Het samenvoegen van absolute en relatieve kwantitatieve PCR gegevens te kwantificeren STAT3 Splice Variant Afschriften
9 oktober 2016
Tandem-splijsgebeurtenissen vinden plaats op plaatsen die minder dan 12 nucleotiden uit elkaar liggen. Het kwantificeren van verhoudingen van dergelijke splitsvarianten is haalbaar met behulp van een absolute kwantitatieve PCR-benadering. Dit manuscript beschrijft hoe splitsvarianten van het gen STAT3, waarbij twee splitsgebeurtenissen resulteren in Serine-701 inclusie/uitsluiting en α/β C-termini, kunnen worden gekwantificeerd.
Het algemene doel van dit protocol is om de verhoudingen en absolute niveaus van STAT3-splice variant transcripten in eosinofielen te kwantificeren. Deze methode kan sleutelvraagstukken in het veld van de splicing-regulatie aanpakken, zoals de coassociatie van distale splicing-gebeurtenissen en de identificatie van omstandigheden die kunnen leiden tot verschillen in tandem splicing-verhoudingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de plasmidestandaarden die de verwerving van absolute en relatieve qPCR-gegevens mogelijk maken, zodat we de verhoudingen en totale niveaus van vier STAT3-transcripten kunnen bepalen.
In ons geval willen we weten hoe de vier STAT3-varianten S alfa, S bèta, delta S alfa en delta S bèta veranderen wanneer eosinofielen worden gestimuleerd door cytokines. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de STAT3-samenstelling van eosinofielen, kan deze ook worden toegepast op andere celtypen waarvoor cDNA kan worden verkregen. Omdat S en delta S slechts in drie nucleotiden verschillen, moesten we efficiëntie opofferen om specificiteit te bereiken in de standaarden voor elke variant.
In dit protocol wordt cDNA bereid uit menselijke eosinofielen gebruikt als sjabloon voor het amplificeren van de STAT3-splice varianten. Na het maken van de plasmiden zoals beschreven in het tekstprotocol, bereid sequencingreacties voor voor het sequencen van plasmiden van verschillende kolonies. Elke 20-microliter reactie zou drie microliter sequencingreactiebuffer, twee microliter sequencingreactiemix, 12 microliter ultrapuur water, één microliter plasmide en twee microliter sequencingprimer moeten bevatten.
Wanneer de sequencingresultaten beschikbaar zijn, beoordeel de elektroforogrammen van de plasmiden die elke variant coderen; S alfa, S bèta, delta S alfa en delta S bèta. Meet de concentratie van puur plasmide-DNA in nanogram per microliter en bereken het aantal kopieën per microliter. Begin deze procedure door een verdunningsreeks van één op tien van de STAT3-plasmiden te bereiden met ultrapuur water.
Met ongeveer 10 tot de achtste tot 10 tot de derde kopieën per microliter. Meet de concentratie van de meest geconcentreerde monster. Gebruik de verdunde plasmiden om vier niet-doelmixen te bereiden als negatieve controles voor elke splice variant bij 10 tot de zesde kopieën per microliter voor elke variant.
Bereid een doelmix met gelijke concentraties van alle vier de templates, elk bij 10 tot de zesde kopieën per microliter. Bereid primerpaaroplossingen voor elke splice variant met 60 microliters primers, elk bij een concentratie van zeven micromolar, voor een eindconcentratie van 560 nanomolar in het monster. Verdun het DNA-polymerase, dubbelstrengs DNA-bindende kleurstofmix, zeven tot vijf met zuiver water.
Stel het assay op in een 96-well PCR-plaat volgens dit sjabloon. Voeg eerst aan elke put 21 microliters van de verdunde DNA-polymerase, dubbelstrengs DNA-bindende kleurstofmix toe. Voeg vervolgens twee microliters primermix en twee microliters template toe.
Voeg aan elke controle-put zonder template twee microliters gefilterd water toe in plaats van template. Stel de reacties op in duplicaat om de herhaalbaarheid te beoordelen. Verzegeld de qPCR-plaat met een zelfklevende afdekking en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 1.200 g bij 12 graden Celsius.
Schakel het qPCR-apparaat in en plaats de verzegeldde qPCR-plaat. Als u het ABI real-time PCR-systeem gebruikt, stelt u het experiment in zoals gedemonstreerd. Klik op Bestand, Nieuw, Volgende, selecteer nieuwe Detector, geef vervolgens een naam en kies een Reporter en een Quencher.
Stel een nieuwe detector in voor elke splice variant. Selecteer Volgende en stel de standaarden in zoals gevraagd op de pagina Sample Plate Setup, zorg ervoor dat de hoeveelheden in de tabel worden ingevoerd en dat de juiste detectoren zijn geselecteerd. Klik op Voltooien.
Stel het juiste PCR-cyclingprogramma in. Zorg ervoor dat de fluorescentiemeting om de drempelcycluswaarden te bepalen plaatsvindt tijdens de stap van 72 graden Celsius van elke cyclus. Selecteer Uitvoeren.
Wanneer de run voltooid is, klik op het tabblad Resultaten, het tabblad Amplificatie Plot. Evalueer de Output Amplificatie plot om de gegevenskwaliteit te beoordelen. Een exponentiële plot duidt op betrouwbare amplificatie.
Exporteer de resultaten naar een spreadsheetsoftware. Analyse van de gegevens zoals beschreven in het tekstprotocol is essentieel om te weten of het assay verdere optimalisatie vereist om de reproduceerbaarheid te waarborgen. Het cDNA voor dit assay wordt bereid uit eosinofielen behandeld met cytokines om transcriptie te bevorderen.
Bereid seriële verdunningen van twee cDNA-monsters met een verdunningsbereik van één op één tot één op 1.024. Stel het assay op in een 96-well plaat met 25-microliter reacties zoals gedemonstreerd voor het analyseren van primerspecificiteit, maar met verschillende primerconcentraties voor pan STAT3 en een huishoudgen GUSB. Een sjabloon wordt in deze tabel getoond.
Plaats de verzegeldde PCR-plaat in de qPCR-machine. Stel het experiment in met behulp van de software door een nieuwe detector toe te voegen voor GUSB en het juiste PCR-cyclingprogramma te gebruiken. Vervolgens worden de resultaten gebruikt om de drempelcycluswaarde voor elk monster te berekenen zoals beschreven in het tekstprotocol.
Om deze procedure te beginnen, vergelijk de drempelcycluswaarden verkregen in relatieve qPCR voor het huishoudgen GUSB en verdun het cDNA dienovereenkomstig met ultrapuur water om ervoor te zorgen dat alle concentraties binnen een orde van grootte liggen. Stel de absolute qPCR-assays van de monsters in 96-well platen in. Volg dit sjabloon voor S alfa en S bèta en dit sjabloon voor delta S alfa en delta S bèta.
Voer de assays uit zoals eerder getoond en herhaal de assays minstens één keer. Stel vervolgens een absolute qPCR 96-well plaat in met 25 microliter reacties met behulp van pan STAT3-primers bij 400 micromolar en een mix van alle vier de plasmiden of een enkel plasmide volgens dit sjabloon. Verzegeld de qPCR-plaat met een zelfklevende afdekking en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 1.200 g bij 12 graden Celsius.
Plaats
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het kwantificeren van de verhoudingen en absolute niveaus van STAT3-splice variant transcripten in eosinofielen. Het protocol maakt gebruik van absolute kwantitatieve PCR om splice varianten te analyseren die het resultaat zijn van tandem-splice-gebeurtenissen.
Belangrijkste onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Moleculair biologie
Achtergrond
- Tandem-splice-gebeurtenissen vinden plaats op locaties die minder dan 12 nucleotiden van elkaar liggen.
- Het kwantificeren van splice varianten is essentieel voor het begrijpen van gen-regulatie.
- STAT3-splice varianten omvatten S alfa, S bèta, delta S alfa en delta S bèta.
- Het begrijpen van deze varianten kan inzicht geven in de functie van eosinofielen en hun reactie op cytokinen.
Doel van het onderzoek
- Om de niveaus van STAT3-splice varianten in eosinofielen te kwantificeren.
- Om te onderzoeken hoe cytokine-stimulatie de expressie van deze varianten beïnvloedt.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het beoordelen van de verhoudingen van splice varianten.
Gebruikte methoden
- Bereiding van cDNA uit humane eosinofielen.
- Gebruik van plasmide-standaarden voor absolute en relatieve qPCR-gegevensverwerving.
- Sequencingreacties om plasmide-constructies voor elke splice variant te beoordelen.
- Opzetten van qPCR-assays in een 96-well formaat om transcriptniveaus te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kwantificering van vier STAT3-splice varianten.
- Aangetoonde veranderingen in splice variant niveaus bij cytokine-stimulatie.
- Een methode geboden die toepasbaar is op verschillende celtypen voor splice variant analyse.
- Gegevens gaven aan dat er optimalisatie nodig is in de reproduceerbaarheid van de assay.
Conclusies
- De methode kwantificeert effectief STAT3-splice varianten in eosinofielen.
- De verkregen inzichten kunnen het begrip van splice-regulatie verbeteren.
- Deze aanpak kan worden aangepast voor andere celtypen en condities.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of splice variant proportions enables mechanistic de-risking in target validation by resolving transcriptional heterogeneity that can confound functional assays. This approach supports predictive confidence in lead identification by linking isoform-specific expression to phenotypic outcomes in disease-relevant systems. The method’s adaptability to tandem splicing sites offers a scalable strategy for early discovery workflows where subtle transcriptional changes inform go/no-go decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional hypotheses by quantifying isoform-specific expression changes in response to cytokine stimulation.
- Operational Value: Provides absolute quantification via plasmid standards, reducing reliance on comparative methods that may introduce normalization bias.
- Predictive Value: Supports assessment of co-splicing interdependence, aiding in the prioritization of targets with coordinated regulatory mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, reproducibility-ready data for four highly similar splice variants, enabling precise discrimination in multiplexed assays.
- Operational Value: Establishes standardized workflows using calibrated plasmid dilutions, facilitating cross-lab consistency in transcript quantification.
- Scalability: Compatible with 96-well qPCR formats, allowing medium-throughput screening of splice variant dynamics under experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links eosinophil STAT3 isoform shifts to cytokine exposure, providing a disease-relevant system for inflammatory pathway analysis.
- Mechanistic De-risking: Reveals co-splicing patterns between distal tandem sites, informing biomarker strategies that account for coordinated transcriptional regulation.
- Preclinical Model Relevance: Demonstrated adaptability to lymphoma cells, supporting cross-system validation of splice variant functional roles.
Pipeline & Workflow Integration
The method bridges discovery biology and lead identification by delivering absolute and relative transcript data that inform both target validation and assay readiness stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of splicing regulation by quantifying isoform-specific responses to stimuli, clarifying pathway-level effects.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs from absolute qPCR, enabling reliable comparison of splice variant proportions across conditions.
- Analytics: Combines absolute quantification with efficiency-corrected relative qPCR to derive both proportional and total transcript levels, enhancing data interpretability.
- Translational Research: Connects isoform dynamics in primary eosinophils to preclinical models, supporting continuity in target validation.
- Enterprise Reuse: Plasmid-based standardization allows the assay to be reused across projects and cell types as a plug-and-play quantification module.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving isoform-specific expression, improving target confidence in STAT3-related pathways.
- Operational Value: Ensures reproducibility through plasmid standard curves and optimized cycling parameters, minimizing inter-assay variability.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by linking splice variant ratios to functional outcomes in cellular models.
- Portfolio Impact: Enables data-driven triage of targets based on isoform expression stability and co-splicing behavior under pathophysiological conditions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in qPCR optimization, plasmid preparation, and sequence validation to ensure splice variant specificity.
- Dependent on access to qPCR instrumentation with fluorescence detection and thermal cycling precision for accurate threshold cycle determination.
- Necessitates cross-team standardization of plasmid dilution series and primer concentration protocols to maintain assay comparability.
- Involves adaptation considerations when transferring the method to new cell types, including cDNA quality and transcript abundance thresholds.
- Practical limitation: Primer specificity must be balanced with amplification efficiency due to minimal nucleotide differences between variants, as noted in the protocol optimization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:16
Creating Plasmids as Template Standards
2:20
Analyzing Primer Specificity for Absolute qPCR
5:49
Performing Relative qPCR Assays
6:57
Analyzing Absolute qPCR Data for Unknown Samples
8:27
Results: Measurement of STAT3 Splice Variant Levels in Eosinophils Treated with Cytokines
10:06
Conclusion
