 100 mm.Plaats vervolgens een druppel van één tot twee µL van de op te spuiten oplossing dicht bij de injectiedruppel. Bedek daarna de druppels en de injectieplaat met ongeveer 10 mL minerale olie. Plaats de plaat op de microscooptafel en gebruik een microdispenser om ongeveer 20 tot 30 zygotes aan de bovenzijde van de injectiedruppel te laden.Laad de te injecteren oplossing in de injectiepipet door met het 4X objectief negatieve druk uit te oefenen met de micro-injector. Laad voldoende oplossing om twee tot drie zygoten te injecteren en beweeg vervolgens naar de injectiedruppel. Verplaats binnen de injectiedruppel de houdpipet zodat de punt dicht bij een zygote komt.Breng negatieve druk aan met de holding-micro-injector zodat de zygote wordt vastgezet aan de holding-pipet. Zodra de zygote stevig vastzit, wordt overgeschakeld naar een 20X objectief. Controleer of de injectiepipet op het middenvlak van het embryo is gepositioneerd door de zygote voorzichtig aan te raken op de injectieplaats.Als de naald zich niet op het middenvlak bevindt, zal deze de neiging hebben het embryo te laten roteren in plaats van te puncteren. Gebruik vervolgens software om de laser verticaal in de zona pellucida te plaatsen op de plek waar het gat gemaakt zal worden. Zodra de laser correct is gepositioneerd, gebruikt u het besturingsvenster van de laser en klikt u op de knop FIRE.Zorg ervoor dat de grootte van het gat voldoende is om een opening in de zona pellucida te creëren, zodat de naald kan passeren zonder het plasmamembraan te beschadigen. Voer de injectienaald door het gat in de zona pellucida en maak contact met het plasmamembraan. Duw de pipet verder naar voren totdat de naald voor 3/4 in het embryo is.Observeer de positie van de meniscus bij de grensvlak tussen de oplossing en de olie. Dit wordt gebruikt om het injectievolume consistent te controleren. Breng negatieve druk aan op de injectiepipet om het plasmamembraan en het cytoplasma in de injectienaald op te zuigen.Ga door totdat de beweging van het cytoplasma in de naald versnelt of wanneer cytoplasma-inhoud, die zich mengt met de injectie-oplossing, zichtbaar wordt. Dit duidt op het doorbreken van het plasmamembraan. Injecteer de cytoplasmatische inhoud terug, gevolgd door de oplossing in het cytoplasma van de zygote, door positieve druk uit te oefenen totdat de meniscus bij de grensvlak tussen oplossing en olie één zygote-diameter voorbij het startpunt is gevorderd.Schakel vervolgens over naar een 4X objectief en verplaats het geïnjecteerde embryo naar de onderzijde van de injectiedruppel. Laat het embryo los door positieve druk uit te oefenen op de holding micro-injector. Verzamel de geïnjecteerde embryo's met een micro-dispenser.Was de geïnjecteerde embryo's door ze door de drie druppels SOF-HEPES te bewegen en kweek ze vervolgens, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Een succesvolle aflevering van de oplossing is zichtbaar in de fluorescentie-afbeelding, waarin dexion red wordt gebruikt om de injectieplaats, de injectie-efficiëntie en de nauwkeurigheid te volgen. Hier is de kleurstof homogeen verdeeld in het cytoplasma, wat typerend is bij het gebruik van deze techniek.Dit protocol vertoont minimale lyserate in runder- en schapenzygoten. Slechts enkele van de geïnjecteerde embryo's bij runderen of schapen lyseren als gevolg van micro-injectie. Daarnaast zijn er geen statistisch significante verschillen in de blastocyste-ontwikkelingspercentages tussen de controlegroep en de geïnjecteerde groepen voor zowel runder- als schapenembryo's.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze worden uitgevoerd met een snelheid van twee embryo's per minuut. Met een handige persoon is de injectie-efficiëntie hoog, wat het aantal benodigde dierlijke blastocysten minimaliseert. Na het bekijken van deze video zou u moeten begrijpen hoe u laser-ondersteunde intracytoplasmatische micro-injectie in zygotes van vee uitvoert.En ook hoe positieve en negatieve zuigdruk kunnen worden gebruikt om het scheuren van het plasmamembraan te waarborgen voor een efficiënte aflevering.

laser-assisted-cytoplasmic-microinjection-in-livestock-zygotes

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Micro-injectie is een gevestigde en effectieve methode voor het introduceren van vreemde stoffen in bevruchte zebravis embryo's. Hier tonen we een robuuste micro-injectie techniek voor het uitvoeren van mRNA overexpressie en morfolino oligonucleotide-gen knock-down studies in de zebravis.

Micro-injectie van mRNA en morfolino antisense oligonucleotiden in zebravis embryo&#39;s.

Deze video laat zien hoe morfolino of mRNA kan worden geïnjecteerd in zebravis embryo's in het een-cellig stadium te verlagen of te verhogen van het niveau van specifieke gen-producten tijdens de verdere ontwikkeling.

Micro-injectie van de zebravis embryo&#39;s Gene functie analyseren

Deze video beschrijft een techniek van Embryo microinjection om verbindingen in Zebrafish dooierzak te leveren.

Embryo Microinjection: Een techniek om een verbinding in de Zebrafish Yolk te leveren

In this video, we demonstrate the laser-assisted permeation of the protective layer of zona pellucida in mouse fertilized eggs for facilitating lentiviral gene delivery. Lentivirus enables the generation of transgenic animals with a gene of interest stably integrated into their genome.

Laser-Assisted Lentiviral Gene Delivery: A Technique to Permeabilize Mouse Fertilized Eggs to Facilitate Lentiviral Gene Delivery

Microinjectie is een veelgebruikte techniek gebruikt om DNA constructen mRNA, morfolino antisense oligonucleotiden of andere behandelingen te leveren in eieren, embryo's en cellen van verschillende soorten.

High Throughput micro-injecties van Sea Urchin Zygotes

Methoden die morphant embryo's zijn essentieel voor ontwikkelingsstoornissen mechanismen en gen-regulatorische netwerken te bestuderen. De zee ster Patiria miniata is een opkomende modelsysteem voor deze studies. Hier presenteren we een protocol voor het verkrijgen van gameten, producerende culturen van embryo's, en snelle micro-injectie van zygoten van deze soort.

Een methode voor micro-injectie van Patiria Minata Zygotes

De mediterrane fruitvlieg (Ceratitis capitata) (Diptera: Tephritidae) is een wereldwijde plaag in de landbouw. Een dieper begrip van zijn biologie is cruciaal voor het beheersen van fruitvliegpopulaties en daarmee het verminderen van de economische impact. Micro-injectie van embryo's is een fundamenteel hulpmiddel dat zowel transformatie van de kiemlijn als reverse genetica studies in deze soort mogelijk maakt.

Levering van nucleïnezuren door middel van Embryo micro-injectie in de Worldwide Landbouw Pest Insect,<em&gt; Middellandse-Zeevlieg</em

Microinjection van zebravis embryo's en larven is een essentieel maar uitdagende techniek gebruikt in vele zebrafish modellen. Hier presenteren we een scala van microscale instrumenten om te helpen bij de stabilisatie en de oriëntatie van de zebravis voor zowel microinjection en beeldbewerking.

Microstructured apparaten voor geoptimaliseerde Microinjection en beeldvorming van zebravis larven

Muis bevruchte eieren en vroege fase embryo's worden beschermd door de zona zitten, een glycoproteïne-matrix die een barrière tegen levering van het gen vormt. Dit artikel beschrijft een protocol voor de zona perforeren met een laser transduce van embryonale cellen met lentivirale vectoren en maken van transgene muizen.

Laser-assisted lentivirale Gene levering aan muis bevruchte eieren

Het huidige protocol beschrijft zygote micro-injectie van CRISPR-Cas9 en donor-DNA om efficiënt gencassette knock-in en floxed muizen te produceren.

Zygote micro-injectie voor het maken van gencassette knock-in en flox-allelen bij muizen

Leer laserondersteunde cytoplasmatische micro-injectie in vee-zygoten voor genoombewerking met CRISPR Cas9. Deze methode maakt efficiënte levering van oplossingen mogelijk voor transgene dierproductie.

Laser-assisted Cytoplasmatische Micro-injectie in Livestock Zygotes

Meer video's verkennen