Novel-RNA-bindende eiwitten Isolatie door de snelle Methodologie
30 september 2016
RNA-eiwitinteracties liggen aan de basis van veel cellulaire processen. Hier beschrijven we een in vivo methode om specifiek RNA te isoleren en nieuwe eiwitten te identificeren die ermee geassocieerd zijn. Dit kan nieuw licht werpen op hoe RNA's in de cel worden gereguleerd.
Het algemene doel van deze procedure is om specifiek RNA efficiënt te isoleren samen met de eiwitten die in vivo aan het RNA geassocieerd zijn. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over RNA-metabolisme en -regulatie, zoals wat de specifieke set RNA-bindende eiwitten is die aan een bepaald transcript gebonden zijn. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de hoge isolatie-efficiëntie, wat de daaropvolgende identificatie van nieuwe mRNA-geassocieerde eiwitten mogelijk maakt.
De snelle methodologie maakt gebruik van een giststam die MS2-getagd MRNA en een fusie-eiwit van een MS2-bindend eiwit en een streptavidine-bindend eiwit co-expresseert. Kweek 500 milliliters gistcellen bij 30 °C in synthetisch dextrose of SD-selectief medium tot een OD600 van 0,8 tot 1,0. Wanneer de cellen klaar zijn, centrifugeer deze vervolgens bij 3000 ×g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant.
Was de cellen in PBS en centrifugeer opnieuw. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in een gelijk volume SD zonder methionine. Incubeer 45 tot 60 minuten bij 30 °C om de expressie van het fusie-eiwit te induceren.
Zet na 45 tot 60 minuten 10 milliliters van de cellen apart voor RNA-extractie en gebruik de resterende cellen voor snelle zuivering. Voeg om met deze procedure te beginnen 1,35 milliliters 37%formaldehyde toe aan de cellen, tot een eindconcentratie van 0,1%, om de RNA-proteïnecomplexen te crosslinken. Zet de incubatie voort bij 30 degrees Celsius gedurende 10 minuten.
Om de cross-linking te stoppen, voegt u 26,5 milliliters van 2,5 molar glycine toe, tot een eindconcentratie van 0,125 molar, en incubeert u dit gedurende 3 minuten bij 30 degrees Celsius. Houd vanaf dit punt alles op ijs en werk snel om RNA-degradatie te minimaliseren. Centrifugeer de cellen bij 3000 times G gedurende 4 minuten bij 4 degrees Celsius.
Verwijder het supernatant, voeg 45 milliliters koud PBS toe en centrifugeer opnieuw. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 5 milliliters rapid lysis buffer die een hoge concentratie Rnase-remmers bevat. Verdeel de celsuspensie in aliquoten van 500 microliters in microcentrifugebuisjes met schroefdop en voeg aan elke aliquot ongeveer 400 milligrams gekoelde glasparelletjes toe.
Lyseer de cellen in een bead-beater gedurende drie minuten. Plaats het lysaat onmiddellijk op ijs. Breng het lysaat over naar nieuwe microcentrifugebuisjes.
Snijd de bovenkant van een spuit van 5 milliliter af en plaats deze op een lege buis van 15 milliliter om als adapter voor buizen met schroefdop te dienen. Gebruik een verhitte naald om een klein gaatje in de bodem van elke buis te prikken en plaats deze bovenop de aangepaste buizen van 15 milliliter. Centrifugeer de buisassemblages bij 3000 ×g gedurende één minuut bij 4 °C om het lysaat in de buizen van 15 milliliter te elueren.
Overdraag de doorloop van elke buis van 15 milliliter naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter en centrifugeer bij 10,000 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C om het celdebris te verwijderen. Voeg de supernatant van alle buizen van 1,5 milliliter samen in één enkele buis van 15 milliliter. Zet respectievelijk 1/50ste en 1/100ste van het volume van het lysaat apart voor RNA- en proteïne-isolatie.
Start de snelle procedure voor het isoleren van RNA-proteïnecomplexen door 300 micrograms Avidine toe te voegen aan het cellysaat. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 degrees Celsius onder constant rollen. Terwijl het cellysaat wordt geïncubeerd met Avidine, worden de streptavidine-beads voorgewassen; breng ongeveer 300 microliters van de streptavidine-bead slurry over naar een microcentrifugebuis van 1.5 milliliters, centrifugeer het preparaat en verwijder vervolgens het bovenste supernatant, wat resulteert in 250 microliters beads.
Voeg 1 milliliter snelle lysisbuffer toe aan de kraaltjes en centrifugeer 2 minuten bij 660 ×g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en was opnieuw met snelle lysisbuffer. Om de kraaltjes te blokkeren, voegt u 0,5 milliliter snelle lysisbuffer, 0,5 milliliter BSA en 10 µL gist TRNA toe en incubeert u dit gedurende 1 uur bij 4 °C onder constante rotatie.
Was de kraaltjes twee keer met 1 milliliter rapid lysis buffer. Voeg 250 microliters van de vooraf gewassen streptavidine-kraaltjes toe aan het avidine-bevattende lysaat en incubeer dit gedurende 1 uur bij 4 graden Celsius onder constante rotatie. Deze incubatietijd is een compromis tussen het bieden van voldoende bindingstijd en het minimaliseren van de kans op RNA-degradatie.
Centrifugeer na één uur gedurende 2 minuten bij 660 ×g bij 4 °C om de streptavidine-beads te klaren. Breng het supernatant over naar een buis van 15 ml. Zet respectievelijk 1/50ste en 1/100ste van het volume van het lysaat apart voor RNA- en proteïne-isolatie.
Voeg 1 milliliter rapid lysis buffer toe aan de beads. Meng door te pipetteren, breng over naar een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis en centrifugeer bij 660 ×g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Was nog drie keer met rapid lysis buffer.
Verwijder na de laatste wasbeurt met rapid lysisbuffer het supernatant, voeg 1 milliliter rapid washbuffer toe en roteer gedurende 5 minuten bij 4 graden Celsius. Centrifugeer en was nog 2 keer met rapid washbuffer. Was de beads met 1 milliliter PBS en centrifugeer zoals voorheen.
Verwijder het supernatant, voeg 120 microliters PBS toe aan de beads en roteer dit gedurende 5 minuten in een roller. Centrifugeer zoals voorheen en verzamel al het supernatant als wassample voor RNA- en proteinextractie. Om RNA en RNA-geassocieerde eiwitten te elueren, voegt u 120 microliters 6 millimolar biotine in PBS toe aan de beads en incubeert u dit gedurende 45 minuten bij 4 graden Celsius onder constante rotatie.
Centrifugeer de kraaltjes en breng het elueermateriaal over naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter. Centrifugeer het elueerde monster opnieuw en breng de bovenste fase over naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter om overdracht van kraaltjes te voorkomen. Neem monsters af voor RNA- of eiwitextractie.
Om de isolatie-efficiëntie en de kwaliteit van het RNA te bepalen, werd een Northern-analyse uitgevoerd voor twee gelabelde RNA's: PMP1 en FPR1, afkomstig uit cellyse via casting, snelle cellyse en na elutie met biotine. Ribosomaal RNA werd gedetecteerd via kleuring met ethidiumbromide, en de afwezigheid van ribosomaal RNA in het elutie-monster duidt op de strengheid van de zuivering.
De strengheid en specificiteit van de zuivering worden verder aangetoond door het ontbreken van een signaal van een niet-getagd MRNA in de elutie monsters. Het zichtbare signaal in de FPR1-baan, dat niet de grootte van ACT1 heeft, is een restant van een eerdere hybridisatie met de MS2L-sonde. Hoewel het input RNA enigszins meer gedegradeerd is in vergelijking met het RNA dat via het Hot Phenol-protocol is gezuiverd, wordt een aanzienlijke hoeveelheid full-length getagd RNA specifiek geïsoleerd, zoals blijkt uit het sterke signaal in de elutiefracties.
Eiwitmonsters kunnen vóór de proteomanalyse worden geanalyseerd via SDS-PAGE en zilverkleuring. Het MS2-CP-GFP-SBP-fusie-eiwit, aangegeven door de pijl, demonstreert een gelijke eiwitbelading. De asterisken geven banden aan met differentiële intensiteiten die later uit de gel zijn gesneden voor analyse via massaspectrometrie.
Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om handschoenen te dragen, te zorgen voor een schone werkplek, oplossingen te bereiden met RNAse-vrij water en snel en efficiënt te werken om de protocoltijd te verkorten. Vergeet niet dat het werken met reagentia zoals fenol en formaldehyde extreem gevaarlijk kan zijn; voorzorgsmaatregelen, zoals het werken in een zuurkast, moeten altijd worden genomen tijdens deze procedure. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u efficiënt en effectief RNA van fayn-tress en het bijbehorende lichaam kunt zuiveren.
Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals RNA-Seq, worden uitgevoerd om RNA's te detecteren die binden aan het transcript van belang.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een in vivo methode voor het isoleren van specifiek RNA samen met de geassocieerde eiwitten. Deze techniek is erop gericht ons begrip van de RNA-regulatie binnen cellen te verbeteren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- RNA-proteïne-interacties
- Cellulaire processen
- RNA-metabolisme
Achtergrond
- RNA-eiwitinteracties zijn cruciaal voor diverse cellulaire functies.
- Inzicht in deze interacties kan leiden tot een beter begrip van RNA-regulatie.
- Bestaande methoden kunnen tekortschieten in de efficiëntie bij het isoleren van specifieke RNA-eiwitcomplexen.
- Deze studie introduceert een nieuwe benadering met behulp van giststammen.
Doel van de studie
- Om specifiek RNA in vivo te isoleren en de geassocieerde eiwitten te identificeren.
- Om vragen over RNA-metabolisme en regulatie te beantwoorden.
- Om de efficiëntie van technieken voor de isolatie van RNA-eiwitcomplexen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een giststam die MS2-getagd mRNA co-exprimeert.
- Fusie-eiwit van MS2-bindend eiwit en streptavidine-bindend eiwit.
- Groei van gistcellen in synthetisch dextrosemedium.
- Centrifugatie om RNA-eiwitcomplexen te isoleren.
Belangrijkste Resultaten
- Er werd een hoge efficiëntie bereikt bij het isoleren van RNA-proteïnecomplexen.
- De identificatie van nieuwe mRNA-geassocieerde proteïnen werd vergemakkelijkt.
- De methode maakt een snelle verwerking van monsters mogelijk.
- Via deze benadering werd inzicht verkregen in de RNA-regulatie.
Conclusies
- Deze methode biedt een waardevolle tool voor het bestuderen van RNA-proteïne-interacties.
- Het vergroot ons begrip van het RNA-metabolisme en de regulatie hiervan.
- Toekomstige toepassingen kunnen leiden tot ontdekkingen in cellulaire processen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Het identificeren van RNA-bindende eiwitten (RBP's) die geassocieerd zijn met specifieke transcripten is essentieel voor doelwitvalidatie bij RNA-therapeutica en de ontdekking van biomarkers. De RaPID-methodologie maakt efficiënte in vivo isolatie van RNA-eiwitcomplexen mogelijk, wat mechanistische risicovermindering ondersteunt door functionele interacties in een ziekte-relevant systeem te verduidelijken. Deze benadering vergroot de voorspellende betrouwbaarheid in de vroege ontdekkingsfase door kwantitatieve, reproduceerbare gegevens te leveren over RBP-mRNA-associaties.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door RBPs te identificeren die gebonden zijn aan ziekterelateerde mRNAs, zoals ER-geassocieerde PMP1.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare workflow voor het isoleren van natuurlijke RNA-proteïnecomplexen uit gist, waardoor fout-positieven uit in vitro methoden worden verminderd.
- Predictieve waarde: Ondersteunt het vertrouwen in targets door specifieke, hoog-efficiënte capture van in vivo interacties, wat helpt bij de triage van de portfolio.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gevalideerde biologische systemen (giststammen die MS2-getagd RNA en fusie-eiwitten tot expressie brengen) voor downstream screeningtoepassingen.
- Operationele waarde: Standardiseert complexe isolatie via streptavidine-bead pulldown, waardoor de reproduceerbaarheid tussen experimenten wordt verbeterd.
- Assay-gereedheid: Produceert gezuiverde RNA- en eiwitfracties die geschikt zijn voor kwantitatieve analyse via massaspectrometrie of Northern blot.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt de identificatie van RBP's in de ontdekkingsfase met preklinische validatie door vervolganalyses zoals RNA-Seq en SDS-PAGE mogelijk te maken.
- Mechanistische risicovermindering: Toont striktheid en specificiteit aan door de afwezigheid van ribosomaal RNA en niet-getagde mRNA-signalen in elutie-monsters.
- Ziekterellevant systeem: Toepasbaar op gistmodellen van RNA-metabolisme, met potentiële aanpassing naar zoogdiersystemen voor doelwitvalidatie.
Integratie van pipeline en workflow
De RaPID-methode past binnen het continuüm van vroege ontdekking en ondersteunt hypothese-testen en biologische risicovermindering voorafgaand aan de identificatie van lead-verbindingen en preklinische validatie.
- Ontdekkingsbiologie: Faciliteert hypothesetesten door specifieke RNA-eiwitcomplexen uit vivo-condities te isoleren, waardoor functionele associaties worden verduidelijkt.
- Screening: Maakt assay-ontwikkeling mogelijk via gestandaardiseerde isolatie van RNA-eiwitcomplexen, wat reproduceerbare compound- of genetische screening ondersteunt.
- Analytica: Genereert kwantitatieve output via massaspectrometrie en Northern blot-analyse, waardoor vergelijking van de RBP-abundantie over verschillende condities mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt preklinische continuïteit door gezuiverde complexen te leveren voor downstream-validatie in ziektemodellen.
- Hergebruik in de onderneming: Vestigt een herbruikbaar platform voor de ontdekking van RBP's over meerdere transcripten, waardoor redundante methodeontwikkeling wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in RNA-regulatie te verminderen.
- Operationele waarde: Verbeterde standaardisatie en schaalbaarheid door gedefinieerde stappen voor crosslinking, lysis en bead-gebaseerde zuivering.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door betrouwbare gegevens te leveren over RBP-mRNA-interacties, waardoor biologische risico's in een late fase worden verminderd.
- Portfolio-impact: Maakt risicogebaseerde prioritering van targets mogelijk op basis van gevalideerde RBP-associaties in ziekte-relevante contexten.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in moleculaire biologie, gistcultuur en technieken voor RNA-eiwitinteractie.
- Vereist instrumentarium voor crosslinking (formaldehyde), scheiding op basis van beads en centrifugatie bij verschillende snelheden.
- Vereist standaardisatie tussen teams van de samenstelling van de lysisbuffer en het gebruik van RNase-remmers om reproduceerbaarheid te garanderen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij overdracht van gist naar andere modelsystemen, met name met betrekking tot tagging en expressie van fusie-eiwitten.
- Omvat praktische beperkingen, zoals het risico op RNA-degradatie tijdens de verwerking en de noodzaak van een snelle, koude behandeling om de integriteit van complexen te behouden.
