Name: Het samenvoegen van absolute en relatieve kwantitatieve PCR gegevens te kwantificeren STAT3 Splice Variant Afschriften (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Leer hoe u absolute en relatieve qPCR combineert om STAT3 splice-varianten in eosinofielen te kwantificeren. Deze methode gebruikt plasmide-standaarden voor nauwkeurige transcriptanalyse bij cytokinestimulatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag aan de National Institutes of Health-NHLBI voor het Programma Project Grant erkennen over de rol van Eosinophils in luchtwegontsteking en remodeling: P01HL088584 (PI: N. Jarjour), en de Universiteit van Wisconsin Carbone Cancer Center en het Department of Medicine voor intramurale financiering. Wij danken Douglas Annis voor het klonen van de vier STAT3 varianten.

LET OP: perifeer bloed eosinofielen werden ontvangen zonder identificerende informatie in overeenstemming met een protocol goedgekeurd (# 2013-1570) van de Universiteit van Wisconsin-Madison Centrum voor Gezondheidswetenschappen Institutional Review Board. Ondertekende geïnformeerde toestemming van de donor werd verkregen voor het gebruik van elk monster in onderzoek. 1. Het creëren van plasmiden als sjabloon Standards <ol><li> Maak primers voor een amplicon overspannen zowel STAT3 splice sites, met 5&#39;-Kpnl en Nhel restrictie sites (en 5&#39;-extensies) volgens Tabel 1a. OPMERKING: KpnI en NheI plaatsen werden gekozen om inserts kunnen worden geligeerd in een gemodificeerde pET-28a vector met kanamycineresistentie 25,26 KpnI-plaats werd toegevoegd in de meervoudige kloneringsplaats.. </li><li> Met behulp van vers geschonken eosinofielen, voor te bereiden duplo-monsters van 2,5 x 10 6 cellen / ml in celkweekmedium (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1.640 gemiddeld). Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C onder 5% CO2 en 10% vochtigheid. <ol><li> Bereid complementaire (c) DNA uit monsters (ten minste 1 x 10 6 cellen per preparaat) volgens instructies van de fabrikant met behulp van de RNA-extractie en cDNA-synthese kits. </li></ol></li><li> Van sjabloon cDNA bereid in stap 1.2.1, versterken STAT3 splice-varianten met behulp van amplificatie PCR volgens Tabel 2a. </li><li> Resolve amplicons in 2% agarose Tris-acetaat-acetaat (TAE) gel 27. Accijnzen bands uit de gel en zuiveren volgens gel uitsnijding kit instructies. </li><li> Gesneden amplicons en plasmide met geschikte restrictie-enzymen (overzicht van beperking referentie 27), met behulp volumes incubatietijden en temperaturen aanbevolen door enzym provider; en zuiveren zoals in stap 1,4. Ligeren beperkt amplicons in plasmide onder-provider aanbevolen omstandigheden. </li><li> Bereid een negatieve control (beperkte plasmide-DNA zonder inzet, maar met ligase) en een positieve controle (onbeperkt plasmide met kanamycineresistentie). Voer standaard plasmide transformaties van competente E. coli DH5a 28 middels ligatiemengsels 27. </li><li> Incubate getransformeerd E. coli in 1 ml Luria-Broth (LB) medium (bereid volgens de instructies 27) schudden gedurende 1 uur bij 37 ° C. Spread transformanten op LB-platen die 50 ug / ml kanamycine en incubeer bij 37 ° C overnacht. </li><li> Pick enkele kolonies van de STAT3 α en STAT3 β platen met steriele tandenstokers 27. Transfer elk 2 ml LB. Groeien kweken overnacht bij 37 ° C in een schudincubator. </li><li> Zuiver plasmiden uit bacterieculturen door de instructies verschaft in een DNA-zuivering kit. WINKEL plasmiden bij -20 of -80 ° C. </li><li> Sequentie plasmiden uit verschillende kolonies door bereiding 20 pl sequentiebepalingsreacties. pipet 3sequencing pl reactiebuffer, 2 ui sequencing reactiemengsel, 12 gl ultrazuiver water, 1 pi plasmide als matrijs en 2 pl sequencing primer. LET OP: Als met behulp van PET-28a vector, gebruiken sequencing primer 5&#39;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG-3 &#39;. <ol><li> Assess electrophoretograms van plasmiden die coderen elke variant: Sα, Sβ, ΔSα en ΔSβ 25. </li></ol></li><li> Meet concentratie van zuivere nucleïnezuren in ng / ul. Als het lezen van absorptie bij 260 nm met behulp van een spectrofotometer, berekenen DNA-concentratie met behulp van de wet bier-Lambert 29: <img alt="vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq1.jpg" /> Waarbij c = concentratie, A = absorptie, ε (extinctiecoëfficiënt) = 0,02 (ug / ml) -1 cm -1 voor dubbelstrengs DNA en L = padlengte van licht (gewoonlijk 1 cm). </li><li> Met de molecuulgewichten van STAT3 splice-variant cDNA amplicons en de vector, berekent het aantal kopieën per ul. LET OP: Moleculair gewicht per basenparen (bp) wordt geschat op 650 Da. <img alt="vergelijking 2" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq2.jpg" /></li></ol> 2. Het analyseren van Primer specificiteit voor Absolute qPCR <ol><li> Bereid 1 in 10 verdunningsreeks van STAT3 plasmiden met ~ 10 augustus - 10 maart kopieën per ul (20 ul) gebruikt ultrazuiver water. Meet de concentratie van de meest geconcentreerde (~ 10 8 kopieën per ul, zie stap 1.11). </li><li> Gebruik verdund plasmiden vier &quot;non-target&quot; mixes te bereiden (bijv., STAT3 ΔSβ negatieve controle die gelijke concentraties van STAT3 Sα, ΔSα, Sβ maar geen ΔSβ) op 10 6 kopieën per ul per stuk. Bereid een &quot;target&quot; mix met gelijke concentraties van alle vier templates elk op 10 6 kopieën per ul. </li><li> Bereid primerpaar oplossings per splice variant (zie Tabel 1b en figuur 1) door ~ 60 pi primers elk in een 7 uM concentratie (eindconcentratie van het monster wordt 560 nM). </li><li> Verdun DNA polymerase / dsDNA-bindende kleurstof mix 7: 5 met pure H 2 O. </li><li> Opgericht Assay 1 in een 96-well PCR plaat zie matrijs (tabel 3). <ol><li> Voeg 21 ul verdund DNA polymerase / dsDNA-bindende kleurstof mix, vervolgens 2 ui primer mix en 2 pl template (als per tabel 2b). In plaats van het sjabloon, voeg 2 ul gefilterd H 2 O aan de template geen controle (NTC) ook. Opgericht reacties in tweevoud herhaalbaarheid 30 te beoordelen. </li></ol></li><li> Seal qPCR plaat met kleefmiddelafdekking en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1200 xg bij 12 ° C. </li><li> Als met behulp van software die op Materials, opgezet experiment zoals beschreven. <ol><li> Zet qPCR machine en insert verzegeld qPCR plaat. Klik op File &amp;# 62; Nieuw&gt; Volgende&gt; Selecteer &quot;Nieuwe detector&quot;, kies reporter, quencher en zorgen voor de naam. Opzetten van een &quot;nieuwe detector&quot; voor elke splice variant. </li><li> Selecteer Next en het opzetten van normen zoals gevraagd op de Set Up Sample Plate pagina, zodat hoeveelheden in de tabel opgenomen en passende melders worden geselecteerd. Klik finish. </li><li> Opgezet fiets als per tabel 2b. Zorgen dat fluorescentieaflezing (bepalen Ct) optreedt tijdens de 72 ° C stap van elke cyclus. Selecteer Run. </li><li> Wanneer run is voltooid, klikt u op de&gt; Amplification plot Tabblad Results. Evalueer uitgang versterking complot om data kwaliteit te beoordelen (kijk voor een exponentiële plot, zoals in figuur 2). OPMERKING: Zorg ervoor versterking percelen zijn meestal exponentieel en dat de cyclus drempel kan worden ingesteld op de exponentiële deel van de plot. Zorg ervoor dat NTC&#39;s worden niet versterkt en andere standaard punten tonen een lage Ct waarde met een hoge ΔRn. </li><li> om export resultaten naar spreadsheet software, klikt u op Bestand&gt; Exporteren&gt; Resultaten. </li></ol></li></ol> 3. Het beoordelen Absolute qPCR Assay specificiteit en herhaalbaarheid <ol><li> herhaalbaarheid <ol><li> Met de gegevens uit stap 2.7.5 tot standaardafwijking van Ct (cyclus drempelwaarde voor fluorescentie) berekenen. <img alt="vergelijking 3" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq3.jpg" /> Waarin N = aantal monsters (2 of in duplo uitgevoerd), <img alt="vergelijking 4" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq4.jpg" /> = Monster Ct en <img alt="vergelijking 5" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq5.jpg" /> = Monster Ct betekenen. Controleer of de standaardafwijking van Ct-waarden van duplicaten is ≤0.2. Controleer of Ct-waarden in alle, maar NTC putten zijn kleiner dan 38. </li><li> Als herhaalbaarheid is slecht optimaliseren fietsen parameters door ofwel verhogen of te verlagen gloeien tijd. </li></ol></li><li> Plot log exemplaar gevoelloosER (zoals bepaald in stap 1,12 en bereid in stap 2.1) versus Ct waarde een standaardcurve te maken; waarbij de volgende vergelijking: <img alt="vergelijking 6" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq6.jpg" /> Waarbij y Ct, m de helling, x log (kopienummer) en b het snijpunt waarde. OPMERKING: De R2 van de lineaire regressie wordt ≥0.95 voor goede gegevens. </li><li> Bepalen amplificatie-efficiëntie met behulp van standaard curve en de vergelijking: <img alt="vergelijking 7" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq7.jpg" /> LET OP: Streef naar efficiency ≥75%. </li><li> Bereken de specificiteit van qPCR assay 1 met behulp van Too&#39;s formule: <img alt="vergelijking 8" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq8.jpg" /> Waar Δ Ct Too = Ct doelgroep - Ct non-target, beschrijft het verschil in drempel cyclus nummer voor specifieke en niet-specifieke amplification LET OP: De specificiteit moet vier ordes van grootte overschrijdt (dat wil zeggen, specificiteit factor ≥4.). <ol><li> Als specificiteit slecht is, te optimaliseren door het verlagen van de primer concentratie. Opgezet assays (zoals beschreven in stappen 2.5-2.7) met de uiteindelijke primer concentraties variërend van 100 nM tot 500 nM. </li></ol></li></ol> 4. Het uitvoeren van Relatieve qPCR Testen <ol><li> Behandel Cellen met cytokines om transcriptie bevorderen. <ol><li> Voor vers gewonnen eosinofielen bereiden duplo monsters van 2,5 x 10 6 cellen / ml in celkweekmedium (RPMI 1640 medium) en behandel met 50 ng / ml interleukine-3 (IL3) en / of 50 ng / ml tumor necrose factor α ( TNFa) voor een periode van 3, 6, 9 en 20 uur bij 37 ° C onder 5% CO2 en 10% vochtigheid. </li></ol></li><li> Bereid cDNA uit eosinofiele monsters (ten minste 1 x 10 6 cellen per preparaat) volgens instructies van de fabrikant met behulp van de RNA-extractie en cDNA-synthese kits. </li&gt; <li> Bereid seriële verdunningen van monster twee cDNA monsters (controle of rust monsters), met een verdunningsreeks van &quot;1&quot; naar &quot;1 in 1024&quot; verdunning. <ol><li> Voor de 1 op de 4 verdunning, pipet 1 pi cDNA en 3 ui ultrapuur water. </li><li> Voor de 1 in 16 verdunning pipet 1 pi van 1 in 4 verdunning en 3 pl ultrazuiver water, etc. </li></ol></li><li> PCR opgezet in 96-wells plaat met 25 ul reacties volgens stappen 2,3-2,5 maar met verschillende primer concentraties pan STAT3 en GUSB (zie template in tabel 4). </li><li> Add &quot;Nieuwe detector&quot; voor GUSB en volg de stappen 2,6-2,7, met behulp van de fietsen parameters in tabel 2c beschreven. </li><li> Genereer standaard curves (zie stap 3.2 en 3.3) om te bepalen welke primer concentraties resulteren in een 95-100% amplificatie-efficiëntie. </li><li> Opzetten plaat met voorbereide cDNA monsters (uit stap 4.2) en geoptimaliseerd primer concentraties(zie tabel 2c voor fietsen parameters, reagentia en Tabel 5 96-well plaat template). </li><li> Voer stappen 2,6-2,7. Herhaal de test ten minste een keer en controleer de kwaliteit van gegevens. </li><li> Bereken de gemiddelde Ct waarde van duplo Cts voor zowel STAT3 en het huishouden gen GUSB. </li><li> Verkrijgen Δ Ct-waarden voor elk monster. <img alt="vergelijking 9" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq9.jpg" /></li><li> Aanwijzen rust monster (meestal heeft de laagste concentratie transcript of interest) als monster 0. Bereken ΔΔ Ct 31 voor elk monster (hier aangeduid als monster X): <img alt="vergelijking 10" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq10.jpg" /></li><li> Bereken fold-verhoging voor elk monster: <img alt="vergelijking 11" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq11.jpg" /></li><li> reproduceerbaarheid <ol><li> Bereken de variatiecoëfficiënt (CV) van de kopie nummer voor pan-STAT3 en GUSB. <img alt="vergelijking 12" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq12.jpg" /> Waar N = aantal monsters, = monster berekend aantal kopieën en = steekproefgemiddelde. Controleer of de CV van elk monster (meerdere assays) is ≤10%. </li></ol></li></ol> 5. Het analyseren Absolute qPCR gegevens voor onbekende monsters <ol><li> Vergelijk Ct-waarden verkregen in relatieve qPCR (zoals beschreven in stap 4.9) voor schoonmakers gen GUSB om ervoor te zorgen samples &#39;cDNA concentraties binnen een orde van grootte. <ol><li> Verdunde cDNA dienovereenkomstig (bijvoorbeeld als monster 1 heeft een Ct-waarde van ~ 17,5, en Ct-waarden andere monsters &#39;zijn ~ 21, monster 1 is ongeveer 2 (21-17,5) = 11 keer meer geconcentreerd Voer een 1:. 1 verdunning met ultrapuur water binnen hetzelfde bereik zonder verdunnen meer dan nodig). LET OP: enorm verschillend uitgangspunt concentraties vooringenomenheid de lineaire regressie-analyse (stap 4.12). </li></ol></li><li> Opzetten absolute qPCR analyse van monsters. Bereid assay 2a template plaat voor Sα en Sβ als per tabel 6; en voor te bereiden assay 2b voor ΔSα en ΔSβ als per tabel 7. Het uitvoeren van testen zoals beschreven in de stappen 2.6-2.7.3 (en tabel 2b). Herhaal assays ten minste eenmaal. </li><li> Controleer datakwaliteit en exporteren, zoals beschreven in de stappen 2.7.4-2.7.5. </li><li> Opzetten absolute qPCR 96 goed plaat met 25 ul reacties met behulp van pan- STAT3 primers (primers in tabel 1c, sjabloon in Tabel 8) bij 400 urn en een mix van alle vier plasmiden of een enkel plasmide bij beursgenoteerde totale concentraties. OPMERKING: Efficiëntie maakt niet uit absolute qPCR, maar optimaliseren efficiëntie van deze primers is belangrijk voor relatieve qPCR (stap 4). </li><li> Seal qPCR plaat met kleefmiddelafdekking en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1200 xg bij 12 ° C. </li><li> Het opzetten van &quot;nieuwe detector&quot; voor pan- STAT3 als in de stappen 2.7.1-2.7.3. </li><li> Opgezet fietsen voor pan-STAT3 als per tabel 2c (dezelfde voorwaarden als relatieve qPCR). Zorgen dat fluorescentieaflezing (bepalen Ct) optreedt tijdens de 72 ° C stap van elke cyclus. Herhaal test ten minste eenmaal reproduceerbaarheid te waarborgen. </li><li> Controleer kwaliteit van de gegevens en de uitvoer (zie stappen 2.7.4-2.7.5). <ol><li> Als amplificatie plots niet exponentieel (zie figuur 2), verdund cDNA monster (01:10) en herhaal assay zoals beschreven (stap 5,7). </li></ol></li><li> Behulp van de vergelijking van de standaardkromme (zie 3.2, figuur 3) en de Ct-waarden van monsters Bereken het aantal kopieën van elk splicevariant en pan- STAT3 in elk monster. <img alt="vergelijking 13" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq13.jpg" /></li><li> Plot log (qPCR absolute aantal kopieën verkregen waarden voor pan-STAT3) versus log (cumulatieve absolute qPCR copy number waarden voor STAT3 splice-varianten). LET OP: Ideale lineaire regressie en de helling waarden zouden beide ~ 1. </li><li> Bereken herhaalbaarheid (Stap 3.1) en de reproduceerbaarheid (stap 4.13). </li></ol> 6. samenvoegen absolute en relatieve qPCR gegevens <ol><li> Vermenigvuldig het aandeel van de variant met de totale STAT3 fold-stijging tot fold-stijging van elk splice variant berekenen. </li><li> Bereken de standaarddeviaties (zie stap 3.1.1) van de absolute en relatieve waarden om rekening te houden voor de vermeerdering van de fout. Bepaal standaard meetfout (SEM) zoals: <img alt="vergelijking 14" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq14.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Hiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetically+widespread+alternative+splicing+at+unusual+GYNGYN+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetically widespread alternative splicing at unusual GYNGYN donors.</a> Genome Biol. 7 (7), R65(2006).</li>
<li>Treacy, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twin+of+I-POU%3A+a+two+amino+acid+difference+in+the+I-POU+homeodomain+distinguishes+an+activator+from+an+inhibitor+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Twin of I-POU: a two amino acid difference in the I-POU homeodomain distinguishes an activator from an inhibitor of transcription.</a> Cell. 68 (3), 491-505 (1992).</li>
<li>Schindler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+at+NAGNAG+acceptors+in+Arabidopsis+thaliana+SR+and+SR-related+protein-coding+genes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing at NAGNAG acceptors in Arabidopsis thaliana SR and SR-related protein-coding genes.</a> BMC Genomics. 9, 159(2008).</li>
<li>Szafranski, K., Kramer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((It%27s+a+bit+over%2C+is+that+ok%3F+The+subtle+surplus+from+tandem+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">It's a bit over, is that ok? The subtle surplus from tandem alternative splicing.</a> RNA Biol. 12 (2), 115-122 (2015).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+at+GYNNGY+5%27+splice+sites%3A+more+noise%2C+less+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing at GYNNGY 5' splice sites: more noise, less regulation.</a> Nucleic Acids Res. 42 (22), 13969-13980 (2014).</li>
<li>Hiller, M., Platzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+and+subtle%3A+alternative+splicing+at+short-distance+tandem+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Widespread and subtle: alternative splicing at short-distance tandem sites.</a> Trends Genet. 24 (5), 246-255 (2008).</li>
<li>Tsai, K. W., Lin, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+wobble+splicing+indicates+that+it+is+not+tissue+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of wobble splicing indicates that it is not tissue specific.</a> Genomics. 88 (6), 855-864 (2006).</li>
<li>Tadokoro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+occurrence+of+protein+isoforms+with+or+without+a+single+amino+acid+residue+by+subtle+alternative+splicing%3A+the+case+of+Gln+in+DRPLA+affects+subcellular+localization+of+the+products%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Frequent occurrence of protein isoforms with or without a single amino acid residue by subtle alternative splicing: the case of Gln in DRPLA affects subcellular localization of the products.</a> J Hum Genet. 50 (8), 382-394 (2005).</li>
<li>Bradley, R. K., Merkin, J., Lambert, N. J., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+RNA+triplets+is+often+regulated+and+accelerates+proteome+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of RNA triplets is often regulated and accelerates proteome evolution.</a> PLoS Biol. 10 (1), e1001229(2012).</li>
<li>Zheng, C. L., Fu, X. D., Gribskov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+regulatory+elements+defining+constitutive+splicing+and+different+modes+of+alternative+splicing+in+human+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Characteristics and regulatory elements defining constitutive splicing and different modes of alternative splicing in human and mouse.</a> RNA. 11 (12), 1777-1787 (2005).</li>
<li>Schaefer, T. S., Sanders, L. K., Nathans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+transcriptional+activity+of+Jun+and+Stat3+beta%2C+a+short+form+of+Stat3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cooperative transcriptional activity of Jun and Stat3 beta, a short form of Stat3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9097-9101 (1995).</li>
<li>Waitkus, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+and+gene+induction+by+a+functionally+distinct+STAT3+phosphoform%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signal integration and gene induction by a functionally distinct STAT3 phosphoform.</a> Mol Cell Biol. 34 (10), 1800-1811 (2014).</li>
<li>Srivastava, J., DiGiovanni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-canonical+Stat3+signaling+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Non-canonical Stat3 signaling in cancer.</a> Mol Carcinog. , (2015).</li>
<li>Holland, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+mutations+in+the+hyper-IgE+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">STAT3 mutations in the hyper-IgE syndrome.</a> N Engl J Med. 357 (16), 1608-1619 (2007).</li>
<li>Maritano, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STAT3+isoforms+alpha+and+beta+have+unique+and+specific+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The STAT3 isoforms alpha and beta have unique and specific functions.</a> Nat Immunol. 5 (4), 401-409 (2004).</li>
<li>Hevehan, D. L., Miller, W. M., Papoutsakis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+and+phosphorylation+of+distinct+STAT3+proteins+during+granulocytic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential expression and phosphorylation of distinct STAT3 proteins during granulocytic differentiation.</a> Blood. 99 (5), 1627-1637 (2002).</li>
<li>Yoo, J. Y., Huso, D. L., Nathans, D., Desiderio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+ablation+of+Stat3beta+distorts+the+pattern+of+Stat3-responsive+gene+expression+and+impairs+recovery+from+endotoxic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Specific ablation of Stat3beta distorts the pattern of Stat3-responsive gene expression and impairs recovery from endotoxic shock.</a> Cell. 108 (3), 331-344 (2002).</li>
<li>Stahl, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+STATs+and+other+substrates+specified+by+modular+tyrosine-based+motifs+in+cytokine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Choice of STATs and other substrates specified by modular tyrosine-based motifs in cytokine receptors.</a> Science. 267 (5202), 1349-1353 (1995).</li>
<li>Zheng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mix+of+S+and+DeltaS+variants+of+STAT3+enable+survival+of+activated+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">A mix of S and DeltaS variants of STAT3 enable survival of activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells in culture.</a> Oncogenesis. 4, 184(2016).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigations+on+DNA+intercalation+and+surface+binding+by+SYBR+Green+I%2C+its+structure+determination+and+methodological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications.</a> Nucleic Acids Res. 32 (12), e103(2004).</li>
<li>Kelly, E. A., Liu, L. Y., Esnault, S., Quinchia Johnson, B. H., Jarjour, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+synergistic+effect+of+IL-3+and+TNF+on+matrix+metalloproteinase+9+generation+by+human+eosinophils%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Potent synergistic effect of IL-3 and TNF on matrix metalloproteinase 9 generation by human eosinophils.</a> Cytokine. 58 (2), 199-206 (2012).</li>
<li>Whelan, J. A., Russell, N. B., Whelan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+absolute+quantification+of+cDNA+using+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for the absolute quantification of cDNA using real-time PCR.</a> J Immunol Methods. 278 (1-2), 261-269 (2003).</li>
<li>Too, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+PCR+quantification+of+GFRalpha-2+alternatively+spliced+isoforms+in+murine+brain+and+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Mol+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Real time PCR quantification of GFRalpha-2 alternatively spliced isoforms in murine brain and peripheral tissues.</a> Brain Res Mol Brain Res. 114 (2), 146-153 (2003).</li>
<li>Turton, K. B., Annis, D. S., Rui, L., Esnault, S., Mosher, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratios+of+Four+STAT3+Splice+Variants+in+Human+Eosinophils+and+Diffuse+Large+B+Cell+Lymphoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Ratios of Four STAT3 Splice Variants in Human Eosinophils and Diffuse Large B Cell Lymphoma Cells.</a> PloS One. 10 (5), e0127243(2015).</li>
<li>Maurer, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+binding+site+on+fibronectin+for+the+functional+upstream+domain+of+protein+F1+of+Streptococcus+pyogenes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Extended binding site on fibronectin for the functional upstream domain of protein F1 of Streptococcus pyogenes.</a> J Biol Chem. 285 (52), 41087-41099 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Current+protocols+in+molecular+biology%22">Current protocols in molecular biology</a>. Ausubel, F. M., et al. , Greene Pub. Associates; J. Wiley. (1987).</li>
<li>Grant, S. G., Jessee, J., Bloom, F. R., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+plasmid+rescue+from+transgenic+mouse+DNAs+into+Escherichia+coli+methylation-restriction+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation-restriction mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (12), 4645-4649 (1990).</li>
<li>Kocsis, L., Herman, P., Eke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+modified+Beer-Lambert+law+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">The modified Beer-Lambert law revisited.</a> Phys Med Biol. 51 (5), N91-N98 (2006).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+guidelines%3A+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29 (9), e45(2001).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22A-Z+of+quantitative+PCR%22">A-Z of quantitative PCR</a>. Bustin, S. A. , International University Line. (2004).</li>
<li>Zhang, H. F., Lai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+in+cancer-friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">STAT3 in cancer-friend or foe.</a> Cancers (Basel). 6 (3), 1408-1440 (2014).</li>
<li>Caldenhoven, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3beta%2C+a+splice+variant+of+transcription+factor+STAT3%2C+is+a+dominant+negative+regulator+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">STAT3beta, a splice variant of transcription factor STAT3, is a dominant negative regulator of transcription.</a> J Biol Chem. 271 (22), 13221-13227 (1996).</li>
<li>Zammarchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumorigenic+potential+of+STAT3+alternative+splicing+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Antitumorigenic potential of STAT3 alternative splicing modulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (43), 17779-17784 (2011).</li>
<li>Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Dependency+of+Cellular+Protein+Levels+on+mRNA+Abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance.</a> Cell. 165 (3), 535-550 (2016).</li>
<li>Narimatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+autoregulation+of+the+stat3+gene+and+its+role+in+interleukin-6-induced+survival+signals+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific autoregulation of the stat3 gene and its role in interleukin-6-induced survival signals in T cells.</a> Mol Cell Biol. 21 (19), 6615-6625 (2001).</li>
<li>Szafranski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+state+co-regulates+thousands+of+mammalian+mRNA+splicing+events+at+tandem+splice+sites+and+alternative+exons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Physiological state co-regulates thousands of mammalian mRNA splicing events at tandem splice sites and alternative exons.</a> Nucleic Acids Res. 42 (14), 8895-8904 (2014).</li>
<li>Sundin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+STAT3+mutation+causing+hyper-IgE+syndrome%3A+studies+of+the+clinical+course+and+immunopathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Novel STAT3 mutation causing hyper-IgE syndrome: studies of the clinical course and immunopathology.</a> J Clin Immunol. 34 (4), 469-477 (2014).</li>
<li>Oltean, S., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+alternative+splicing+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of alternative splicing in cancer.</a> Oncogene. 33 (46), 5311-5318 (2014).</li>
<li>Boultwood, J., Dolatshad, H., Varanasi, S. S., Yip, B. H., Pellagatti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+splicing+factor+mutations+in+the+pathogenesis+of+the+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biol+Regul%22%5BJournal%5D)">The role of splicing factor mutations in the pathogenesis of the myelodysplastic syndromes.</a> Adv Biol Regul. 54, 153-161 (2014).</li>
<li>Tilgner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+transcriptome+analysis+using+synthetic+long-read+sequencing+reveals+molecular+co-association+of+distant+splicing+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive transcriptome analysis using synthetic long-read sequencing reveals molecular co-association of distant splicing events.</a> Nat Biotechnol. 33 (7), 736-742 (2015).</li>
<li>Hiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+occurrence+of+alternative+splicing+at+NAGNAG+acceptors+contributes+to+proteome+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Widespread occurrence of alternative splicing at NAGNAG acceptors contributes to proteome plasticity.</a> Nat Genet. 36 (12), 1255-1257 (2004).</li>
<li>Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+multi-nucleotide+polymorphisms+in+the+human+genome+characterized+by+whole+genome+and+exome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing.</a> Nucleic Acids Res. 38 (18), 6102-6111 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We ontwikkelden dit protocol om de niveaus en verhoudingen van STAT3 splicevariant transcripten in eosinofielen en lymfoomcellen meten en weten of cytokinestimulatie beïnvloedde de niveaus en verhoudingen. STAT3 is van bijzonder belang vanwege zijn pleiotrope en onzekere functionaliteit met tegenstrijdige verslagen zij optreedt als oncoproteïne of tumor suppressor bij kanker (besproken in referentie 33). Verschillen in STAT3 α en β splitsingsvariant functie eerder was 34,35 gekarakteriseerd en ons protocol vergemakkelijkt een knock-down / re-expressie analyse dat een behoefte aan een optimale verhouding van de S en suggereert AS 19 transcripten. Nauwkeurige kwantificering van verschillende splice-varianten zullen verder onderzoeken met betrekking heterogene STAT3 functie variant samenstelling splitsen vergemakkelijken. Het protocol integreert absolute en relatieve qPCR data combineert het vermogen van abopgeloste qPCR berekenen splitsingsvariant verhoudingen en relatieve qPCR veranderingen in totale STAT3 expressie te meten. Deze aanpak maakt het mogelijk om subtiele verschillen in sequentie onderscheiden en gelijktijdig meten splicing verhoudingen twee alternatieve splice plaatsen meer dan 50 nucleotiden van elkaar. Het bepalen van de verhoudingen van de splicing gebeurtenissen individueel zou de opmerkelijke bevinding dat een co-splicing vooroordeel bestond zodat ΔSβ hoger zijn dan verwacht wanneer gebruik van de twee plaatsen willekeurig gesplitst 25 hebben opgeleverd. Kritisch, absolute qPCR met gebruik van plasmide kalibratiecurven maakt kwantificering (om suboptimale efficiëntie) van splice varianten die resulteren in zeer vergelijkbare sequenties. We verwachten een nieuwe subtiele splicing qPCR assay moet ongeveer twee maanden in beslag nemen om te optimaliseren. Belangrijke stappen in assay ontwikkeling zijn de creatie van STAT3 plasmiden gebruikt bij het genereren van standaard curves voor absolute qPCR; experimenteelhet vaststellen van optimaal primersequenties en fietsen parameters om de specificiteit en reproduceerbaarheid te waarborgen; en de integratie van relatieve qPCR gegevens uit kwantificeren pan-STAT3 expressie ten opzichte van GAPDH expressie. De correlatie van de kopie aantal gekwantificeerd door pan-STAT3 versus cumulatieve kwantificering (Sα + ΔSα + Sβ + ΔSβ) laat zien dat het protocol levert betrouwbare resultaten. Een nadeel van deze techniek is het uitgebreid validatieproces. Er moet intra-assay variatie (herhaalbaarheid), inter-variabiliteit (reproduceerbaarheid) en specificiteit te beoordelen. Het protocol beschrijft manieren om numerieke uitgangen voor deze parameters te krijgen. We geacht efficiency ≥75%, specificiteit factor ≥4, variatiecoëfficiënt (reproduceerbaarheid) ≤10% en Ct standaarddeviatie (herhaalbaarheid) ≤0.2 als geschikte drempels 30. Mutaties of deleties in de STAT3 sequentie aminozuren 1-690 zal niet discove zijnRed van dit protocol, hoewel ze splicing verhoudingen kunnen beïnvloeden. Transcript proporties zou niet in verhouding tot proporties 36 proteoform zijn. Sinds monsters hebben verschillende basisbedragen van de totale cDNA, absolute qPCR is geschikt voor het vergelijken van kopie aantallen splice varianten binnen een monster, maar niet voor inter-sample vergelijking tenzij in combinatie met relatief qPCR gebruikgemaakt van een vast housekeeping gen. De beschreven methode voldoet aan MiQE qPCR richtlijnen voor reproduceerbaarheid 30. PCR cyclusparameters en primerconcentraties moet worden gewijzigd om reproduceerbare gegevens, indien andere apparatuur wordt gebruikt. Perfect specificiteit is niet mogelijk zonder afbreuk te doen aan de efficiëntie drastisch, maar het doel is efficiënter versterkt door meer dan vier ordes van grootte. Lineaire DNA wordt gemakkelijker versterkt dan cirkelvormig. Als er een alternatieve plasmide niet bevredigend standaard curves heeft voorzien (R2 &lt;; 0,95), overweeg dan lineariseren het plasmide door enkele site beperking voorafgaand aan kwantificering. Optimaliseren qPCR is cruciaal voor het verkrijgen van betrouwbare gegevens (figuur 1). De meeste qPCR protocollen rekenen op twee stappen fietsen en machines zijn dienovereenkomstig geoptimaliseerd. Non-gelijkmatige verwarming van de verwarming blok kan worden verergerd in drie-stappen-fietsen, wat bijdraagt ​​aan een slechte reproduceerbaarheid. Testen moeten worden opgezet onder steriele omstandigheden met filter pipet tips en ultrapuur water, bij voorkeur in een speciale laminaire stroming kap. Omdat verontreinigingen kan leiden tot inconsistente resultaten, moeten tests worden opgezet onder steriele omstandigheden met filter pipet tips en ultrapuur water, bij voorkeur in een speciale laminaire stroming kap. Voor meer informatie over qPCR optimalisatie, verwijzen naar Bustin et al. 32 Kwantificeren STAT3 kan leiden tot meer inzicht in een aantal contexten. STAT3 auto-regelt zijn eigen expressie 37, en de hierboven beschreven protocol kan helpenom te onderzoeken of verhoudingen van STAT3 splice varianten dragen bij aan het reguleren van deze positieve terugkoppeling. Het protocol kan worden gebruikt om veranderingen in splitsingsvariant verhoudingen zoals deze voorkomt in cellen bij verschillende dichtheden 38 of in de loop van de ontwikkeling: het is bekend dat de STAT3 α / β verhouding veranderingen op eiwitniveau tijdens hematopoiese 16. Sundin et al. gevonden dat een intron enkele nucleotide polymorfisme voorgespannen splicing van exon 12 in STAT3 van een patiënt met het syndroom baan 39. Het is denkbaar dat een van de vele SNPs in de introns tussen exon 21 en 22 of exon 22 en 23 respectievelijk kunnen bijdragen aan splicing verhoudingen van AS / S en α / β. De test kan worden gebruikt om STAT3 transcripten in kankercellen, waarbij mutaties of veranderingen in splicing verordening vertekening introduceren de splicing proces 40 kwantificeren. Mutaties in splicing factoren (zoals SF3B1), als OBSERVed in myelodysplastische syndromen 41 kan ook leiden tot veranderingen die kan worden gemeten door dit protocol. Meer in het algemeen, deze aanpak detecteert specifiek co-vereniging in splicing, wat niet haalbaar is met conventionele RNA-Seq, noch standaard qPCR. Hoewel het fenomeen van elkaar uitsluitende exon splicing demonstreert coördinatie van splicing beslissingen, de co-associatie van andere splicing evenementen is nog niet goed onderzocht. Een recent beschreven alternatieve werkwijze, waarbij RNA-Seq werd gewijzigd om volle lengte cDNA ondervragen suggereert verre splitsingsgebeurtenissen meer co-afhankelijke dan eerder gedacht 42. STAT3 bevat een donor tandem splitsingsplaats. Acceptor tandem splice sites zijn vaker 43 en de beginselen van de geschetste protocol kan als uitgangspunt voor de ontwikkeling van tests voor coïncidentie detectie van NAGNAG splicing en andere splicing gebeurtenissen binnen 200 nucleotiden dienen. andere potentieel toepassingen omvatten kwantificering van samenloop van andere subtiele opeenvolging verschillen, zoals indels of dubbele / triple nucleotide polymorphisms 44.

Korte afstand (tandem) alternatieve splitsing, waarbij alternatieve acceptor of donor sites zijn dicht bij elkaar is gebruikelijk in zoogdieren 1, invertebraten en planten 2 3. Geschat wordt dat 20% van zoogdiergenen bevatten alternatieve splitsingsplaatsen 2-12 nucleotiden elkaar 4. Veel van deze sites zijn 3 nucleotiden uit elkaar en leiden tot opname of uitsluiting van een enkel codon. Er is discussie over de aard van splicing regelgeving op deze sites 5,6 met enige argument dat de splicing motief verschillen zijn zo subtiel dat selectie stochastische 7, terwijl anderen afleiden regelgeving op basis van weefsel specificiteit 8. Tandem splitsingsplaats selectie is geanalyseerd semi-kwantitatief met behulp van gemodificeerde capillaire elektroforese 7, en hoge-resolutie gelelektroforese 8. RNA-Seq (RNA sequencing) gelezen kan worden gebruikt om de splitsing verhoudingen kwantificeren elke spliceplaats. Zo heeft RNA-Seq data inzicht gegeven in de regulatie van tandem splitsingsplaatsen 9. Tevens heeft het voorspellen van de verwachte splice variant berekend op basis van nucleotide 10 motief. De meeste aandacht voor splicing die opgenomen of weggelaten één codon heeft op de meer voorkomende tandem acceptor splitsingsplaatsen, bekend als NAGNAGs (waarin N = elk nucleotide) is. Tandem donor alternatieve splice sites, waaronder of met uitzondering van een enkel codon (GYNGYN erkenning motief, waarbij Y = pyrimidine) zijn minder vaak voor dan tandem acceptanten. Signaal transducer en activator van transcriptie 3 (STAT3) is een gen ondergaat tandem alternatieve splicing donor 1,11. De tandem donor splice locaties mee exons 21 en 22 en resulteren in de opname of uitsluiting van het codon voor serine-701 (S of AS respectievelijk) 1,11. Downstream alternatieve acceptor sites (40 nucleotiden van elkaar) verbinden exons 22 en23a / b resulteren in het opnemen van hetzij de 55 eindstandige resten van het transactivatie domein (α) of een afgeknotte transactiveringsdomein met 7 unieke C-eindstandige resten (β) 11. Daarom vier splice varianten mogelijk. STAT3 eiwit is een transcriptiefactor en belangrijk signaal integrator in talrijke celsoorten 12 wanneer gemuteerd zijn constitutieve activering bijdraagt aan verscheidene kanker fenotypes (besproken in referentie 13). Job syndroom, een immunodeficiëntie stoornis gekenmerkt door hoge niveaus van IgE, wordt ook veroorzaakt door mutaties in STAT3 (besproken in referentie 14). Verschillende rollen voor STAT3 α en β splitsingsvariant eiwitten zijn eerder beschreven 15. Aanvankelijk werd STAT3 β gedacht om op te treden in een dominant-negatieve manier 16, tegenwerken van transcriptie-activiteit STAT3 α, maar latere werk gesuggereerd heeft onafhankelijke target genen 17 </sup&gt;. Ondanks de subtiliteit van tandem splicing, is er reden om de aan- of afwezigheid van Serine-701 (Ser701) invloeden functie geloven. Niet alleen is Ser701 in de nabijheid van tyrosine-705 (het residu gefosforyleerd STAT3 activering 18), maar een recente studie suggereert dat STAT3 S en AS splice varianten zijn zowel noodzakelijk levensvatbaarheid van STAT3 verslaafde Diffuse Large B cel lymfoom (DLBLCL) 19 cellen. De biologische relevantie nog worden onderzocht. Gezien het feit dat splice variant samenstelling functie van invloed kunnen zijn, hebben we geprobeerd om te ontdekken of de verhouding in eosinofielen werd verstoord door cytokine stimulatie. We aanvankelijk geprobeerd om de koppeling tussen de twee splitsingsgebeurtenissen onderzoeken met behulp van PCR specifiek voor STAT3 α en β splice varianten, gevolgd door splitsing van producten met een restrictie-enzym specifiek voor de S splice varianten AFEI. Densitometrie van de producten aangegeven opname van Ser701 was roughly tien keer vaker dan het weglaten (AS) zowel STAT3 α en β (gegevens niet getoond). Echter, deze semi-kwantitatieve benadering niet voldoende reproduceerbaar en kon niet effectief worden gebruikt voor het meten vier splice varianten tegelijk. Proporties van elk van de vier splicevarianten analyseren noodzakelijk een kwantitatieve PCR (qPCR) protocol dat strakke technische (meerdere assays van een gegeven monster) gaf was vastgesteld repliceert. Relatieve qPCR gebaseerd op de vergelijking van een gen van interesse naar een standaard of housekeeping gen bekend herleid tot een bepaald niveau 20 en is geschikt wanneer het gen van belang en huishoud-gen geamplificeerd met gelijke efficiëntie. Een dubbelstrengs (ds) DNA-bindende fluorescentie (cyanine) kleurstof bindt aan PCR amplicons 21, en na een bepaald aantal cycli is voldoende amplificatie opgetreden op fluorescentie detecteerbaar te zijn. Hoe hoger het aanvangsniveauvan het transcript, hoe lager de drempelcyclus (Ct) waarde. Aangezien de concentratie van cDNA preparaten verschillen, moet men de concentratie transcript te vergelijken met de concentratie van een bekende transcript tot expressie wordt gebracht op een consistent in alle monsters, zoals glucuronidase-β (GUSB) in eosinofielen 22. Relatieve qPCR is niet haalbaar voor zeer vergelijkbare sequenties, zoals in splice varianten gevolg van tandem splicing. De strenge voorwaarden die nodig zijn om specifiek versterken de splice-varianten resulteren in een afname van de efficiëntie. In plaats daarvan moet absolute kwantificering worden gebruikt 23. Dit houdt in het opstellen van een standaard curve met bekende concentraties van de gesplitste transcript van belang, en het waarborgen van PCR te optimaliseren specificiteit 24. Zoals beschreven, kunnen absolute en relatieve qPCR gegevens van een bepaald gen worden samengevoegd tot begrip van expressie van het gen hoogte in een bepaald celtype, indit geval STAT3 in afwisselend gestimuleerd eosinofielen 25. Hierin wordt STAT3 splicevariant kwantificering beschreven met de verwachting dat de werkwijze kan worden aangepast voor gerichte studies andere tandem splitsingsgebeurtenissen. Optimalisatie was een langdurig proces, waarbij verschillende primerparen in verschillende concentraties en talrijke herhalingen van cyclusparameters werden getest in de loop van enkele maanden. De belangrijkste kenmerken van het protocol zijn primer specificiteit validatie en kwantificering op basis van standaard bochten met bekende concentraties van de splice-varianten. Relatieve qPCR in samenhang nuttig gebleken voor onze toepassing, maar is niet noodzakelijk.

<table><tbody><tr><td>MJ Research PTC-200 Thermal Cycler</td><td>GMI</td><td>N/A</td><td>Wordt gebruikt voor standaard PCR</td></tr><tr><td>7500 Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>N/A</td><td>qPCR-machine</td></tr><tr><td>GS-6R</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>centrifuge voor 96-well platen</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 sprectrofotometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8758</td><td>celcultuurmedium</td></tr><tr><td>PfuTurbo DNA Polymerase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600410</td><td>DNA-polymerase voor standaard PCR</td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biosciences</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biosciences</td><td>R0131S</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Qiagen</td><td>330523</td><td>qPCR, DNA-polymerase/dsDNA-bindende kleurstofmix</td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>RNA-extractiekit</td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Invitrogen (ThermoFisher Scientific)</td><td>18080-044</td><td>cDNA-synthesekit</td></tr><tr><td>Primers</td><td>Integrated DNA Technology</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 1.1</td><td>New England Biosciences</td><td>B7201S</td><td></td></tr><tr><td>GenePure LE Agarose</td><td>ISC BioExpress</td><td>E-3120-500</td><td>component van TAE-gel</td></tr><tr><td>Pipettors</td><td>Grote lableveranciers (MLS)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Filter pipette tips</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT10XL, BT20, BT200</td><td></td></tr><tr><td>EU One Piece Thin Wall Plate</td><td>MidSci</td><td>ABI7501</td><td></td></tr><tr><td>ThermalSeal A Sealing Film</td><td>MidSci</td><td>TSA-100</td><td>96 well plate seal</td></tr><tr><td>pET-Elmer (variant van pET-28a)</td><td>Novagen; aangepast in Mosher lab</td><td>N/A</td><td>Details in PMID: 20947497</td></tr><tr><td>Wizard Plus SV Minipreps DNA-zuiveringssysteem</td><td>Promega</td><td>A1460</td><td>Plasmid-zuivering</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4337455</td><td>Sequencing kit</td></tr><tr><td>QIAEX II Gel Extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td>Amplicon-zuivering</td></tr><tr><td>DH5&alpha; competente cellen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18265-017</td><td>beschikbaar bij verschillende leveranciers, zie PMID: 2162051</td></tr><tr><td>kanamycine</td><td>Research Products International Corp.</td><td>K22000-5.0</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td>component van TAE-buffer</td></tr><tr><td>Glacial azijnzuur</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A38C-212</td><td>component van TAE-buffer</td></tr><tr><td>EDTA (Ethyleendiaminetetraazijnzuur)</td><td>Sigma Chemical Company (Sigma Aldrich)</td><td>E-5134</td><td>component van TAE-buffer</td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211705</td><td>component van Luria Broth</td></tr><tr><td>Bacto Gistextract, technisch</td><td>BD Biosciences</td><td>288620</td><td>component van Luria Broth</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S271-10</td><td>component van Luria Broth</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td>component van Luria Broth</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td>component van Luria Broth-plaat</td></tr><tr><td>Lasergene SeqBuilder</td><td>DNASTAR</td><td></td><td>Figuur 1 gegenereerd met behulp van Lasergene SeqBuilder software versie 12.2.0 (DNASTAR)</td></tr></tbody></table>

het samenvoegen van absolute en relatieve kwantitatieve pcr gegevens te kwantificeren stat3 splice variant afschriften

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Human signal transducer en activator van transcriptie 3 (STAT3) is een van de vele genen die een tandem-splicingsite bevatten. Alternatieve donor-splicingsites op 3 nucleotiden afstand resulteren in het opnemen (S) of uitsluiten (ΔS) van een enkele residuu, Serine-701. Verderop resulteert het splitsen bij een paar alternatieve acceptor-splicingsites in transcripten die coderen voor of de 55 terminale residuen van het transactiveringsdomein (α) of een afgeknot transactiveringsdomein met 7 unieke residuen (β). Zoals beschreven in dit manuscript, was het meten van de verhoudingen van de vier gespleten transcripten van STAT3 (Sα, Sβ, ΔSα en ΔSβ) mogelijk met behulp van absolute qPCR (kwantitatieve polymerasekettingreactie). Het protocol onderscheidt en meet daarom zeer vergelijkbare splitsvarianten. Absolute qPCR maakt gebruik van kalibratorplasmiden en daarom wordt de specificiteit van detectie niet in het gedrang gebracht ten koste van de efficiëntie. Het protocol vereist validatie van primers en optimalisatie van de cyclusparameters. Een combinatie van absolute qPCR en efficiëntie-afhankelijke relatieve qPCR van totale STAT3 transcripten maakte een beschrijving mogelijk van de fluctuaties van de niveaus van STAT3 splitsvarianten in eosinofielen behandeld met cytokinen. Het protocol leverde ook bewijs van een co-splicinginterafhankelijkheid tussen de twee STAT3 splitsgebeurtenissen. De strategie, gebaseerd op een combinatie van de twee qPCR-technieken, zou gemakkelijk aanpasbaar moeten zijn voor het onderzoeken van co-splicing op andere tandem-splicingsites.

Goede qPCR datakwaliteit zal een sigmoïdale versterking perceel (Figuur 2a) te genereren, betekent exponentiële toename van transcripten in de loop van het wielrennen. De aanwezigheid van te veel matrijs kan leiden tot een hoge achtergrond fluorescentie, wat een ongepaste basislijn wordt vastgesteld in de eerste cycli. Als de gegevens niet een exponentiële curve (Figuur 2b) bieden, verdere optimalisatie nodig is (beschreven in de stappen 3.1 en 3.4). Voor meer informatie over het oplossen van problemen qPCR resultaten, zie referentie 32. De standaard krommen gegenereerd voor de template kalibrator plasmiden de efficiëntie van amplificatie (curve voor STAT3 Sα figuur 3) te geven. Efficiënties tussen 83 en 95% werden waargenomen onder de beschreven omstandigheden. De vergelijking van specificiteit (stap 3,4) veronderstelt gelijke efficiëntie, wat onwaarschijnlijk 25, zodat de specificiteitis waarschijnlijk groter dan specificiteit factor suggereert. Om de congruentie van STAT3 niveaus evalueren, werden de absolute waarden van elk van de vier splice varianten gemeten alsmede het niveau van de totale STAT3, laatstgenoemde gebruik van primers amplificeren een gebied voor alle vier splice varianten (figuur 4). Idealiter zou de lineaire regressie (naam correlatie) en de helling (verhouding pan- STAT3 gesommeerde splitsingsvarianten) zowel dicht bij 1. De absolute qPCR gegevens worden gepresenteerd als taartdiagrammen om de verhoudingen van de vier splice varianten laten zien na verloop van tijd na de stimulatie met cytokines (figuur 5a). Rusten eosinofielen (0 uur) had de kleinste aandeel van STAT3 Sα, hoewel deze variant was altijd de meest voorkomende. Vermenigvuldigen van de fractie van STAT3 β splice varianten (S ^6; + ΔSβ) van de fractie van STAT3 AS splice varianten (ΔSα + ΔSβ) gaf consistent een lagere waarde dan de experimenteel-geregistreerde waarde voor ΔSβ. Als de splicing gebeurtenissen onafhankelijk waren, zou men verwachten dat vermenigvuldigen fractie van AS varianten door de fractie van β varianten zou een waarde die overeenkomt met de experimenteel bepaalde waarde. Hogere ΔSβ dan verwacht van onafhankelijke splitsingsgebeurtenissen suggereert een co-splicing vertekening bestaat. Het samenvoegen van absolute en relatieve qPCR data aangetoond dat het niveau van alle STAT3 splice-varianten verhoogd post-stimulatie met cytokinen IL3 en TNFa, met niveaus piek 6 uur na stimulatie (Figuur 5b - e). Drie van de vier splice varianten transcript niveaus waren ongeveer 3 maal hoger in IL3 + TNFa behandelde eosinofielen (6 uur) vergeleken met eosinofielen in mediaop hetzelfde tijdstip. STAT3 Sα niveaus waren 3,5 keer hoger in IL3 + TNFa behandelde eosinofielen ten opzichte van eosinofielen in media op dit tijdstip. De grootste onzekerheid (grootste standaardmeetfout) werd waargenomen bij ΔSβ (figuur 5e), waarbij de kleinste fractie van totale STAT3 in alle monsters omvat. Dit was geen verrassing, aangezien lagere niveaus hebben betrekking hogere Ct-waarden. Die meer cycli bereikt de drempel cyclus zal de onzekerheid verergeren als gevolg van cyclus-tot-cyclus variatie in de efficiëntie van de amplificatie. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54473/54473fig1.jpg" /> Figuur 1: Schema van primerparen gebruikt voor qPCR uitvoeren van STAT3 splice varianten en pan-STAT3 Primers gebruikt om specifiek amplificeren van elk van de STAT3 splice varianten (Sα, Sβ respectievelijk ΔSα en ΔSβ) zijn s.hown. Forward primers (STAT3 &quot;S&quot; en &quot;AS&quot;) beslaan de kruising tussen exons 21 en 22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54473/54473fig2.jpg" /> Figuur 2:. Amplificatie plots van qPCR data (a) sigmoïdale amplificatie percelen betekent betrouwbare amplificatie. Deze gegevens werden verkregen van qPCR twee seriële verdunningen van plasmide dat STAT3 Sα, waarbij elk paar van gekleurde lijnen die de fluorescentie niveaus van dubbele verdunde monsters in de loop van 40 cycli (x-as). De meest geconcentreerde monster (grijsgroene) werd geamplificeerd door voldoende cyclus 17 (met dsDNA-bindende kleurstof evenredig fluorescentie, getoond op de y-as) op de fluorescentie drempelwaarde overschrijden (baseline getoond als groene pijl). De Ct waarde zijn 17 (b) Niet-exponentiële plots suggereren dat de achtergrond-fluorescentie drempel niet correct werd in de eerste cycli. Dit zou te wijten zijn aan de aanwezigheid van een remmer, of sterk geconcentreerde sjabloon of primers. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54473/54473fig3.jpg" /> Figuur 3: Standaard curve van log (aantal kopieën van STAT3 Sα) vs Ct Er is een lineair verband tussen de log van het aantal kopieën en de drempel cyclus elke STAT3 splice variant&#39;s (Ct).. Een standaardcurve van plasmide-DNA imiteert de cDNA monsters en duszorgt voor een betere meting dan een curve gemaakt op basis van verdund PCR amplicons. De gepresenteerde gegevens Ct-waarden verkregen qPCR twee seriële verdunningen van plasmide dat STAT3 Sα. Uit deze curve, kan het aantal kopieën aanwezig is in elk monster worden geïnterpoleerd, en amplificatie-efficiëntie berekend (83,9%). Hoewel y onderschept zijn minder reproduceerbaar dan helling, het snijpunt suggereert 42,2 cycli nodig zou zijn zeker geen doel-DNA aanwezig te zijn. Fout balken geven de SEM, n = 3. De vergelijkbare curves werden gebouwd voor STAT3 Sβ, ΔSα en ΔSβ (niet getoond). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54473/54473fig4.jpg" /> Figuur 4: Vergelijking van gekwantificeerde pan- <strong&gt; STAT3 vs cumulatieve STAT3 splice-varianten. De regressie van toegevoegde STAT3 splice varianten vs totale STAT3 moeten helling te hebben (verhouding van pan om cumulatief) en R2-waarde (correlatie) dicht bij 1. Waarden van 17 monsters (eosinofielen en DLBCL) inbegrepen. Foutbalken geven SEM van x naar y bepalingen, n ≥ 2 per. Figuur aangepast van referentie 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/54473/54473fig5.jpg" /> Figuur 5:. STAT3 splice variant fluctueerde de loop van cytokine behandeling (a) Cirkelgrafieken aangeeft percentages van elk STAT3 splice variantin eosinofielen tijdens de behandeling met IL3 en TNFa. (B - e) Mutatie STAT3 splice varianten eosinofielen behandeld met verschillende combinaties van cytokinen, gemeten door het combineren van relatieve en absolute qPCR data STAT3 Sα (b), Sβ (c), ΔSα (d) en ΔSβ (e) niveau. schommelde in de tijd na de stimulatie. Levels aanvankelijk gestegen, met een piek 6 uur na stimulatie. De IL3 + TNFa combinatie uitgelokt hogere expressie van alle vier STAT3 splice varianten dan IL3 alleen. SEM berekend voor elk gegevenspunt goed voor voortplanting van fouten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="tafel 1" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl1.jpg" /> Tafel 1:<html> Primers die voor amplificatie (a), absolute (b) en relatieve (c) kwantitatieve PCR. Klonen primers restrictie sequenties en 5&#39;-extensies voor efficiënt snijden. Kpnl en Nhel knipplaatsen zijn vetgedrukt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473tbl1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.</a> <img alt="tabel 2" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl2.jpg" /> Tabel 2. PCR fietsen parameters (links) en reagens volumes (rechts) voor de amplificatie (a), ten opzichte van (b), absolute (c) kwantitatieve PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473tbl2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.</a> <html> 3 / 54473tbl3.jpg &quot;/&gt; Tabel 3:. Template absolute qPCR plasmide kalibratie assay Deze assay is noodzakelijk om de reproduceerbaarheid en efficiëntie, en het genereren van standaard curves om interpoleren beoordelen. De &quot;non-target&quot; mixen zal een schatting van specificiteit te geven. Optimalisatie kan nodig zijn om consistentie te bereiken zijn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473tbl3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.</a> <img alt="tabel 4" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl4.jpg" /> Tabel 4:. Template voor relatieve qPCR (pan- STAT3 en het huishouden gen GUSB) kalibratie test In tegenstelling tot de absolute qPCR, het punt van deze test is om de voorwaarden waartegen amplificatie-efficiëntie is ~ 100% te bepalen.tp_upload / 54473 / 54473tbl4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze tabel te bekijken. <img alt="tabel 5" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl5.jpg" /> Tabel 5:.. Template voor relatieve qPCR steekproef test voor het meten van pan-STAT3 en huishoud-gen GUSB Standaard curven elkaar herhaald met monsters naar vergelijkbare rendement van de testen te waarborgen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473tbl5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.</a> <img alt="tabel 6" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl6.jpg" /> Tabel 6: Template voor absolute qPCR steekproef test voor het meten van S varianten Standaard curves samen herhaald met monsters vergelijkbare eff garanderen.<html> iciency van de testen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473tbl6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.</a> <img alt="tabel 7" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl7.jpg" /> Tabel 7:.. Template voor absolute qPCR steekproef test voor het meten van AS varianten Standaard curven elkaar herhaald met monsters naar vergelijkbare rendement van de testen te waarborgen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54473/54473tbl7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.</a> <img alt="tabel 8" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl8.jpg" /> Tabel 8: Template voor absolute qPCR steekproef test voor het meten van pan-STAT3.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze tabel te bekijken.

Tandem-splijsgebeurtenissen vinden plaats op plaatsen die minder dan 12 nucleotiden uit elkaar liggen. Het kwantificeren van verhoudingen van dergelijke splitsvarianten is haalbaar met behulp van een absolute kwantitatieve PCR-benadering. Dit manuscript beschrijft hoe splitsvarianten van het gen STAT3, waarbij twee splitsgebeurtenissen resulteren in Serine-701 inclusie/uitsluiting en α/β C-termini, kunnen worden gekwantificeerd.

Het samenvoegen van absolute en relatieve kwantitatieve PCR gegevens te kwantificeren STAT3 Splice Variant Afschriften

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Het algemene doel van dit protocol is om de proporties en absolute niveaus van STAT3-splicevariant-transcripten in eosinofielen te kwantificeren. Deze methode kan cruciale vragen in het veld van splicingregulatie beantwoorden, zoals de co-associatie van distale splicing-gebeurtenissen en de identificatie van condities die kunnen leiden tot verschillen in de proporties van tandem-splicing. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het gebruik van plasmide-standaarden, waardoor de acquisitie van absolute en relatieve qPCR-gegevens mogelijk is, zodat we de proporties en algemene niveaus van vier STAT3-transcripten kunnen bepalen.In ons geval willen we leren hoe de vier STAT3-varianten S alpha, S beta, delta S alpha en delta S beta veranderen wanneer eosinofielen door cytokinen worden gestimuleerd. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de STAT3-samenstelling van eosinofielen, kan deze ook worden toegepast op andere celtypen waarvan cDNA kan worden verkregen. Omdat S en delta S slechts in drie nucleotiden verschillen, moesten we concessies doen aan de efficiëntie om specificiteit te bereiken in de standaarden voor elke variant.In dit protocol wordt cDNA, geprepareerd uit humane eosinofielen, gebruikt als template voor het amplifieren van de STAT3-splicevarianten. Nadat de plasmiden zijn gemaakt zoals beschreven in het tekstprotocol, worden sequeneringsreacties voorbereid voor het sequeneren van plasmiden uit verschillende koloniën. Elke reactie van 20 µL moet drie µL sequeneringsreactiebuffer, twee µL sequeneringsreactiemix, 12 µL ultrapuur water, één µL plasmide en twee µL sequeneringsprimer bevatten.Wanneer de sequentieresultaten beschikbaar zijn, beoordeel dan de elektroforetogrammen van de plasmiden die elke variant coderen: S alpha, S beta, delta S alpha en delta S beta. Meet de concentratie van puur plasmide-DNA in nanogram per microliter en bereken het kopiegetal per microliter. Begin deze procedure door een verdunningsreeks van 1:10 van de STAT3-plasmiden voor te bereiden met gebruik van ultrapuur water.Met ongeveer 10⁸ tot 10³ kopieën per microliter. Meet de concentratie van het meest geconcentreerde monster. Gebruik de verdunde plasmiden om vier nontarget-mengsels te bereiden als negatieve controles voor elke splice-variant bij 10⁶ kopieën per microliter voor elke variant.Bereid een targetmix voor met gelijke concentraties van alle vier de templates, elk met 10⁶ kopieën per µL. Bereid primerpaaroplossingen voor voor elke splice-variant met 60 µL primers, elk met een concentratie van 7 µM, voor een eindconcentratie van 560 nM in het monster. Verdun de DNA-polymerase en de dubbelstrengs DNA-bindende kleurstofmix in een verhouding van 7:5 met puur water.Stel de assay op in een 96-well PCR-plaat volgens dit sjabloon. Voeg eerst aan elke well 21 µL van de verdunde DNA-polymerase, dubbelstrengs DNA-bindende kleurstofmix toe. Voeg vervolgens twee µL primermix en twee µL template toe.Voeg aan elke no-template control-well twee µL gefilterd water toe in plaats van het template. Zet de reacties in dubbele uitvoering op om de reproduceerbaarheid te beoordelen. Sluit de qPCR-plaat af met een plakfolie en centrifugeer vijf minuten bij 1.200 g bij 12 °C.Zet de qPCR-machine aan en plaats de verzegelde qPCR-plaat. Als u het ABI real-time PCR-systeem gebruikt, stelt u het experiment in zoals gedemonstreerd. Klik op Bestand, Nieuw, Volgende, selecteer een nieuwe Detector, geef vervolgens een naam op en kies een Reporter en een Quencher.Stel voor elke splicevariant een nieuwe detector in. Selecteer Next en stel de standaarden in zoals aangegeven op de pagina Set Up Sample Plate, waarbij u ervoor zorgt dat de hoeveelheden in de tabel worden ingevoerd en de juiste detectoren worden geselecteerd. Klik op Finish.Stel het geschikte PCR-cyclingsprogramma in. Zorg ervoor dat de fluorescentiemeting om de threshold cycle-waarden te bepalen plaatsvindt tijdens de stap van 72 °C van elke cyclus. Selecteer Run.Klik na voltooiing van de run op het tabblad Resultaten en vervolgens op het tabblad Amplificatieplot. Evalueer de resulterende amplificatieplot om de datakwaliteit te beoordelen. Een exponentiële plot duidt op een betrouwbare amplificatie.Exporteer de resultaten naar software voor spreadsheetbeheer. De analyse van de gegevens, zoals beschreven in het tekstprotocol, is essentieel om vast te stellen of de assay verdere optimalisatie vereist ten behoeve van de reproduceerbaarheid. Het cDNA voor deze assay wordt geprepareerd uit eosinofielen die zijn behandeld met cytokinen om transcriptie te bevorderen.Bereid seriële verdunningen voor van twee cDNA-monsters met een verdunningsreeks van één tot één op 1.024. Stel de assay op in een 96-wells plaat met reactievolumes van 25 µL, zoals gedemonstreerd voor het analyseren van primerspecificiteit, maar met verschillende primerconcentraties voor pan STAT3 en het housekeeping-gen GUSB. Een sjabloon hiervoor wordt in deze tabel weergegeven.Plaats de verzegelde PCR-plaat in het qPCR-apparaat. Stel het experiment in met de software door een nieuwe detector voor GUSB toe te voegen en het passende PCR-cyclingschema te gebruiken. Vervolgens worden de resultaten gebruikt om de drempelcycluswaarde (threshold cycle value) voor elk monster te berekenen, zoals beschreven in het tekstprotocol.Om met deze procedure te beginnen, vergelijkt u de drempelcycluswaarden die zijn verkregen bij relatieve qPCR voor het housekeeping-gen GUSB en verdunt u het cDNA dienovereenkomstig met ultrapuur water om ervoor te zorgen dat alle concentraties binnen één grootteorde liggen. Stel de absolute qPCR-assays van de monsters in 96-wells platen op. Volg dit sjabloon voor S alfa en S beta en dit sjabloon voor delta S alfa en delta S beta.Voer de assays uit zoals eerder beschreven en herhaal de assays ten minste één keer. Stel vervolgens een absolute qPCR 96-well plaat op met reacties van 25 microliter met pan STAT3-primers van 400 micromolar en een mix van alle vier de plasmiden of een enkel plasmide volgens dit sjabloon. Af kittens de qPCR-plaat met een kleefdeksel en centrifugeer vijf minuten bij 1.200 g bij 12 graden Celsius.Plaats de verzegelde PCR-plaat in het qPCR-apparaat en stel het experiment in zoals eerder beschreven, waarbij een nieuwe detector voor pan STAT3 wordt toegevoegd. Hanteer dezelfde cyclusparameters als voor relatieve qPCR. Analyseer de resultaten volgens het tekstprotocol nadat de assay ten minste één keer is herhaald.qPCR-gegevens van goede kwaliteit genereren een sigmoïdale amplificatieplot die duidt op een exponentiële toename van transcripten gedurende de cycli. Deze gegevens zijn verkregen uit qPCR van twee seriële verdunningen van een plasmide dat STAT3 S alpha bevat. Elk paar gekleurde lijnen vertegenwoordigt de fluorescentieniveaus van dubbele verdunned monsters over een periode van 40 cycli.Standaardcurven gegenereerd voor de template-calibratorplasmiden zullen de amplificatie-efficiëntie aangeven. In deze curve voor STAT3 S alpha was de amplificatie-efficiëntie 83,9%. Om de congruentie van STAT3-niveaus te evalueren, werden de absolute waarden van elk van de vier splice-varianten gemeten, evenals het niveau van totaal STAT3. Idealiter moeten zowel de lineaire regressie als de helling dicht bij één liggen.De absolute qPCR-gegevens worden weergegeven als cirkeldiagrammen om hun proporties van de vier STAT3-splicevarianten tijdens de cytokinebehandeling te tonen. Het samenvoegen van absolute en relatieve qPCR-gegevens toonde aan dat de spiegels van alle STAT3-splicevarianten toenamen na stimulatie met de cytokines IL3 en TNF alpha, waarbij de spiegels piekten na zes uur. Het samenvoegen van de gegevens van alle tijdspunten onthulde een kleine maar significante bias voor coassociatie van de beta- en delta S-splicinggebeurtenissen.Zodra deze techniek is geoptimaliseerd, kunnen de bijbehorende assays in vier uur worden uitgevoerd, mits dit correct gebeurt. Tijdens deze procedure is het belangrijk om onder steriele omstandigheden te werken om contaminatie te voorkomen. Splicing-beslissingen waarbij één codon wordt geïncludeerd of geëxcludeerd, zijn verantwoordelijk voor 20% van de in-frame splicevariatie.Ons protocol zou gemakkelijk aanpasbaar moeten zijn voor de kwantificering van dergelijke variaties. Na de ontwikkeling stelde deze techniek Mao Zhang in staat om in samenwerking met mijn groep in de groep van Li-Shan Rue knockdown-re-expressie-experimenten van STAT3-varianten in ABC-lymfoomcellen uit te voeren. Deze experimenten toonden aan dat een mengsel van S- en delta-S-varianten vereist is voor de overleving van cellen in kweek.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u absolute en relatieve qPCR uitvoert en welke condities geschikt zijn voor het onderscheiden en kwantificeren van subtiele verschillen in splicing.

merging-absolute-relative-quantitative-pcr-data-to-quantify-stat3

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Het is aangetoond dat de regulatie van alternatieve splicing bijdraagt aan de epitheel-mesenchymale overgang (EMT), een essentieel cellulair programma in verschillende fysiologische en pathologische processen. Hier beschrijven we een methode die gebruikmaakt van een induceerbaar EMT-model voor de detectie van alternatieve splicing tijdens EMT.

Detectie van alternatieve splicing Tijdens-mesenchymale transitie

Hier beschrijven we een protocol gericht op onderzoek naar de gevolgen van afwijkende splicing op resistentie in solide tumoren en hematologische maligniteiten. Om dit doel te bereiken, analyseerden we het transcriptoom profielen van de ouders en bestand in vitro modellen door middel van RNA-seq en vestigde een qRT-PCR-methode om kandidaatgenen te valideren.

Met behulp van RNA-sequencing te detecteren Novel Splice varianten Gerelateerd aan Drug Resistance in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cancer Models

We beschrijven een methode om enkele zoogdiercellen te sorteren en om de expressie van maximaal 96 doelgenen van belang in elke cel te kwantificeren. Deze methode omvat het gebruik van interne qPCR-standaarden om de schatting van absolute transcripttellingen mogelijk te maken.

Eencellige Gene Expression Profiling Met behulp van FACS en qPCR met interne standaarden

Een in situ hybridisatie (ISH) protocol dat gebruikmaakt van korte antisense oligonucleotides voor alternatieve pre-mRNA-splicing patronen kunt ontdekken in muis hersenen secties wordt beschreven.

Kwantitatieve analyse van alternatieve Pre-mRNA-Splicing in muis hersenen secties met behulp van RNA In Situ hybridisatie Assay

In dit artikel wordt een protocol met hoge doorvoer beschreven voor een snelle en betrouwbare bepaling van de genexpressieniveaus in enkele of bulk C. elegansmonsters. Dit protocol vereist geen RNA-isolatie en produceert cDNA rechtstreeks uit monsters. Het kan worden gebruikt samen met high-throughput multiplexed nanofluidic real-time qPCR platforms.

Kwantitatieve RT-PCR met hoge doorvoer in enkele en bulk C. elegans-monsters met behulp van nanofluïdische technologie

Dit protocol biedt een snel en nuttig hulpmiddel voor het evalueren van de rol van een eiwit met een niet-gekarakteriseerde functie in alternatieve splicing-regulatie na chemotherapeutische behandeling.

De E1A Minigene Tool gebruiken om mRNA-splicingwijzigingen te bestuderen

Alternatieve splicing (AS) en alternatieve polyadenylation (APA) vergroten de diversiteit van transcriptisovormen en hun producten. Hier beschrijven we bioinformatische protocollen om bulk RNA-seq en 3'-eindsequencingtests te analyseren om AS en APA te detecteren en te visualiseren, variërend tussen experimentele omstandigheden.

Identificatie van alternatieve splicing en polyadenylation in RNA-seq-gegevens

Dit protocol beschrijft een minigene reporter assay om de impact van 5'-splice site mutaties op splicing te monitoren en ontwikkelt suppressor U1 snRNA voor de redding van mutatie-geïnduceerde splicing remming. De reporter en suppressor U1 snRNA constructen worden uitgedrukt in HeLa cellen, en splicing wordt geanalyseerd door primer extensie of RT-PCR.

Een op reporter gebaseerde cellulaire test voor het bewaken van splicing-efficiëntie

Dit protocol meet kwantitatief de stabiliteit en halveringstijd van intergene en intragenische enhancer-RNA's in muisembryonale stamcellen met behulp van Actinomycine D-behandeling, RT-qPCR en niet-lineaire regressieanalyse. Positie-specifieke normalisatiestrategieën worden geïntegreerd om eRNA-vervaldynamiek nauwkeurig te modelleren op een contextafhankelijke manier.

Geoptimaliseerde kwantitatieve beoordeling van de stabiliteit van enhancer-RNA in muisembryonale stamcellen

Dit protocol biedt een gestroomlijnde computationele pijplijn voor het kwantificeren van ontluikende enhancer-transcripties. Door de toegankelijkheid van chromatine, de chromatinefunctie en transcriptiegegevens te integreren, maakt het nauwkeurige detectie en strengspecifieke analyse van de enhancer-activiteit in complexe intragene regio's mogelijk, terwijl het toegankelijk blijft voor onderzoekers zonder uitgebreide bio-informaticatraining.

Een computationele pijplijn voor intergene/intragene enhancer RNA-kwantificering in embryonale stamcellen van muizen

Leer hoe u absolute en relatieve qPCR combineert om STAT3 splice-varianten in eosinofielen te kwantificeren. Deze methode gebruikt plasmide-standaarden voor nauwkeurige transcriptanalyse bij cytokinestimulatie.

Het samenvoegen van absolute en relatieve kwantitatieve PCR gegevens te kwantificeren STAT3 Splice Variant Afschriften

Meer video's verkennen