Name: Novel-RNA-bindende eiwitten Isolatie door de snelle Methodologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Leer een snelle methode voor isolatie van RNA-bindende eiwitten in Saccharomyces cerevisiae. Deze techniek identificeert nieuwe mRNA-geassocieerde eiwitten en verbetert inzicht in RNA-regulatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Prof. Jeff Gerst en Boris Slobodin voor hun nuttige adviezen bij het opzetten van de snelle protocol en het verstrekken van de noodzakelijke plasmiden. We danken ook dr Avigail Atir-Lande voor haar hulp bij het vaststellen van dit protocol en Dr Tamar Ziv uit de Smoler Proteomics Center voor haar hulp bij de LC-MS / MS analyse. Wij danken Prof. TG Kinzy (Rutgers) voor de YEF3 antilichaam. Dit werk werd ondersteund door subsidie ​​2011013 van de binationale Science Foundation.

Opmerking: Plaats een die bestaat uit 12 MS2-bindingsplaatsen (MS2 loops; MS2L) in de gewenste genomische locus, meestal tussen het open leeskader (ORF) en de 3 &#39;UTR. Een gedetailleerd protocol voor deze integratie is elders 22 verstrekt. Controleer de juiste inbrengen en expressie door PCR, Northern analyse of RT-PCR 20,23. Het is belangrijk te controleren dat aan de greep niet de synthese van de 3&#39;UTR. Bovendien moet een plasmide dat MS2-CP gefuseerd met SBP onder de expressie van een induceerbare promoter (methionine depletie) worden ingebracht in de cellen 24. Een identieke stam, met uitzondering van het ingebrachte MS12 lussen worden gebruikt als controle voor de detectie van niet-specifieke signalen. 1. snelle zuivering <ol><li> 500 ml kweken van gistcellen (gebruik 250-1,000 ml gistcellen afhankelijk van het expressieniveau van het gen van belang) tot expressie MS2-mRNA hebben 20 enMS2-CP-GFP-fusie-eiwit SBP 24 OD 600 0,8-1,0 bij 30 ° C in het geschikte groeimedium (bijvoorbeeld Synthetic Dextrose (SD) selectief medium). </li><li> Centrifugeer cellen bij 3000 xg gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur en gooi de supernatant. </li><li> Was de cellen in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), centrifuge zoals hierboven (stap 1,2), resuspendeer in een gelijk volume (stap 1,1) SD zonder methionine en incubeer gedurende 45 - 60 minuten bij 30 ° C om expressie van het MS2 induceren -CP-GFP-fusie-eiwit SBP. Let op: Langere inductietijd kan aggregatie van GFP veroorzaken. </li><li> Zet opzij 10 ml van cellen en extraheren RNA uit dit monster met behulp van de eenvoudige &quot;hot fenol&quot; -methode 25. Let op: Fenol is zeer giftig en moet worden behandeld in overeenstemming met de veiligheidsvoorschriften. Opmerking: Dit RNA is een goede referentie voor de kwaliteit van geïsoleerde RNA (Figuur 1A). </li><li> Voor 500 ml cellen, voeg 1,35 ml 37% formaldehyde tot een uiteindelijke concentration van 0,1% aan het RNA-eiwitcomplexen verknopen. Verder incubatie bij 30 ° C gedurende 10 minuten. Let op: Formaldehyde is zeer giftig en moet worden behandeld in overeenstemming met de veiligheidsvoorschriften. </li><li> Voeg 26,5 ml 2,5 M glycine tot een uiteindelijke concentratie van 0,125 M en incubeer gedurende 3 min verknoping te stoppen. Vanaf deze stap op, zet alles op het ijs om RNA degradatie te minimaliseren. </li><li> Centrifugeer cellen bij 3000 g gedurende 4 min bij 4 ° C en wassen met 45 ml koude 1x PBS. </li><li> Resuspendeer cellen in 1 ml RAPID Lysis buffer per 100 ml van de initiële celkweek. </li><li> Gesplitst in porties van 500 pl in-schroefdop microcentrifugebuizen en voeg ~ 400 mg van gekoeld glazen kralen aan elke hoeveelheid (ongeveer een volle 0,2 ml PCR-buis). </li><li> Lyse cellen in een kraal klopper gedurende 3 min. Meteen het lysaat op ijs. Opmerking: Cell lysis releases cellulaire RNasen, die de belangrijkste oorzaak van RNA afbraak. Rapid Lysis buffer bevat een hoge concentratie van RNase inhibitors, zoals de niet-specifieke RNase inhibitor heparine en specifieke inhibitoren. Werken snel en het houden van alles koud is ook een aanrader. </li><li> Breng het lysaat nieuwe buizen. Pierce een klein gat in de bodem van elke microcentrifugebuis met een hete naald (0,8 mm x 40 mm) en plaats de micro-centrifugebuisjes bovenop de 15 ml buizen. Met de kop van een 5 ml spuit als adapter tussen de microfuge buizen en 15 ml buizen. Centrifugeer de buizen montage bij 3000 xg gedurende 1 min bij 4 ° C </li><li> Breng de doorstroom van de 15 ml buis naar een nieuwe 1,5 ml buis en centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C om celresten te verwijderen. </li><li> Pool supernatanten Uit 1,5 ml buizen in een 15 ml buis en vernietiging 1/50 en 1/100 volume van het lysaat voor RNA en eiwit isolatie, respectievelijk. Opmerking: Deze zullen als &quot;Input&quot; monsters voor verdere analyse (figuur 1) dienen. </li><li> Voeg 300 ug per 500 ml avidine initial gistcultuur en incubeer gedurende 30 min (dit kan worden verminderd tot 10 min) bij 4 ° C onder constant rollen (10 rpm). Opmerking: Avidine blokken biotine en gebiotinyleerde eiwitten binden aan de streptavidineparels. </li><li> Voorwas streptavidine korrels vóór incubatie met het cellysaat. <ol><li> Breng ongeveer 300 ul van de streptavidineparels slurry naar een 1,5 ml microcentrifugebuis en het bovendeel supernatant. Dit resulteert in 250 pl parels. Was de kralen tweemaal met 1 ml RAPID lysisbuffer. Centrifugeer de streptavidineparels bij 660 xg gedurende 2 min bij 4 ° C tussen elke stap. </li><li> Blokkeer de kralen door het incuberen gedurende 1 uur met 0,5 ml van snelle lysis buffer, 0,5 ml 10 mg / ml BSA en 10 pl 10 mg / ml gist tRNA. Kralen kunnen worden gelaten O / N op blokkeeroplossing bij 4 ° C met rotatie indien noodzakelijk. </li><li> Was tweemaal met 1 ml RAPID Lysis buffer. Opmerking: Magnetische kralen kunnen ook worden gebruikt om de tijd en backgr verminderenond. Deze hebben echter een lagere capaciteit dan sepharose korrels. </li></ol></li><li> Voeg 250 ul van de voorgewassen streptavidine kralen om de avidine-bevattende lysaat (uit stap 1,14) en incubeer 1 uur bij 4 ° C met een constante rotatie (10 tpm). Opmerking: Deze incubatietijd is een compromis tussen voldoende binding tijd en het minimaliseren kansen voor RNA-afbraak. </li><li> Centrifugeer bij 660 xg gedurende 2 min bij 4 ° C om de streptavidineparels wissen en breng het supernatant naar een nieuwe buis van 15 ml. Vernietiging 1/50 en 1/100 volume van het lysaat voor RNA en eiwit isolatie, respectievelijk. Let op: Dit zullen de &quot;niet geconsolideerd&quot; samples. </li><li> Was de korrels met 1 ml RAPID lysisbuffer, schud voorzichtig naar een nieuwe 1,5-ml microcentrifuge buis en centrifugeer zoals in stap 1.17. Herhaal deze stap drie keer. </li><li> Was de korrels met 1 ml wasbuffer snelle en ditmaal draaien (10 opm) gedurende 5 min bij 4 ° C. Herhaal deze stap twee keer. </li&gt; <li> Was de korrels met 1 ml 1x PBS en centrifugeer zoals hierboven. </li><li> Was de korrels opnieuw met 120 pl 1x PBS. Centrifuge zoals hierboven, en neem de hele supernatant voor RNA en eiwit-extractie als de &quot;Wash&quot; sample. Opmerking: Dit laatste wasbeurt monster zal de striktheid van de wassingen geven en van hetzelfde volume als de elutie monster moet zijn. Dit wordt het verwerken en laden vereenvoudigen volgende assays. </li><li> RNA en RNA-geassocieerde eiwitten uit de kolom, voeg 120 ul van 6 mM biotine in 1x PBS en incubeer gedurende 45 minuten bij 4 ° C met een constante rotatie (10 tpm). </li><li> Centrifugeer de kralen als hierboven en het geëlueerde materiaal naar een nieuwe 1,5 ml buis. Spin de geëlueerde monster opnieuw en breng de bovenste fase naar een nieuwe 1,5 ml buis tot geen overdracht van kralen te garanderen. </li><li> Monsters nemen voor RNA of eiwit-extractie. Opmerking: Het volume genomen moet worden op het volgende test en expressie niveau van het RNA of eiwit van belang. Als richtlijn voor Noord-analyse 26, neemt 80% van de steekproef, voor Western blot 23,27 of RT-PCR 28, neemt 20%, en voor massaspectrometrie 29 om nieuwe eiwitten te ontdekken, neem het gehele monster. </li></ol> 2. RNA-extractie <ol><li> Voeg een gelijk volume van 2x verknoping Omkering buffer en incubeer gedurende 45 minuten bij 65 ° C. Doorgaan direct voor RNA-extractie. Opmerking: De verknoping Reversal buffer bevat ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), die aanzienlijk verbeterd RNA-extractie 20. </li><li> Gebruik de standaard fenol: chloroform methode 26 RNA te extraheren uit de &quot;input&quot; en &quot;niet-gebonden&quot; monsters (stappen 1.13 en 1.17). Opmerking: Deze monsters bevatten veel van de RNase inhibitor heparine, die daarop achterzijde Transcriptase- (RT) met gebruikmaking van assays kan remmen (bijvoorbeeld, RT-PCR), dus LiCl neerslag 30 wordt aangeraden om het te verwijderen. De WAsh &quot;en&quot; elutie &quot;samples (stappen 1.21 en 1.24) bevatten lage hoeveelheden RNA en worden neergeslagen door middel van de volgende stappen. </li><li> Voeg een gelijk volume 8 M Guanidinium-HCl (GuHCl) en twee volumes 100% ethanol aan het &quot;wassen&quot; en &quot;elutie&quot; samples. Incuberen bij -80 ° C gedurende ten minste 2 uur. Opmerking: Guanidinium zal efficiënt eiwitten denatureren en daardoor remmen RNases en proteasen in het monster. </li><li> Centrifugeer bij 20.000 xg, 4 ° C gedurende 30 min en gooi het supernatant. Was de pellet met koude 80% ethanol en centrifugeer opnieuw bij 20.000 xg, 4 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Los het RNA pellet in 400 ui van RNase vrij water en neer te slaan opnieuw om overgebleven GuHCl of andere verontreinigingen te verwijderen. Voeg 40 pl 3 M natriumacetaat, pH 5,2 en 800 pi 100% ethanol, incuberen bij -20 ° C gedurende ten minste 1 uur. </li><li> Centrifuge en was als in stap 2.4 en verwijder alle ethanol met een 10 ul tip. Resuspendeer de RNA Pellet in 10 pi RNase vrij water. Wees extra voorzichtig als het RNA pellet is meestal niet zichtbaar is. Opmerking: De monsters kunnen worden gebruikt voor Northern-analyse zoals beschreven in 23 (figuur 1). </li></ol> 3. Eiwit Voorbereiding voor Western Blot of massaspectrometrie Analyse <ol><li> Voeg 1/3 volume van 4 x Laemmli monsterbuffer (LSB) eiwit monsters en incubeer 45 minuten bij 65 ° C om de verknoping van RNA en eiwitten te keren. Opmerking: De monsters worden bewaard bij -20 ° C. </li><li> Run eiwitten op een SDS-polyacrylamidegel (SDS-PAGE) 31. Stel het percentage van de gel volgens de grootte van de eiwitten te analyseren. Opmerking: 10% acrylamidegel geeft uiteenlopende scheiding en is goed als een eerste benadering. </li><li> Transfer eiwitten aan het membraan volgens de standaard immunoblot analyse 27 voor het regelen van isoleerrendement (figuur 1C). Kleuren met Coomassie Blue ofwel R250 of zilver vlek voor massaspectrometrie analyse. Opmerking: zilverkleuring is de voorkeur omdat deze gevoeliger en zorgt voor een betere detectie (Figuur 1B). Kleuring kan met handmatig bereide oplossingen of commerciële kits. De incubatietijd van de gel in de uiteindelijke kleurstofoplossing moet experimenteel worden bepaald. Lange incubatietijd kan een lage overvloedige eiwitten zichtbaar te maken, maar kan leiden tot sterk uitgedrukt eiwitten zoals MS2-CP-SBP-GFP tot meer dan lood en kunnen de omliggende eiwitten maskeren in hun nabijheid. Daarnaast kan een hoge achtergrond plaatsvinden. Volg de reactie zorgvuldig en voeg Stop Solution op het juiste moment. </li><li> Knip bands uit de gel en overbrengen naar 1,5 ml buizen. WINKEL monsters bij -20 ° C, of stuur voor eiwitextractie en trypsine digestie gevolgd door LC-MS / MS analyse 32. </li><li> Als alternatief proteomische benadering van de gel scheidingsstap sluiten verteren geëlueerde materiaal uit stap 1,24 ZODATlutie met behulp van trypsine en onderworpen aan LC-MS / MS analyse 33. Let op: weglaten van de SDS-PAGE scheiding vereenvoudigt het protocol en verhoogt de opbrengst. Echter mogelijk monsters het reinigingsmiddel NP-40, die massaspectrometrie analyse remt bevatten. Om dit probleem op te lossen, voert u de volgende stappen: <ol><li> Run eiwit op SDS-PAGE 31 gedurende 10 - 15 min. </li><li> Knip het hele gedeelte van de baan (dat wil zeggen, waar de eiwitten zich bevinden). Opmerking: Het eiwitmonster kan een aanzienlijke hoeveelheid van het MS2-CP-SBP eiwit dat signalen van lage abundantie proteïnen kunnen verhullen omvatten. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+RNA-binding+proteins+interact+with+functionally+related+sets+of+RNAs%2C+suggesting+an+extensive+regulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system.</a> PLoS Biol. 6, e255(2008).</li>
<li>Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+search+reveals+unexpected+RNA-binding+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> PloS One. 5, (2010).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149, 1393-1406 (2012).</li>
<li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46, 674-690 (2012).</li>
<li>Mitchell, S. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+properties+of+eukaryotic+mRNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Principles and properties of eukaryotic mRNPs.</a> Mol Cell. 54, 547-558 (2014).</li>
<li>Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+processing+and+its+regulation%3A+global+insights+into+biological+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA processing and its regulation: global insights into biological networks.</a> Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).</li>
<li>Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+chaperone+Ssa1+affects+mRNA+localization+to+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria.</a> FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).</li>
<li>Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-disciplinary+methods+to+define+RNA-protein+interactions+and+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks.</a> Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).</li>
<li>Denman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNPs+take+shape+by+CLIPPING+and+PAIRING%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING.</a> BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).</li>
<li>McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+comprehensive+experimental+identification+of+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions.</a> Genome Biol. 15, 203(2014).</li>
<li>Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+mRNA-protein+complexes+using+a+yeast+three-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system.</a> Methods. 26, 123-141 (2002).</li>
<li>SenGupta, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-hybrid+system+to+detect+RNA-protein+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).</li>
<li>Yosefzon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+RNA+binding+specificity+of+yeast+Puf2p%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p.</a> RNA. 17, 1479-1488 (2011).</li>
<li>Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+yeast+mRNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Global analysis of yeast mRNPs.</a> Nat Struct Mol Biol. 20, 127-133 (2013).</li>
<li>Zielinski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+ribonucleoprotein-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).</li>
<li>Bell, T. J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Cell+Genomics%3A+RNA+Exon-Specific+RNA-Binding+Protein+Isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation.</a> Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).</li>
<li>Leppek, K., Stoecklin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+streptavidin-binding+RNA+aptamer+for+purification+of+ribonucleoprotein+complexes+identifies+novel+ARE-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins.</a> Nucleic Acids Res. 42, e13(2014).</li>
<li>Slobodin, B., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mRNA+affinity+purification+technique+for+the+identification+of+interacting+proteins+and+transcripts+in+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes.</a> RNA. 16, 2277-2290 (2010).</li>
<li>Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elongation+factor+eEF3+%28Yef3%29+interacts+with+mRNA+in+a+translation+independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner.</a> BMC Mol Biol. 16, 17(2015).</li>
<li>Loya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3%27-UTR+mediates+the+cellular+localization+of+an+mRNA+encoding+a+short+plasma+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The 3'-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein.</a> RNA. 14, 1352-1365 (2008).</li>
<li>Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+integration+method+for+the+simultaneous+visualization+of+endogenous+mRNAs+and+their+translation+products+in+living+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast.</a> RNA. 17, 2249-2255 (2011).</li>
<li>Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+extensive+intra-molecular+associations+between+3%27-UTRs+and+their+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs.</a> Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).</li>
<li>Slobodin, B., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RaPID%3A+an+aptamer-based+mRNA+affinity+purification+technique+for+the+identification+of+RNA+and+protein+factors+present+in+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes.</a> Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).</li>
<li>Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simple+method+for+preparation+of+RNA+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).</li>
<li>Eldad, N., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ribosomal+density-mapping+procedure+to+explore+ribosome+positions+along+translating+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs.</a> Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).</li>
<li>Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GRFbeta%2C+a+novel+regulator+of+calcium+signaling%2C+is+expressed+in+pancreatic+beta+cells+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain.</a> J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).</li>
<li>Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+gene+expression+in+pancreatic+beta-cells%3A+cloning+and+characterization+of+differentially+expressed+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes.</a> Diabetes. 48, 552-556 (1999).</li>
<li>Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+eukaryotic+initiation+factor+5+rescues+the+translational+defect+of+tpk1w+in+a+manner+that+necessitates+a+novel+phosphorylation+site%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site.</a> FEBS J. 282, 504-520 (2015).</li>
<li>Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+RNA+extracted+from+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria.</a> Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).</li>
<li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-dimensional+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+%281D+SDS-PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE).</a> Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).</li>
<li>Gundry, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+proteins+and+peptides+for+mass+spectrometry+analysis+in+a+bottom-up+proteomics+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25(2009).</li>
<li>Medzihradszky, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-solution+digestion+of+proteins+for+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">In-solution digestion of proteins for mass spectrometry.</a> Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).</li>
<li>Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((StreptoTag%3A+a+novel+method+for+the+isolation+of+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins.</a> RNA. 5, 1509-1516 (1999).</li>
<li>Oeffinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+steps+forward--one+step+back%3A+advances+in+affinity+purification+mass+spectrometry+of+macromolecular+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two steps forward--one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes.</a> Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).</li>
<li>Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+beta-actin+mRNA+zipcode-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein.</a> Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).</li>
<li>Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+Xenopus+Vg1+mRNA+by+Vera+protein+and+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum.</a> Science. 276, 1128-1131 (1997).</li>
<li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol Cell. 2, 437-445 (1998).</li>
<li>Aizer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+mRNA+targeting+to+P-bodies+in+living+human+cells+reveals+their+dual+role+in+mRNA+decay+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage.</a> J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).</li>
<li>Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+mRNAs+coding+for+mitochondrial+proteins+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 17, 1551-1565 (2011).</li>
<li>Lopez de Heredia,, M,, Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+integrity+as+a+quality+indicator+during+the+first+steps+of+RNP+purifications+%3A+a+comparison+of+yeast+lysis+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochem%22%5BJournal%5D)">RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods.</a> BMC Biochem. 5, 14(2004).</li>
<li>Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integration+in+CHO+cells+mediated+by+CRISPR%2FCas9+and+homology-directed+DNA+repair+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway.</a> Sci Rep. 5, 8572(2015).</li>
<li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Res. 24, 142-153 (2014).</li>
<li>Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantitation+of+protein+expression+and+site-specific+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).</li>
<li>de Godoy, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SILAC+yeast%3A+from+labeling+to+comprehensive+proteome+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification.</a> Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Verschillende methoden de isolatie van specifieke mRNAs hun geassocieerde eiwitten 11,34 35 identificeren. Deze werkwijzen passen in vitro en in vivo strategieën RNA-eiwitinteracties sonde. In vitro werkwijzen Incubeer exogeen RNA getranscribeerd met cellysaat te isoleren RBPs vangen en RNP-complexen 36,37. Een effectieve aanpak van dit type werd onlangs gepresenteerd, die de identificatie van nieuwe eiwitten die een regulerende RNA-motief 18 binden ...

RNA-bindende eiwitten (RBPs) vertegenwoordigen ongeveer 10% van S. cerevisiae eiwitten 1,2 en ongeveer 15% zoogdiereiwitten 3-5. Ze zijn betrokken bij vele cellulaire processen zoals mRNA post-transcriptie verwerking en regelgeving, vertaling, ribosoom biogenese, tRNA aminoacylering en modificatie, chromatine remodeling, en nog veel meer. Een belangrijke subgroep van RBPs is de mRNA-bindende eiwitten (mRNPs) 6,7. In de loop van mRNA rijping, verschillende RBPs binden het transcript en bemiddelen zijn nucleaire verwerking, export uit de nucleus, cellulaire lokalisatie, vertaling en degradatie 6-8. Zo is de afzonderlijke reeks RBPs gebonden aan een bepaalde transcript op elk tijdstip is bepalend voor de verwerking en uiteindelijk zijn lot. De identificatie van RBPs geassocieerd met een mRNA kan een aanzienlijke verbetering van ons inzicht in de processen die ten grondslag liggen hun post-transcriptie regulatie. diverse genetische, Microscopische, biochemische en bioinformatica methoden zijn gebruikt om eiwitten betrokken bij regulatie mRNA (beoordeeld in 9-11) te identificeren. Slechts enkele van deze werkwijzen mogelijk zijn om eiwitten gekoppeld aan een specifiek doelwit mRNA. Opmerkelijk is de gist Drie hybridesysteem (Y3H), die gebruik maakt van mRNA van belang als lokaas om een ​​expressiebibliotheek te screenen in gistcellen. Positieve klonen worden gewoonlijk waargenomen door een groeiselectie of reporterexpressie 12-14. Het belangrijkste voordeel van deze werkwijze is het groot aantal eiwitten die in een cellulaire omgeving en het vermogen om de sterkte van de RNA-eiwit interactie te meten kan worden gescand. Nadelen zijn het relatief grote aantal vals-positieve resultaten als gevolg van niet-specifieke binding en de hoge kans op vals negatieve resultaten ten dele, verkeerde vouwing van het fusieproteïne roof of aas RNA. Een alternatief voor de genetische benadering affiniteit opzuiveringcatie van RNA met zijn geassocieerde eiwitten. PolyA bevattend mRNA kan worden geïsoleerd door middel van oligo dT kolommen en hun geassocieerde eiwitten worden gedetecteerd door middel van massaspectrometrie. Het RNA-eiwit interactie is geconserveerd in zijn cellulaire context door verknoping, die op korte afstand covalente bindingen maakt. Het gebruik van de oligo dT kolom geeft een globaal overzicht van het gehele proteoom die is gekoppeld aan een poly A-mRNA bevattende 3,5,15. Dit betekent echter geen volledig overzicht van eiwitten die zijn gekoppeld aan een bepaalde mRNA. Zeer weinig methoden beschikbaar om dergelijke identificatie bereiken. De PAIR methode is gebaseerd op de transfectie van nucleïnezuur complementair aan de doelwit mRNA 16,17. Het nucleïnezuur is ook verbonden met een peptide, die het mogelijk maakt om verknoping RBPs in dichte nabijheid van de interactieplaats. Na verknoping kunnen de RBP-peptide-nucleïnezuur worden geïsoleerd en onderworpen aan analyse proteomics. Onlangs, een van aptameergebaseerde methodiek wassucces toegepast op extracten van zoogdiercellijnen 18. Een RNA aptameer met verbeterde affiniteit voor streptavidine is ontwikkeld en gefuseerd aan een sequentie van belang (AU-rijk element (ARE) in dit geval). Het aptameer-ARE RNA werd gekoppeld aan streptavidine korrels en gemengd met cellysaat. Eiwitten die gekoppeld aan de ARE sequentie werden gezuiverd en geïdentificeerd door massaspectrometrie (MS). Hoewel deze methode ontdekt associaties die zich buiten de mobiele instellingen (bijvoorbeeld in vitro), is het waarschijnlijk in de toekomst worden gewijzigd om de aptameren introduceren in het genoom kunnen kopen, waardoor de isolatie van eiwitten geassocieerd met het mRNA terwijl in de cellulaire milieu (dat wil zeggen, in vivo). In gist, waarbij genetische manipulaties goed zijn gevestigd, de snelle methode (ontwikkeld in Prof. Jeff Gerst&#39;s lab) geeft een beeld van de in vivo verenigingen 19. Rapid combineert de specifieke en sterke binding van het MS2 manteleiwit (MS2-CP) naar het MS2-RNA-sequentie, en de streptavidine-bindende domein (SBP) om geconjugeerde streptavidine beads. Dit maakt efficiënte zuivering van MS2-mRNA&#39;s hebben met streptavidine beads. Bovendien, de expressie van 12 exemplaren van MS2 lussen kunnen maximaal zes MS2-CP&#39;s gelijktijdig binden aan het RNA en verhoging van de efficiëntie van haar isolement. Dit protocol werd daarom voorgesteld om de identificatie van nieuwe mRNA-geassocieerde eiwitten mogelijk zodra de geëlueerde monsters worden onderworpen aan proteomics analyse met massaspectrometrie. We hebben onlangs gebruikt om snelle nieuwe eiwitten geassocieerd met de gist PMP1 mRNA 20 identificeren. PMP1 mRNA werd eerder aangetoond geassocieerd te zijn met de ER membraan en het 3 &#39;onvertaalde gebied (UTR) bleek een belangrijke determinant in dit verband 21 zijn. Aldus RBPs dat PMP1 3 &#39;UTR binden waarschijnlijk een belangrijke rol spelen bij de lokalisatie. Snelle gevolgd door vloeistofchromatografiey-massaspectrometrie / massaspectrometrie (LC-MS / MS) resulteerde in de identificatie van vele nieuwe eiwitten die interageren met PMP1 20. Hierin geven we een gedetailleerd protocol van de snelle methode, belangrijke controles die moeten worden gedaan, en technische tips dat de opbrengst en specificiteit kunnen verbeteren.

<table><tbody><tr><td>Tris</td><td>sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>bio-lab</td><td>1981232300</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Acidic Phenol (pH 4.3)</td><td>sigma</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3)</td><td>sigma</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>bio-lab</td><td>3080521</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Frutarom</td><td>5551820</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>Soybean Trypsin Inhibitor</td><td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease&nbsp; Inhibitor</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>Glass Beads</td><td>Sartorius</td><td>BBI-8541701</td><td>0.4-0.6mm diameter&nbsp;</td></tr><tr><td>Mini BeadBeater</td><td>BioSpec</td><td>Mini BeadBeater 16</td><td></td></tr><tr><td>Guanidinium</td><td>Sigma</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Sigma</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Beads</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>17-5113-01</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA</td><td>Sigma</td><td>R8508</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Bacto</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>peptone</td><td>Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate-Buffered saline (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer (LSB)</td><td></td><td></td><td>0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue.</td></tr><tr><td>Hot phenol lysis buffer</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS&nbsp;</td></tr><tr><td>3 M Sodium Acetate pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% and 70% Ethanol (EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase-free water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RaPID lysis buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 &micro;g/ml Leupeptin, 10 &micro;g/ml Aprotinin, 10 &micro;g/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 &micro;g/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease&nbsp; Inhibitor.</td></tr><tr><td>2x Cross-linking reversal buffer</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.</td></tr><tr><td>RaPID wash buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris-HCl pH 7.5,&nbsp; 300 mM NaCl, 0.5% NP-40</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>161-0449</td><td>Voor het detecteren van eiwitten in polyacrylamide gels</td></tr><tr><td>SD selectief medium&nbsp;</td><td></td><td></td><td>1,7 g/l Gist stikstofbasis zonder aminozuren en ammoniumsulfaat, 5 g/l Ammoniumsulfaat, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptofaan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine</td></tr><tr><td>Anti-eEF3 (EF3A,YEF3)</td><td>Gift van Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School)</td><td>1:5.000</td><td></td></tr><tr><td>Anti GFP-antilichaam</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8334</td><td>1:3.000</td></tr><tr><td>Anti konijn IgG-HRP geconjugeerd</td><td>SIGMA</td><td>A9169</td><td>1:10.000</td></tr></tbody></table>

novel-rna-bindende eiwitten isolatie door de snelle methodologie

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-bindende eiwitten (RBP's) spelen een belangrijke rol in elk aspect van RNA-metabolisme en -regulatie. Hun identificatie is een grote uitdaging in de moderne biologie. Slechts enkele in vitro en in vivo methoden maken de identificatie van RBP's mogelijk die geassocieerd zijn met een specifiek doel-mRNA. Hun belangrijkste beperkingen zijn echter de identificatie van RBP's in een niet-cellulaire omgeving (in vitro) of de lage efficiëntie van het isoleren van het RNA van belang (in vivo).. Een RNA-bindende eiwit-zuiverings- en identificatiemethode (RaPID) werd ontworpen om deze beperkingen in gist te overwinnen en om een efficiënte isolatie van eiwitten die in vivo geassocieerd zijn, mogelijk te maken. Hiervoor wordt het RNA van belang voorzien van MS2-lussen en mede-geëxpresseerd met een fusie-eiwit van een MS2-bindend eiwit en een streptavidine-bindend eiwit (SBP). Cellen worden vervolgens onderworpen aan crosslinking en gelyseerd, en complexen worden geïsoleerd via streptavidinekralen. De eiwitten die mede-zuiveren met het getagde RNA kunnen vervolgens worden bepaald door massaspectrometrie. We hebben dit protocol onlangs gebruikt om nieuwe eiwitten te identificeren die geassocieerd zijn met het ER-geassocieerde PMP1 mRNA. Hier bieden we een gedetailleerd protocol van RaPID en bespreken we enkele van zijn beperkingen en voordelen.

Snelle maakt de isolatie van een specifieke doel-RNA met zijn geassocieerde eiwitten. Cruciaal voor het succes houdt het RNA intact zoveel mogelijk, waardoor een voldoende hoeveelheid eiwitten verkregen. Om de isolatie efficiëntie en kwaliteit van RNA te bepalen, wordt Northern analyse uitgevoerd (Figuur 1A). Northern-analyse heeft het voordeel van de efficiëntie en kwaliteit van de snelle rechtstreeks rapporteert. Aldus kan de relatieve hoeveelheden van volledige lengte...

RNA-eiwitinteracties liggen aan de basis van veel cellulaire processen. Hier beschrijven we een in vivo methode om specifiek RNA te isoleren en nieuwe eiwitten te identificeren die ermee geassocieerd zijn. Dit kan nieuw licht werpen op hoe RNA's in de cel worden gereguleerd.

Novel-RNA-bindende eiwitten Isolatie door de snelle Methodologie

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Het algemene doel van deze procedure is om specifiek RNA efficiënt te isoleren samen met de eiwitten die in vivo aan het RNA geassocieerd zijn. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over RNA-metabolisme en -regulatie, zoals wat de specifieke set RNA-bindende eiwitten is die aan een bepaald transcript gebonden zijn. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de hoge isolatie-efficiëntie, wat de daaropvolgende identificatie van nieuwe mRNA-geassocieerde eiwitten mogelijk maakt.De snelle methodologie maakt gebruik van een giststam die MS2-getagd MRNA en een fusie-eiwit van een MS2-bindend eiwit en een streptavidine-bindend eiwit co-expresseert. Kweek 500 milliliters gistcellen bij 30 °C in synthetisch dextrose of SD-selectief medium tot een OD600 van 0,8 tot 1,0. Wanneer de cellen klaar zijn, centrifugeer deze vervolgens bij 3000 ×g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant.Was de cellen in PBS en centrifugeer opnieuw. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in een gelijk volume SD zonder methionine. Incubeer 45 tot 60 minuten bij 30 °C om de expressie van het fusie-eiwit te induceren.Zet na 45 tot 60 minuten 10 milliliters van de cellen apart voor RNA-extractie en gebruik de resterende cellen voor snelle zuivering. Voeg om met deze procedure te beginnen 1,35 milliliters 37%formaldehyde toe aan de cellen, tot een eindconcentratie van 0,1%, om de RNA-proteïnecomplexen te crosslinken. Zet de incubatie voort bij 30 degrees Celsius gedurende 10 minuten.Om de cross-linking te stoppen, voegt u 26,5 milliliters van 2,5 molar glycine toe, tot een eindconcentratie van 0,125 molar, en incubeert u dit gedurende 3 minuten bij 30 degrees Celsius. Houd vanaf dit punt alles op ijs en werk snel om RNA-degradatie te minimaliseren. Centrifugeer de cellen bij 3000 times G gedurende 4 minuten bij 4 degrees Celsius.Verwijder het supernatant, voeg 45 milliliters koud PBS toe en centrifugeer opnieuw. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 5 milliliters rapid lysis buffer die een hoge concentratie Rnase-remmers bevat. Verdeel de celsuspensie in aliquoten van 500 microliters in microcentrifugebuisjes met schroefdop en voeg aan elke aliquot ongeveer 400 milligrams gekoelde glasparelletjes toe.Lyseer de cellen in een bead-beater gedurende drie minuten. Plaats het lysaat onmiddellijk op ijs. Breng het lysaat over naar nieuwe microcentrifugebuisjes.Snijd de bovenkant van een spuit van 5 milliliter af en plaats deze op een lege buis van 15 milliliter om als adapter voor buizen met schroefdop te dienen. Gebruik een verhitte naald om een klein gaatje in de bodem van elke buis te prikken en plaats deze bovenop de aangepaste buizen van 15 milliliter. Centrifugeer de buisassemblages bij 3000 ×g gedurende één minuut bij 4 °C om het lysaat in de buizen van 15 milliliter te elueren.Overdraag de doorloop van elke buis van 15 milliliter naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter en centrifugeer bij 10,000 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C om het celdebris te verwijderen. Voeg de supernatant van alle buizen van 1,5 milliliter samen in één enkele buis van 15 milliliter. Zet respectievelijk 1/50ste en 1/100ste van het volume van het lysaat apart voor RNA- en proteïne-isolatie.Start de snelle procedure voor het isoleren van RNA-proteïnecomplexen door 300 micrograms Avidine toe te voegen aan het cellysaat. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 degrees Celsius onder constant rollen. Terwijl het cellysaat wordt geïncubeerd met Avidine, worden de streptavidine-beads voorgewassen; breng ongeveer 300 microliters van de streptavidine-bead slurry over naar een microcentrifugebuis van 1.5 milliliters, centrifugeer het preparaat en verwijder vervolgens het bovenste supernatant, wat resulteert in 250 microliters beads.Voeg 1 milliliter snelle lysisbuffer toe aan de kraaltjes en centrifugeer 2 minuten bij 660 ×g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en was opnieuw met snelle lysisbuffer. Om de kraaltjes te blokkeren, voegt u 0,5 milliliter snelle lysisbuffer, 0,5 milliliter BSA en 10 µL gist TRNA toe en incubeert u dit gedurende 1 uur bij 4 °C onder constante rotatie.Was de kraaltjes twee keer met 1 milliliter rapid lysis buffer. Voeg 250 microliters van de vooraf gewassen streptavidine-kraaltjes toe aan het avidine-bevattende lysaat en incubeer dit gedurende 1 uur bij 4 graden Celsius onder constante rotatie. Deze incubatietijd is een compromis tussen het bieden van voldoende bindingstijd en het minimaliseren van de kans op RNA-degradatie.Centrifugeer na één uur gedurende 2 minuten bij 660 ×g bij 4 °C om de streptavidine-beads te klaren. Breng het supernatant over naar een buis van 15 ml. Zet respectievelijk 1/50ste en 1/100ste van het volume van het lysaat apart voor RNA- en proteïne-isolatie.Voeg 1 milliliter rapid lysis buffer toe aan de beads. Meng door te pipetteren, breng over naar een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis en centrifugeer bij 660 ×g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Was nog drie keer met rapid lysis buffer.Verwijder na de laatste wasbeurt met rapid lysisbuffer het supernatant, voeg 1 milliliter rapid washbuffer toe en roteer gedurende 5 minuten bij 4 graden Celsius. Centrifugeer en was nog 2 keer met rapid washbuffer. Was de beads met 1 milliliter PBS en centrifugeer zoals voorheen.Verwijder het supernatant, voeg 120 microliters PBS toe aan de beads en roteer dit gedurende 5 minuten in een roller. Centrifugeer zoals voorheen en verzamel al het supernatant als wassample voor RNA- en proteinextractie. Om RNA en RNA-geassocieerde eiwitten te elueren, voegt u 120 microliters 6 millimolar biotine in PBS toe aan de beads en incubeert u dit gedurende 45 minuten bij 4 graden Celsius onder constante rotatie.Centrifugeer de kraaltjes en breng het elueermateriaal over naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter. Centrifugeer het elueerde monster opnieuw en breng de bovenste fase over naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter om overdracht van kraaltjes te voorkomen. Neem monsters af voor RNA- of eiwitextractie.Om de isolatie-efficiëntie en de kwaliteit van het RNA te bepalen, werd een Northern-analyse uitgevoerd voor twee gelabelde RNA's: PMP1 en FPR1, afkomstig uit cellyse via casting, snelle cellyse en na elutie met biotine. Ribosomaal RNA werd gedetecteerd via kleuring met ethidiumbromide, en de afwezigheid van ribosomaal RNA in het elutie-monster duidt op de strengheid van de zuivering.De strengheid en specificiteit van de zuivering worden verder aangetoond door het ontbreken van een signaal van een niet-getagd MRNA in de elutie monsters. Het zichtbare signaal in de FPR1-baan, dat niet de grootte van ACT1 heeft, is een restant van een eerdere hybridisatie met de MS2L-sonde. Hoewel het input RNA enigszins meer gedegradeerd is in vergelijking met het RNA dat via het Hot Phenol-protocol is gezuiverd, wordt een aanzienlijke hoeveelheid full-length getagd RNA specifiek geïsoleerd, zoals blijkt uit het sterke signaal in de elutiefracties.Eiwitmonsters kunnen vóór de proteomanalyse worden geanalyseerd via SDS-PAGE en zilverkleuring. Het MS2-CP-GFP-SBP-fusie-eiwit, aangegeven door de pijl, demonstreert een gelijke eiwitbelading. De asterisken geven banden aan met differentiële intensiteiten die later uit de gel zijn gesneden voor analyse via massaspectrometrie.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om handschoenen te dragen, te zorgen voor een schone werkplek, oplossingen te bereiden met RNAse-vrij water en snel en efficiënt te werken om de protocoltijd te verkorten. Vergeet niet dat het werken met reagentia zoals fenol en formaldehyde extreem gevaarlijk kan zijn; voorzorgsmaatregelen, zoals het werken in een zuurkast, moeten altijd worden genomen tijdens deze procedure. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u efficiënt en effectief RNA van fayn-tress en het bijbehorende lichaam kunt zuiveren.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals RNA-Seq, worden uitgevoerd om RNA's te detecteren die binden aan het transcript van belang.

novel-rna-binding-proteins-isolation-by-the-rapid-methodology

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Vanwege het tijdelijke karakter van de pre-mRNA, kan het moeilijk zijn te isoleren en te...

Een snelle High-throughput Methode voor Mapping Ribonucleoproteins (RNP&#39;s) op de menselijke pre-mRNA

RNA transcripten zijn onderworpen aan een uitgebreide posttranscriptionele regulering die wordt bemiddeld door een veelheid van trans-werkende RNA-bindende eiwitten (RBPs). Hier presenteren wij een generaliseerbaar methode om te identificeren precies en op een transcriptoom schaal van de RNA-bindingsplaatsen van RBPs.

PAR-Clip - een methode om Transcriptome-breed de bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten te identificeren

Een stap voor stap-protocol om het isoleren en identificeren van RNA bijbehorende complexen door middel van RIP-Chip.

Werkwijze voor het isoleren en identificeren van mRNAs, microRNA en eiwitcomponenten van ribonucleoproteïne complexen uit celextracten met RIP-Chip

This video demonstrates an in vitro RNA pull-down assay to identify RNA-binding proteins (RBPs), which interact with the adenylate-uridylate-rich element (ARE) sequences in mRNA. The target RBPs from a cell lysate are mixed with an RNA probe to form RNA-protein complexes. The complexes are isolated via affinity purification utilizing the affinity of the desthiobiotin label of the RNA probe to a streptavidin-labeled magnetic bead.

RNA-Protein Pull-Down Assay to Isolate RNA-Binding Proteins via Affinity Extraction

In this video, we describe the systematic evolution of ligands by the exponential enrichment (SELEX) method to identify specific RNA-binding sequences for a target protein of interest. The protein is incubated with a large pool of randomized RNA sequences, and the protein-binding RNA sequences are isolated, PCR-amplified, and sequenced to identify their protein-binding sites.

SELEX-Based In Vitro Binding Assay to Identify RNA-Protein Interactions

Dit manuscript beschrijft een aanpak om selectieve cognate RNP's te isoleren die in eukaryote cellen worden gevormd via een specifieke oligonucleotide-gestuurde verrijking. We tonen de toepasbaarheid van deze aanpak door een cognate RNP te isoleren die gebonden is aan het retrovirale 5' niet-vertaalde gebied dat is samengesteld uit DHX9/RNA-helicase A.

Isolatie van Cognate RNA-eiwitcomplexen van cellen met behulp van oligonucleotide-gerichte Elution

We beschrijven een protocol te identificeren van RNA-bindende proteÃ¯nen en kaart van de regio's hun RNA-bindende in levende cellen met behulp van UV-gemedieerde photocrosslinking en massaspectrometrie.

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Een tandem RNA isolatie procedure (reis) voor herstel van endogeen gevormde mRNA-eiwitcomplexen wordt beschreven. Specifiek, RNA-eiwitcomplexen kruisverwijzende in vivo, polyadenylated RNAs zijn geïsoleerd uit extracten met oligo(dT) kralen en bepaalde mRNAs met gemodificeerde RNA antisense oligonucleotides worden vastgelegd. Eiwitten gebonden aan mRNAs worden gedetecteerd door analyse van de immunoblot.

Een Oligonucleotide gebaseerde Tandem RNA isolatie Procedure om te herstellen van eukaryotische mRNA-eiwitcomplexen

Bij deze methode kwantificeren we de bindende affiniteit van RNA-bindende eiwitten (rbp's) naar verwant en niet-verwant binding sites met behulp van een eenvoudige, Live, reporter assay in bacteriële cellen. De test is gebaseerd op onderdrukking van een reporter-gen.

Een test voor het kwantificeren van eiwit-RNA-binding bij bacteriën

Sequentie specificiteit is essentieel voor genregulatie. Regelgevende eiwitten die specifieke sequenties herkennen zijn belangrijk voor genregulatie. Het definiëren van functionele binding sites voor dergelijke eiwitten is een uitdagend biologisch probleem. Een iteratieve benadering voor de identificatie van een bindingsplaats voor een RNA-bindend eiwit wordt hier beschreven en is toepasbaar op alle RNA-bindende eiwitten.

Sequentie ruimte verkennen om bindende sites te identificeren voor regulatoire RNA-bindende eiwitten

Hier presenteren we een geoptimaliseerde in vitro methode om eiwitinteractoren van specifieke RNA-sequenties te ontdekken, kwantificeren en valideren, met behulp van totaal eiwitextract uit menselijke cellen, streptavidineparels bedekt met gebiotinyleerd RNA en massaspectrometrie-analyse.

Een geoptimaliseerde kwantitatieve pull-down analyse van RNA-bindende eiwitten met behulp van kort gebiotinyleerd RNA

Leer een snelle methode voor isolatie van RNA-bindende eiwitten in Saccharomyces cerevisiae. Deze techniek identificeert nieuwe mRNA-geassocieerde eiwitten en verbetert inzicht in RNA-regulatie.

Novel-RNA-bindende eiwitten Isolatie door de snelle Methodologie

Meer video's verkennen