Name: Phagosome Closure Assay naar phagosome Formatie Visualiseer in drie dimensies behulp van totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Leer hoe u fagosoomformatie en -sluiting in 3D visualiseert in levende macrofagen met behulp van TIRF-microscopie. Deze methode combineert TIRF met epifluorescentie voor gedetailleerde monitoring van pseudopodiumuitbreiding en tipfusie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, Parijs, Frankrijk) voor de initiële besprekingen over de experimentele aanpak en Dr. Jamil Jubrail voor het lezen van het manuscript. Nadège Kambou en Susanna Borreill worden erkend voor het uitvoeren van experimenten met de methode in ons laboratorium. Dit werk werd ondersteund door subsidies van CNRS (ATIP-programma), Ville de Paris en Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518, inclusief een doctoraatsbeurs voor FMA) aan FN, en Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales" (ANRS), inclusief een doctoraatsbeurs voor JM.

Opmerking: Het plasmide gebruikt Lifeact-mCherry is een soort geschenk van Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Parijs, geproduceerd na 17. 1. Cellen en Transfectie Opmerking: RAW264.7 macrofagen worden gekweekt tot sub- confluentie in compleet medium (RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 medium, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvaat, 50 uM β-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine en 10% FCS ( foetaal kalfsserum)) in een 100 mm plaat. Ze zijn getransfecteerd met plasmiden die coderen fluorescent gelabelde eiwitten door elektroporatie. Routinematig ongeveer 5-6 x 10 6 cellen respectievelijk getransfecteerd met 20 ug of 10 ug plasmide voor elke transfectie of co-transfectie. Merk op dat andere transfectie basis van elektroporatie of lipofectie kan worden gebruikt als alternatieve benaderingen. <ol><li> Schraap de cellen met een cel lifter en resuspendeer ze in 10 ml kweekmedium door en neer te pipetteren meerdere malen. </li><li> centrifuge decelsuspensie 300 xg, 5 minuten bij kamertemperatuur in swingende hoek rotor. </li><li> Voorverwarming 10 ml compleet medium gesupplementeerd met 10 ug / ml gentamicine bij 37 ° C. </li><li> Na centrifugatie, gooi het supernatant en resuspendeer de pellet in 3 ml &quot;wasbuffer A&quot; van de elektroporatie kit. </li><li> Centrifugeer de celsuspensie 300 xg, 5 min bij kamertemperatuur in zwenkhoek rotor. </li><li> Ondertussen bereidt de DNA mengsel bij kamertemperatuur: 120 ul 2x buffer B, 20 ug plasmide DNA dat codeert voor het eiwit van belang, QSP 240 ui H2O </li><li> Na centrifugeren, gooi het hele supernatant. </li><li> Resuspendeer de celpellet in het DNA mengsel en breng in 4 mm elektroporatie cuvetten. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min. </li><li> Elektroporatie bij 250 V, 900 uF. </li><li> Onmiddellijk resuspendeer de cellen in de voorverwarmde (37 ° C) compleet medium aangevuld met gentamicine en de plaatm in een 100 mm schaal. </li><li> Incubeer de getransfecteerde cellen een nacht bij 37 ° C, 5% CO2. </li><li> De volgende ochtend, vervangt het compleet medium met 10 ml serumvrij microscopie medium (RPMI 1640 zonder fenolrood, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvaat, 50 uM β-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine). </li></ol> 2. opsonisatie van rode bloedcellen Opmerking: Als model van deeltjes doelwit voor macrofagen, worden rode bloedcellen van schapen (SRBC&#39;s) gebruikt. Meestal is ongeveer 7 x 10 6 SRBC&#39;s per 35 mm glazen bodem schaal wordt gebruikt. <ol><li> Was de SRBC met 100 pl 1x PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) /0.1% BSA (runderserumalbumine) en gecentrifugeerd (600 xg, 4 min). </li><li> Na centrifugeren, gooi het supernatant en resuspendeer de SRBC&#39;s in 100 ul 1x PBS / 0,1% BSA en centrifuge (600 xg, 4 min). </li><li> Na centrifugeren, gooi het supernatant en resuspendeer de SRBC&#39;s in 1x PBS / 0,1% BSA met konijn IgG anti-SRBC&#39;sop sub-agglutinerende concentratie. Gebruik 500 pl oplossing die antilichaam / 5 gl SRBC. Opmerking: De sub-agglutinerende antilichamen concentratie overeenkomt met de laagste concentratie die geen agglutinatie ontdekt de vorming van een netwerk induceerde. In het algemeen, de verder agglutinerende concentratie 8,2 ug / ml. <ol><li> Bepaal de concentratie van IgG anti-SRBC verplicht de SRBC opsoniseren door een hemagglutinatie-test. Serieel verdunnen de IgG anti-SRBC (voorraad bij 13,1 mg / ml) tussen 1/50 - 1 / 25.600 in een microplaat. Voeg 2 x 10 6 SRBC&#39;s in elk putje. Incubeer de plaat in het donker bij kamertemperatuur gedurende verscheidene uren. </li></ol></li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten onder langzaam draaien. </li><li> Na twee wassingen in 1x PBS / 0,1% BSA zoals hierboven beschreven, resuspendeer de IgG-opsonized SRBC (IgG-SRBC&#39;s) in voorverwarmd serumvrij medium microscopie (2 ml / schaal). </li></ol> 3. Poly-lysine Coating van Coverslips <ol><li> In de tussentijdBehandelen 35 mm glazen bodem gerechten met 2 ml 0,01% poly-L-lysine gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> De afwas tweemaal met 2 ml 1x PBS. </li></ol> 4. Niet-covalente Fixatie van SRBC&#39;s on Glass Bottom Dishes <ol><li> Giet 2 ml SRBC&#39;s schorsing per 35 mm glazen bodem schaal. </li><li> Centrifugeren met een swingende rotor bij 500 xg gedurende 2 min op 35 mm glazen bodem gerechten. </li><li> Verwijder de supernatant en was eenmaal met 2 ml 1 x PBS / 10% BSA. </li><li> Incubeer de deeltjes gedurende 30 minuten met 2 ml van 1 x PBS / 10% BSA per schaal. </li><li> De afwas drie keer met 2 ml 1x PBS. </li><li> Vervang 1x PBS met 2 ml voorverwarmde (37 ° C) serumvrij medium microscopie. </li></ol> 5. Fagocytose gevisualiseerd door TIRFM <ol><li> Microscoop Opmerking: TIRFM werd uitgevoerd met een microscoop met een olie-immersie objectief (N 100X, NA1.49), een verhittingskamer met CO 2, en twee zingle fotondetectie camera EMCCD (Electron vermenigvuldigen Charge Coupled Device) in combinatie met een 1.5X lens. <ol><li> De dag voor de TIRF microscoop sessie, zet de verwarming kamer bij 37 ° C om een ​​homogene opwarming van de microscoop podium staan. </li></ol></li><li> Kritische hoek Bepaling Opmerking: ImageJ Color Profiler software wordt gebruikt om TIRF beeld streams te verwerken. <ol><li> Plaats een 35 mm glazen bodem schaaltje met geopsoniseerd SRBC met serumvrij medium microscopie onder de microscoop. </li><li> Schraap de cellen en resuspendeer ze in het medium voordat ze toe te voegen (100 - 500 pl) in de schaal. </li><li> Met &quot;Live Acquisition&quot; software om de microscoop controleren en uitvoeren van excitatie met een 491 nm en / of 561 nm laser om cellen die fluorescent gelabelde eiwitten te identificeren. </li><li> Identificeren van een cel die de fluorescent gelabelde eiwitten tot expressie brengt. </li><li> Plaats het in het midden van het veld en het verwerven van 500 imleeftijden een excitatiegolflengte, met verschillende hoeken vanaf 0 ° tot 5 °, met een toename van 0.01º (figuur 2A). De hoeken worden automatisch gewijzigd door het microscoopsysteem. </li><li> Bepaal de kritische hoek waardoor het invallende licht volledig tot uiting komen in de glazen / medium-interface en het genereren van de uitdovende golf. Met behulp van ImageJ Color Profiler software, opent u de reeks afbeeldingen door te klikken op &quot;File&quot;, &quot;Open&quot; en selecteer het bestand. </li><li> Selecteer een van belang (ROI), met de rechthoekige gereedschap, in de cel met een uniforme fluorescentie (Figuur 2B geel 1). </li><li> Zet de &quot;Z-profiel-as&quot; betekent fluorescentie-intensiteit gemeten in de ROI met de functie van de hoeken op de x-as door te klikken op de tab &quot;Beeld&quot;, &quot;Stacks&quot; in het drop down menu en &quot;Plot Z-as Profile&quot; (Figuur 2B rood 2). Opmerking: De kritische hoek is de hoek die naar de maximum fluorescentie voor een scherpe daling van de fluorescentie. </li><li> Gebruik een waarde van de hoek op de x-as boven de kritische hoek in de microscopie sessie naar een TIRF signaal bijvoorbeeld 2,00 (figuur 2C) te verkrijgen. </li></ol></li><li> acquisities <ol><li> Met Live Acquisitie software, het opzetten van de parameters van de overname met de module &quot;Protocol Editor&quot; (figuur 3A). <ol><li> Maak een protocol met een &quot;loop&quot; omvattende &quot;Multi Channels&quot; overname fluorescerende signaal van eiwitten van belang in de regio TIRF te verwerven. Voer de TIRF hoek (bijvoorbeeld 2,00), de blootstellingstijd (bijvoorbeeld 50 msec) en de laserintensiteit (bijvoorbeeld 50%) (figuur 3B 1). </li><li> Introduceer een &quot;Z move&quot; van de doelstelling van 3 micrometer boven het gebied TIRF om het signaal acquisitie verkrijgen epifluorescentie met de &quot;Multi Channels&quot; tool. Voer een hoek hieronder tHij grenshoek (zoals bijvoorbeeld 1,00), de tijd van blootstelling (50 msec) en de laserintensiteit (50%) (Figuur 3B, 2 en 3). </li><li> Voeg vervolgens een &#39;z move &quot;van de doelstelling 3 urn hieronder, om terug te keren in de TIRF regio (Figuur 3B 4). Voeg een &#39;snapshot&#39; van de cel in fel licht LED (Light-Emitting Diode) (Figuur 3B 5). </li></ol></li><li> Vind een cel van belang met een beperkte mate van fluorescent gemerkt eiwit expressie die fagocytose van SRBC initieert door de uitbreiding van plasmamembraan rond het deeltje. </li><li> Plaats het in het midden van het veld. </li><li> Begin streaming overname van 500 - 1000 frames. In het tabblad &quot;loop count&quot;, voert u &quot;750 frames&quot; (Figuur 3B 1). Opmerking: ImageJ Color Profiler software wordt gebruikt om TIRF beeld streams te verwerken. </li><li> Open de reeks beelden in Image J-software door te klikken op&quot;File&quot;, &quot;Open&quot; en het kiezen van het bestand. </li><li> Scheid de kanalen door te klikken op de tab &quot;Beeld&quot;, &quot;Hyperstacks&quot; drop-down menu en op &quot;Stack HyperStack&quot; -functie. Vul het verschenen venster: Order: xyctz; Channel (c): aantal kanalen (ex: &quot;2&quot; als u twee fluorochromen); Plakken (z): aantal segmenten in z-as (ex: &quot;1&quot; als er geen beweging in de z-as); Frames (t): aantal beelden opgesplitst per aantal kanalen; Display mode: grijsschaal. Opmerking: Twee afzonderlijke beeldsequenties worden gegenereerd, corresponderend met de twee kanalen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Ann Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+cups+into+phagosomes+and+macropinosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shaping cups into phagosomes and macropinosomes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).</li>
<li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+comparative+innate+immunity%3A+learning+on+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly.</a> Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).</li>
<li>Niedergang, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNiedergang%2C+F+%22Encyclopedia+of+Cell+Biology%22">Encyclopedia of Cell Biology</a>. Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).</li>
<li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+clearance%3A+basic+biology+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nat Rev Immunol. 14, 166-180 (2014).</li>
<li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annu. Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).</li>
<li>Underhill, D. M., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+processing+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Information processing during phagocytosis.</a> Nat Rev Immunol. 12, 492-502 (2012).</li>
<li>Underhill, D. M., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+of+microbes%3A+complexity+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis of microbes: complexity in action.</a> Annu Rev Immunol. 20, 825-852 (2002).</li>
<li>Canton, J., Neculai, D., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenger+receptors+in+homeostasis+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Scavenger receptors in homeostasis and immunity.</a> Nat Rev Immunol. 13, 621-634 (2013).</li>
<li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+receptors%2C+signal+integration%2C+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol Rev. 262, 193-215 (2014).</li>
<li>Scott, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-4%2C5-bisphosphate+hydrolysis+directs+actin+remodeling+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis.</a> J Cell Biol. 169, 139-149 (2005).</li>
<li>Schlam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide+3-kinase+enables+phagocytosis+of+large+particles+by+terminating+actin+assembly+through+Rac%2FCdc42+GTPase-activating+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide 3-kinase enables phagocytosis of large particles by terminating actin assembly through Rac/Cdc42 GTPase-activating proteins.</a> Nat Commun. 6, 8623(2015).</li>
<li>Marion, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NF-kappaB+Signaling+Protein+Bcl10+Regulates+Actin+Dynamics+by+Controlling+AP1+and+OCRL-Bearing+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The NF-kappaB Signaling Protein Bcl10 Regulates Actin Dynamics by Controlling AP1 and OCRL-Bearing Vesicles.</a> Dev Cell. 23, 954-967 (2012).</li>
<li>Loovers, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+phagocytosis+in+Dictyostelium+by+the+inositol+5-phosphatase+OCRL+homolog+Dd5P4%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Regulation of phagocytosis in Dictyostelium by the inositol 5-phosphatase OCRL homolog Dd5P4.</a> Traffic. 8, 618-628 (2007).</li>
<li>Deschamps, C., Echard, A., Niedergang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+cytokinesis%3A+do+cells+use+common+tools+to+cut+and+to+eat%3F+Highlights+on+common+themes+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and cytokinesis: do cells use common tools to cut and to eat? Highlights on common themes and differences.</a> Traffic. 14, 355-364 (2013).</li>
<li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+12%2C+Unit+12.29%3A+Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Chapter 12, Unit 12.29: Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Curr Protoc Cytom. , (2012).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li>
<li>Marie-Anais, F., Mazzolini, J., Herit, F., Niedergang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-actin+cross-talk+contributes+to+phagosome+formation+and+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Dynamin-actin cross-talk contributes to phagosome formation and closure.</a> Traffic. 17 (5), 487-499 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het experimentele protocol dat hier wordt beschreven, stelt een ongekende methode voor om in realtime en in levende cellen, met hoge resolutie, de vorming van een fagosoom en met name zijn sluiting te volgen. Er zijn verschillende technische aspecten die besproken moeten worden. Ten eerste is de test erg gevoelig voor temperatuur. Het is erg belangrijk om te controleren of de verwarmingskamer op 37 °C staat en dat alle media, apparaten of cellen binnen de kamer worden gehouden om temperatuurveranderingen te voorkomen die...

Fagocytose is een belangrijke celfunctie die begint bij de herkenning en binding van het materiaal aan receptoren oppervlakte, die vervolgens leidt tot de internalisatie en degradatie van het opgenomen materiaal. Terwijl eencellige eukaryoten, zoals de mal Dictyostelium discoideum en amoeben gebruiken fagocytose voor het voeden op bacteriën, hebben hogere organismen geëvolueerd met professionele cellen. Macrofagen of dendritische cellen zijn de eerste verdedigingslinie tegen pathogenen in verschillende weefsels en organen, en zijn van cruciaal belang voor het adaptieve immuunsysteem activeren via antigeen presentatie en cytokine productie 1-4. Onder bepaalde omstandigheden fagocytose kan worden uitgevoerd door niet-professionele fagocyten, bijvoorbeeld, endotheel- en epitheelcellen. Dit is van belang om homeostase te handhaven tijdens ontwikkeling en in de volwassenheid voor normaal weefsel omzet en hermodellering. Tenslotte gespecialiseerde fagocyten zoals Sertoli cellen in de testis of retinalepigment epitheelcellen zijn uiterst potente fagocyten 5. De vorming van een phagosome waarbij afbraak van micro-organismen of celresten optreedt begint met de clustering van fagocytische receptoren op het oppervlak van de fagocytische cellen. Downstream signalering gebeurtenissen na clustering van opsonische receptoren zoals Fc-receptoren (FcR) of complement receptoren (CRS) zijn goed gekarakteriseerd. Er zijn echter ook vele niet-opsonische receptoren waaronder Toll-achtige receptoren (TLRs), lectinen, receptoren en mannose scavenger receptor. Deze receptoren herkennen determinanten deeltjesoppervlak zoals mannose en fucose residuen, fosfatidylserine en lipopolysacchariden 1,6-9. Pathogeen of celresten erkenning omvat binding van en clustering van verschillende soorten fagocyterende receptor, die vervolgens leiden tot intens en voorbijgaande actine remodeling. Parallel, focale exocytose van intracellulaire compartments bijdraagt ​​aan de afgifte van membraan spanning en is belangrijk voor een efficiënte fagocytose van grote deeltjes. De signalering gebeurtenissen die tot actine polymerisatie en membraan deformatie werden ontleed in experimentele modellen die één fagocyterende receptor geactiveerd. Tijdens FcR-gemedieerde fagocytose, is er intense actine polymerisatie die wordt gereguleerd door kleine GTPases (Rac, Cdc42). Onder hun effectoren, de Wiskott-Aldrich syndroom eiwit (WASP) leidt tot activatie van de Actin-gerelateerd eiwit 2/3 complex (Arp2 / 3) dat actine filamenten 1,2,4,10 nucleates. Lokale productie van fosfatidylinositol-4, 5-bifosfaat (PI (4,5) P2) is essentieel voor initiële actine polymerisatie die pseudopod vorming aandrijft. De omzetting PI (3,4,5) P3 vereist voor pseudopod uitbreiding en phagosome sluiting 11. Verscheidene signaalwegen tot het verdwijnen van PI (4,5) P2. Ten eerste detachement van fosfatidylinositol fosfaat kinases (PIPKIs) van de phagosome arrestaties PI (4,5) P2 synthese. Ten tweede kan worden gefosforyleerd en geconsumeerd door klasse I PI3K kinases (PI3K) en omgezet in PI (3,4,5) P3 12. Een rol voor fosfatasen en fosfolipasen is ook geïmpliceerd in PI (4,5) P2 hydrolyse en F-actine verwijdering gedurende fagocytose in zoogdiercellen en in Dictyostelium 13,14. De fosfolipase C (PLC) δ hydrolyseert PI (4,5) P2 in diacylglycerol en inositol-1,4,5- tris fosfaat. De PI (4,5) P2 en PI (3,4,5) P3 fosfatase OCRL (oculocerebrorenal syndroom van Lowe) is ook betrokken bij phagosome formatie. Nauwkeurige lokale vorming van F-actine en de depolymerisatie wordt strak gereguleerd in ruimte en tijd en we hebben aangetoond dat rekrutering van intracellulaire compartimenten belangrijk lokaal leveren de OCRL fosfatase, hetgeen bijdraagt ​​aan lokale actine depolymerisatie aan de voet van de fagocytische cup <sup&gt; 13,15. Hiervoor gebruikten we de experimentele set-up hier beschreven. De spelers mechanisme en moleculaire vereist phagosome sluiting en membraan splitsing blijven slecht gedefinieerd vanwege de moeilijkheden bij het visualiseren en controleren van de plaats van phagosome sluiting. Tot voor kort werd fagocytose waargenomen op vaste of levende cellen die deeltjes internaliseren hun dorsale zijde of de zijden, waardoor de tijdige visualisatie van de plaats van sluiting phagosome moeilijk. Bovendien kan bevestigingssystemen terugtrekken van membranen en afwijking de resultaten op pseudopodia uitbreiding en sluiting veroorzaken. Daarentegen is de test die wij hebben opgezet en beschrijf hier kunnen we pseudopod uitbreiding en de afsluiting stap van fagocytose in levende cellen 13, op basis van totale interne reflectie microscopie (TIRFM) 16 visualiseren. Deze optische techniek gebruikt een uitdovende golf fluoroforen in een dunne gebied exciteren op het raakvlak tussen een transparant, zodatdeksel (dekglaasje) en een vloeistof (celkweekmedium). De dikte van de excitatie diepte ongeveer 100 nm van het vaste oppervlak, waardoor visualisatie van moleculaire gebeurtenissen dichtbij de plasmamembraan. TIRFM maakt een hoge signaal-tot-achtergrond verhouding en beperkt de out-of-focus fluorescentie verzameld en de cytotoxiciteit door verlichting van cellen. Maken van TIRFM ontwikkelden we de &quot;phagosome afsluiting assay&quot; waarin dekglaasjes worden geactiveerd met polylysine en vervolgens met IgG-opsonized rode bloedcellen (IgG-SRBC). Macrofagen transiënt tot expressie fluorescent gelabelde eiwitten plaats mogen dan overspoelen de IgG-SRBC. Terwijl de cellen los doeldeeltjes die niet-covalent gebonden aan het glasoppervlak, kunnen de uiteinden van de pseudopods worden afgelezen en geregistreerd in de TIRF modus. TIRF aankopen worden gecombineerd met acquisities in de epifluorescentie wijze, na het verschuiven van de fase 3 urn boven, waardoor de visualization van de basis van de fagocytische cup. Toevoeging van farmacologische middelen zoals actine remmen of dynamin tijdens het proces mogelijk om het proces verder te ontleden op moleculair niveau. De in detail hier beschreven protocol voor RAW264.7 murine macrofaag cellijn en geopsoniseerde deeltjes, maar praktisch kan worden aangepast aan andere fagocytische cellen en andere doelen, zoals parels. Deze methode zal een betere karakterisering van de verordening mogelijk te maken in tijd en ruimte van de moleculaire spelers die betrokken zijn bij pseudopod uitbreiding en phagosome sluiting tijdens diverse fagocytische processen.

<table><tbody><tr><td>Anti-schapenrode bloedcellen IgG</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td></td></tr><tr><td>Rundereiwit Albumine hitteschokfractie, pH 7, &ge;98%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cellifter</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes 4 mm</td><td>Cell project</td><td>EP104</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, geen calcium, geen magnesium</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-094</td><td>Kamertemperatuur</td></tr><tr><td>Electrobuffer kit</td><td>Cell project</td><td>EB110</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-behandelde celcultuurschaal</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Gene X-cell pulser</td><td>Biorad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine-oplossing</td><td>Sigma</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Glazenkokers 35 mm ongecoat 1.5</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C Case</td><td></td></tr><tr><td>iMIC</td><td>TILL Photonics</td><td></td><td>Olie-immersieobjectief (N 100X, NA1.49), verwarmingskamer met CO2, een camera met enkele fotondetectie EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) en een 1.5X lens</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine-oplossing 0,1%</td><td>Sigma</td><td>P8920-100ml</td><td>Verdunning tot 0,01% in water&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640-medium GLUTAMAX&nbsp; Supplement</td><td>Life technologies</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640-medium, geen fenolrood (10 x 500 ml)</td><td>Life technologies</td><td>11835-105</td><td>Verwarmen in 37 &deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>Schapenrode bloedcellen (SRBC's)</td><td>Eurobio</td><td>DSGMTN00-0Q</td><td>Geconserveerd in Alsever-buffer bij 4 &deg;C voor gebruik</td></tr></tbody></table>

&quot;phagosome closure assay&quot; naar phagosome formatie visualiseer in drie dimensies behulp van totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (tirfm)

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

Fagocytose is een mechanisme dat door gespecialiseerde cellen wordt gebruikt om micro-organismen of cellulaire afvalstoffen te internaliseren en te elimineren. Het berust op diepgaande herschikkingen van het actine-cytoskelet dat de drijvende kracht is voor de uitbreiding van het plasmamembraan rond het deeltje. Bovendien is efficiënte insluiting van groot materiaal afhankelijk van focale exocytose van intracellulaire compartimenten. Dit proces is zeer dynamisch en er zijn talrijke moleculaire spelers beschreven die een rol spelen tijdens de vorming van de fagocytische cup. De nauwkeurige regulatie in tijd en ruimte van al deze moleculen blijft echter onduidelijk. Bovendien is de laatste stap van het sluiten van de fagosoom erg moeilijk waar te nemen, omdat remming door RNA-interferentie of dominante negatieve mutanten vaak resulteert in een gestopte vorming van de fagocytische cup.
We hebben een toegewijde experimentele aanpak opgezet met behulp van totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie (TIRFM) gecombineerd met epifluorescentie om stap voor stap de uitbreiding van pseudopoden en hun uiteinden in een fagosoom te volgen die groeit rond een losjes gebonden deeltje aan een dekglas. Deze methode stelt ons in staat om met hoge resolutie de uiteinden van de pseudopoden en hun fusie tijdens het sluiten van de fagosoom in levende cellen waar te nemen voor twee verschillend gelabelde fluorescente eiwitten tegelijk.

Het experimentele systeem in dit handschrift beschreven is schematisch weergegeven in figuur 1. Getransfecteerde RAW264.7 macrofagen tot expressie brengen van de eiwitten van belang gefuseerd aan een fluorescerend label in aanraking gebracht met IgG-opsonized rode bloedcellen van schapen (SRBC&#39;s) die niet-covalent vast waren op het dekglaasje. De macrofagen kan de SRBC los te maken van het dekglaasje om het te overspoelen. De TIRF microscoop gebruikt maakt gelijktijd...

We beschrijven een experimentele opstelling om fagosoombevorming en -afsluiting in drie dimensies in levende macrofagen met ongekend hoge resolutie te visualiseren, met behulp van total internal reflection fluorescentiemicroscopie. Het maakt het mogelijk om de basis van de fagocytische cup, de uitbreidende pseudopoden, evenals de precieze plaats van fagosooombaan te monitoren.

&quot;Phagosome Closure Assay&quot; naar phagosome Formatie Visualiseer in drie dimensies behulp van totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

Het algemene doel van dit protocol is om de vorming van fagosomen, evenals de precieze locatie van de fagosoomsplitsing in 3D, te visualiseren in levende macrofagen met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence-microscopie, oftewel TIRF-microscopie. Deze methode combineert TIRF-microscopie met epifluorescentie om de stapsgewijze lokalisatie van twee verschillende fluorescerende eiwitten tijdens de extensie van pseudopodia en tipfusie te monitoren. De techniek biedt een systematische methode om de kritieke hoek te bepalen en een TIRF-signaal te verkrijgen, wat cruciaal is voor het trekken van conclusies over gebeurtenissen nabij het plasmamembraan.Schakel de dag vóór de TIRF-microscoopsessie de verwarmingskamer in op 37 °C om een homogene opwarming van de microscooptafel mogelijk te maken. De volgende ochtend worden 7x10⁶ schapenrode bloedcellen of SRBC's per glazen bodemschaal van 35 mm twee keer gewassen met 100 µL PBS, aangevuld met 0,1% BSA. Resuspendeer de cellen na de tweede centrifugatie in 500 µL konijnen-IgG anti-SRBC's in PBS aangevuld met 0,1% BSA, tegen een sub-agglutinerende concentratie per 5 µL cellen, en incubeer de cellen gedurende 30 minuten onder langzame rotatie.Was na afloop van de incubatie de SRBC's twee keer in PBS plus BSA en resuspendeer de cellen in 2 milliliters microscopiemedium zonder serum bij 37-degree Celsius per schaal. Behandel vervolgens 35-millimeter glazen bodemschalen met 2 milliliters 0,1% poly-L lysine gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door twee wasbeurten met 2 milliliters PBS. Giet voor non-covalente fixatie van de SRBC's 2 milliliters van de IgG-opsonisatiecellen in elke met polylysine gecoate schaal en centrifugeer de monsters in een centrifuge met zwaairotor.Verwijder de supernatanten en was de deeltjes één keer met 2 milliliters PBS plus 10%BSA. Incubeer de deeltjes vervolgens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met 2 milliters verse PBS plus 10%BSA, gevolgd door drie wasbeurten met 2 milliliters PBS. Vervang na de laatste wasbeurt de PBS door 2 milliliters serumvrij microscopie-medium van 37-degree Celsius.Plaats een met SRBC gecoate schaal op de microscooptafel. Schraap vervolgens de getransfecteerde cellen van belang van de bodem van de kweekschaal en pipetteer de cellen enkele keren om een suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen. Voeg de getransfecteerde cellen toe aan de met SRBC gecoate schaal.Start de software voor live-acquisitie. Zoek een cel die de fluorescentie-gelabelde eiwitten tot expressie brengt en pas de positie van de schaal aan zodat de cel van belang zich in het midden van het beeldveld bevindt. Neem 500 beelden op onder verschillende hoeken van 0 tot 5% met stappen van 0,01 graad, bij één excitatiegolflengte.Om de kritieke hoek te bepalen waarbij het invallende licht volledig wordt gereflecteerd op de interface tussen het glas en het medium, waardoor een evanescente golf wordt gegenereerd, opent u de beeldsequentie in de geschikte imagingsoftware. Selecteer een region of interest in de cel met een uniforme fluorescentie. Selecteer vervolgens onder het tabblad Image de optie Stacks en klik op Plot Z Axis Profile.Om het profiel van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de z-as, gemeten in het gebied van interesse, uit te zetten als functie van de hoeken op de x-as. Elke hoekwaarde op de x-as die groter is dan de kritieke hoek, kan vervolgens tijdens de microscopiesessie worden gebruikt om een TIRF-signaal te verkrijgen. Gebruik daarna in de software voor live acquisitie de protocoleditor om de parameters van de acquisitie in te stellen.Inclusief het aantal loop-acquisitiesequenties, de fluorescentiekanalen en hun laserintensiteit, de TIRF-hoek en de belichtingstijd. Stel de Z-verplaatsing van het objectief in om het vlak van de epifluorescentiemodus te bereiken. Stel vervolgens, in de epifluorescentiemodus, de TIRF-hoek in op 1 en de Z-verplaatsing van het objectief terug naar het TIRF-vlak.Maak vervolgens een afbeelding van de cel in de bright light LED-modus. Zoek nu een cel van belang met een matig niveau van fluorescentie-gelabelde eiwitexpressie die fagocytose met een SRBC vertoont, en verplaats de cel naar het midden van het gezichtsveld. Let op dat zo'n cel kan worden geïdentificeerd aan een verlengd plasmamembraan rond het partikel.Voer het aantal frames in het tabblad Loop Count in om een streaming acquisitie van 500 tot 1.000 frames te starten. Pas indien nodig de laserintensiteit en de belichtingstijd aan om deze af te stemmen op de verschillende fluorescentieniveaus in de cel. Om twee afzonderlijke beeldsequenties te genereren die overeenkomen met de twee kanalen, opent u de sequenties in de imagine-software en klikt u op het tabblad Image.Selecteer Stack to Hyperstack in het Hyperstacks-menu. Voer vervolgens in het pop-upvenster xyctz in bij Order, het aantal gebruikte fluorochromen bij Channels, het aantal Slices in de z-as, het aantal afbeeldingen gedeeld door het aantal kanalen bij Frames, en Grayscale bij Display Mode. Splits daarna de kanalen.Hier wordt een representatieve live-cell TIRF-microscopievideo getoond van een fagosoomsluitingsassay in RAW 264.7-macrofagen die een IgG-opsoniseerde SRBC opslokken. Terwijl de punten van de pseudopodia tegen het glazen dekglas rond de SRBC drukken, wordt er in het TIRF-gebied een F-actine-ring gedetecteerd die progressief versmalt tot deze sluit. Parallel daaraan komt het wazige F-actine-signaal gedetecteerd door epifluorescentie, na het verplaatsen van de tafel drie micron boven het TIRF-gebied, overeen met depolymerisatie aan de basis van de fagocytosecup.Na drie minuten is de SRBC volledig geïnternaliseerd, wat wordt bevestigd door transmissielichtbeeldvorming. Met deze methode kan de actine aan de basis van de fagocytosecup, waar de focale exocytose van de intracellulaire compartimenten plaatsvindt, worden aangetoond. Na acquisitie kan een cel verder worden verwerkt voor correlatieve elektronenmicroscopie, of kan de gehele celpopulatie worden gefixeerd en bevroren verwerkt voor klassieke immunofluorescentiemicroscopie.Het is belangrijk om er rekening mee te houden dat fagocytose zeer temperatuurgevoelig is; daarom moeten de temperatuur in de verwarmingskamer en het medium in de kweekschaal gedurende de gehele procedure constant worden gehouden op 37 °C. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u deeltjes moet opsoniseren, dekglasjes met de deeltjes moet coaten, de kritische hoeken voor TIRF-microscopie moet bepalen en de lokalisatie van eiwitten van belang moet afbeelden tijdens live-cell fagocytose.

phagosome-closure-assay-to-visualize-phagosome-formation-three

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video describes TIRF, a total internal reflection microscopy-based technique to visualize actin and microtubule polymerization dynamics. The method allows the high-resolution imaging of actin and microtubule coupling dynamics in real-time, which is essential for understanding cellular crosstalks.

TIRF Microscopy to Visualize Actin and Microtubule Coupling Dynamics

This video demonstrates a high-resolution total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy technique for real-time visualization of phagosome formation and closure during macrophage-mediated phagocytosis of IgG-opsonized red blood cells (RBCs) attached to the surface of a glass bottom dish. The macrophages extend pseudopodia around the RBCs and engulf them inside the phagosomes, detaching them from the glass surface.

TIRF Microscopy-Based Visualization of Phagosome Formation and Closure

Source: Daniele, F., et. al TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the imaging of human neuroblastoma cells using a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope to visualize fluorophore-tagged synaptic vesicles. The cells are first focused in epifluorescence mode. Adjustments are then made to achieve total internal reflection,...

Cell Imaging Using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Source: Winkle, C. C., et al. Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for visualizing exocytic events in cortical neurons. A pH-sensitive green fluorescent protein (GFP) marker fluoresces upon vesicle fusion, with selective TIRF excitation capturing membrane-proximal exocytosis in time-lapse imaging.

Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Visualization of Exocytic Events 

-Polarisatie gebaseerde Total Internal Reflection Fluorescentie microscopie (pTIRFM) maakt real-time detectie van celmembraan dynamiek. Dit artikel beschrijft de uitvoering van pTIRFM voor de studie van membraan remodeling tijdens gereguleerde exocytose. De techniek is generaliseerbaar naar andere celbiologische processen die veranderingen in de membraan vorm direct of indirect te betrekken.

Imaging Plasma Membraan Vervormingen Met pTIRFM

Clathrine-gemedieerde endocytose, een snel en zeer dynamisch proces, internaliseert veel eiwitten, inclusief signaalreceptoren. Het hier beschreven protocol visualiseert direct de kinetiek van individuele endocytische gebeurtenissen. Dit is essentieel om te begrijpen hoe kernleden van de endocytische machinerie met elkaar coördineren en hoe eiwitlading dit proces beïnvloedt.

Visualiseren Clathrine-gemedieerde endocytose van G-proteïne gekoppelde receptoren bij Single-event resolutie via TIRF Microscopie

Dit artikel beschrijft een methode voor het onderzoeken van de dynamica van neurotransmittervesicles in neuroblastoomcellen, met behulp van een synaptobrevin2-pHluorine construct en Total Internal Reflection Fluorescence Microscopie. De strategie die ontwikkeld is voor beeldverwerking en gegevensanalyse wordt ook gerapporteerd.

TIRFM en pH-gevoelige GFP-sondes naar Neurotransmitter Vesicle Dynamics Evalueer in SH-SY5Y Neuroblastoom Cellen: cell imaging en data-analyse

Hier beschrijven we methoden draaiende schijf confocale microscopie afbeelding één fagocytische gebeurtenissen via muis resident peritoneale macrofagen. De protocollen kunnen worden uitgebreid tot andere fagocytische cellen.

Time-lapse 3D beeldvorming van fagocytose door macrofagen van de muis

Een geavanceerde Microscoop waarmee snel en met hoge resolutie zal imaging van zowel de geïsoleerde plasmamembraan en de omliggende intracellulaire volume, worden gepresenteerd. De integratie van de draaiende schijf en de totale interne reflectie fluorescentie microscopie in één installatie kunt levende imaging experimenten bij hoge acquisitie tarieven tot 3.5 s per afbeeldingsstapel.

Visualiseren van hechting vorming in cellen door middel van geavanceerde draaiende schijf-totale interne reflectie fluorescentie microscopie

We presenteren een protocol voor het implementeren van interferentie-reflectiemicroscopie en totaal-interne-reflectie-fluorescentiemicroscopie voor de gelijktijdige beeldvorming van dynamische microtubuli en fluorescerend gelabelde microtubuli-geassocieerde eiwitten.

Gelijktijdige interferentiereflectie en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie voor beeldvorming van dynamische microtubuli en bijbehorende eiwitten

Leer hoe u fagosoomformatie en -sluiting in 3D visualiseert in levende macrofagen met behulp van TIRF-microscopie. Deze methode combineert TIRF met epifluorescentie voor gedetailleerde monitoring van pseudopodiumuitbreiding en tipfusie.

Phagosome Closure Assay naar phagosome Formatie Visualiseer in drie dimensies behulp van totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM) (Video) | JoVE Journal

"Phagosome Closure Assay" naar phagosome Formatie Visualiseer in drie dimensies behulp van totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM)

Meer video's verkennen