Snelle en specifieke beoordeling van de halogenerend Peroxidase activiteit in leukocyten verrijkte bloedmonsters
28 juli 2016
Dit protocol beschrijft de snelle verrijking van leukocyten uit kleine bloedmonsters voor een daaropvolgende specifieke bepaling van de halogenerende peroxidase-activiteit binnen de cellen. De methode kan worden toegepast op menselijk en niet-menselijk materiaal en kan bijdragen aan de evaluatie van nieuwe ontstekingsmarkers.
Het algemene doel van deze methode voor erytrocytendepletie is om een snelle en eenvoudige leukocytenverrijking uit een kleine bloedstalen te bewerkstelligen. Veel voordelen van deze techniek zijn dat deze goedkoop, betrouwbaar en snel is. Bovendien kan het worden toegepast op zowel menselijke als niet-menselijke bloedstalen.
Stel vóór aanvang van de lysiprocedure de pipet voor het toevoegen van water in op twee milliliters en de pipet voor PBS op vijf milliliters. Plaats vervolgens open kolven met water en PBS onder een laminaire flow-kap bij kamertemperatuur. Aangezien de hypotone lyse een tijdskritisch proces is, dient alles vooraf te zijn voorbereid.
Bovendien moet de lysisprocedure altijd op dezelfde wijze worden uitgevoerd om compatibele resultaten te verkrijgen. Draag vervolgens 100 µL van elk bloedmonster over naar een conische buis van 15 mL. Voeg twee milliliter gedestilleerd water aan elk monster toe met vortexen op de middelste stand.
Laat de cellen 60 seconden rusten en voeg vervolgens vijf milliliter PBS toe. Meng de monsters door te vortexen. Verzamel nu de cellen door middel van centrifugatie en schenk de supernatanten af.
Keer de buisjes om en tik de openingen tegen een papieren handdoek om zoveel mogelijk vloeistof te verwijderen. Herhaal vervolgens de procedure voor hypotone lysis zoals zojuist gedemonstreerd. Nadat er voor de tweede keer een droge pellet is verkregen, wordt elk monster opnieuw opgelost in 500 microliters HBSS, totdat een homogene oplossing is verkregen.
Breng de cellen vervolgens over naar 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes op ijs. Om de peroxidase-specificiteit van de monsters na aminofenolfluoresceïne- (APF-) kleuring te controleren, voegt u eerst vijf microliters van de heme-peroxidase-remmer 4-ABAH toe aan de betreffende monsters voor een incubatie van 15 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg daarna vijf microliters APF-werkoplossing toe aan elke buis en vortex de cellen voorzichtig op de gemiddelde stand.
Incubeer alle monsters 30 minuten bij 37 °C. Voeg vervolgens 5 µL waterstofperoxide-werkoplossing toe aan elk monster en vortex de buisjes voorzichtig. Centrifugeer de cellen na 60 minuten bij 37 °C en verwijder voorzichtig het supernatant zonder de pellets te verstoren.
Resuspendeer tot slot de cellen in 250 µL HBSS en bewaar de monsters in het donker tot aan de analyse om fotobleking te voorkomen. Hier wordt een representatief voorbeeld getoond van de leukocytpopulaties na hypotone lyse en APF-kleuring zoals zojuist gedemonstreerd. Door de celgrootte tegenover de granulariteit uit te zetten, kan de robuuste uitputting van de erytrocyten worden waargenomen, waarbij de populatie rode bloedcellen en debris slechts 22% van de events uitmaakt.
Verder maakt de intensiteitsverdeling van de APF-afgeleide fluorescentie een duidelijk onderscheid mogelijk tussen de peroxidase-negatieve erytrocyten en lymfocyten, waarbij een matige APF-oxidatie wordt waargenomen voor de peroxidase-positieve monocyten en eosinofielen, en een sterke peroxidase-oxidatie wordt vertoond door de neutrofielen. Eenmaal beheerst kan deze techniek, mits correct uitgevoerd, parallel worden toegepast op maximaal 50 bloedmonsters. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals antilichaamkleuring, worden uitgevoerd om de relevante celondergroepen te identificeren.
Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van studies bij kleine dieren om de rol van de halogeneringsactiviteit van MPO en EPO te onderzoeken in diermodellen voor chronische inflammatoire ziekten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een snelle en eenvoudige methode voor het verrijken van leukocyten uit kleine bloedmonsters, toepasbaar op zowel menselijk als niet-menselijk materiaal. De techniek is kosteneffectief en betrouwbaar, wat de evaluatie van nieuwe ontstekingsmarkers vergemakkelijkt.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Immunologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Leukocytenverrijking is essentieel voor het bestuderen van immuunresponsen.
- Traditionele methoden kunnen tijdrovend en complex zijn.
- Deze methode is erop gericht het proces te vereenvoudigen.
- Het kan worden gebruikt voor zowel menselijke als niet-menselijke bloedmonsters.
Doel van de studie
- Om een protocol voor de snelle verrijking van leukocyten te ontwikkelen.
- Om de halogenerende peroxidaseactiviteit in leukocyten te beoordelen.
- Om bij te dragen aan de identificatie van ontstekingsmarkers.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van pipetten voor de toediening van water en PBS.
- Gebruik van een laminaire flowkast voor de verwerking van monsters.
- Hypotone lyse voor het verwijderen van erytrocyten.
- Tijdkritische uitvoering van de lyseprocedure.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle verrijking van leukocyten uit kleine bloedmonsters.
- Betrouwbare bepaling van de peroxidase-activiteit.
- Haalbaarheid voor zowel menselijke als niet-menselijke monsters.
- Potentieel voor het evalueren van nieuwe ontstekingsmarkers.
Conclusies
- De methode is efficiënt en kosteneffectief.
- Het verbetert de studie van immuunresponsen.
- Verder onderzoek kan voortbouwen op dit protocol.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit protocol maakt snelle, gestandaardiseerde verrijking van leukocyten uit kleine bloedmonsters mogelijk, ter ondersteuning van vroege ontdekkingsfase-onderzoek naar inflammatoire ziekten. Door de halogenerende peroxidase-activiteit van MPO en EPO te kwantificeren, biedt het een mechanistische readout voor targetvalidatie en pathway de-risking. De compatibiliteit van de methode met flowcytometrie en antilichaamkleuring vergemakkelijkt de integratie in screening- en translationele workflows.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om leukocyten-specifieke peroxidaseactiviteit te onderzoeken om MPO en EPO te valideren als therapeutische targets bij chronische ontsteking.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van een minimaal samplevolume (50–100 µL), waardoor herhaalde bemonstering uit kleine diermodellen mogelijk is voor longitudinale studies naar target engagement.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Combineert APF-kleuring met flowcytometrie om kwantitatieve, fluorescentiegebaseerde read-outs van HOCl/HOBr-productie te genereren voor assay-standaardisatie.
- Operationele waarde: Maakt high-throughput verwerking van maximaal 50 monsters in parallel mogelijk, wat schaalbare screeningscampagnes ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt leukocytenperoxidaseactiviteit aan ziekte-relevante inflammatoire processen, wat bijdraagt aan de afstemming van biomarkers in preklinische modellen.
- Operationele waarde: Werkt met zowel menselijk als knaagdierbloed, waardoor translationele continuïteit tussen soorten bij doelwitvalidatie mogelijk wordt gemaakt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege toetsing van doelwit-hypotheses tot preklinische validatie, in het bijzonder bij programma's voor immunologie en inflammatoire ziekten.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door enzymspecifieke peroxidaseactiviteit te kwantificeren in gezuiverde leukocytenpopulaties.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten via APF-fluorescentie en flowcytometrie, waardoor het effect van verbindingen op de peroxidaseactiviteit kan worden beoordeeld.
- Analytics: Genereert meetbare fluorescentie-intensiteitsgegevens die vergelijking mogelijk maken van peroxidase-positieve cel-subsets (neutrofielen, monocyten, eosinofielen) onder experimentele condities.
- Translational Research: Verbindt peroxidaseactiviteit aan mechanismen van inflammatoire ziekten, wat de preklinische continuïteit ondersteunt wanneer dit wordt gecombineerd met kleuring van celoppervlaktemarkers.
- Enterprise Reuse: Gestandaardiseerde leukocytenverrijking en APF-gebaseerde detectie vormen een herbruikbaar platform voor meerdere programma's gericht op inflammatoire targets.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellende zekerheid bij targetvalidatie door peroxidase-activiteit te isoleren tot specifieke leukocytenlijnen.
- Operationele waarde: Biedt een kostenefficiënt, snel protocol dat minimale instrumentatie vereist (centrifuge, vortexer, flowcytometer).
- Strategische waarde: Verkort de tijdlijnen voor biologische risicoreductie door een snelle, iteratieve beoordeling van targetmodulatie in leukocytenmonsters mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van MPO/EPO-remmers door vroege functionele activiteitsgegevens van fysiologisch relevante cellen te leveren.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van leukocyten, flowcytometrie en de chemie van fluorescerende probes.
- Afhankelijk van toegang tot centrifuges, vortexers, laminaire flowkappen en flowcytometers met passende fluorescentiekanalen.
- Standaardisatie van APF- en waterstofperoxide-werkoplossingen tussen laboratoria is nodig voor reproduceerbare resultaten.
- Aanpassing aan niet-menselijke soorten vereist validatie van de peroxidase-expressie en de efficiëntie van de APF-kleuring in de doellukocyten-subsets.
- Beperkt tot het detecteren van halogenerende peroxidase-activiteit; meet geen andere leukocytenfuncties tenzij gecombineerd met aanvullende assays.
