Name: Rapid One-step enzymatische synthese en All-waterige Zuivering van Trehalose analogen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Leer een snelle enzymatische methode voor de synthese en zuivering van trehalose-analogen. Deze efficiënte techniek biedt toepassingen in de detectie van mycobacteriën en tuberculoseonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van de National Institutes of Health (R15 AI117670) aan B.M.S en P.J.W, evenals een Cottrell College Scholar Award van de Research Corporation (20185) aan P.J.W. L.M.M. werd ondersteund door een Provost's Fellowship van CMU.

1. Expressie en zuivering van Tret van Top10 E. coli LET OP: Neem contact op met de auteurs van de Tret-uiting van E. coli-stam te vragen (pBAD Tret plasmide, met daarin de T. tenax tret gen onder de controle van de AraC proteïne, getransformeerd in Top10 E. coli 19) en de bijbehorende materiaal overeenkomst tot overdracht . Het volgende protocol geeft kenmerkend een eiwit opbrengst van ongeveer 4 mg / l. <ol><li> Bereid een 3 ml overnacht cultuur van Tret expressie E. coli. <ol><li> Streak Top10 E. coli getransformeerd met pBAD-Tret expressievector op lysogenie bouillon (LB) agar plaat bevattende 100 ug / ml ampicilline. </li><li> Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende ongeveer 48 uur. </li><li> Kies een enkele kolonie van de plaat en enten 3 ml vloeibaar LB-medium dat 100 ug / ml ampicilline in een kweekbuis. </li><li> Plaats de buis in een schudincubator bij 37 &amp; #176; C x 175 rpm &#39;s nachts. </li></ol></li><li> Induceren eiwitexpressie in Tret expressie brengende E. coli. <ol><li> 750 ml Terrific Broth toe gesupplementeerd met 100 ug / ml ampicilline om een ​​2800 mL Fernbach kolf. Breng 1 ml kweekvloeistof uit de kolf naar een cuvet voor later gebruik als blanco. </li><li> Voeg de 3 ml overnacht cultuur gegenereerd in stap 1.1.4 om de cultuur kolf, en zet de kolf in een incubator en schud bij 37 ° C x 200 rpm. Controleer regelmatig de absorptie van de cultuur bij 600 nm ten opzichte van de verzamelde stap 1.2.1 leeg. </li><li> Zodra de absorptie bij 600 nm 0,5-1,0 bereikt tussen induceren Tret expressie door toevoeging van 750 gl 1 M oplossing arabinose (1 mM eindconcentratie) aan de kweek. Breng de kolf in de incubator en schud de nacht bij 37 ° C x 200 rpm. </li></ol></li><li> Pellet en lyseren de Tret expressie E. coli-cellen. <ol><li> Breng de cultuur tot een polypropyleen bottle en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 4000 xg bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 15 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Breng de celsuspensie om een ​​50 ml conische buis en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 4000 xg bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en doorgaat naar een lysis (stap 1.3.4) cel of bewaar de pellet onbepaalde tijd bij -80 ° C. </li><li> Los 1 proteaseremmer mini-tablet in 20 ml wasbuffer (50 mM NaH 2PO 4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazool, pH 8,0) in een 50 ml conische buis. </li><li> Breng de protease-inhibitor bevattende wasbuffer het conische buis met de pellet. Vortex totdat de pellet wordt geresuspendeerd. </li><li> Transfer-geresuspendeerde cellen aan een 100 ml bekerglas en lyseren de cellen door sonicatie (pulssequentie van 45 seconden aan en 45 seconden met een looptijd van 2 minuten en 15 seconden bij een amplitude van 75 procent). </li><li> Transfer het lysaat om een ​​50 ml metalen conische buisen centrifugeer gedurende 60 minuten bij 15.000 xg bij 4 ° C. </li><li> Verduidelijking van het lysaat door doorgang door een 0,2-0,45 urn spuitfilter in een 50 ml conische buis. OPMERKING: De typische concentratie lysaat verkregen 100 mg / ml. </li></ol></li><li> Zuiver Tret uit E. coli cellysaat via snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC). <ol><li> Stel de FPLC met een nikkel-affiniteitskolom (5 ml bed volume). Was de kolom met 10 ml gedeïoniseerd water of totdat de kolom vrij van verontreinigingen. Equilibreren van de kolom met 20 ml wasbuffer (50 mM NaH 2PO 4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazool, pH 8,0) bij een stroomsnelheid van 1 ml / minuut. </li><li> Laad het lysaat (20 ml) verkregen uit stap 1.3.8 op de kolom en elueer ongemerkte eiwitten met wasbuffer met een stroomsnelheid van 1 ml / min, totdat de absorptie achtergrondniveaus bereikt (typisch 80-100 ml wasbuffer vereist) . </li><li> Elueren His-tag Tret door een lineaire gradient elutiebuffer (50 mM NaH 2PO 4, 500 mM NaCl, 250 mM imidazool, pH 8,0) van 1-100% in 60 minuten bij een stroomsnelheid van 1 ml / minuut. Verzamel 4 ml fracties totdat Tret is uitgewassen en de absorptie basisniveau bereikt. OPMERKING: Gewoonlijk 60 ml elutiebuffer nodig om het eiwit te elueren en het eiwit elueerde in het 60-100% bereik elutiebuffer. Ongeveer 10-15 ml zuiver Tret in elutiebuffer worden verkregen. </li><li> Bepaal de concentratie van Tret door meting van absorptie bij 280 nm tegen een blanco elutiebuffer. </li></ol></li><li> Exchange Tret in tris (hydroxymethyl) aminomethaan (Tris) buffer door middel van dialyse. <ol><li> Na bereiding van de dialyseslang volgens de instructies van de fabrikant, eerste door spoelen met gedeïoniseerd water en vervolgens Tris buffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0). </li><li> Laad de Tret monster in de dialyse slang met behulp van een injectiespuit en stompe naald. Dialyseren &#39;s nachts eengainst 2 L Tris-buffer. </li><li> Bepaal de concentratie van Tret door meting van absorptie bij 280 nm tegen een blanco vanuit het dialyse wassen. </li><li> Breng de oplossing Tret een 50 mL conische buis en ga verder met trehalose analoge synthese (stap 2) of bewaar het enzym bij 4 ° C. LET OP: Tret is een thermostabiel eiwit. De Tret werd opgeslagen in Tris-buffer bij 4 ° C gedurende enkele maanden zonder inachtneming significant activiteitsverlies. </li></ol></li></ol> 2. Een stap Synthese van Trehalose analogen gebruik van Tret Enzyme OPMERKING: De onderstaande protocol beschrijft een reactieschaal basis van 4 ml volume, dat ongeveer 15-30 mg trehalose analoog kan leveren afhankelijk reactierendement en het molecuulgewicht van het product. De reactiecomponenten kunnen worden geschaald op min of meer analoge trehalose te verkrijgen indien gewenst. <ol><li> Voeg glucose-analogon (0,080 mmol, massa zal afhangen van het molecuulgewicht), UDP-glucose (0.160 mmol, 97,6 mg) en MgCl2 (0,080 mmol, 16,3 mg) teneinde een 15 ml conische buis. De uiteindelijke concentraties van deze componenten zal 20 mM, 40 mM en 20 mM, respectievelijk. </li><li> Voeg Tret in Tris buffer (verkregen uit stap 1.5.4) en eventueel een geschikt volume Tris-buffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0) tot een uiteindelijke enzymconcentratie van 300 ug / ml en een uiteindelijk bereiken volume van 4 ml. Pipet het mengsel op en neer voorzichtig of omkeren van de buis om de vaste stoffen op te lossen. </li><li> Incubeer de reactie bij 70 ° C onder schudden bij 300 rpm gedurende 1 uur en zet de buis op ijs te koelen. </li></ol> 3. Zuivering van trehalose analogen van ruwe enzymatische reactie Mengsel <ol><li> Voorspoelen een centrifugale filtereenheid (nominaal molecuulgewicht grens (NWML) 10 kDa) om sporen glycerol te verwijderen uit het membraan door het toevoegen van 3 ml gedeïoniseerd water om de centrifugale filtereenheid en centrifugeren bij 3000 xg tot alle vloeistof door het filterin de buis (ongeveer 20 min). Herhaal nog tweemaal. Vul deze stap onmiddellijk vóór of tijdens de reactie (stap 2,3). </li><li> Na afkoelen van het enzymatische reactiemengsel (verkregen bij stap 2,3), mogelijk in de pre-gespoeld centrifugale filtereenheid. Spoel de reactiebuis met 1 mL gedeïoniseerd water en breng de centrifugale filtereenheid. Herhaal spoelen van de reactiebuis voor maximale terugwinning van product. </li><li> Centrifugeer de centrifugale filtereenheid bij 3000 xg tot alle vloeistof door het filter in de buis (ongeveer 20 min). Spoel de bovenste kamer van de centrifugale filtereenheid met 3 ml gedeïoniseerd water en centrifugeer bij 3000 xg tot alle vloeistof door het filter in de buis (ongeveer 20 min). Herhaal het spoelen voor een maximale herstel van het product. </li><li> Gooi de bovenste kamer van de centrifugale filter unit. Add gemengd bed ionen-uitwisselingshars (3 g) aan het filtraat op de bodem van de buis (typische filtraat volUme is 8-15 ml, afhankelijk van het aantal spoelingen). Roer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met een magnetische roerstaaf met een snelheid die voldoende is om de harskorrels gesuspendeerd in de oplossing te houden. </li><li> Decanteer het supernatant en filteren om de hars te verwijderen. Voeg 5 ml gedeïoniseerd water om de resterende hars te spoelen. Decanteer het supernatant en filteren, te combineren met de productoplossing uit het eerste decantatie. Herhaal spoelen van de hars voor maximale terugwinning van product. </li><li> Analyseer de reactie door dunne laagchromatografie (TLC) of HPLC te bepalen of volledige omzetting van de glucose-analoog uitgangsmateriaal trehalose analoge product werd verkregen. Zie stap 4.1 voor TLC-analyse en stap 4.2 voor HPLC-analyse. </li><li> Verwijderen water door vriesdrogen of rotatieverdamping het gedroogde product. Indien geen ongereageerde glucose analoge tijdens TLC of HPLC-analyse werd waargenomen, zuivering door chromatografie onnodig. Weeg het product aan het reactiemengsel verkrijgen yield en voert kernmagnetische resonantie (NMR) spectroscopische analyse (stap 4,3) aan productstructuur en zuiverheid bevestigt. </li><li> Als ongereageerde glucose analoge tijdens TLC-analyse werd waargenomen, scheiden van de trehalose analoge toepassing van een gelfiltratiekolom. <ol><li> Bereid een 1 x 100 cm kolom met gedeïoniseerd water verzadigde, extra fijne P2 polyacrylamide korrelgrootte uitsluitingsmedia volgens de instructies van de fabrikant. LET OP: De grootte exclusie kolom kan worden hergebruikt na het wassen met gedemineraliseerd water. </li><li> Opnieuw oplossen van het gedroogde enzymreactie product (verkregen uit stap 3.7) in 0,5 ml gedeïoniseerd water. Breng de productoplossing de gelfiltratiekolom handmatig of met behulp van een kolom flowadaptor. Spoel het flesje dat het ruwe product met een andere 0,5 ml gedeïoniseerd water bevatte en laden in de gelfiltratiekolom. </li><li> Elueer product met gedeïoniseerd water door zwaartekracht en laat fracties van ongeveer 2 mL volume. </li><li> Analyseer de fracties volgens TLC (stap 4,1). Verzamel de fracties die zuiver trehalose analoog. </li><li> Verwijderen water door vriesdrogen of rotatieverdamping het gedroogde product. Weeg het product om de reactie opbrengst en ga verder met NMR analyse (zie stap 4,3). </li></ol></li></ol> 4. Analyse van Trehalose Analoog Producten <ol><li> Analyse uitvoeren dunnelaagchromatografie (TLC) van Tret reactie. Opmerking: Deze procedure kan ook worden gebruikt om gelfiltratiekolom fracties te analyseren. Het kan noodzakelijk zijn het reactiemengsel of kolomfracties vóór TLC analyse verbinding kleuring mbt de TLC-plaat te concentreren. <ol><li> Mark lanen op de TLC plaat met een potlood en analyt (en) en relevante norm (en) bij de daarvoor bestemde rijstroken, waaronder glucose analoge standaard, de trehalose analoge standaard (indien aanwezig), het reactiemengsel (of fracties verzameld size exclusion kolomzuivering), en een co-spot. Na het opbrengen elk monster op de TLC-plaat, zodat de plaat drogen. OPMERKING: Bij reactie analyse wordt kenmerkend 2 pl monster op DLC plaat. </li><li> Ontwikkel het TLC-plaat met behulp van n-butanol / ethanol / gedemineraliseerd water (5: 3: 2). </li><li> Droog de ontwikkelde TLC-plaat, dip dan 5% in H 2 SO 4 in ethanol (suiker kleuring) en verwarm op een hete plaat op de hoogste stand totdat suikerhoudende plekken kunnen worden gevisualiseerd (gewoonlijk 5 min). </li></ol></li><li> Voer een HPLC analyse van Tret reactiemengsels met behulp van een HPLC-systeem kan scheiden en detecteren van koolhydraten. Dit protocol gaat koolhydraten scheiding met behulp van een aminopropyl HPLC-kolom en detectie met behulp van brekingsindex. <ol><li> Attach aminopropyl kolom (4,6 x 250 mm) met een voorgevulde guard kolom aan de HPLC. </li><li> Equilibreren aminopropyl kolom met 80% acetonitril in gedeioniseerd water met een stroomsnelheid van 0,4ml / min. </li><li> Laad de oplossing van reactieproduct (of standaard) op de kolom aminopropyl. </li><li> Elueer het product (of standaard) met 80% acetonitril in gedeïoniseerd water met een stroomsnelheid van 0,4 ml / min en een kolomtemperatuur van 50 ° C. Typisch, de looptijd gebruikt is 40 min. OPMERKING: Zowel de glucose analoge uitgangsmateriaal en het trehalose analoge product kan worden gedetecteerd door brekingsindex, hoewel andere werkwijzen zoals verdampings- lichtverstrooiingsdetectie (ELSD) worden gebruikt. Met de beschreven omstandigheden, glucose analogen typisch elueren tussen 10-15 min en trehalose analogen elueren tussen 15-25 min. </li></ol></li><li> NMR-analyse van gezuiverd trehalose analogen. <ol><li> Ontbinden gezuiverd trehalose in analoog D 2 O (700 ui) en breng de oplossing een NMR buis. </li><li> Verwerven 1 H en 13C NMR spectra overeenkomstig passende NMR faciliteit protocollen. </li></ol></li></ol><ol><li> Synthetiseren, zuiveren, en te beheren 6-TreAz M. smegmatis (Msmeg). <ol><li> Voeg 6-azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz, 0,020 mmol, 4,1 mg), UDP-glucose (0,040 mmol, 24,4 mg) en MgCl2 (0,020 mmol, 4,1 mg) in een 15 ml conische buis. </li><li> Voeg Tret in Tris buffer (verkregen uit stap 1.5.4) tot een uiteindelijke enzymconcentratie van 300 ug / ml en een eindvolume van 1 ml te bereiken. Pipet het mengsel op en neer voorzichtig of omkeren van de buis om de vaste stoffen op te lossen. </li><li> Incubeer de reactie bij 70 ° C onder schudden gedurende 15 minuten. </li><li> Verdun het enzymatische reactiemengsel met 3 ml gedeïoniseerd water en overbrengen naar een vooraf gewassen centrifugale filtereenheid (NMWL 10 kDa). Centrifugeer de filtereenheid bij 3000 xg tot het meeste van de vloeistof door het filter in de lengte van ongeveer 10 minuten. </li><li> teruggooi the bovenkamer van de centrifugale filter unit. Add gemengd bed ionen-uitwisselingshars (0,75 g) aan de buis en roer / schudden bij kamertemperatuur gedurende 25 min. Decanteer het supernatant en filteren om de hars te verwijderen. OPMERKING: Stappen 5.1.1-5.1.5 bieden een waterige oplossing van 6-azido-trehalose (6-TreAz) bij ongeveer 5 mM concentratie in minder dan 1 uur. De 5 mM concentratie wordt geschat op basis van de kwantitatieve omzetting van substraat naar product en de verwatering die plaatsen neemt tijdens het zuiveringsproces stappen, uitgaande van minimaal verlies van het product tijdens deze stappen. De oplossing kan steriel gefiltreerd voor toevoeging aan een biologisch monster indien gewenst. </li><li> Voeg de juiste hoeveelheid van 6-TreAz product oplossing voor een log-fase kweek van M. smegmatis (Msmeg), doorgaans naar een uiteindelijk cultuur volume van 100-1000 pi en een laatste 6-TreAz concentratie van ~ 25 pm te bereiken. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende de gewenste tijd, gewoonlijk 60 minuten. </li></ol></li><li> Voer op chemie een fluorofoor-gelabelde cellen azide conjugeren. In dit protocol gebruiken Cu-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie (CuAAC) een fluorofoor celoppervlak aziden leveren Msmeg. <ol><li> Centrifugeer de cellen bij 3900 g gedurende 5 minuten en daarna wassen van de cellen met PBS bevattende 0,5% runderserumalbumine. Herhaal tweemaal. </li><li> Resuspendeer de gepelleteerde cellen in 4% para-formaldehyde in PBS om ze op te lossen. Na incubatie gedurende 10 min Herhaal stap 5.2.1 om de cellen te wassen. </li><li> Re-schorten gepelleteerde cellen in 138 pi PBS. </li><li> Voeg 3 ul van een 1 mM voorraadoplossing van alkyn-carboxyrhodamine 110 (Acetyleenalkoholen-488) in DMSO. </li><li> Voeg 3 ul van een vers bereide 60 mM voorraadoplossing van natriumascorbaat in gedeïoniseerd water. </li><li> Voeg 3 ul van een 6,4 mM voorraadoplossing van tris [(1-benzyl-1H-1,2,3-triazool-4-yl) methyl] amine (TBTA) in tert-butanol / dimethylsulfoxide (DMSO) 4: 1. </li><li> Voeg 3 &amp; #956, L van een 50 mM voorraad oplossing van CuSO4 in gedemineraliseerd water. </li><li> Pipet de celsuspensie op en neer, daarna incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 min. </li><li> Herhaal stap 5.2.1 om de cellen te wassen. Resuspendeer de cellen in 150 pi PBS. </li></ol></li><li> Voer cellulaire fluorescentie analyse. In dit protocol gebruiken fluorescentiemicroscopie cellulaire fluorescentie van gemerkte Msmeg visualiseren. <ol><li> Voeg 10 ul van bacteriële cellen gesuspendeerd in PBS tot een microscoopglaasje uitgespreid en licht de vloeistof in een dunne laag met de rand van een dekglaasje. Laat droog in het donker aan de lucht. </li><li> Voeg 10 ul van montage medium over de gedroogde monster, leg deksel bevestiging over het monster en toe te passen lijm (bijv nagellak) te immobiliseren. </li><li> Beeld de glaasjes met een fluorescentiemicroscoop bij 100x vergroting. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Elbein, A. D., Pan, Y. T., Pastuszak, I., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+on+trehalose%3A+a+multifunctional+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">New insights on trehalose: a multifunctional molecule.</a> Glycobiology. 13, 17-27 (2003).</li>
<li>Tournu, H., Fiori, A., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+trehalose+in+pathogenicity%3A+some+general+rules%2C+yet+many+exceptions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Relevance of trehalose in pathogenicity: some general rules, yet many exceptions.</a> PLoS Pathog. 9, 1003447(2013).</li>
<li>Ohtake, S., Wang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose%3A+Current+use+and+future+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Trehalose: Current use and future applications.</a> J. Pharm. Sci. 100, 2020-2053 (2011).</li>
<li>Adams, R. P., Kendall, E., Kartha, K. K. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/222463216_Comparison_of_free_sugars_in_growing_and_desiccated_plants_of_Selaginella_lepidophylla">Comparison of free sugars in growing and desiccated plants of Selaginella lepidophylla.</a> Biochem. Syst. Ecol. 18, 107-110 (1990).</li>
<li>Kubota, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKubota%2C+M+%22Glycoenzymes%22">Glycoenzymes</a>. Ohnishi, M. , Japan Scientific Societies Press. (2000).</li>
<li>Walmagh, M., Zhao, R., Desmet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+analogues%3A+latest+insights+in+properties+and+biocatalytic+production%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Trehalose analogues: latest insights in properties and biocatalytic production.</a> Int. J. Mol. Sci. 16, 13729-13745 (2015).</li>
<li>Kim, H. -M., Chang, Y. -K., Ryu, S. -I., Moon, S. -G., Lee, S. -B. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/229148606_Enzymatic_synthesis_of_a_galactose-containing_trehalose_analogue_disaccharide_by_Pyrococcus_horikoshii_trehalose-synthesizing_glycosyltransferase_Inhibitory_effects_on_several_disaccharidase_activitie">Enzymatic synthesis of a galactose-containing trehalose analogue disaccharide by Pyrococcus horikoshii trehalose-synthesizing glycosyltransferase: Inhibitory effects on several disaccharidase activities.</a> J. Mol. Catal. B: Enzym. 49, 98-103 (2007).</li>
<li>Backus, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+of+unnatural+trehalose+analogs+as+a+reporter+for+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Uptake of unnatural trehalose analogs as a reporter for Mycobacterium tuberculosis.</a> Nat. Chem. Biol. 7, 228-235 (2011).</li>
<li>Swarts, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mycobacterial+trehalome+with+bioorthogonal+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Probing the mycobacterial trehalome with bioorthogonal chemistry.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 16123-16126 (2012).</li>
<li>Rose, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+biological+evaluation+of+trehalose+analogs+as+potential+inhibitors+of+mycobacterial+cell+wall+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Synthesis and biological evaluation of trehalose analogs as potential inhibitors of mycobacterial cell wall biosynthesis.</a> Carbohydr. Res. 337, 105-120 (2002).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+trehalose-based+compounds+and+their+inhibitory+activities+against+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis of trehalose-based compounds and their inhibitory activities against Mycobacterium smegmatis.</a> Bioorg. Med. Chem. 12, 6397-6413 (2004).</li>
<li>Gobec, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+synthesis%2C+biochemical+evaluation+and+antimycobacterial+action+of+phosphonate+inhibitors+of+antigen+85C%2C+a+crucial+enzyme+involved+in+biosynthesis+of+the+mycobacterial+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Design, synthesis, biochemical evaluation and antimycobacterial action of phosphonate inhibitors of antigen 85C, a crucial enzyme involved in biosynthesis of the mycobacterial cell wall.</a> Eur. J. Med. Chem. 42, 54-63 (2007).</li>
<li>Sarpe, V. A., Kulkarni, S. S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/264303743_ChemInform_Abstract_Regioselective_Protection_and_Functionalization_of_Trehalose">Regioselective protection and functionalization of trehalose.</a> Trends in Carbohydr. Res. 5, 8-33 (2013).</li>
<li>Chaube, M. A., Kulkarni, S. S. Stereoselective construction of 1,1-alpha,alpha-glycosidic bonds. Trends in Carbohydr. Res. 4, 1-19 (2013).</li>
<li>Leigh, C. D., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+studies+toward+Mycobacterium+tuberculosis+sulfolipid-I%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthetic studies toward Mycobacterium tuberculosis sulfolipid-I.</a> J. Org. Chem. 73, 1008-1017 (2008).</li>
<li>Chaen, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/273977592_Efficient_Enzymatic_Synthesis_of_Disaccharide_ALPHA-D-Galactosyl_ALPHA-D-Glucoside_by_Trehalose_Phosphorylase_from_Thermoanaerobacter_brockii">Efficient enzymatic synthesis of disaccharide, alpha-D-galactosyl-alpha-D-glucoside, by trehalose phosphorylase from Thermoanaerobacter brockii.</a> J. Appl. Glycosci. 48, 135-137 (2001).</li>
<li>Vander Borght, J., Soetaert, W., Desmet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+acceptor+specificity+of+trehalose+phosphorylase+for+the+production+of+trehalose+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Progr%22%5BJournal%5D)">Engineering the acceptor specificity of trehalose phosphorylase for the production of trehalose analogs.</a> Biotechnol. Progr. 28, 1257-1262 (2012).</li>
<li>Kouril, T., Zaparty, M., Marrero, J., Brinkmann, H., Siebers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+trehalose+synthesizing+pathway+in+the+hyperthermophilic+Crenarchaeon+Thermoproteus+tenax%3A+the+unidirectional+TreT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A novel trehalose synthesizing pathway in the hyperthermophilic Crenarchaeon Thermoproteus tenax: the unidirectional TreT pathway.</a> Arch. Microbiol. 190, 355-369 (2008).</li>
<li>Urbanek, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoenzymatic+synthesis+of+trehalose+analogues%3A+rapid+access+to+chemical+probes+for+investigating+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Chemoenzymatic synthesis of trehalose analogues: rapid access to chemical probes for investigating mycobacteria.</a> ChemBioChem. 15, 2066-2070 (2014).</li>
<li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stepwise+Huisgen+cycloaddition+process%3A+copper%28I%29-catalyzed+regioselective+%22ligation%22+of+azides+and+terminal+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A stepwise Huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 41, 2596-2599 (2002).</li>
<li>Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidotriazoles+on+solid+phase%3A+%5B1%2C2%2C3%5D-triazoles+by+regiospecific+copper%28I%29-catalyzed+1%2C3-dipolar+cycloadditions+of+terminal+alkynes+to+azides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides.</a> J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).</li>
<li>Kalscheuer, R., Weinrick, B., Veeraraghavan, U., Besra, G. S., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose-recycling+ABC+transporter+LpqY-SugA-SugB-SugC+is+essential+for+virulence+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Trehalose-recycling ABC transporter LpqY-SugA-SugB-SugC is essential for virulence of Mycobacterium tuberculosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 21761-21766 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Trehalose analogen hebben het potentieel om verschillende gebieden beïnvloeden, van conservering van voedsel en medicijnen tot diagnose en behandeling van microbiële infecties 6. Bestaande meerstaps chemische synthese werkwijzen bruikbaar voor het produceren van complexe trehalose afgeleiden met meerdere plaatsen van modificatie (bijvoorbeeld natuurlijk voorkomende complexe mycobacteriële glycolipiden). Deze werkwijzen zijn steevast lang en inefficiënt, zelfs wanneer toegepast op de synt...

Trehalose is een symmetrische niet-reducerende disaccharide bestaande uit twee glucose eenheden die zijn verbonden door een 1,1-α, α-glycosidische binding (Figuur 1A). Terwijl trehalose ontbreekt in mensen en andere zoogdieren wordt aangetroffen bij bacteriën, schimmels, planten en invertebraten 1. De primaire rol van trehalose in de meeste organismen te beschermen tegen milieu-invloeden, zoals uitdroging 1. Bovendien hebben sommige humane pathogenen vereist trehalose voor virulentie, waaronder tuberculose veroorzaakt Mycobacterium tuberculosis, die trehalose gebruikt als een mediator van celwand biosynthese en als bouwsteen voor de constructie van immunomodulerende glycolipiden 2. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig1.jpg" /> Figuur 1: Trehalose en trehalose analogen. (A) Structuren van trehalose natuurlijke en onnatuurlijke analoge trehalose, waarbij X een structurele modificatie. (B) Voorbeelden van trehalose analogen in de literatuur dat potentiële toepassingen in biopreservation en Bio-imaging hebben. Door zijn unieke structuur en fysiologische functies, heeft trehalose veel aandacht getrokken voor gebruik in bio (techno) logisch en biomedische toepassingen 3. De beschermende eigenschappen van trehalose waargenomen in natuur- bv, zijn opvallende vermogen om te helpen ondersteunen het leven in &#39;opstanding&#39; planten die extreme uitdroging hebben ondergaan 4 -hebben spoorde haar uitgebreide gebruik in biopreservation toepassingen. Trehalose is gebruikt voor een breed scala aan biologische monsters, zoals nucleïnezuren, eiwitten, cellen en weefsels 3 behouden. Zo wordt trehalose gebruikt als stabiliserende additief in een aantal farmaceutische thoed op de markt, waaronder een aantal anti-kanker monoklonale antilichamen 3. Eveneens, wordt trehalose gebruikt als zoetstof in de voedingsindustrie, en het wordt uitgebreid voor product bewaren voor voedsel en cosmetische industrie. De vaststelling van trehalose voor deze soorten commerciële toepassingen werd aanvankelijk beperkt door het onvermogen om grote hoeveelheden zuiver trehalose uit natuurlijke bronnen of door middel van synthese te verkrijgen. Echter, een efficiënte enzymatische werkwijze voor de economische productie van trehalose uit zetmeel is recent ontwikkeld, die het wijdverbreide commerciële toepassing heeft aangezet 5. Chemisch gemodificeerde derivaten van trehalose, hierin aangeduid als trehalose analogen steeds meer aandacht hebben gekregen voor verschillende toepassingen (algemene structuur in figuur 1A, specifieke voorbeelden van trehalose analogen figuur 1B) 6. Bijvoorbeeld, Lacto-trehalose is trehalose analoog met één van de glucose-eenheden vervangen galactose, waardoor de 4-positie hydroxylgroep een omgekeerde stereochemische configuratie. Lacto-trehalose heeft dezelfde eigenschappen als stabiliserende trehalose maar is resistent tegen afbraak door intestinale enzymen, waardoor zowel als niet-calorische additief 6, 7. het belang van onze fractie in trehalose-analogen in de eerste plaats betrekking heeft op hun waarde als mycobacteriën-specifieke probes en remmers. Barry en Davis groepen ontwikkelde een fluoresceïne-geconjugeerd keto-analoog trehalose, genaamd FITC-keto-trehalose, die bleek metabolisch labelen de celwand van levende M. tuberculosis, waardoor de detectie met fluorescentiemicroscopie 8. De Bertozzi lab ontwikkelde kleinere azido-trehalose (TreAz) analogen die metabolisch kon het etiket van de celwand en vervolgens zijn detweerspiegelde het gebruik van click chemie en fluorescentie analyse 9. Deze ontwikkelingen wijzen op de mogelijkheid van het gebruik van trehalose probes als diagnostische beeldvormingsmiddelen voor tuberculose. Trehalose analogen zijn ook gevoerd als remmers van M. tuberculosis wegens het potentiële trajecten in de bacterie die essentieel zijn voor de levensvatbaarheid en de virulentie 10, 11, 12 zijn verstoren. Tot nu toe, het belangrijkste obstakel voor de ontwikkeling van trehalose analogen voor bio (techno) logisch en biomedische toepassingen is het gebrek aan efficiënte synthetische methoden. De twee traditionele routes te produceren trehalose analogen afhankelijk chemische synthese (Figuur 2). Één route omvat desymmetrization / modificatie van natuurlijke trehalose, terwijl de andere gaat ab goed gefunctionaliseerde monosaccharide bouwblokken en het uitvoeren van chemische glycosylering tesmeden de 1,1-α, α-glycosidische binding. Deze benaderingen, die onlangs in review artikelen 13, 14 hebben besproken, zijn nuttig voor het uitvoeren van meerdere stappen synthese van kleine hoeveelheden complexe-trehalose bevattende natuurlijke producten, zoals sulfolipid-1 van M. tuberculosis 15 bewezen. Is de benadering die in het algemeen inefficiënt, tijdrovend, ontoegankelijk voor niet-chemici en, bovendien, niet als milieuvriendelijk. Zo synthetiseren van bepaalde trehalose analogen, deze strategieën zijn niet ideaal. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig2.jpg" /> Figuur 2: Benaderingen trehalose analoge synthese. Chemical zal trehalose analoge synthese, getoond aan de linkerkant, gebruiken meerdere stappen procedures die moeilijk bescherming te betrekkentie / ontscherming, desymmetrization en / of glycosylatie stappen. Enzymatische synthese, zie rechts, gebruikt enzym (en) stereoselectief omzetten eenvoudige onbeschermde substraten analogen in waterige oplossing trehalose. De enzymatische protocol dit formulier gebruikt een trehalose synthase (TRUE) enzym glucose analogen en UDP-glucose omzetten in trehalose analogen in een enkele stap. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54485/54485fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Een efficiënte biokatalytische route naar trehalose analogen zou de productie, evaluatie, en de toepassing van deze veelbelovende klasse van moleculen te vergemakkelijken. Terwijl de commerciële enzymatische werkwijze voor de productie van trehalose 5 is niet aangepast aan het synthetiseren van analogen omdat het gebruik maakt van zetmeel als substraat, zijn er andere biosynthetische padwijze natuur waarvan gebruik wordt gemaakt voor trehalose analoge synthese. Echter, onderzoek op dit gebied, die onlangs werd beoordeeld 6, is beperkt. Eén melding gebruikte werkwijze geïnspireerd door Escherichia coli trehalose biosynthese route om een fluor-analoog trehalose uit de overeenkomstige fluor-glucose. Deze benadering vereist een drie-enzymsysteem dat beperkte efficiëntie en algemeenheid 8. Een andere benadering die is onderzocht is trehalose fosforylase (TREP) gebruik in de omgekeerde richting, die in principe één-stap synthese van trehalose analogen van glucose analogen en glucose-1-fosfaat 6, 16, 17 mogelijk maakt. Hoewel deze aanpak belofte voor de toekomst kan hebben, zowel omkeren en behouden TREP hebben momenteel nadelen voor analoge synthese. Bijvoorbeeld, het omkeren van TREP een onbetaalbaar ervansive donormolecuul (β-D-glucose 1-fosfaat) en behouden TREP slechte enzymexpressie opbrengsten / stabiliteit en beperkte substraat promiscuïteit. Significante verbeteringen (bijvoorbeeld via enzyme engineering) nodig zal zijn voordat TREP-gemedieerde analoge synthese is praktisch. Momenteel is de meest praktische benadering voor de enzymatische synthese van trehalose analogen is een trehalose synthase (Tret) enzym dat glucose omzet en uridine difosfaat (UDP) glucose in trehalose in een enkele stap 6 gebruikt. We hebben onlangs gemeld het gebruik van Thermoproteus tenax Tret-een thermostabiel enzym en unidirectionele 18 -de trehalose synthetiseren analogen van glucose analogen en UDP-glucose (figuur 3) 19. Dit enzym werkt alleen in de richting synthetische en vermijdt het probleem van trehalose afbraak in het TREP systeem. Deze éénfasige reactie could vullen in 1 uur, en een grote verscheidenheid aan trehalose analogen werden benaderd in hoge opbrengst (tot&gt; 99% zoals bepaald door hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC)) uit gemakkelijk beschikbare glucose analoge substraten (zie tabel 1 in de Representatieve resultaten sectie). <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig3.jpg" /> Figuur 3: TRet gekatalyseerde één-stap synthese van trehalose analogen. De Tret enzym uit T. tenax stereoselectief kan deelnemen beschikbaar glucose analogen en UDP-glucose trehalose analogen vormen in één stap. R1-R4 = Variable structurele modificatie, bijvoorbeeld azido-, fluor, deoxy-, thio-, stereochemische of isotoop label wijzigingen; Y = variabele heteroatoom, zoals zuurstof of zwavel, of een isotoop gemerkte heteroatoom. Hier bieden we adEDETAILLEERDE protocol voor de Tret synthesewerkwijze, waaronder expressie en zuivering van Tret van E. coli geoptimaliseerde Tret reactieomstandigheden en een verbeterde zuiveringswerkwijze die volledig in de waterfase wordt uitgevoerd. Deze gewijzigde protocol kan de doelmatige en efficiënte synthese en zuivering van diverse analogen trehalose op semi-preparatieve schaal (10-100 mg). We tonen ook het gebruik van dit protocol voor het bereiden en toedienen van een trehalose-gebaseerde probe voor mycobacteriën in minder dan 1 uur, waarbij de snelle fluorescentie detectie van mycobacteriële cellen mogelijk.

<table><tbody><tr><td>LB agar</td><td>Research Products International</td><td>L24021</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Luria broth</td><td>Research Products International</td><td>L24045</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth</td><td>Research Products International</td><td>T15050</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-Arabinose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3256</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30256</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>BDH</td><td>BDH9286</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate, monobasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter, 0.45 &micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>09719D</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor mini-tablets, EDTA-free</td><td>Thermo Scientific</td><td>88666</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap HP nickel affinity column, 5 mL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5248-02</td><td></td></tr><tr><td>TRIS base ultrapure</td><td>Research Products International</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing, MWCO 12&ndash;14,000</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-152-16</td><td></td></tr><tr><td>Glucose analogues</td><td>CarboSynth, Sigma Aldrich, Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals</td><td></td><td>Voorbeelden van leveranciers die talrijke glucose-analogen aanbieden</td></tr><tr><td>6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz)</td><td>CarboSynth</td><td>MA02620</td><td></td></tr><tr><td>UDP-Glucose</td><td>abcam Biochemicals</td><td>ab120384</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rex RG 501-X8 mixed-bed ion-exchange resin</td><td>Bio-Rad</td><td>444-9999</td><td></td></tr><tr><td>Extra-Fine Bio-Gel P2 media</td><td>Bio-Rad</td><td>150-4118</td><td></td></tr><tr><td>Glass-backed silica gel thin-layer chromatography plates</td><td>EMD Millipore</td><td>1056280001</td><td></td></tr><tr><td>n-Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25310A</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A300</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>EMD Millipore</td><td>AX0145</td><td></td></tr><tr><td>Deuterium oxide, 99.8%</td><td>Acros Organics</td><td>351430075</td><td></td></tr><tr><td>Aminopropyl HPLC column</td><td>Sigma Aldrich</td><td>58338</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Para-formaldehyde</td><td>Ted Pella</td><td>18505</td><td></td></tr><tr><td>Alkyne-488</td><td>Sigma Aldrich</td><td>761621</td><td></td></tr><tr><td>Sodium ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>1061</td><td></td></tr><tr><td>tert-Butanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360538</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W387520</td><td></td></tr><tr><td>Copper(II) sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1297</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G mounting medium</td><td>Southern Biotechnology</td><td>10001</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid one-step enzymatische synthese en all-waterige zuivering van trehalose analogen

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Chemisch gemodificeerde versies van trehalose, trehalose of analoga hebben toepassingen in de biologie, biotechnologie en farmaceutische wetenschappen, onder andere gebieden. Zo hebben trehalose analogen richting detecteerbare labels gebruikt om Mycobacterium tuberculosis te detecteren en kunnen applicaties tuberculose diagnostische beeldvormingsmiddelen hebben. Hydrolytisch stabiele versies van trehalose worden ook nagestreefd vanwege hun potentieel voor toepassing als niet-calorische zoetstoffen en bioprotectieve middelen. Ondanks de aantrekkingskracht van deze klasse van verbindingen voor verschillende toepassingen, in potentie groot onvervulde door het ontbreken van een solide route voor hun productie. Hier melden wij een gedetailleerd protocol voor de snelle en efficiënte one-step biokatalytische synthese van trehalose analogen dat de problemen in verband met chemische synthese omzeilt. Door gebruikmaking van de thermostabiele trehalose synthase (TRUE) enzym uit Thermoproteus tenax, kan trehalose analogen generated in een enkele stap uit glucose analogen en uridine difosfaat glucose in hoge opbrengst (tot kwantitatieve conversie) in 15-60 min. Een eenvoudige en snelle niet-chromatografische zuivering protocol waarbij spin dialyse en ionenuitwisseling veel trehalose analogen van bekende concentratie te leveren in waterige oplossing in slechts 45 minuten. Wanneer ongereageerde glucose-analoog blijft, kan chromatografische zuivering van het trehalose analoge product worden uitgevoerd. Over het algemeen is deze methode zorgt voor een &quot;groene&quot; biokatalytische platform voor de versnelde synthese en zuivering van trehalose analogen die efficiënt en toegankelijk voor niet-chemici. Om de toepasbaarheid van deze methode illustreren, beschrijven we een protocol voor de synthese volledig waterige zuivering en toediening van trehalose-gebaseerde click chemie probe mycobacteriën, hetgeen alles minder dan 1 uur nodig fluorescentiedetectie van mycobacteriën. In de toekomst voor ogen dat we, onder OTHer toepassingen Dit protocol kan worden toegepast op de snelle synthese van trehalose-probes voor tuberculose diagnostiek. Bijvoorbeeld kortlevende radionuclide trehalose gemodificeerde analogen (bijvoorbeeld 18 F-gemodificeerde trehalose) kunnen worden gebruikt voor geavanceerde klinische beeldvormingsmodaliteiten zoals positron emissie tomografie-computed tomografie (PET-CT).

T. tenax Tret werd verkregen van E. coli in een opbrengst van ongeveer 4 mg / l gebruikt standaard eiwitexpressie en zuiveringstechnieken. Eén nikkel affiniteitschromatografiestap volstond om Tret zuiveren uit E. coli-lysaat (vertegenwoordiger FPLC spoor wordt getoond in figuur 4). Zoals vermeld in onze eerste publicatie op Tret synthesewerkwijze, recombinante T. tenax Tret is in staat om een brede variatie glucose-analoga waarvan vele...

Trehalose-analogen duiken op als belangrijke moleculen voor bio(techno)logische en biomedische toepassingen. We beschrijven een geoptimaliseerd protocol voor het enzymatisch synthetiseren en zuiveren van trehalose-analogen dat eenvoudig, efficiënt, snel en milieuvriendelijk is. De toepassing ervan voor de snelle productie en toediening van een sonde voor de detectie van mycobacteriën wordt gedemonstreerd.

Rapid One-step enzymatische synthese en All-waterige Zuivering van Trehalose analogen

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

Het algemene doel van deze methode is om snel trehalose-analogen te synthetiseren en zuiveren met mogelijke toepassingen variërend van de detectie van pathogene bacteriën tot de conservering van biomaterialen. Dit is een snelle en hoog opbrengstmethode die toegang biedt tot analogen van het disaccharide trehalose. Deze verbindingen hebben verschillende gevestigde en opkomende toepassingen in biomedisch en biotechnologisch onderzoek.Deze methode bestaat uit een eenstaps enzymatische synthese en een volledig waterige zuivering. Samen helpen deze procedures om enkele van de nadelen van traditionele chemische syntheses van trehalose-analogen aan te pakken, die langdurig, met een lage opbrengst en milieuonvriendelijk kunnen zijn. De implicaties van deze methode kunnen zich uitstrekken tot de studie en diagnose van tuberculose omdat gemodificeerde trehalose-analogen zijn gebruikt voor het beeldvormen van microbacterium tuberculosis, de veroorzaker van tuberculose.Deze methode kan ook helpen bij het versnellen van de synthese en evaluatie van trehalose-analogen voor andere mogelijke toepassingen zoals de conservering van biologische producten en gebruik als niet-calorische zoetstoffen. Voordat u met de procedure begint, bereidt u een nachtcultuur van TreT-expresserende E.coli voor. Om de TreT-expressieprocedure te beginnen, plaatst u 750 milliliter TB-groeimedium in een 2.800 milliliter Fernbach-cultuurfles en steriliseert deze.Voeg ampicilline toe aan het bouillon om een ​​eindconcentratie van 100 microgram per milliliter te bereiken. Verkrijg cuvettes voor UV-vis-spectroscopie en vul één cuvette met bouillon uit de fles als blanco. Voeg vervolgens drie milliliter van de bereide TreT-expresserende E.coli-nachtcultuur toe aan de fles.Incubeer de fles bij 37 graden Celsius terwijl u schudt bij 200 rpm. Controleer periodiek de absorptie van de bouillon bij 600 nanometer tegen de bouillon blanco. Wanneer de absorptiewaarde bij 600 nanometer tussen 0,5 en 1,0 ligt, voegt u 750 microliter arabinos toe aan de fles om TreT-expressie te induceren.Incubeer de cultuur bij 37 graden Celsius gedurende de nacht terwijl u schudt bij 200 rpm. Plaats vervolgens de cultuur in een polypropyleen centrifugefles van één liter en centrifugeer de cultuur gedurende 15 minuten bij 4.000 keer G op vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg en suspendeer de pellet in 15 milliliter fosfaat gebufferde zoutoplossing.Breng de suspensie over naar een kegelvormige centrifugeerbuis en centrifugeer onder dezelfde omstandigheden. Gooi vervolgens het supernatant weg en sla desgewenst de pellet op bij min 80 graden Celsius. Los een protease-remmer mini-tablet op in 20 milliliter wasbuffer.Voeg de protease-remmeroplossing toe aan de pellet en vortex de mix om de pellet op te schorsen. Breng de suspensie over naar een 100 milliliter beker. Soniceer vervolgens de suspensie om de cellen te lyseren en plaats de sonde ongeveer een centimeter van de bodem van de beker.Plaats het lysate in een metalen kegelvormige buis en centrifugeer het lysate gedurende 60 minuten bij 15.000 keer G bij vier graden Celsius. Filter het lysate met een spuitfilter. Isolateer TreT door middel van fast protein liquid chromatografie en beoordeel de zuiverheid met SDS-pagina.Vervolgens wisselt u TreT uit naar Tris-buffer door dialyse overnacht bij vier graden Celsius om de TreT-oplossing voor trehalose-analogensynthese te vormen. Verzamel de blanco van de dialyse wassing. Bepaal de TreT-concentratie door UV-vis-spectroscopie tegen de dialyse blanco.Om de synthese van 6-Azido-trehalose te beginnen met behulp van TreT op de 20 tot 30 milligram schaal, plaatst u 0,08 millimol 6-Azido-glucose, 0,16 millimol UDP-glucose en 0,08 millimol magnesiumdichloor in een 15 millimeter kegelvormige buis. Voeg de TreT en Tris-buffer toe. Verdun het mengsel met Tris-buffer zo nodig om een ​​enzymconcentratie van 300 microgram per milliliter in een eindvolume van vier milliliter te bereiken.Dek de buis af en draai deze om om de vaste stoffen op te lossen. Incubeer het reactiemengsel gedurende één uur bij 70 graden Celsius terwijl u schudt bij 300 rpm. Tijdens de incubatie, plaatst u drie milliliter gedeïoniseerd water in een 10 kilodalton centrifugale filtereenheid en centrifugeert u bij 3.000 keer G totdat alle vloeistof in de buis zit.Herhaal de wassing nog twee keer om een grondige spoeling van de filtereenheid te garanderen. Wanneer de reactie voltooid is, koelt u het mengsel af tot kamertemperatuur op ijs. Breng vervolgens het productmengsel over naar de centrifugale filtereenheid.Spoel de reactiebuis driemaal met één milliliter gedeïoniseerd water en breng elke spoeling over naar de centrifugale filtereenheid. Centrifugeer het mengsel bij 3.000 keer G totdat alle vloeistof in de buis is gepasseerd. Voeg drie milliliter gedeïoniseerd water toe aan de filtereenheid en centrifugeer opnieuw onder dezelfde omstandigheden.Herhaal de spoeling zo nodig om de productopbrengst te maximaliseren. Voeg drie gram gemengd bed ionenuitwisselingshars toe aan het filtraat. Roer het mengsel met een roerbar bij kamertemperatuur gedurende één uur.Na het roeren, decanteer en filtreer het supernatant. Spoel de hars met vijf milliliter gedeïoniseerd water en filtreer de spoeling. Herhaal indien nodig om de productopbrengst te maximaliseren en combineer alle filtraten.Concentreer het gecombineerde filtraat. Bereid vervolgens een silicagel TLC-plaat voor om ongereageerde 6-GlcAz-precursor te controleren met vlekken van 6-GlcAz, 6-TreAz, het geconcentreerde product en een co-vlek. Ontwikkel de plaat met een mengsel van n-butanol, ethanol en gedeïoniseerd water.Zodra de plaat droog is, visualiseert u de vlekken door de plaat te dompelen in 5% zwavelzuur en ethanol en de plaat op hoog te verwarmen op een hotplate gedurende ongeveer vijf minuten. Als er ongereageerde precursor wordt waargenomen, zuivert u het productmengsel op een grootte-exclusiekolom en herhaalt u de TLC-analyse. Zodra het pure trehalose-

rapid-one-step-enzymatic-synthesis-all-aqueous-purification-trehalose

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In dit artikel wordt een hoge doorvoer methode voorgesteld voor de synthese van Oligosacchariden en de bevestiging aan het oppervlak van polyanhydride nanodeeltjes voor verder gebruik in voor specifieke receptoren op antigeen-presenterende cellen.

High-throughput synthese van koolhydraten en functionalisering van polyanhydride Nanodeeltjes

De hierin beschreven protocol heeft tot doel uit te leggen en verkorten de vele obstakels in de weg van de ingewikkelde route die leidt tot gewijzigde nucleosidetrifosfaten. Bijgevolg Dit protocol maakt zowel de synthese van deze geactiveerde bouwstenen en hun beschikbaarheid voor praktische toepassingen.

Nucleosidetrifosfaten - Van Synthese tot biochemische karakterisering

Indoxyl glycosides zijn goed gevestigde en veelgebruikte hulpmiddelen voor enzymscreening en het bewaken van enzymactiviteit. Vooral voor glucose-type structuren bleken eerdere syntheses uitdagend en met een lage opbrengst. Onze nieuwe aanpak gebruikt indoxylzuur esters als waardevolle tussenproducten om een aanzienlijk aantal indoxyl glycosides met een goede opbrengst te verkrijgen.

Synthese van Indoxyl-glycosiden voor detectie van Glycosidase Activiteiten

Een modulaire benadering van de synthese van N- glycanen voor bevestiging aan een aluminium oxide-gecoate glazen schuif (ACG dia) als een microarray glycan heeft ontwikkeld en het gebruik ervan voor de profilering van een HIV in grote lijnen neutraliserende antilichamen aangetoond.

Chemo-enzymatische synthese van N- glycanen voor Array ontwikkeling en HIV antilichaam profilering

Een 2-azido-1-nitraat-ester kan worden geconverteerd naar de corresponderende 2-azido-1-trichloroacetimidate in een één-pot-procedure. Het doel van het manuscript is om aan te tonen van de nut van de reactor van de magnetron in de synthese van de koolhydraten.

One-pot magnetron-bijgewoonde conversie van anomere nitraat-esters naar Trichloroacetimidates

Hier presenteren we protocollen voor de synthese van disaccharide nucleosiden door de regioselectieve O- glycosylatie van ribonucleosides via een tijdelijke bescherming van hun 2', 3'-diol wordt met behulp van een cyclische ester van koppeling. Deze methode is van toepassing op verschillende onbeschermde nucleosiden zoals adenosine, calciumguanosine, cytosinetrifosfaat, uridine, 5-methyluridine en 5-fluorouridine te geven van de corresponderende disaccharide nucleosiden.

Regioselectieve O- glycosylatie van nucleosiden via de tijdelijke 2', 3'-Diol bescherming door een koppeling Ester voor de synthese van Disaccharide nucleosiden

Dit protocol demonstreert het gebruik van de auto-CHO software voor hiërarchische en programmeerbare One-pot synthese van oligosacchariden. Het beschrijft ook de algemene procedure voor RRV-bepalings experimenten en eenpotglycosylatie van SSEA-4.

Hiërarchische en programmeerbare One-pot oligosaccharide synthese

Representatieve experimentele procedures voor de toevoeging van Amine-nuclefielen aan tricarbonyl (tropone) ijzer en daaropvolgende demetallatie van de resulterende complexen worden gedetailleerd gepresenteerd.

Bereiding van 6-aminocyclohepta-2, 4-dien-1-een derivaten via tricarbonyl (tropon) ijzer

CO2 -transformaties worden uitgevoerd in een eenpottweestapsprocedure voor de synthese van complexe moleculen. De selectieve 4 e- reductie van co2 met een hydroboraan reductie biedt een reactieve en veelzijdige bis (boryl) acetale intermediair, die vervolgens wordt betrokken bij condensatiereactie of carbene-gemedieerde C-C koppelings generatie.

Veelzijdige CO2 -transformaties in complexe producten: een Eenpottweestapsstrategie

Oligonucleotide 5′-trifosfaten zijn alomtegenwoordige componenten in essentiële biologische routes en worden steeds vaker gebruikt in biotechnologische toepassingen. Hier beschrijven we technieken voor de routinematige synthese en zuivering van oligonucleotide-5′-trifosfaten, uitgaande van oligonucleotiden bereid door standaard geautomatiseerde synthesetechnieken.

Chemische trifosforylering van oligonucleotiden

Leer een snelle enzymatische methode voor de synthese en zuivering van trehalose-analogen. Deze efficiënte techniek biedt toepassingen in de detectie van mycobacteriën en tuberculoseonderzoek.

Rapid One-step enzymatische synthese en All-waterige Zuivering van Trehalose analogen

Meer video's verkennen