"Phagosome Closure Assay" naar phagosome Formatie Visualiseer in drie dimensies behulp van totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM)

Het algemene doel van dit protocol is om de vorming van fagosomen, evenals de precieze locatie van de fagosoomsplitsing in 3D, te visualiseren in levende macrofagen met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence-microscopie, oftewel TIRF-microscopie. Deze methode combineert TIRF-microscopie met epifluorescentie om de stapsgewijze lokalisatie van twee verschillende fluorescerende eiwitten tijdens de extensie van pseudopodia en tipfusie te monitoren. De techniek biedt een systematische methode om de kritieke hoek te bepalen en een TIRF-signaal te verkrijgen, wat cruciaal is voor het trekken van conclusies over gebeurtenissen nabij het plasmamembraan.

Schakel de dag vóór de TIRF-microscoopsessie de verwarmingskamer in op 37 °C om een homogene opwarming van de microscooptafel mogelijk te maken. De volgende ochtend worden 7x10⁶ schapenrode bloedcellen of SRBC's per glazen bodemschaal van 35 mm twee keer gewassen met 100 µL PBS, aangevuld met 0,1% BSA. Resuspendeer de cellen na de tweede centrifugatie in 500 µL konijnen-IgG anti-SRBC's in PBS aangevuld met 0,1% BSA, tegen een sub-agglutinerende concentratie per 5 µL cellen, en incubeer de cellen gedurende 30 minuten onder langzame rotatie.

Was na afloop van de incubatie de SRBC's twee keer in PBS plus BSA en resuspendeer de cellen in 2 milliliters microscopiemedium zonder serum bij 37-degree Celsius per schaal. Behandel vervolgens 35-millimeter glazen bodemschalen met 2 milliliters 0,1% poly-L lysine gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door twee wasbeurten met 2 milliliters PBS. Giet voor non-covalente fixatie van de SRBC's 2 milliliters van de IgG-opsonisatiecellen in elke met polylysine gecoate schaal en centrifugeer de monsters in een centrifuge met zwaairotor.

Verwijder de supernatanten en was de deeltjes één keer met 2 milliliters PBS plus 10%BSA. Incubeer de deeltjes vervolgens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met 2 milliters verse PBS plus 10%BSA, gevolgd door drie wasbeurten met 2 milliliters PBS. Vervang na de laatste wasbeurt de PBS door 2 milliliters serumvrij microscopie-medium van 37-degree Celsius.

Plaats een met SRBC gecoate schaal op de microscooptafel. Schraap vervolgens de getransfecteerde cellen van belang van de bodem van de kweekschaal en pipetteer de cellen enkele keren om een suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen. Voeg de getransfecteerde cellen toe aan de met SRBC gecoate schaal.

Start de software voor live-acquisitie. Zoek een cel die de fluorescentie-gelabelde eiwitten tot expressie brengt en pas de positie van de schaal aan zodat de cel van belang zich in het midden van het beeldveld bevindt. Neem 500 beelden op onder verschillende hoeken van 0 tot 5% met stappen van 0,01 graad, bij één excitatiegolflengte.

Om de kritieke hoek te bepalen waarbij het invallende licht volledig wordt gereflecteerd op de interface tussen het glas en het medium, waardoor een evanescente golf wordt gegenereerd, opent u de beeldsequentie in de geschikte imagingsoftware. Selecteer een region of interest in de cel met een uniforme fluorescentie. Selecteer vervolgens onder het tabblad Image de optie Stacks en klik op Plot Z Axis Profile.

Om het profiel van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de z-as, gemeten in het gebied van interesse, uit te zetten als functie van de hoeken op de x-as. Elke hoekwaarde op de x-as die groter is dan de kritieke hoek, kan vervolgens tijdens de microscopiesessie worden gebruikt om een TIRF-signaal te verkrijgen. Gebruik daarna in de software voor live acquisitie de protocoleditor om de parameters van de acquisitie in te stellen.

Inclusief het aantal loop-acquisitiesequenties, de fluorescentiekanalen en hun laserintensiteit, de TIRF-hoek en de belichtingstijd. Stel de Z-verplaatsing van het objectief in om het vlak van de epifluorescentiemodus te bereiken. Stel vervolgens, in de epifluorescentiemodus, de TIRF-hoek in op 1 en de Z-verplaatsing van het objectief terug naar het TIRF-vlak.

Maak vervolgens een afbeelding van de cel in de bright light LED-modus. Zoek nu een cel van belang met een matig niveau van fluorescentie-gelabelde eiwitexpressie die fagocytose met een SRBC vertoont, en verplaats de cel naar het midden van het gezichtsveld. Let op dat zo'n cel kan worden geïdentificeerd aan een verlengd plasmamembraan rond het partikel.

Voer het aantal frames in het tabblad Loop Count in om een streaming acquisitie van 500 tot 1.000 frames te starten. Pas indien nodig de laserintensiteit en de belichtingstijd aan om deze af te stemmen op de verschillende fluorescentieniveaus in de cel. Om twee afzonderlijke beeldsequenties te genereren die overeenkomen met de twee kanalen, opent u de sequenties in de imagine-software en klikt u op het tabblad Image.

Selecteer Stack to Hyperstack in het Hyperstacks-menu. Voer vervolgens in het pop-upvenster xyctz in bij Order, het aantal gebruikte fluorochromen bij Channels, het aantal Slices in de z-as, het aantal afbeeldingen gedeeld door het aantal kanalen bij Frames, en Grayscale bij Display Mode. Splits daarna de kanalen.

Hier wordt een representatieve live-cell TIRF-microscopievideo getoond van een fagosoomsluitingsassay in RAW 264.7-macrofagen die een IgG-opsoniseerde SRBC opslokken. Terwijl de punten van de pseudopodia tegen het glazen dekglas rond de SRBC drukken, wordt er in het TIRF-gebied een F-actine-ring gedetecteerd die progressief versmalt tot deze sluit. Parallel daaraan komt het wazige F-actine-signaal gedetecteerd door epifluorescentie, na het verplaatsen van de tafel drie micron boven het TIRF-gebied, overeen met depolymerisatie aan de basis van de fagocytosecup.

Na drie minuten is de SRBC volledig geïnternaliseerd, wat wordt bevestigd door transmissielichtbeeldvorming. Met deze methode kan de actine aan de basis van de fagocytosecup, waar de focale exocytose van de intracellulaire compartimenten plaatsvindt, worden aangetoond. Na acquisitie kan een cel verder worden verwerkt voor correlatieve elektronenmicroscopie, of kan de gehele celpopulatie worden gefixeerd en bevroren verwerkt voor klassieke immunofluorescentiemicroscopie.

Het is belangrijk om er rekening mee te houden dat fagocytose zeer temperatuurgevoelig is; daarom moeten de temperatuur in de verwarmingskamer en het medium in de kweekschaal gedurende de gehele procedure constant worden gehouden op 37 °C. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u deeltjes moet opsoniseren, dekglasjes met de deeltjes moet coaten, de kritische hoeken voor TIRF-microscopie moet bepalen en de lokalisatie van eiwitten van belang moet afbeelden tijdens live-cell fagocytose.