Single-molecule Super-resolutie beeldvorming van fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat in het plasmamembraan met Novel Fluorescerende Probes

Het algemene doel van dit werk is om de nanokaal-distributie van fosfatidylinositol 4, 5-bisfosfaat in het plasmamembraan van de cel in kaart te brengen met behulp van fluorescentie-lokalisatiemicroscopie voor enkelvoudige moleculen. Deze methode helpt bij het beantwoorden van kernvragen over fosfoinositide-signalering, zoals: wat is de nanokaal-organisatie van fosfoinositiden onder het signaleringscomplex in het celmembraan?

De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de hoge ruimtelijke resolutie en het omzeilen van detergentbehandeling, wat een belangrijk aandachtspunt is bij morfologische studies van fosfolipiden. Deze aanpak omvat drie hoofstappen. Stap één: de preparatie van het plasmamembraanvel uit levende cellen.

Stap twee: Fosfoïnositidelabeling en single-molecule fluorescentie-imaging. Stap drie: Single-molecule lokalisatie en beeldreconstructie. Coat op de dag van het experiment de dekglasplaatjes met een halve tot één milliliter PDL.

Absorbeer na één of twee uur het overtollige PDL aan de rand van het dekglas met vloeipapier. Bewaar de dekglazen vervolgens op een metalen plaat bij vier graden Celsius. Was daarna vooraf getransfecteerde INS-1-cellen die op dekglazen zijn gekweekt met een halve tot één milliliter ijskoud PBS dat één millimolair EGTA bevat.

Herhaal deze wasbeurt drie keer en absorbeer het overtollige PBS. Plaats nu met een pincet de dekglasjes met de gecultiveerde cellen op de PDL-gecoate dekglasjes, met de cellzijde naar beneden. Doe dit op de gekoelde metalen plaat.

Plaats de plaat vervolgens voor zeven tot tien minuten bij vier graden Celsius om de cellen de tijd te geven zich te hechten. Gebruik daarna een pincet om het met cellen beladen dekglas voorzichtig af te pellen, waardoor een dunne laag celmembraan op het met PDL gecoate dekglas achterblijft. Was de membraanvellen vervolgens voorzichtig met een halve tot één milliliter ijskoud PBS.

Fix nu elk membraanvel in ongeveer 150 µL ijskoud 4% PFA met 0,2% glutaraldehyde in PBS. Laat de membranen 15 minuten fixeren bij 4 °C. Ga na de fixatie direct over tot beeldvorming of dek de preparaten af met ijskoud PBS en bewaar deze bij 4 °C.

Indien pH-elektroden worden gebruikt, wordt onmiddellijke beeldvorming sterk aanbevolen. Voor deze procedure wordt een SMLM-systeem op basis van een TIRF-microscoop gebruikt. Verdun vóór de beeldvorming van de membranen één µL fluorescerende krakeloplossing in 10 mL PBS met 50 mM magnesiumchloride.

Laad vervolgens een monster in de beeldkamer, voeg 200 µL van de verdunde oplossing toe en wacht 10 minuten. Was daarna het monster drie keer met PBS. Start nu het PALM-beeldvormingssysteem op.

Selecteer in de bijbehorende imaging-software de knop voor het iRFP-kanaal. Lokaliseer vervolgens in het iRFP-kanaal het celmembraan dat de pH-probes tot expressie brengt en gebruik de fluorescerende beads voor driftcorrectie. Stel een normale TIRF-hoek in op 2140, wat 1,5 dieper is dan de TIRF-kritische hoek en de standaardhoek zou moeten zijn.

Gebruik vervolgens de capture-knop om een conventionele TIRF-afbeelding in het iRFP-kanaal als referentie vast te leggen. Schakel daarna over naar het PAm-Cherry1-kanaal door op de RFP-kanaalknop te klikken. Verschuif vervolgens de schuifbalk in het AOTF-paneel helemaal naar rechts voor volledige belichting en pas de laser gedurende ongeveer 10 tot 20 seconden toe om de achtergrondfluorescentie van het membraan weg te bleken.

Stel vervolgens onder het tabblad 'format' de optimale camerinstelling in op 2x2 binning. Stel daarna onder het tabblad 'ND Sequence Acquisition' het protocol voor snelle acquisitie in op 30 000 beelden bij 20 Hz. Pas vervolgens tijdens de beeldacquisitie een vermogen van 0,1% tot 1% toe op de 405 nm laser, zodat ruimtelijk gescheiden punten in elk frame gemakkelijk identificeerbaar zijn.

Verkrijg nu de PAm-Cherry1-beelden door op de knop Run Now te klikken. Het aantal moleculen dat geactiveerd kan worden, zal tijdens de acquisities geleidelijk afnemen. Verhoog in reactie daarop stapsgewijs de intensiteit van de 405 nanometer laser om een optimale signaaldichtheid te behouden.

Verwerf beelden totdat al het PAm-Cherry1-signaal is geactiveerd. Identificeer en lokaliseer bij de latere beeldbewerking en reconstructie de individuele moleculaire gebeurtenissen uit elk frame. Stel de filterintensiteitsdrempel in met het drempelgetal in de wavelet.

Verdere details worden verstrekt in het tekstprotocol. De ruimtelijke distributie van PIP2 is gevoelig voor verschillende fixatiemethoden; bij de juiste fixatie, zoals beschreven in de tekst, vertoonden PIP2-probes een consistente distributie wanneer ze werden gelabeld met PIP2-antilichamen of specifieke pH-domeinen. Ter vergelijking: levende cellen gelabeld met EGFP-getagde pH-domeinen vertonen geen noemenswaardige verschillen in beeldvorming.

Alle monsters vertoonden een gelijkmatige verdeling van de probes. In tegenstelling hiertoe leidde een niet-optimale fixatie tot scherp-dense PIP2-clusters en een afname van de signaalintensiteit. Onder optimale fixatiecondities onthulden de superresolutiebeelden van PIP2 in gefixeerde cellen een homogene verdeling van probes in een aanzienlijk deel van het plasmamembraan met slechts beperkte concentratiegradiënten.

Sommige membraanpatches verrijkt met PIP2-probes waren schaars verspreid en hadden verschillende groottes. PALM-beelden van levende cellen vertoonden een soortgelijke ruimtelijke distributie als gefixeerde cellen. Gedetailleerde analyse van de PIP2-signalen onthulde dat hun dynamiek in lokale gebieden snel was, maar dit leidde niet tot significante veranderingen in hun totale abundantie.

Deze techniek introduceert een nieuwe manier voor onderzoekers op het gebied van fosfolipiden om de distributie en activiteit van andere fosfoïnositide-subtypes onder fysiologische omstandigheden te onderzoeken.