Name: Snelle en specifieke beoordeling van de halogenerend Peroxidase activiteit in leukocyten verrijkte bloedmonsters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Leer een snelle methode voor leukocytenverrijking uit kleine bloedmonsters om halogenerende peroxidase-activiteit te beoordelen. Deze techniek is kosteneffectief en betrouwbaar voor menselijke en niet-menselijke samples.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd mogelijk gemaakt door financiering van het Duitse federale ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF, 1315883), evenals door het Sächsische Aufbaubank (SAB) project 100116526 uit een financiering van het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (EFRO).

Alle menselijke bloedmonsters werden verkregen van gezonde vrijwilligers, en de toegepaste leukocyten verrijking protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissie van de Medische Faculteit van de Universiteit van Leipzig. De experimenten met ratten bloed werden goedgekeurd door de bevoegde lokale ethische commissie (Landesdirektion Sachsen, Referat 24), volgens de Duitse richtlijnen voor de verzorging van dieren en het gebruik. 1. Experimentele Setup OPMERKING: de hypotone lysis procedure voor de uitputting van erytrocyten uit de bloedmonsters een tijdkritische procedure bereiden alle benodigde apparatuur (bijvoorbeeld, buffers) voor dit deel van het protocol van tevoren. <ol><li> Label een 15 ml centrifugebuis voor hypotone lysis en een 1,5 ml monster buis voor de volgende aminofenyl fluoresceïne (APF) kleuring per bloedmonster. <ol><li> Als het leukocyten verrijking zal worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden, het uitvoeren van deze etikettering onder een stroomdoos. </li></ol></li><li> Bereid ongeveer 12 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 10 mM) per monster. Naargelang de leukocyten onder steriele omstandigheden worden geïsoleerd of neen, PBS hetzij door steriele oplossing bereid van een leverancier of door oplossen PBS tabletten in gedestilleerd water. Controleer de pH en, indien nodig, op pH 7,4 met behulp van kleine hoeveelheden 0,1 M HCl en NaOH oplossingen. <ol><li> Ontbinden PBS tabletten (zie tabel of Materials) in 200 ml gedestilleerd water aan een niet-steriele bufferoplossing voldoende krijgen ongeveer 16 monsters. Desgewenst steriliseren oplossing steriele filtratie. </li></ol></li><li> Bereid ongeveer 1 ml Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS), aangevuld met Ca2 + per monster. <ol><li> Los op 970 mg van HBSS zout in 100 ml (uiteindelijk volume) dubbel gedestilleerd water. Voor het vullen tot het eindvolume, controleer de pH en stel deze op pH 7,4. Door zijn lage buffercapaciteit, voorbereiding van deze buffer elke dag vers van eend de pH bijzonder zorgvuldig uitvoeren met kleine hoeveelheden van 0,1 M HCl en NaOH oplossingen. OPMERKING: Steriele oplossing kan worden gebruikt, afhankelijk van het experiment. De oplossing kan worden gesteriliseerd door steriele filtratie. </li></ol></li><li> Naast de twee buffers, label en stelt een buis (bijvoorbeeld 50 ml centrifugebuis) of kolf (bijvoorbeeld 250 ml maatbeker) met tweemaal gedestilleerd water voor hypotone lysis procedure vooraf. Bereid ongeveer 10 ml water per monster. </li><li> Bereid een container met crushed ijs voor de APF kleuring (deel 3), die wordt uitgevoerd op het ijs. </li><li> Aliquots van APF vooraf aan de snelle bereiding van werkoplossingen die tijdens de kleuring mogelijk (stap 3,2) en herhaaldelijk voorkomen invriezen en ontdooien van de APF oplossing. OPMERKING: APF wordt gewoonlijk verkregen als een 5 mg / ml (11,81 mmol) voorraadoplossing in methylacetaat. <ol><li> Freeze hoeveelheden van 10-100 pl in 0,5 ml buizen. Voor de APF kleuring een definitiefkleurstof concentratie van 10 uM gebruikt (stap 3,8). </li></ol></li></ol> 2. hypotone lysis van de erytrocyten OPMERKING: Voer de hypotone lysis stappen (met uitzondering van het centrifugeren stappen) onder een laminaire stroming bankje om besmetting te voorkomen. Voer de hele procedure bij kamertemperatuur. Aangezien de hypotone lysis is een tijdkritisch proces, pas de pipetten water (2 ml) en PBS (5 ml) toevoeging van tevoren en het water en PBS flacons openen voordat de procedure. Bewaar de PBS-oplossing en gedestilleerd water op kamertemperatuur voor gebruik. <ol><li> Uit elk bloedmonster overdracht 100 pi aan de juiste 15 ml centrifugebuis. Opmerking: In onze experimenten bloedmonsters bevatten gewoonlijk 10 U / ml heparine om stolling te voorkomen. Maar als gevolg van verschillende bronnen van het monstermateriaal de aard en concentratie van de anti-coagulant kunnen verschillen. De invloed op de APF kleuring moet worden getest door comparing de resultaten met de resultaten verkregen uit bloedmonsters aangevuld met andere soorten of concentraties van anti-coagulant. </li><li> Voeg 2 ml gedestilleerd water en meng de monsters met behulp van een vortex mixer ingesteld op een gemiddeld niveau. Incubeer de monsters gedurende 60 seconden, voeg dan 5 ml PBS per monster en meng met de vortex mixer. OPMERKING: Tot ongeveer 5 monsters worden bereid in parallel. Houd het monster volgorde hetzelfde voor de toevoeging van water en PBS om vergelijkbare incubatietijd te bereiken. </li><li> Na regeneratie van isotone omstandigheden door toevoeging PBS (stap 2,2) pellet resterende intacte cellen in alle monsters door centrifugatie gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur en 450 x g. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof door te gieten in een tabel afvalbak. Verwijder zoveel vloeistof als mogelijk door het omkeren van de centrifugebuis en de opening op een papieren handdoek te tikken. Controleer of de celpellet zo droog mogelijk. </li><li> Herhaal de hypotone lysis procedure zoals beschreven (stap 2,2). NOTE: In principe dit hypotonische lysis procedure (stappen 2,3-2,5) kan meermaals worden herhaald, afhankelijk van de zuiverheid van de gemengde leukocytfractie te verkrijgen. Na twee lysis stappen het aandeel overblijvende erytrocyten in de verkregen gemengde celfractie ongeveer 25%. </li><li> Pellet de resterende intacte cellen door centrifugatie gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur en 450 x g. Verwijder de bovenstaande vloeistof (zie stap 2.4). Voeg 500 ul HBSS de pellet voorzichtig los totdat een homogene oplossing wordt verkregen. Transfer elk monster aan de dienovereenkomstig gelabeld 1,5 ml monster buis. </li><li> Afhankelijk van het experiment analyseert meteen verkregen monsters (bijvoorbeeld via stroomcytometrie) 25, kleuring met fluorescentie gemerkte antilichamen (voor het identificeren van enkelvoudige celtypen) 32 incuberen met mobiele stimuli (voor celactivering experimenten) 33 of op ijs bewaard en gebruik later. Afhankelijk van het doel van het onderzoek, onmiddellijk Opeenvolgende experimentende gemengde leukocytfractie omdat granulocyten een vrij korte halfwaardetijd van ongeveer 20 uur. Opmerking: Dit geldt ook voor de peroxidase activiteit kleuring hieronder beschreven. </li></ol> 3. halogenerend Peroxidase activiteit kleuring OPMERKING: HOCl- en HOBr-productie door de bloed afgeleide heem peroxidasen MPO en EPO gekwantificeerd door APF, die wordt geoxideerd tot fluoresceïne door de genoemde hypohalous zuren. Dus als cel labeling met fluorescentie-gelabelde antilichamen wordt uitgevoerd in combinatie met APF vlekken, vermijd fluoroforen die interfereren met de emissie signaal van de fluoresceïne. <ol><li> Voer APF kleuring bij 4 ° C op ijs. </li><li> Voor het bereiden van een werkoplossing van APF dooi een geschikte hoeveelheid van de kleurstof (bijvoorbeeld 10 pl, 11,81 mM) en verdund met HBSS precies 1 mM (bijvoorbeeld voeg 108,1 ul buffer aan de 10 pl). <ol><li> Voor elk monster (500 pi cel-oplossing) voor te bereiden 5 μl van de beschreven APF werkoplossing. Dienovereenkomstig Gebruik een 10 pl aliquot van APF (11,81 mM), die resulteert 118,1 gl APF werkoplossing (1 mM) en ongeveer 20 monsters te bereiden. Door verlies tijdens pipetteren bereiden ongeveer 10% meer APF werkoplossing dan berekend. </li></ol></li><li> Om de specificiteit van de peroxidase kleuring APF controleren bereiden controlemonsters met heem peroxidase remmer 4-aminobenzoëzuur hydrazide (4-ABAH) 35. <ol><li> Bereid een 1 M voorraadoplossing van 4-ABAH (151,17 g / mol) in dimethylsulfoxide (DMSO) door verdunning van 75,6 mg 4-ABAH in 500 pi oplosmiddel. Verder verdunnen 4-ABAH 1/10 in HBSS. </li></ol></li><li> Voor de bereiding van een H 2 O 2 werkoplossing label twee 1,5 ml centrifugeren buizen met &quot;70 mM H 2 O 2&quot; en &quot;7 mM H 2 O 2&quot;, respectievelijk. <ol><li> In de buis met het label &quot;70 mM H 2 O 2&quot;, vers verdund 10 glvan een 30% voorraadoplossing (8,8 mM) H 2 O 2 via 990 gl gedestilleerd water tot een concentratie van ongeveer 88 mM te verkrijgen. Bewaar op ijs en te gebruiken binnen 4 uur. OPMERKING: H 2 O 2 wordt gewoonlijk geleverd als een 30% voorraadoplossing door de leveranciers. Indien bewaard bij 4 ° C, is stabiel gedurende ongeveer 3 jaar. Voer verdunningen van H 2 O 2 in gedestilleerd water om ontleding te voorkomen. H 2 O 2 verdunningen kunnen ook worden bereid in 0,1 M NaOH-oplossing. </li><li> Voor de bepaling van de exacte H 2 O 2 concentratie bereiden nog 1 tot 10 verdunning van de eerste H 2 O 2 voorraadoplossing (ongeveer 88 mM) door toevoeging van 100 ul van deze oplossing tot 900 ul gedistilleerd water in 1,5 ml buis gelabeld &quot;7 mM H 2 O 2&quot;. </li><li> Neem een spectrum in het nabije UV bereik (200-300 nm) met behulp van een UV-Vis fotospectrometer en gebruik de absorptie bij 240 nm (49; 240 = 34 M -1 cm -1) om te bepalen van de werkelijke H 2 O 2-concentratie in de tweede H 2 O 2 stockoplossing 34. Zorg ervoor dat de referentiecuvet bevat alleen gedestilleerd water. Voor de meting gebruik kwarts cuvetten een spectrum in het UV-gebied wordt opgenomen. </li><li> Uit dit resultaat berekent de exacte concentratie van zowel H 2 O 2 voorraadoplossingen. Dient de concentratie van de eerste voorraadoplossing in de &quot;70 mM H 2 O 2&quot; monsterbuisje exact 70 mM door toevoeging van een geschikte hoeveelheid gedestilleerd water. Bewaar de verkregen werkoplossing op ijs en binnen een uur. </li></ol></li><li> Voeg 5 ul van de 4-ABAH werkoplossing (100 mM) aan de geschikte monsters voor een uiteindelijke concentratie van 1 mM. Incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij 37 ° C in de incubator voor APF toevoeging. </li><li> Voeg 5 ul APF werkoplossing (1 mM) aan elk500 pl monster tot een uiteindelijke kleurstof concentratie van 10 urn. Meng de monsters voorzichtig (bijvoorbeeld met behulp van de vortex mixer met matige) en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C. </li><li> Voeg 5 ul H 2 O 2 werkoplossing (70 mM) aan elk 500 pl monster voor een eindconcentratie van 700 uM. Meng de monsters en incubeer ze gedurende 60 minuten bij 37 ° C. Voer geschikte controlemetingen in parallel. OPMERKING: Controle toonden aan dat 700 uM H 2 O 2 zijn niet toxisch voor de cellen. Ook werden geen significante cellulaire reacties waargenomen. OPMERKING: De APF kleuring kan ook worden uitgevoerd door het weglaten van het toevoegen van H 2 O 2, afhankelijk van de wetenschappelijke vraag. Aangezien waterstofperoxide alleen de basale chloreringsmiddel MPO en EPO activiteit wordt bepaald terwijl de toevoeging van H 2 O 2 maakt detectie mogelijk van de maximale HOCl en HOBr productie door de cellen. Thij laatste betekent een aanzienlijk hoger fluorescentiesignaal. </li><li> Voor pelleteren van de cellen gecentrifugeerd met monsters gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en 400 x g. Reinig het supernatans verwijderen zonder de pellet te vernietigen en voeg 250 ul HBSS om de cellen te resuspenderen. Opmerking: De monsters zijn nu klaar voor analyse via flowcytometrie 25. </li><li> Bewaar de monsters in het donker totdat analyse bleken te voorkomen. Na excitatie bij 480-490 nm detecteren emissie van fluoresceïne bij ongeveer 525 nm 37. </li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Als neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in menselijk bloed de isolatie van peroxidase-positieve cellen vaak alleen gericht op deze cellen en omvat een scheiding van neutrofielen uit andere leukocyten door dichtheidsgradiënt centrifugatie 38. Nog neutrofielen veel minder overvloedig in muizen 39 bloedmonsters voor deze ingewikkelder methoden worden gebruikt 40. Bovendien beide methoden leiden tot de verwijdering van peroxidase-positieve monocyten uit de monsters en vanwege d...

Polymorfonucleaire leukocyten (PMN&#39;s, ook wel granulocyten) en monocyten vormen belangrijke cellulaire componenten van het aangeboren immuunsysteem in het bloed 1,2. Zij bijdragen aan de primaire afweer tegen ziekteverwekkers alsook de activering van het verworven immuunsysteem en het initiëren van een systemische ontstekingsreactie 2-4. Maar vooral neutrofielen, de meest voorkomende vorm van granulocyten en monocyten ook aanzienlijk bijdragen tot de regulering en de beëindiging van acute ontstekingen gebeurtenissen 5. Daarom zijn deze cellen kunnen ook een belangrijke rol bij chronische ontstekingsziekten zoals reumatoïde artritis 6,7 spelen. In feite, astma, een pathologie wordt gekenmerkt door een verminderde apoptose van eosinofielen, de tweede soort granulocyten in het bloed 8. Toch is de apoptose van granulocyten en hun snelle verwijdering door macrofagen zijn twee essentiële stappen tijdens de cellulaire beëindiging9-11 van ontsteking. In de genoemde immuuncellen twee nauw verwante enzymen, namelijk myeloperoxidase (MPO, neutrofielen en monocyten) en eosinofiel peroxidase (EPO, eosinofielen) kan worden gevonden 12,13. Deze heem peroxidasen zijn klassiek gerelateerd aan de humorale immuunrespons mocht twee elektronisch oxideren (pseudo-) halogeniden in de overeenkomstige hypo (pseudo) halous zuren die bekend staan ​​om hun bactericide 14-16. Onder fysiologische omstandigheden MPO voornamelijk vormen hypochloorzuur (HOCl) en hypothiocyaniet (- OSCN) terwijl de laatste en onderbromig acid (HOBr) gevormd door EPO 17-19. Nieuwe resultaten suggereren dat de (pseudo-) halogeneringsmiddel enzymactiviteit kan bijdragen aan de regulering van ontstekingsreacties en de beëindiging van immuunreacties 20,21. In feite is de productie van HOCl MPO en afgeleide producten werden naar T-cellen gebaseerde adaptieve immuunreacties onderdrukken 22-24. Om meer inzicht in de immunologische rol leukocyten profiteren van het aangeboren immuunsysteem bij chronische ontstekingsziekten en het bepalen van de bijdrage van MPO en EPO deze fysiologische functie hebben we een methode om snel te verrijken leukocyten uit kleine bloedmonsters voor een volgende specifieke bepaling van het halogeneringsmiddel peroxidase activiteit in deze cellen. Voor erytrocyt depletie kozen we een gestandaardiseerde werkwijze omvattende twee opeenvolgende hypotone lysis stappen met gedestilleerd water, wat leidt tot een snelle leukocyten verrijking tegen lage materiaalkosten. Voor de volgende bepaling van de halogenerend MPO en EPO activiteit van de HOCl- en HOBr specifieke kleurstof aminofenyl fluoresceïne (APF) werd gebruikt 25-27. In tegenstelling tot de toepassing van niet-specifieke peroxidase kleuringen 28,29, deze benadering de selectieve detectie van het halogeneringsmiddel peroxidase activiteit, die vaak ernstig is aangetast inflammation 30,31.

<table><tbody><tr><td>Materials/Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifugeerbuisjes</td><td>VWR/Corning</td><td>734-0451</td><td>-</td></tr><tr><td>1,5 ml monsterbuisjes</td><td>VWR/Eppendorf</td><td>211-2130DE</td><td>-</td></tr><tr><td>Pipetten voor volumes tot 5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>bijv., 3120000070</td><td>We gebruiken Eppendorf Resarch plus pipetten met instelbare volumes in het bereik van 1-10 &micro;l, 10-100 &micro;l, 100-1.000 &micro;l en 500-5.000 &micro;l</td></tr><tr><td>laminar flow bench</td><td>Thermo Electron Corperation</td><td>HeraSafe</td><td>-</td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Bender &amp; Hobein AG</td><td>Vortex Genie 2</td><td>-</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Kendro Laboratory Products</td><td>Laborfuge 400R</td><td>De centrifuge moet op 450 x g kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Kleine centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td>De centrifuge moet op 400 x g kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Heraeus</td><td>cytoperm 2</td><td>Instellingen: 37 &deg;C, 95% vochtigheid, 5% CO2 inhoud</td></tr><tr><td>UV-Vis spectrofotometer</td><td>Varian</td><td>Cary 50 bio</td><td>Er moet een spectrum tussen 200 en 300 nm worden geregistreerd. Daarom moeten kwarts cuvettes worden gebruikt</td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>Becton, Dickinson</td><td>BD Facs Calibur</td><td>Elke flow cytometer kan worden gebruikt die is uitgerust met een laser die geschikt is voor de excitatie van fluoresceïne (bijv., 488 nm argonlaser)</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Chemicaliën</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>amresco</td><td>K812</td><td>steriele oplossing, klaar voor gebruik</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>tabletten voor oplossing in 200 ml millipore water</td></tr><tr><td>Hanks balanced salt solution (HBSS) met Ca2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1387</td><td>970 mg/100 ml, controleer en pas de pH-waarde zorgvuldig aan tot 7,4</td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Merck Millipore</td><td>1.09057.1000</td><td>1 M oplossing</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Riedel-deHa&euml;n</td><td>30620</td><td>Vaste pellets. Voor een 1 M oplossing, los 4 g/100 ml Millipore water op</td></tr><tr><td>Aminofenylfluoresceine</td><td>Cayman</td><td>10157</td><td>5 mg/ml oplossing (11,81 mM) in methylacetaat, aliquots (bijv. 100 &micro;l) moeten worden bereid en op -20 &deg;C worden bewaard</td></tr><tr><td>Waterstofperoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>Deze 30% stamoplossing komt overeen met een concentratie van ongeveer 8,8 M. Verdere verdunning moet direct voor gebruik vers worden bereid in gedestilleerd water en gekwantificeerd door absorptiemetingen</td></tr><tr><td>4-aminobenzoëzuurhydrazide (4-ABAH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A41909</td><td>Een eerste stamoplossing van 1 M moet worden bereid in DMSO, een tweede van 100 mM door 1:10 verdunning in HBSS</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR chemicals</td><td>23500.26</td><td>-</td></tr></tbody></table>

snelle en specifieke beoordeling van de halogenerend peroxidase activiteit in leukocyten verrijkte bloedmonsters

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

In dit artikel een protocol voor de snelle en gestandaardiseerde verrijking van leukocyten uit kleine hele bloedmonsters wordt beschreven. Deze procedure is gebaseerd op de hypotonische lysis van erytrocyten en kan worden toegepast op menselijke monsters en bloed van niet-menselijke oorsprong. De aanvankelijke kleine monstervolume van ongeveer 50 tot 100 gl maakt deze methode van toepassing op periodieke bloedmonsters van kleine proefdieren. Bovendien is leukocyten verrijking bereikt binnen enkele minuten en met een laag materiaal inspanningen ten aanzien van chemische stoffen en instrumentatie, het maken van deze methode niet van toepassing in meerdere laboratorium omgevingen. Gestandaardiseerde zuivering van leukocyten wordt gecombineerd met een zeer selectieve kleuring methode halogeneringsmiddel peroxidase activiteit van het heem peroxidasen evalueren, myeloperoxidase (MPO) en eosinofiel peroxidase (EPO), dat wil zeggen de vorming van hypochloorzuur en onderbromig zuur (HOCl en HOBr). Terwijl MPO is sterk uitgedrukt in neutrophils, het meest voorkomende celtype immuunsysteem in menselijk bloed als in monocyten, de bijbehorende enzym EPO uitsluitend tot expressie gebracht in eosinofielen. Halogeneringsmiddel activiteit van deze enzymen wordt behandeld met het bijna HOCl- en HOBr specifieke kleurstof aminofenyl fluoresceïne (APF) en de primaire peroxidase substraat waterstofperoxide. Bij daaropvolgende flowcytometrieanalyse alle peroxidase-positieve cellen (neutrofielen, monocyten, eosinofielen) zijn onderscheiden en hun halogenerend peroxidase activiteit kan worden gekwantificeerd. Aangezien APF kleuring kan worden gecombineerd met de toepassing van celoppervlak markers, kan dit protocol worden uitgebreid om meer bepaald leukocyt subfracties. De methode is toepasbaar op te sporen HOCl en HOBr productie zowel in de mens en in knaagdieren leukocyten. Gezien het wijd en divers besproken immunologische rol van deze enzymatische produkten chronische ontstekingsziekten kan dit protocol bijdragen aan een beter begrip van deimmunologische relevantie van leukocyt afgeleide heem peroxidasen.

Zoals eerder gemeld de bovenbeschreven werkwijze bleek toepassing zowel menselijke en niet-menselijke materiaal 32. Bovendien zoals getoond voor muizen met astmatische symptomen kunnen de APF kleuring een geschikt instrument om verschillen in de systemische pro-inflammatoire toestand detecteren. Daarom wordt in een volgende studie we dit protocol dat wordt gebruikt om herhaaldelijk te evalueren de halogenerend activiteit van MPO (en EPO) in vrouwelijke Dark Agouti rat...

Dit protocol beschrijft de snelle verrijking van leukocyten uit kleine bloedmonsters voor een daaropvolgende specifieke bepaling van de halogenerende peroxidase-activiteit binnen de cellen. De methode kan worden toegepast op menselijk en niet-menselijk materiaal en kan bijdragen aan de evaluatie van nieuwe ontstekingsmarkers.

Snelle en specifieke beoordeling van de halogenerend Peroxidase activiteit in leukocyten verrijkte bloedmonsters

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

Het algemene doel van deze methode voor erytrocytendepletie is om een snelle en eenvoudige leukocytenverrijking uit een kleine bloedstalen te bewerkstelligen. Veel voordelen van deze techniek zijn dat deze goedkoop, betrouwbaar en snel is. Bovendien kan het worden toegepast op zowel menselijke als niet-menselijke bloedstalen.Stel vóór aanvang van de lysiprocedure de pipet voor het toevoegen van water in op twee milliliters en de pipet voor PBS op vijf milliliters. Plaats vervolgens open kolven met water en PBS onder een laminaire flow-kap bij kamertemperatuur. Aangezien de hypotone lyse een tijdskritisch proces is, dient alles vooraf te zijn voorbereid.Bovendien moet de lysisprocedure altijd op dezelfde wijze worden uitgevoerd om compatibele resultaten te verkrijgen. Draag vervolgens 100 µL van elk bloedmonster over naar een conische buis van 15 mL. Voeg twee milliliter gedestilleerd water aan elk monster toe met vortexen op de middelste stand.Laat de cellen 60 seconden rusten en voeg vervolgens vijf milliliter PBS toe. Meng de monsters door te vortexen. Verzamel nu de cellen door middel van centrifugatie en schenk de supernatanten af.Keer de buisjes om en tik de openingen tegen een papieren handdoek om zoveel mogelijk vloeistof te verwijderen. Herhaal vervolgens de procedure voor hypotone lysis zoals zojuist gedemonstreerd. Nadat er voor de tweede keer een droge pellet is verkregen, wordt elk monster opnieuw opgelost in 500 microliters HBSS, totdat een homogene oplossing is verkregen.Breng de cellen vervolgens over naar 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes op ijs. Om de peroxidase-specificiteit van de monsters na aminofenolfluoresceïne- (APF-) kleuring te controleren, voegt u eerst vijf microliters van de heme-peroxidase-remmer 4-ABAH toe aan de betreffende monsters voor een incubatie van 15 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg daarna vijf microliters APF-werkoplossing toe aan elke buis en vortex de cellen voorzichtig op de gemiddelde stand.Incubeer alle monsters 30 minuten bij 37 °C. Voeg vervolgens 5 µL waterstofperoxide-werkoplossing toe aan elk monster en vortex de buisjes voorzichtig. Centrifugeer de cellen na 60 minuten bij 37 °C en verwijder voorzichtig het supernatant zonder de pellets te verstoren.Resuspendeer tot slot de cellen in 250 µL HBSS en bewaar de monsters in het donker tot aan de analyse om fotobleking te voorkomen. Hier wordt een representatief voorbeeld getoond van de leukocytpopulaties na hypotone lyse en APF-kleuring zoals zojuist gedemonstreerd. Door de celgrootte tegenover de granulariteit uit te zetten, kan de robuuste uitputting van de erytrocyten worden waargenomen, waarbij de populatie rode bloedcellen en debris slechts 22% van de events uitmaakt.Verder maakt de intensiteitsverdeling van de APF-afgeleide fluorescentie een duidelijk onderscheid mogelijk tussen de peroxidase-negatieve erytrocyten en lymfocyten, waarbij een matige APF-oxidatie wordt waargenomen voor de peroxidase-positieve monocyten en eosinofielen, en een sterke peroxidase-oxidatie wordt vertoond door de neutrofielen. Eenmaal beheerst kan deze techniek, mits correct uitgevoerd, parallel worden toegepast op maximaal 50 bloedmonsters. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals antilichaamkleuring, worden uitgevoerd om de relevante celondergroepen te identificeren.Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van studies bij kleine dieren om de rol van de halogeneringsactiviteit van MPO en EPO te onderzoeken in diermodellen voor chronische inflammatoire ziekten.

fast-specific-assessment-halogenating-peroxidase-activity-leukocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een methode wordt beschreven om biochemische markers van neonatale hypoxie-ischemie te meten. De aanpak maakt gebruik van hoge druk vloeistofchromatografie (HPLC) en gaschromatografie-massaspectrometrie (GC / MS).

Biochemische Meting van Neonatale Hypoxie

Source:Jing Li1, Jaehyung Cho2,31MBL International Corporation, Des Plaines.2Division of Hematology, Department of Medicine, Washington University School of Medicine.3Department of Pathology and Immunology, Washington University School of Medicine.This video demonstrates a degranulation assay of azurophilic granules in mouse neutrophils, involving the stimulation of neutrophils to release myeloperoxidase-containing azurophilic granules. The subsequent enzymatic reaction is employed to quantify...

An Assay to Monitor Degranulation of Azurophilic Granules in Neutrophils following Activation

We aangepast een reeks protocollen voor de meting van reactive oxygen species (ROS) die in verschillende amoebe en zoogdieren cellulaire modellen kan worden toegepast voor de kwalitatieve en kwantitatieve studies.

Opsporen, visualiseren en kwantificeren van de Generatie van reactive oxygen species in een Amoeba Model Systeem

Bloed leukocyten en bloedplaatjes kunnen worden gebruikt als een marker van algemene bio-energetische gezondheid van een individu en dus de potentie om pathologische processen en het effect van behandeling te controleren. Hier beschrijven we een werkwijze voor het isoleren en meten mitochondriale functie en de oxidatieve uitbarsting in deze cellen.

Bio-energetica en de oxidatieve Burst: Protocollen voor de Isolatie en evaluatie van menselijke leukocyten en bloedplaatjes

Hier beschrijven we een fluorimetrische cel-vrije biochemische bepaling voor bepaling van de HDL-lipide peroxidatie. Deze snelle en reproduceerbare kwantitatieve analyse kan worden gebruikt om te bepalen van HDL functie in grootschalige studies en kan bijdragen aan ons begrip van HDL functie in ziekten bij de mens.

Cel-vrije biochemische fluorimetrische enzymatische Assay voor High-throughput meting van lipide peroxidatie in High Density lipoproteïne

Dit manuscript beschrijft het gebruik van genetisch-gecodeerde fluorogenic verslaggevers in een toepassing voor live-cel imaging voor de behandeling van xenobioticum-geïnduceerde oxidatieve stress. Deze experimentele aanpak biedt ongeëvenaarde Spatio resolutie, gevoeligheid en specificiteit terwijl het vermijden van veel van de tekortkomingen van conventionele methoden voor de detectie van toxicologische oxidatieve stress.

Imaging benaderingen van evaluaties van toxicologische oxidatieve Stress met behulp van genetisch-gecodeerde Fluorogenic sensoren

Dit artikel presenteert een economisch en efficiënt protocol voor het onderzoeken van peroxidase-positieve leukocyten in sperma. Met behulp van een computerondersteund sperma-analysesysteem (CASA) kan de concentratie van peroxidase-positieve leukocyten in sperma binnen een totaal van 60 minuten worden verkregen, waardoor de efficiëntie van andrologielaboratoria en andrologen effectief wordt verbeterd.

Het onderzoek van peroxidase-positieve leukocyten in sperma

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode om intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te kwantificeren met behulp van dihydroethidium (DHE) als fluorescentiekleurstofsonde met behulp van een high-throughput screeningbenadering. Het protocol beschrijft de methoden voor kwantitatieve beoordeling van intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de drie verschillende hepatocellulaire carcinoomcellijnen.

High Throughput Screening Assessment van het genereren van reactieve zuurstofsoorten (ROS) met behulp van dihydroethidium (DHE) fluorescentiekleurstof

Kwantificering van zowel geoxideerde als gereduceerde vormen van glutathion (respectievelijk GSSG en GSH) is bereikt door het gebruik van orthoftalaldehyde (OPA). OPA wordt sterk fluorescerend zodra het is geconjugeerd met GSH, maar kan GSSG niet conjugeren totdat het is verminderd. Hier beschrijven we een multiparametrische test om beide te kwantificeren met behulp van eiwitkwantificering voor normalisatie.

Snelle kwantificering van geoxideerde en gereduceerde vormen van glutathion met behulp van orthoftalaldehyde in gekweekte zoogdiercellen in vitro

De vorming van superoxide-anionen is essentieel voor de stimulatie van bloedplaatjes en, indien ontregeld, van cruciaal belang voor trombotische aandoeningen. Hier presenteren we drie protocollen voor de selectieve detectie van superoxide-anionen en de studie van redox-afhankelijke bloedplaatjesregulatie.

Alternatieve methoden voor de detectie van superoxide-anionvorming in bloedplaatjes 

Leer een snelle methode voor leukocytenverrijking uit kleine bloedmonsters om halogenerende peroxidase-activiteit te beoordelen. Deze techniek is kosteneffectief en betrouwbaar voor menselijke en niet-menselijke samples.

Snelle en specifieke beoordeling van de halogenerend Peroxidase activiteit in leukocyten verrijkte bloedmonsters

Meer video's verkennen