Ontwikkeling van een meer gevoelige en specifieke Chromogenic Agar Medium voor de detectie van Vibrio parahaemolyticus En andere Vibrio Species

Het algemene doel van deze procedure is om de gevoeligheid en specificiteit van een nieuw chromogeen medium te evalueren voor het vermogen om Vibrio parahaemolyticus te detecteren en isoleren in vergelijking met conventionele media. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van voedsel- en milieumicrobiologie, zoals wat is de prevalentie van Vibrio-soorten in voedsel en oogstmilieus? Het grote voordeel van onze procedure is dat veel bacterie-isolaatjes kunnen worden gebruikt, ook in aanwezigheid van een voedselmatrix.

Voor het kweken van de bacteriën, autoclaveer al het agarmedium. Koel vervolgens de agar af tot 45 tot 50 graden Celsius in een waterbad. Wanneer de agar klaar is, schik lege petrischalen in stapels van vijf tot zes schalen.

Giet vervolgens, beginnend vanaf de onderkant van de stapel, de gesmolten agar in elke schaal tot ongeveer halfvol, en vervang de deksels na het gieten. Laat de agar minstens 12 uur bij kamertemperatuur stollen. Om de microbiële stamculturen op te zetten, gebruik wanneer de agar klaar is, een steriele inoculatieschraper om de culturen over te brengen op de juiste niet-selectieve agarplaten, waarbij de bacteriën in een patroon worden uitgestreken dat de observatie van geïsoleerde kolonies mogelijk maakt.

Wanneer alle kolonies zijn uitgezaaid, incubeer de culturen ondersteboven bij 35 tot 37 graden Celsius gedurende maximaal 48 uur, behalve voor Campylobacter-soorten, die in een gesloten pot met een gaszak moeten worden geïncubeerd om een micro-aerofiele omgeving te creëren. Observeer de koloniemorfologie aan het einde van de incubatie. Pure culturen zouden kolonies moeten opleveren die een vergelijkbare koloniemorfologie vertonen.

Om de kolonies van belang op selectieve en differentiële media te laten groeien, breng enkele geïsoleerde kolonies over in vijf milliliter van het juiste bouillon en incubeer de culturen opnieuw bij 35 tot 37 graden Celsius gedurende 16 tot 24 uur. De volgende dag, spreid een lusvol van de overnachtculturen uit op ten minste één Thiosulfaat-Citraat-Bile-Zouten-Sucrose, of TCBS, agarplaat, en ten minste één chromogeen agarplaat voor maximaal 96 uur incubatie bij 35 tot 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, onderzoek zowel de cultuurdichtheid op de plaat als de grootte van de geïsoleerde kolonies om de algehele groei van de stammen te bepalen, en noteer de kleur van de kolonies onder omgevings- of UV-licht, indien van toepassing, en merk eventuele andere belangrijke kenmerken van de kolonies op.

Om een hersteltest uit te voeren, inoculeer jonge culturen van Vibrio parahaemolyticus in vijf milliliter tryptische sojabout, aangevuld met twee procent natriumchloride, of TSBS, en plaats de buisjes bij 35 tot 37 graden Celsius gedurende 16 tot 24 uur. De volgende dag, vortex de overnachtculturen en stel eenmaal 10 tot de negatieve één tot eenmaal 10 tot de negatieve zeven verdunning van de bacteriën in PBS op. Gebruik de eenmaal 10 tot de negatieve vier tot eenmaal 10 tot de negatieve zeven verdunning om 100 microliter van elke verdunning gelijkmatig op individuele chromogene, TCBS en tryptische sojaagar aan te brengen, aangevuld met twee procent natriumchloride, of TSAS, platen.

Incubeer alle platen bij 35 tot 37 graden Celsius gedurende maximaal 96 uur. Tel vervolgens de kolonies, negeer de platen met te talrijke kolonies om te tellen of met minder dan 25 kolonies. Om een competitietest uit te voeren, selecteer een V.Parahaemolyticus-stam die de verwachte turquoise kolonies op TCBS en cyaan kolonies op chromogeen agar geeft, en een niet-V.

Parahaemolytius-soort die niet op beide media groeit of een andere koloniekleur vertoont. Breng enkele geïsoleerde V.Parahaemolyticus- en V.Metschnikovii-kolonies over van een TSAS-landbouw naar vijf milliliter TSBS voor 16 tot 24 uur incubatie bij 35 tot 37 graden Celsius. Breng enkele geïsoleerde Shigella sonnei-kolonies over van Brain Heart Infusion, of BHI, agar naar vijf milliliter BHI-bouillon gedurende 16 tot 24 uur bij 35 tot 37 graden Celsius.

De volgende dag, voer een seriële verdunning uit voor elke stam, en plaats de verdunning op niet-selectieve agarplaten om de kolonievormingseenheden per milliliter van de overnachtculturen te bepalen. Gebruik vervolgens de overnachtculturen en verdunningsbuisjes om verschillende volumes van een V.Parahaemolyticus-stam en een niet-V. Parahaemolyticus-soort te mengen en spreid 100 microliter van het bacteriemengsel uit op individuele chromogene, TCBS en TSAS-agarplaten.

Na maximaal 96 uur bij 35 tot 37 graden Celsius, tel de kolonies op basis van hun verschillen in groei en morfologie op de chromogene en TCBS-platen. Om de effecten van oesterhomogenaten op bacteriegroei op selectieve en differentiële media te beoordelen, weeg eerst minimaal 50 gram oestervlees van ten minste 12 weekdierschelpdieren, inclusief het vlees en de liquor. Voeg vervolgens een gelijke massa PBS toe aan de oesterweefsels en meng het mengsel op hoge snelheid gedurende 90 seconden.

Voeg vervolgens 100 gram van het verdunde oesterhomogenaat toe aan 400 gram PBS en meng het mengsel gedurende één minuut op hoge snelheid. Autoclaveer vervolgens het homogenaat. Na afkoeling, voeg 100 microliter van elke overnacht V.Parahaemolyticus en niet-V.

Parahaemolyticus-cultuur toe aan de oesterslurry, en gebruik een homogenisator om de bacteriecellen met het oesterhomogenaat te mengen. Maak eenmaal 10 tot de negatieve één tot eenmaal 10 tot de negatieve drie verdunning van de gespikte oesterhomogenaat in PBS zoals gedemonstreerd, en spreid 100 microliter van elke verdunning uit op individuele chromogene, TCBS en TSAS-platen. Na 96 uur bij 35 tot 37 graden Celsius, vergelijk de werkelijke kolonietellingen op de chromogene en TCBS-