Name: Evaluatie van de effectiviteit en toxiciteit van RNAs Targeting HIV-1 productie voor gebruik in Gene of Drug Therapy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Leer een methode om de effectiviteit en toxiciteit van RNA-moleculen tegen HIV-1 te evalueren met behulp van humane embryonale nier 293T-cellen. Deze techniek maakt snelle screening van meerdere RNA-ontwerpen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De hier gepresenteerde werk werd gesteund door de Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (verleent DCB-120.266, PPP-133.377 en HBF-348.967 tot AG).

1. Cellen en transfecties <ol><li> Cultuur HEK 293T cellen in Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine. Bereid een 2 x 10 5 cellen / ml suspensie in het celkweekmedium. Voeg 500, 100 en 1000 ul van de celsuspensie aan elk putje van 24-well, 96-well en 12-well platen voor virusproductie cellevensvatbaarheid en immuun activatie assays, respectievelijk (Figuur 2A). </li><li> Zwenk de platen en incubeer ze O / N bij 37 ° C met 5% CO 2. Kweek cellen 50-70% confluentie. </li><li> Volgens een transfectie plan, bereiden verdunningen van de test RNA&#39;s en hun controles in 1,5 ml micro-buizen (voorbeeld, Figuur 2B). <ol><li> Voor de virusproductie assay Bereid een 10 ng / ul verdunning van een HIV-1 expressieplasmide en voeg 10 ul aan elk buisje. Volgende bereiden 5 uM verdunningen van de test RNA&#39;s en een negatieve controle RNA. Voeg 2,5 of 10 pl van elke test RNA en negatieve controle verdunning tot de overeenkomstige buizen van 25 of 100 nM eindconcentraties. </li><li> Voor de cellevensvatbaarheid test bereiden 5 uM verdunningen van de test RNA en een 10 mg / ml verdunning van de positieve controle RNA laagmoleculaire poly I: C. Voeg 2 ul test RNA of positieve controle RNA verdunningen aan de overeenkomstige buizen voor 100 nM of 200 ug / ml eindconcentraties respectievelijk. </li><li> Voor de activering van het immuunsysteem assay, voeg 20 ul test RNA of positieve controle RNA verdunningen bereid in stap 1.3.2. de overeenkomstige buizen voor 100 nM of 200 ug / ml eindconcentraties respectievelijk. Opmerking: Voor het testen RNA expressieplasmiden bereiden 10 ng / pl verdunningen in plaats van de 5 uM verdunningen test RNA, waardoor uiteindelijke hoeveelheden 25 en 100 ng van stap 1.3.1. en 100 ng voor de stappen 1.3.2. en 1.3.3. </li></ol></li><li> Voeg 50, 25 of 75 gl DMEM aan elke transfectie buis virale production cellevensvatbaarheid en immuun activatie assays, respectievelijk. Voor virale productie assays, brengen cellen en bereid transfectie buizen naar een bio-safety level 3 (BSL3) laboratorium voor de volgende stap. </li><li> Voeg 2 ul van het transfectiereagens achtereenvolgens de transfectie buizen en incubeer 15-20 minuten om complexen te vormen. Zie de Tabel Materialen voor de specifieke transfectie reagens te gebruiken. </li><li> Voeg de gehele transfectiemengsel van elke microbuis druppelsgewijs aan de overeenkomstige posities in de celcultuur platen. Zwenk en incubeer de platen gedurende 48 uur bij 37 ° C met 5% CO2. </li><li> Meet HIV-1-productie (deel 2), levensvatbaarheid van de cellen (deel 3) en activering van het immuunsysteem (deel 4) in de celkweek platen (figuur 2C). </li></ol> 2. virusproductie Assay <ol><li> Verwijder de 24-well celkweek platen uit de incubator en zachtjes wervelen de platen in de BSL3 celkweekkap. Transfer 150 pl supernatant uit elk putje naar een overeenkomstige putje in een 96-well plaat met vlakke bodem, die zal worden gebruikt om te kwantificeren HIV-1-productie. Opmerking: Common virale kwantificering assays omvatten het meten van de expressie van de HIV-1 capside-eiwit (p24) door enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) 20 kwantificeren viraal RNA door reverse transcriptie polymerase kettingreactie (RT-PCR) 21 en meten van de activiteit van de HIV-1 RT enzym. Stappen 2,2-2,5 methoden uit te leggen aan HIV-1 RT-activiteit 13,15,16 kwantificeren. </li><li> Overdracht 5 pi supernatant overeenkomstige putjes in een 96-well plaat met 25 ul van een virale verstoring cocktail 15 (tabel 1). Incubeer het mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en breng de plaat radioactiviteit werkstation. Opmerking: Stap 2.2. is alleen nodig als een radioactiviteit werkstation is niet beschikbaar in de BSL3 laboratorium. Indien de platen niet hoeft uit de te verwijderenBSL3 laboratorium, ga dan naar stap 2.3. en voeg 50 ul van radioactieve / virale verstoring cocktail (Tabel 1) in plaats van de 25 pi radioactief cocktail. </li><li> Bereid een radioactieve cocktail 15 (Tabel 1) en voeg 25 ul aan elk putje van virale supernatant en verstoring cocktail. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 2 uur. </li><li> Spot 5 ui van het reactiemengsel op overeenkomstige velden in een glasvezel Di Ethyl aminoethyl (DEAE) filtermat papier en laat de vlekken drogen 10 min. Spot het reactiemengsel in elke vierkante zodat er geen twee monsters direct elkaar grens. Dit helpt om cross-over tussen de monsters te voorkomen dat bij het bepalen van tellingen per minuut (cpm) in stap 2.6. </li><li> Was de papieren 5x gedurende 5 min met 2x saline natriumcitraat (SSC) buffer (Tabel 1), gevolgd door twee 1 min wassen met 95% ethanol. Laat de kranten te drogen en te verzegelen in zakken. </li><li> Clip monster zakken containing de filtermat papier in een cassette en plaats de cassette in een microplaat scintillatieteller. Stel de teller cpm lezen voor 32 P met de peildatum voorzien voor de partij van [32 P] dTTP gebruikt in het experiment. Selecteer welke monsters te lezen met behulp van de kaart plaat en start de teller. </li><li> Voor elke virale kwantificeermethode, verdelen de waarden verkregen voor elke test RNA de daarnaast negatieve controle en vermenigvuldig deze waarde door 100 om het percentage remming van HIV-1-productie te verkrijgen voor elke herhaling van de test RNA. Een voorbeeld van de resultaten vergelijken verschillende monsters RNA bij verschillende concentraties wordt in figuur 3. </li></ol> 3. levensvatbaarheid van de cellen Assay <ol><li> Verwijder de 96-wells platen uit de incubator en voeg 20 ul van 5 mg / ml MTT (3- [4,5-dimethyl-2-thiazolyl] -2,5-difenyl-2H-tetrazolium bromide) verdund in Dulbecco&#39;s fosfaatgebufferde zoutoplossing ( DPBS) aan elk putje. Incubeer de platen fof 3 uur bij 37 ° C. </li><li> Voeg 150 gl isopropanol aangezuurd met detergent (1% NP-40, 4 mM HCI in isopropanol) aan elk putje en incubeer de platen gedurende 2 uur bij KT. </li><li> Bepaal de absorptie bij 570 nm in een microplaat spectrofotometer. </li><li> Bereken het relatieve MTT stofwisseling voor elke positieve controle en test RNA door de verkregen voor elk monster door de aangrenzende transfectie controle waarde te delen. Een voorbeeld van de resultaten vergelijken verschillende monsters RNA en een positieve controle wordt verschaft in figuur 4. </li></ol> 4. Immune Activation Assay <ol><li> Verwijder de 12-wells platen uit de incubator en zuig het kweekmedium. Voorzichtig te wassen de cellen tweemaal met DPBS en voeg 70 ul koude lysisbuffer 22 (inclusief protease en fosfataseremmers, tabel 1) aan elk putje. Incubeer de platen gedurende 10 minuten op ijs. </li><li> Transfer cellysaten aan micro tubes en snelle vries ze door onderdompeling van debuizen in vloeibare stikstof. Laat de monsters ontdooien en herhaal voor 2 vries dooi cycli in totaal 3. </li><li> Centrifugeer de lysaten gedurende 15 minuten bij 4 ° C, 15.700 xg om celresten te pelleteren. Breng de bovenstaande nieuwe microbuisjes en bepaal de eiwitconcentratie volgens de methode 23,24 Coomassie blue (Bradford). </li><li> Resolve 75 ug eiwit uit elk monster in een 10% denaturerende polyacrylamidegel en overbrengen naar een nitrocellulosemembraan zoals eerder beschreven 25,26. </li><li> Na elektroforese en overdracht naar een membraan, onthullen eiwitbanden door incubatie van het membraan Ponceau S (Tabel 1) gedurende 1 minuut, gevolgd door wassen in dubbel gedistilleerd water. Gebruik de bands en eiwit ladder als een leidraad voor het membraan te snijden op 80 en 55 kDa. Opmerking: In stap kan 4,4 samples worden uitgevoerd op 16 x 18 cm 2 gels naar 34 kDa, zodat het gemakkelijk is om het membraan te snijden op de aangegeven posities en niet dwars door debanden van belang. Als alternatief kunnen meerdere gels worden uitgevoerd met dezelfde monsters om te voorkomen dat het snijden van de membraan. </li><li> Spoel de Ponceau S kleuring met Tris-gebufferde zoutoplossing die 0,05% Tween 20 (TBST, tabel 1). TBST toevoegen 5% magere melk aan de membranen volledig omsluit. Incubeer de membranen bij kamertemperatuur onder schudden gedurende 1 uur. </li><li> Incubeer de membranen O / N in TBST met 3% runderserumalbumine (BSA) en antilichamen verdund tot 1 in 1000 tegen ADAR1 (110 en 150 kDa), fosfo-PKR (62 kDa) en fosfo-IRF3 (47 kDa), de bovenste, middelste en onderste delen van het membraan, respectievelijk. </li><li> Was de membranen 5x gedurende 5 min met TBST en incuberen in TBST met 5% vetvrije melk en met peroxidase gemerkt geit-anti-konijn secundaire antilichamen (verdund tot 1 in 5000) gedurende 1 uur. </li><li> Was de membranen 5x gedurende 5 min met TBST en toepassen oplossing elektrochemiluminescentie (ECL) de banden zichtbaar op folies volgens instructies van de fabrikant. </li><li> Na het visualiseren van de eiwitbanden op films, was de middelste en onderste delen van het membraan gedurende 10 minuten met een antilichaam stripoplossing. Incubeer de membranen O / N in TBST met 3% BSA en antilichamen tegen totale PKR (bij 1 in 500) en IRF3 (1 in 1000), de middelste en onderste delen respectievelijk. Herhaal stap 4.8. en 4,9. met behulp van peroxidase gemerkt geit-anti-muis in plaats van het anti-konijn secundair antilichaam voor de PKR membraan (midden). </li><li> Was het onderste stuk van het membraan 5x gedurende 5 min met TBST en incubeer het membraan in TBST met 3% BSA gedurende 1 uur met een antilichaam tegen actine (verdund tot 1 in 5000). Herhaal stap 4.8. en 4,9. met behulp van peroxidase gemerkt geit-anti-muis in plaats van het anti-konijn secundair antilichaam. Een voorbeeld van de resultaten vergelijken verschillende monsters RNA en een positieve controle wordt verschaft in Figuur 5. Zie de Tabel Materialen voor de specifieke antilichamen te gebruiken. </li></ol>

<ol><li>Hoxie, J. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+and+gene+therapies+for+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Novel cell and gene therapies for HIV.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179(2012).</li>
<li>Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+approaches+for+treatment+of+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection.</a> Genome Med. 7, 50(2015).</li>
<li>Allers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+cure+of+HIV+infection+by+CCR5Delta32%2FDelta32+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation.</a> Blood. 117, 2791-2799 (2011).</li>
<li>DiGiusto, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+hematopoietic+stem+cell+based+gene+therapy+for+HIV-1+infection%3A+considerations+for+proof+of+concept+studies+and+translation+to+standard+medical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice.</a> Viruses. 5, 2898-2919 (2013).</li>
<li>Burke, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Cellular+Resistance+to+HIV-1+Infection+In+Vivo+Using+a+Dual+Therapeutic+Lentiviral+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236(2015).</li>
<li>DiGiusto, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-based+gene+therapy+for+HIV+with+lentiviral+vector-modified+CD34%28%2B%29+cells+in+patients+undergoing+transplantation+for+AIDS-related+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma.</a> Sci Transl Med. 2, 36ra43(2010).</li>
<li>Scarborough, R. J., Gatignol, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+and+Ribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">HIV and Ribozymes.</a> Adv Exp Med Biol. 848, 97-116 (2015).</li>
<li>Eekels, J. J., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+durable+treatment+of+HIV-1+infection+using+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Mol+Biol+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).</li>
<li>Blazquez, L., Fortes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+interference+%28U1i%29+for+Antiviral+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches.</a> Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).</li>
<li>McIntyre, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((96+shRNAs+designed+for+maximal+coverage+of+HIV-1+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants.</a> Retrovirology. 6, 55(2009).</li>
<li>Sajic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+modified+U1+snRNAs+to+inhibit+HIV-1+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication.</a> Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHAPE-directed+discovery+of+potent+shRNA+inhibitors+of+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1.</a> Mol Ther. 20, 820-828 (2012).</li>
<li>Scarborough, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Conserved+Target+Site+in+HIV-1+Gag+RNA+is+Accessible+to+Inhibition+by+Both+an+HDV+Ribozyme+and+a+Short+Hairpin+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178(2014).</li>
<li>Lainé, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+cleavage+of+HIV-1+RNA+by+new+SOFA-HDV+ribozymes+and+their+potential+to+inhibit+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication.</a> RNA Biol. 8, 343-353 (2011).</li>
<li>Scarborough, R. J., Lévesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Evaluation+of+Clinically+Relevant+SOFA-HDV+Ribozymes+Targeting+HIV+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA.</a> Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).</li>
<li>Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+Inhibition+of+HIV-1+Production+by+Short+Hairpin+RNAs+and+Small+Interfering+RNAs+Targeting+a+Highly+Conserved+Site+in+HIV-1+Gag+RNA+Is+Optimized+by+Evaluating+Alternative+Length+Formats%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).</li>
<li>Sarzotti-Kelsoe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+validation+of+the+TZM-bl+assay+for+standardized+assessments+of+neutralizing+antibodies+against+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1.</a> J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).</li>
<li>Campos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+lasting+control+of+viral+rebound+with+a+new+drug+ABX464+targeting+Rev+-+mediated+viral+RNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev - mediated viral RNA biogenesis.</a> Retrovirology. 12, 1-15 (2015).</li>
<li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR%2FCas9+system+inactivates+latent+HIV-1+proviral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA.</a> Retrovirology. 12, 22(2015).</li>
<li>Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+host+ICAM-1+in+laboratory+and+clinical+strains+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+increases+virus+infectivity+and+CD4%28%2B%29-T-cell+depletion+in+human+lymphoid+tissue%2C+a+major+site+of+replication+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo.</a> J Virol. 76, 1004-1014 (2002).</li>
<li>Shan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+PCR+assay+for+quantification+of+HIV-1+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22+J+Virol%22%5BJournal%5D)">A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA.</a> J Virol. 87, 6521-6525 (2013).</li>
<li>Clerzius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PKR+activator%2C+PACT%2C+becomes+a+PKR+inhibitor+during+HIV-1+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication.</a> Retrovirology. 10, 96(2013).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of protein.</a> Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li>
<li>Battisti, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additive+activity+between+the+trans-activation+response+RNA-binding+protein%2C+TRBP2%2C+and+cyclin+T1+on+HIV+type+1+expression+and+viral+production+in+murine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).</li>
<li>Bannwarth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+regulation+of+TRBP1+promoter+by+NF-Y+transcription+factor+in+lymphocytes+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes.</a> J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).</li>
<li>Clerzius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAR1+interacts+with+PKR+during+human+immunodeficiency+virus+infection+of+lymphocytes+and+contributes+to+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication.</a> J Virol. 83, 10119-10128 (2009).</li>
<li>Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+translation+and+its+regulation+by+cellular+factors+PKR+and+PACT%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT.</a> Virus Res. 193, 65-77 (2014).</li>
<li>ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+HIV-1+with+RNA+interference%3A+a+multiple+shRNA+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach.</a> Mol Ther. 14, 883-892 (2006).</li>
<li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+design+and+validation+of+antiviral+siRNA+for+targeting+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1.</a> Retrovirology. 4, 80(2007).</li>
<li>Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+RNA+splicing+and+inhibition+of+HIV-1+replication+induced+by+modified+U1+small+nuclear+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs.</a> J Virol. 84, 12790-12800 (2010).</li>
<li>Chang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+expression+and+HIV-1+inhibition+of+chimeric+tRNA%28Lys3%29-ribozymes+under+dual+U6+snRNA+and+tRNA+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters.</a> Mol Ther. 6, 481-489 (2002).</li>
<li>Chang, L. J., Liu, X., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+siRNAs+targeting+multiple+highly+conserved+RNA+sequences+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1.</a> Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).</li>
<li>Daniels, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+RRE+RNA+acts+as+an+RNA+silencing+suppressor+by+competing+with+TRBP-bound+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs.</a> RNA Biol. 12, 123-135 (2015).</li>
<li>Castanotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+delivery+of+small+interfering+RNAs+reduces+RNAi+efficacy+by+selective+incorporation+into+RISC%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC.</a> Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).</li>
<li>Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+adaptors+result+in+reduction+of+multiple+pre-mRNA+species+principally+by+sequestering+U1snRNP%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP.</a> Nucleic Acids Res. 39, e71(2011).</li>
<li>Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Viral+Entry+Assays+for+the+Identification+and+Evaluation+of+Antiviral+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Riss, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiss%2C+TL+%22Assay+Guidance+Manual%22">Assay Guidance Manual</a>. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).</li>
<li>Reynolds, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+interferon+response+by+siRNA+is+cell+type-+and+duplex+length-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent.</a> Rna. 12, 988-993 (2006).</li>
<li>Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+or+stimulation%3F+siRNA+delivery+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Chem+Biomol+Eng%22%5BJournal%5D)">Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system.</a> Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De HIV-1-productie-assay beschreven werd uitgevoerd onder toepassing HEK293T-cellen (figuur 2) en is vergelijkbaar met assays gebruikt voor het screenen van HIV-1 RNA doeltreffende ribozym 13, 10,29 shRNA, siRNA 30 en U1i RNA 11,31 doelplaatsen. Verschillende methodes te kwantificeren HIV-1 productie, hebben de meeste studies werd virusproductie 48 uur na cotransfectie van een HIV-1 expressieplasmide met kandidaat-RNAs. Na de productie van HIV-1, onrijpe virio...

Een beperking van de huidige HIV-1 behandelingen is dat ze chronisch moeten worden toegediend aan progressie van de ziekte te voorkomen. Transplantatie van HIV-1 resistent T-lymfocyt of hematopoietische stamcellen, heeft het potentieel om lange termijn controle van HIV-1 replicatie verschaffen bij afwezigheid van de therapie 1,2 en kan ook een effectieve aanpak van een HIV-1 behandeling te bereiken 3. Een manier om cellen resistent tegen HIV-1 replicatie render dient een of meer genen die coderen voor anti-HIV-1 RNA of peptiden in cellen van een geïnfecteerd individu plaatst tijdens een autologe transplantatie 4. Sommige kandidaat anti-HIV-1-genen zijn ontworpen met een aantal invoeren klinische proeven in combinaties van twee of 5 drie 6, de ontwikkeling van HIV-1 resistentie voorkomen dat een enkel gen. Anti-HIV-1 RNA tot de top kandidaten voor combinatie gentherapie vanwege hun lage potentie tot immuunreacties en omdatgetranscribeerd vanaf zeer korte gensequenties. Sommige anti-HIV-1 RNA&#39;s zijn ontworpen om virale binnenkomst en integratie targeten. De meeste anti-HIV-1 RNA doelwit na integratiestappen in de virale levenscyclus (figuur 1). Na integratie remmers omvatten helper-RNA&#39;s, gericht op de HIV-1 regulerende eiwitten Tat of Rev 1, en ​​antisense-RNA gebaseerde, gericht is op verschillende plaatsen in HIV-1 RNA, zoals ribozymen 7, shRNAs 8 en 9 U1i RNAs. Werkwijzen die zijn gebruikt om de effectiviteit van anti-HIV-1 RNA te vergelijken onder controle virale replicatie in cellen getransduceerd met genen coderend voor kandidaat RNA&#39;s en het meten van virusproductie in cellen tijdelijk getransfecteerd met plasmiden die kandidaat RNA en HIV-1 expressieplasmide 10 -13. We hebben voorheen een HIV-1-productie-assay voor het screenen van HIV-1 RNA naar nieuwe ribozyme doelplaatsen 13-15. Deze methoden zijn inmiddels verfijnd om het formaat van een RNA te optimalisereninterferentie molecuul tot expressie gebracht uit plasmide-DNA als een shRNA of geleverd als synthetische siRNA 16. De test meet de productie van rijpe virussen uit humane embryonale nier (HEK) 293T cellen, en kan worden gebruikt om de effecten van remmers die post-integratiestappen in de HIV-1 replicatie cyclus targeten (figuur 1) te vergelijken. Voor remmers die pre-integratiestappen targeten, worden alternatieve assays zoals TZM-bl infectiviteit cell assay 17 nodig antivirale werkzaamheid te evalueren. Belangrijke veiligheidsproblemen voor de afgifte van anti-HIV-1 RNA in de kliniek onder potentiële off-target effecten op de RNA of eiwitten, en activering van aangeboren immuunsysteem sensoren. Om de toxiciteit van anti-HIV-1 siRNA evalueren, hebben wij een cellevensvatbaarheid assay verschillende cellijnen 16 gebruikt. Ook gemeten activatie van het dubbelstrengs RNA immune sensoren, RNA geactiveerd proteïne kinase R (PKR) en toll-like receptor 3 (TLR3), alsmede expression van de interferon-geïnduceerde gen, ADAR1 P150. Deze testen kunnen worden gebruikt om te bevestigen dat de werkzaamheid van anti-HIV-1 RNA&#39;s niet door indirecte effecten op cellevensvatbaarheid of immuun activering sensor. Ze zijn ook bruikbaar bij het uitsluiten van kandidaat RNA met potentiële toxiciteiten verdere ontwikkeling. In de volgende protocollen, procedures nieuwe therapeutische RNAs identificeren en optimaliseren van de vorm van bestaande beschreven. De werkwijzen zijn bruikbaar voor het screenen op RNA gebaseerde na integratie remmers van HIV-1 replicatie en kunnen worden aangepast aan andere post-integratie remmers, zoals kleine moleculen gericht op Rev gemedieerde uitvoer van viraal RNA 18 of CRISPR scherm / Cas systemen die gericht geïntegreerd HIV-1-DNA 19.

<table><tbody><tr><td>DMEM HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin Gibco</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Celcultuur platen, 96 wel, 24 wel, 6 wel.</td><td>Corning</td><td>353075, 353047, 353043</td><td></td></tr><tr><td>Micro tubes Axygen</td><td>Corning</td><td>311-08-051</td><td></td></tr><tr><td>Poly I:C met laag molecuulgewicht</td><td>InvivoGen</td><td>3182-29-6</td><td></td></tr><tr><td>DharmaFECT-1</td><td>Dharmacon</td><td>T-2001-01</td><td>transfectie reagens voor synthetische RNA's</td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td>transfectie reagens voor RNA expressie plasmiden</td></tr><tr><td>Nonidet P40 (NP-40)</td><td>USB</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>[32P]dTTP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU505H</td><td></td></tr><tr><td>poly(A) RNA sjabloon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10108626001</td><td></td></tr><tr><td>oligo(dT)12-18 DNA primer</td><td>Thermo Fisher</td><td>18418-012</td><td></td></tr><tr><td>DEAE filtermat papier</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-522</td><td></td></tr><tr><td>Microplaat scintillatieteller</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-024</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2128</td><td></td></tr><tr><td>DPBS HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Microplaat spectrofotometer</td><td>Bio-rad</td><td>1706930</td><td></td></tr><tr><td>Lyse buffertabletten</td><td>Roche</td><td>4693159001, 4906837001</td><td>protease en fosfataseremmers</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagens</td><td>Bio-rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Gel renkamer</td><td>Hoefer</td><td>SE600</td><td></td></tr><tr><td>Semi-dry transfercel</td><td>Bio-rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Protein ladder EZ-Run</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP3603-500</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membraan</td><td>Bio-rad</td><td>162-0094</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-1006</td><td></td></tr><tr><td>Antilichaam strip oplossing</td><td>Millipore</td><td>2504</td><td></td></tr><tr><td>ECL - Pierce</td><td>Thermo Fisher</td><td>PI32106</td><td></td></tr><tr><td>ADAR1 antilichaam</td><td></td><td></td><td>van Dr. B.L. Bass</td></tr><tr><td>phospho-T446-PKR antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab32036</td><td></td></tr><tr><td>phospho-S396-IRF3 antilichaam</td><td>Cell Signaling</td><td>4947</td><td></td></tr><tr><td>PKR antilichaam</td><td></td><td></td><td>van Dr. A. Hovanessian</td></tr><tr><td>IRF3 antilichaam</td><td>Cell Signaling</td><td>11904</td><td></td></tr><tr><td>Actin antilichaam</td><td>Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase-gelabeld geiten anti-konijn</td><td>KPL</td><td>474-1506</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase-gelabeld geiten anti-muis</td><td>KPL</td><td>474-1806</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6226-79-5</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluatie van de effectiviteit en toxiciteit van rna&#39;s targeting hiv-1 productie voor gebruik in gene of drug therapy

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Kleine RNA-therapieën die zich richten op stappen na integratie in de HIV-1 replicatiecyclus behoren tot de topkandidaten voor gentherapie en hebben het potentieel om te worden gebruikt als medicijntherapieën voor HIV-1 infectie. Post-integratie-remmers omvatten ribozyms, korte haakjes (sh) RNA's, kleine interfererende (si) RNA's, U1 interferentie (U1i) RNA's en RNA aptamers. Veel hiervan zijn geïdentificeerd met behulp van transiente co-transfectie assays met een HIV-1 expressie plasmide en sommige zijn gevorderd naar klinische proeven. Naast maatregelen voor effectiviteit, zijn kleine RNA's geëvalueerd op hun potentieel om de expressie van menselijke RNA's te beïnvloeden, celgroei en/of differentiatie te veranderen en innate immuunresponsen op te roepen. In de hier beschreven protocollen wordt een reeks transiente transfectie assays beschreven die zijn ontworpen om de effectiviteit en toxiciteit van RNA moleculen die zich richten op stappen na integratie in de HIV-1 replicatiecyclus te evalueren. We hebben deze assays gebruikt om nieuwe ribozyms te identificeren en het formaat van shRNA's en siRNA's die zich richten op HIV-1 RNA te optimaliseren. De methoden bieden een snelle reeks assays die nuttig zijn voor het screenen van nieuwe anti-HIV-1 RNA's en zouden kunnen worden aangepast om andere post-integratie-remmers van HIV-1 replicatie te screenen.

Een algemeen schema van de procedure is weergegeven in figuur 2 een voorbeeld transfectie plan voor drie proeven RNA en een RNA controle verschaft in Figuur 2B. Voor virusproductie en cellevensvatbaarheidsassays, de aflezing voor elke test construct is genormaliseerd op een negatieve controle. Replicaten worden getransfecteerd in sets, zodat elke test RNA wordt genormaliseerd naar de aangrenzende negatieve controle. Dit wordt gedaan om onjuiste gegevens ...

Methoden om de werkzaamheid en toxiciteit van RNA-moleculen die zich richten op post-integratie stappen van de HIV-1 replicatiecyclus te evalueren, worden beschreven. Deze methoden zijn nuttig voor het screenen van nieuwe moleculen en het optimaliseren van de indeling van bestaande.

Evaluatie van de effectiviteit en toxiciteit van RNA&#39;s Targeting HIV-1 productie voor gebruik in Gene of Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Het algemene doel van deze procedure is om de werkzaamheid en toxiciteit van nieuwe RNA's die gericht zijn op de productie van HIV-1 te vergelijken. Deze methode kan helpen bij het identificeren van nieuwe RNA-moleculen voor gebruik in HIV-1 gentherapie of medicamenteuze therapie, zoals short hairpin- of small interfering RNA's, ribozymen en RNA-decoys. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat verschillende nieuwe RNA-ontwerpen gelijktijdig gescreend kunnen worden met een korte doorlooptijd.Hoewel deze methode is ontworpen om nieuwe RNA-geneesmiddelen of gentherapie voor hiv te evalueren, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals kleine moleculen of CRISPR-toepassingen. We kregen het idee voor deze methode toen we experimenten opzetten om een groot aantal ribozymen te screenen op anti-hiv-effecten. Bereid als eerste een suspensie van humane embryonale nier 293T-cellen voor met een concentratie van 2 × 10⁵ cellen per ml in DMEM met 10% FPS en 1% penicilline-streptomycine.Voeg 500, 100 en 1.000 µL van de celсусpensie toe aan elk van de putjes van 24-, 96- en 12-wells platen voor respectievelijk assays voor virale productie, celviabiliteit en immuunactivatie. Draai de platen voorzichtig rond en incubeer ze overnacht bij 37 °C met 5% CO2 tot een confluentie van 50% tot 70%. Bereid voor de assay voor virale productie een verdunning van 10 ng/µL van een HIV-1 expressieplasmide en voeg 10 µL toe aan elke assaybuis.Bereid vervolgens vijf micromolaire verdunningen van de test-RNA's en een negatieve controle-RNA voor. Voeg daarna 2,5 µL of 10 µL van elke test-RNA- en negatieve controleverdunning toe aan de overeenkomstige buisjes voor eindconcentraties van 25 nM of 100 nM. Bereid voor de celviabiliteitsassay vijf micromolaire verdunningen van de test-RNA's en een verdunning van 10 mg/mL van de positieve controle-RNA, poly(I:C) met een laag molecuulgewicht. Voeg twee µL van de test-RNA- of de positieve controle-RNA-verdunningen toe aan de overeenkomstige buisjes voor respectievelijk eindconcentraties van 100 nM of 200 µg/mL.Voeg voor de immuunactivatie-assay 20 µL van de verdunningen van het test-RNA of het positieve controle-RNA, zoals bereid voor de celviabiliteitsassay, toe aan de overeenkomstige buisjes voor respectievelijk uiteindelijke concentraties van 100 nM of 200 µg/mL. Voeg vervolgens 50, 25 of 75 µL DMEM toe aan elk transfectiebuisje voor respectievelijk de assays voor virusproductie, celviabiliteit en immuunactivatie. Breng voor de virusproductie-assays de cellen en de bereide transfectiebuisjes naar een laboratorium met biosafety level 3, of BSL-3, vóór de volgende stap.Voeg sequentieel twee microliter van het transfectiereagens toe aan de transfectiebuisjes en incubeer 15 tot 20 minuten om de vorming van complexen mogelijk te maken. Voeg het volledige transfectiemengsel uit elk microbuisje druppelsgewijs toe aan de overeenkomstige posities in de celkweekplaten. Draai de platen voorzichtig rond en incubeer deze gedurende 48 uur bij 37 °C en 5% koolstofdioxide.Om de assay voor virale productie uit te voeren, plaatst u de 24-well celkweekplaten na verwijdering uit de incubator in de BSL-3 celkweekkast. Schud de platen voorzichtig rond en breng vervolgens 150 µL van het supernatant uit elke well over naar een overeenkomstige well in een 96-well platbodemplaat, die gebruikt zal worden voor de kwantificering van de HIV-1 productie. Breng vijf µL supernatant over naar de overeenkomstige wells in een 96-well plaat die 25 µL van een virale disruptiecocktail bevat.Na het incuberen van het mengsel gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, wordt de plaat overgebracht naar een werkstation voor radioactiviteit. Bereid vervolgens een radioactieve cocktail en voeg 25 µL toe aan elke put met viraal supernatant en disruptiecocktail. Incubeer de platen gedurende twee uur bij 37 °C.Pipetteer vijf microliters van het reactiemengsel op de overeenkomstige vakken van een glasvezel/DEAE-filtermatpapier en laat de vlekken 10 minuten drogen. Was de papieren vijf keer gedurende vijf minuten met 2x SSC-buffer, gevolgd door twee wasbeurten van één minuut met 95% ethanol. Laat de papieren drogen voordat ze in monsterzakken worden verzegeld.Bevestig de monsterzakjes met het filtermatpapier in een cassette en plaats de cassette in een microplaat-scintillatieteller. Start vervolgens de teller. Voor elke methode tot virale kwantificering worden de verkregen waarden voor elk test-RNA gedeeld door de aangrenzende negatieve controle; vermenigvuldig deze waarde met 100 om het percentage inhibitie van HIV-1 productie voor elk replica van de test-RNA's te bepalen.Om een cellevensvatbaarheidsassay uit te voeren, voegt u na het verwijderen van de 96-wells platen uit de incubator 20 µL van 5 mg/mL MTT en DPBS toe aan elke well. Incubeer de platen vervolgens gedurende drie uur bij 37 °C. Voeg 150 µL aangezuurd isopropanol met detergent toe aan elke well en incubeer de platen gedurende twee uur bij kamertemperatuur.Gebruik vervolgens een microplaat-spectrofotometer om de absorbantie bij 570 nanometer te bepalen. Bereken het relatieve MTT-metabolisme voor elke positieve controle en test-RNA door de waarde van elk monster te delen door de bijbehorende transfectiecontrole. Voor de immuunactivatie-assay wordt het kweekmedium afgezogen nadat de 12-wells platen uit de incubator zijn gehaald, waarna de cellen twee keer voorzichtig worden gewassen met DPBS.Voeg vervolgens 70 µL koude lysisbuffer met protease- en fosfataseremmers toe aan elke well en incubeer de platen 10 minuten op ijs. Breng de cellysaten over naar microtubes en vries deze snel in door de tubes in vloeibare stikstof te dompelen. Laat de monsters ontdooien en voer vervolgens nog twee vries-dooi-cycli uit, voor een totaal van drie vries-dooi-cycli.Centrifuge vervolgens de lysaten bij 15.700 ×g en 4 °C gedurende 15 minuten om het celdebris te pelletteren. Onthul daarna, na elektroforese en overdracht naar een membraan, de eiwitbanden door het membraan één minuut te incuberen in Ponceau S. Was het vervolgens met dubbel gedestilleerd water.Gebruik de banden en de eiwitladder als leidraad om het membraan op 80 en 55 kilodalton door te knippen. Gebruik nu TBS met 0,05% TWEEN 20 of TBST om de Ponceau S-kleuring uit te wassen. Voeg TBST met 5% vetarme melk toe om de membranen volledig te bedekken en incubeer deze gedurende één uur bij kamertemperatuur onder agitatie.Breng de membranen over naar TBST met 3% BSA en antilichamen verdund 1:1.000 voor ADAR, fosfor-PKR en fosfor-IRF3 voor respectievelijk de bovenste, middelste en onderste stukken van het membraan. Incubeer gedurende de nacht bij 4 graden Celsius onder agitatie. Was de membranen de volgende ochtend vijf keer gedurende vijf minuten met TBST, alvorens ze voor één uur over te brengen naar TBST met 5% ontvette melk en 1:5.000 peroxidase-gelabelde geit anti-konijn secundaire antilichamen.Nadat de proteïnebanden op films zijn gevisualiseerd, wordt een stripping-oplossing gebruikt om de middelste en onderste delen van het membraan gedurende 10 minuten te wassen, waarna het middelste deel van het membraan wordt geïncubeerd met PKR-antilichamen en het onderste deel met IRF3-antilichamen. Als positieve controle wordt het onderste membraan gesondeerd met antilichamen tegen Actin volgens het tekstprotocol. Een algemeen schema van de assays wordt hier getoond, inclusief een voorbeeld van een transfectieplan voor drie test-RNA's en een controle-RNA.Voor assays voor virale productie en celviabiliteit wordt de readout voor elk testconstruct genormaliseerd ten opzichte van een negatieve controle. Met behulp van de HIV-1 productie-assay in cellen getransfecteerd met een plasmide dat HIV-1 stam NL4-3 tot expressie brengt, werd het percentage RT-activiteit in cellen die gecotransfecteerd waren met een van de hier getoonde siRNAs, vergeleken met cellen getransfecteerd met een lang Dicer-substraat nonsense siRNA, berekend om de optimale lengte van RNA-interferentiemoleculen gericht op een geconserveerde site in HIV-1 RNA te identificeren. Met behulp van de meest effectieve geïdentificeerde siRNAs werd het percentage MTT-metabolisme voor de getransfecteerde cellen bepaald.In tegenstelling tot dubbelstrengs RNA, verminderde poly(I:C) de celviabiliteit alleen bij de hoogste dosis. Er werd geen significante afname van de celviabiliteit waargenomen voor siRNAs die gericht waren op de 1498-site in HIV-1 RNA, ongeacht hun lengte. Zoals hier aangetoond via Western blot, werd dezelfde set RNA's geëvalueerd in de assay voor immuunactivatie.Onder omstandigheden waarbij poly(I:C) de expressie van ADAR1-p150 activeerde en fosforylering van PKR en IRF3 induceerde, kon er voor geen van de geteste RNA's een significant effect op enige inactivatiemarkers worden waargenomen. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in zeven dagen worden voltooid, mits deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om gebruik te maken van hoogwaardige preparaten van zowel RNA als DNA voor transfectie.Bovendien, om de juiste negatieve en positieve controles op te nemen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals HIV-infectie van getransduceerde cellen, worden gebruikt om de langetermijneffectiviteit en toxiciteit van potentiële anti-HIV-kandidaten te evalueren. Na de ontwikkeling stelde deze techniek ons in staat om een toegankelijke en geconserveerde doelsite in HIV-RNA te identificeren en de formaten van ribozymen, shRNA's en siRNA's die hierop gericht zijn, te optimaliseren.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u nieuwe RNA-kandidaten die gericht zijn op de HIV-productie snel kunt screenen op werkzaamheid met behulp van de assay voor virale productie, en op potentiële toxiciteit met behulp van de assays voor immuunactivatie en celviabiliteit. Vergeet niet dat het werken met HIV en radiogemarkerde nucleotiden extreem gevaarlijk kan zijn. Bij het uitvoeren van deze procedure moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het gebruik van gecertificeerde laboratoria voor biosafety en radioactiviteit.

evaluation-efficacy-toxicity-rnas-targeting-hiv-1-production-for-use

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De huidige HIV-1-strategieën handelen om de virale levenscyclus te onderdrukken, maar niet werkelijk uit te roeien infectie. Hier tonen we aan dat een aangelegde recombinase efficiënt kunnen accijnzen geïntegreerd HIV-1 proviraal DNA van het genoom van de geïnfecteerde cellen.

Interview: HIV-1 proviraal DNA Excisie Met behulp van een Evolved recombinase

Verschillende 2'-fluor RNA aptameren tegen HIV-1Ba-L gp120 met nanomole affiniteit geïsoleerd zijn van een RNA bibliotheek...

Ontwikkeling van Cell-type-specifieke anti-HIV-gp120 aptameren voor siRNA levering

De voorspelling van de coreceptor gebruik van HIV-1 is vereist voor de toediening van een nieuwe klasse antiretrovirale geneesmiddelen, namelijk coreceptor antagonisten. Het kan worden uitgevoerd door sequentieanalyse van...

Voorspelling van HIV-1 coreceptor Usage (tropisme) Sequentie analyse met een Genotypische Approach

RNA-interferentie (RNAi) beschikt over een groot aantal voordelen ten opzichte van gen knock-out en is in brede kring gebruikt als een instrument in gen functionele studies. De uitvinding van DNA-vector-gebaseerde RNAi-technologie heeft op lange termijn en induceerbaar gen knockdown mogelijk, en verhoogde ook de haalbaarheid van gene...

DNA vector-gebaseerde RNA-interferentie op genfunctie in Cancer Study

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Hier beschrijven we cellulaire cytotoxiciteit en ronde infectiviteitsassays die zorgen voor een snelle en nauwkeurige screening van verbindingen om hun cellulaire cytotoxiciteit (CC50) bepalen en IC 50-waarden tegen WT en resistente HIV-1.

Snelle screening van HIV reverse transcriptase en integrase-remmers

Hier beschrijven we een protocol voor de toepassing van high-throughput RNAi screening te ontdekken van de doelen van de gastheer die kunnen worden gemanipuleerd om het verbeteren van oncolytische virus therapie, specifiek rhabodvirus en vaccinia virus therapie, maar het kan gemakkelijk aangepast worden aan andere oncolytische virus platformen of voor het ontdekken van host-genen die virus replicatie in het algemeen moduleren.

Genoom-brede RNAi Screening factoren te identificeren Host die moduleren van oncolytische Virus therapie

Een hoge doorvoersnelheid protocol voor functionele beoordeling van efficiënte reactivering van HIV en de ontmijning van latente proviruses is beschreven en toegepast door het testen van het effect van interventies op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren. Representatieve resultaten van het effect van latentie omkering van agenten op LTR-gedreven transcriptie, egaliseren en lamineren zijn verstrekt.

High Throughput In Vitro beoordeling van latentie omkering van agenten op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren

We hebben een protocol ontwikkeld voor de generatie en evaluatie van een gehumaniseerd en menselijk immunodeficiëntievirus besmet NOG muismodel op basis van stamceltransplantatie, intravaginale blootstelling aan het menselijke immunodeficiëntievirus en druppeldigitale PCR RNA Kwantificering.

Gehumaniseerde NOG Muizen voor intravaginale HIV Blootstelling en behandeling van HIV-infectie

Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling en validatie van goede laboratoriumpraktijken in de conforme detectie van adeno-geassocieerde virale vectoren in menselijke tranen door druppel digitale polymerasekettingreactie ter ondersteuning van de klinische ontwikkeling van gentherapievectoren.

Een valideerbare druppel digitale polymerasekettingreactietest voor de detectie van adeno-geassocieerde virale vectoren in biosheddingstudies van tranen

Deze studie gebruikte in-silico-strategieën om Enumerated Etravirine te identificeren als een veelbelovend therapeutisch middel voor HIV. Onze bevindingen over moleculaire interacties en dynamiek ondersteunen het rationele ontwerp van nieuwe NNRTI's als mogelijke alternatieven voor de behandeling van hiv.

Kwantitatieve structuur-activiteitsrelatie, activiteitsvoorspelling en moleculaire dynamiek van niet-nucleotide reverse transcriptaseremmers

Leer een methode om de effectiviteit en toxiciteit van RNA-moleculen tegen HIV-1 te evalueren met behulp van humane embryonale nier 293T-cellen. Deze techniek maakt snelle screening van meerdere RNA-ontwerpen mogelijk.

Evaluatie van de effectiviteit en toxiciteit van RNA's Targeting HIV-1 productie voor gebruik in Gene of Drug Therapy

Meer video's verkennen