Single-molecule Super-resolutie beeldvorming van fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat in het plasmamembraan met Novel Fluorescerende Probes
15 oktober 2016
PI (4,5) P2 regelt diverse cellulaire functies, maar de nanoschaal organisatie in de cel plasmamembraan wordt slecht begrepen. Etikettering PI (4,5) P2 met een dubbele-color fluorescent probe gefuseerd met het Pleckstrin homologie domein beschrijven we een nieuwe benadering voor het bestuderen PI (4,5) P2 ruimtelijke verdeling in het plasmamembraan op nanometerschaal .
Het algemene doel van dit werk is om de nanoscale verdeling van Fosfatidylinositol 4, 5-bisfosfaat in het celplasmamembraan te meten met behulp van fluorescentielocatiemicroscopie van enkele moleculen. Deze methode helpt bij het beantwoorden van belangrijke vragen over fosfoinositide-signalering. Zoals wat is de nanoscale organisatie van fosfoinositiden onder het signaalcomplex in het celmembraan?
De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de hoge ruimtelijke resolutie en het omzeilen van detergentbehandeling, wat een groot probleem is in morfologische studies van fosfolipiden. Deze aanpak omvat drie hoofdstappen. Stap een: De bereiding van de plasmamembraanplaat uit levende cellen.
Stap twee: Fosfoinositide-labeling en fluorescentiebeeldvorming van enkele moleculen. Stap drie: Lokalisatie en beeldreconstructie van enkele moleculen. Op de dag van het experiment bekleed je de dekglasjes met een halve tot één milliliter PDL.
Een of twee uur later absorbeer je het overtollige PDL met weefselpapier vanaf de rand van het dekglasje. Bewaar vervolgens de dekglasjes op een metalen plaat bij vier graden Celsius. Was vervolgens vooraf getransfecteerde INS-1-cellen die op dekglasjes zijn gekweekt met een halve tot één milliliter ijskoud PBS dat één millimolair EGTA bevat.
Herhaal deze wasbeurt drie keer en absorbeer het overtollige PBS. Plaats vervolgens met behulp van een pincet de dekglasjes met de gekweekte cellen op de met PDL beklede dekglasjes, celzijde omlaag. Doe dit op de gekoelde metalen plaat.
Breng vervolgens de plaat over naar vier graden Celsius gedurende zeven tot tien minuten om de cellen de tijd te geven om zich te hechten. Gebruik vervolgens een pincet om voorzichtig de celbeladen dekglasjes te verwijderen, waarbij een dunne laag celmembraan op het met PDL beklede dekglasje achterblijft. Was vervolgens de membraanbladen voorzichtig met een halve tot één milliliter ijskoud PBS.
Fixeer nu elk membraanblad in ongeveer 150 microliters ijskoud vier procent PFA met 0,2 procent glutaaraldehyde in PBS. Laat de membranen 15 minuten fixeren bij vier graden Celsius. Na de fixatie kunt u direct doorgaan met beeldvorming of de preparaten bedekken met ijskoud PBS en ze bewaren bij vier graden Celsius.
Als er pH-sondes worden gebruikt, wordt onmiddellijke beeldvorming sterk aanbevolen. Voor deze procedure wordt een TIRF-microscoop gebaseerd SMLM-systeem gebruikt. Voordat u de membranen gaat beeldvormen, verdunt u één microliter van de fluorescente pareloplossing in 10 milliliter PBS met 50 millimolair magnesiumchloride.
Laad vervolgens een monster in de beeldvormingskamer en voeg 200 microliter van de verdunde oplossing toe en wacht vervolgens 10 minuten. Was vervolgens het monster drie keer met PBS. Start nu het PALM-beeldvormingssysteem.
Selecteer in de bijbehorende beeldvormingssoftware de iRFP-kanaalknop. Zoek vervolgens het celmembraan dat de pH-sondes in het iRFP-kanaal tot expressie brengt, gebruik de fluorescente pareltjes voor driftcorrectie. Stel een normale TIRF-hoek in als 2140, wat 1,5 dieper is dan de kritische TIRF-hoek en de standaardhoek zou moeten zijn.
Gebruik vervolgens de opnameknop om een conventioneel TIRF-beeld in het iRFP-kanaal als referentie te verzamelen. Schakel vervolgens over naar het PAm-Cherry1-kanaal door op de RFP-kanaalknop te klikken. Pas vervolgens de scrollbalk in het AOTF-paneel helemaal naar rechts aan voor volledige verlichting en activeer de laser gedurende ongeveer 10 tot 20 seconden om de achtergrondmembraanfluorescentie uit te bleken.
Stel vervolgens de optimale camera-instelling onder het tabblad formaat in op twee bij twee binning. Stel vervolgens het snelle acquisitieprotocol in onder het tabblad ND Sequence Acquisition in op 30.000 beelden met 20 hertz. Pas vervolgens 0,1 tot één procent vermogen toe op de 405 nanometer laser tijdens de beeldacquisitie, zodat ruimtelijk geïsoleerde punten in elk frame gemakkelijk te identificeren zijn.
Verwerf nu PAm-Cherry1-beelden door op de knop Nu uitvoeren te klikken. Het aantal moleculen dat kan worden geactiveerd, zal geleidelijk afnemen tijdens de acquisities. Verhoog als reactie hierop geleidelijk de intensiteit van de 405 nanometer laser om een optimale signaaldichtheid te behouden.
Verwerf beelden totdat al het PAm-Cherry1-signaal is geactiveerd. Bij latere beeldverwerking en reconstructie identificeert en localiseert u de individuele moleculaire gebeurtenissen van elk frame. Stel de intensiteitsdrempel in met het drempelnummer in de wavelet.
Meer details worden gegeven in het protocol in de tekst. PIP2-ruimtelijke verdeling is gevoelig voor verschillende fixatie met de juiste fixatie beschreven in de tekst, PIP2-sondes vertoonden een consistente verdeling wanneer gelabeld door PIP2-antilichaam of specifieke pH-domeinen. In vergelijking hiermee verschillen levende cellen gelabeld met EGFP-gelabelde pH-domeinen niet veel in beeldvorming.
Alle monsters vertoonden een gelijkmatige verdeling van sondes. In tegenstelling hiermee resulteerde niet-optimale fixatie in scherpe, dichte PIP2-clusters en een afname van signaalintensiteit. Onder optimale fixatiecondities toonden de superresolutiebeelden van PIP2 in vaste cellen een homogene verdeling van sondes in een aanzienlijk deel van het plasmamembraan met slechts beperkte concentratiegradiënten.
Sommige membraanplekken verrijkt met PIP2-sondes waren schaarse verdeeld en hadden verschillende groottes. Live cell PALM-beelden vertoonden een vergelijkbare ruimtelijke verdeling als vaste cellen. Gedetailleerde analyse van de PIP2-signalen toonde aan dat hun dynamiek snel was in lokale gebieden, maar dit resulteerde niet in significante veranderingen in hun algehele abundantie.
Deze techniek introduceert een nieuwe manier voor onderzoekers op het gebied van fosfolipiden om de verdeling en activiteit van andere fosfoinositiedesoorten onder fysiologische omstandigheden te onderzoeken.
Overzicht
Deze studie onderzoekt de nanoschaaldistributie van fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat (PI(4,5)P2) in het plasmamembraan van de cel met behulp van single-molecule fluorescentielokalisatiemicroscopie. De methode biedt inzicht in fosfoïnositide-signalering en de organisatie van fosfoïnositiden in cellulaire membranen.
Belangrijke onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
- Fluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- PI(4,5)P2 speelt een cruciale rol bij diverse cellulaire functies.
- De organisatie op nanoschaal van PI(4,5)P2 in het plasmamembraan is nog onvoldoende begrepen.
- Bestaande technieken maken vaak gebruik van detergentbehandeling, wat de morfologie van fosfolipiden kan beïnvloeden.
- Deze studie beoogt deze beperkingen te overwinnen door middel van een nieuwe beeldvormingsmethode.
Doel van de studie
- Om de nanoschaaldistributie van PI(4,5)P2 in het plasmamembraan te verduidelijken.
- Om de dynamiek van fosfoïnositidesignalering te onderzoeken.
- Om een methode te ontwikkelen die detergentbehandeling vermijdt voor betere morfologische studies.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van plasmamembraanvellen uit levende cellen.
- Labeling van fosfoinositiden en beeldvorming met behulp van single-molecule fluorescentiemicroscopie.
- Beeldacquisitie en -verwerking om individuele moleculaire gebeurtenissen te lokaliseren.
- Vergelijking van fixatiemethoden om hun impact op de PI(4,5)P2-distributie te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Optimale fixatiecondities onthulden een homogene distributie van PI(4,5)P2 in het plasmamembraan.
- Niet-optimale fixatie leidde tot dichte clusters en een verminderde signaalintensiteit.
- Live cell imaging toonde vergelijkbare ruimtelijke distributiepatronen als bij gefixeerde cellen.
- PI(4,5)P2-dynamiek verliep snel in lokale gebieden zonder significante veranderingen in de totale abundantie.
Conclusies
- De studie introduceert een nieuwe methode voor het onderzoeken van de distributie van fosfoinositiden.
- De resultaten verbeteren het begrip van fosfoinositide-signalering onder fysiologische omstandigheden.
- Deze techniek kan worden toegepast om andere fosfoinositide-subtypes te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Inzicht in de organisatie op nanoschaal van fosfoinositiden zoals PI(4,5)P2 is cruciaal voor het verminderen van risico's bij de validatie van targets in signaaltransductiepaden. Deze methode biedt mechanistisch inzicht in de dynamiek van membraanlipiden zonder artefacten geïnduceerd door detergentia, wat het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt. Het pakt een belangrijk knelpunt bij de targetvalidatie aan door de ruimtelijke organisatie te verduidelijken die relevant is voor drug-target-interacties aan het plasmamembraan.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de ruimtelijke organisatie van PI(4,5)P2 te onthullen, een belangrijke regulator van ionkanalen en signaleringscomplexen.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie mogelijk door directe visualisatie van de organisatie van lipidenanodomeinen in membraanomgevingen die vergelijkbaar zijn met de natuurlijke toestand.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van portfolio's door mechanische helderheid te verschaffen over fosfoïnositide-afhankelijke targets onder fysiologische omstandigheden.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor (gefixeerde membraanvellen en levende cellen) voor downstream screening-assays gericht op fosfoïnositide-modulerende verbindingen.
- Operationele waarde: Levert kwantitatieve superresolutie ruimtelijke read-outs die de standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays verbeteren.
- Schaalbaarheid: Faciliteert hergebruik van het platform over verschillende fosfoïnositide-subtypen, waardoor consistente evaluatie van verbindingen in discovery-pipelines mogelijk wordt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Behoudt de getrouwheid van ziekterelevante systemen door de distributie van PI(4,5)P2 bij live-cell imaging te bewaren, wat extrapolatie naar preklinische modellen ondersteunt.
- Mechanische risicovermindering: Verduidelijkt of waargenomen signaleringseffecten voortkomen uit lipide-reorganisatie in plaats van veranderingen in abundantie, waardoor het vertrouwen in het target wordt verfijnd.
- Voorspellend vertrouwen: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling mogelijk door nanoschaal lipidedynamica te koppelen aan functionele uitkomsten in pathofysiologische contexten.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van de validatie van de doelhypothese via de ontwikkeling van assays tot de preklinische mechanistische validatie, in het bijzonder voor targets die betrokken zijn bij fosfoïnositide-signalering.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetests en de verduidelijking van signaalpaden door de organisatie van PI(4,5)P2 op nanoschaal in microdomeinen van het plasmamembraan te ontrafelen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve ruimtelijke gegevens die direct bruikbaar zijn voor assays en essentieel zijn voor betrouwbare screening van verbindingen tegen lipide-modulerende targets.
- Analytica: Biedt resultaten van single-molecule lokalisatie en reconstructie die vergelijking van de lipideverdeling onder verschillende experimentele condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt fundamentele ontdekkingen met preklinische continuïteit via live-cell imaging die de distributiepatronen van gefixeerde cellen onder fysiologische omstandigheden weerspiegelt.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbare imaging-capaciteit voor het onderzoeken van meerdere fosfoïnositide-subtypen, waardoor redundante methodeontwikkeling tussen projecten wordt verminderd.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door mechanistische ambiguïteit in fosfoïnositide-gemedieerde signaleringspaden te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid via fixatie-geoptimaliseerde protocollen en drift-gecorrigeerde single-molecule imaging.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door lipide-afhankelijke mechanismen te verduidelijken, waardoor biologische risico's in een late stadium bij de ontwikkeling van targets worden verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van de gevalideerde ruimtelijke organisatie van belangrijke membraansignaleringslipiden.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in single-molecule lokalisatiemicroscopie en de preparatie van plasmamembraanvellen.
- Vereist een TIRF-gebaseerd SMLM-systeem met laseractivatie en driftcorrectie middels fluorescente beads.
- Vereist standaardisatie van fixatieprotocollen tussen teams om artefactuele clustering van PI(4,5)P2-signalen te voorkomen.
- Vereist aanpassingen bij uitbreiding naar andere fosfoinositol-subtypes of ziekte-relevante celmodellen.
- Praktische beperking: Bij de interpretatie van signalen moet rekening worden gehouden met snelle lokale dynamiek die de totale lipidengehalte niet verandert, zoals opgemerkt in live-celdata.
