Name: Ontwikkeling van een meer gevoelige en specifieke Chromogenic Agar Medium voor de detectie van Vibrio parahaemolyticus En andere Vibrio Species (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Leer een nieuw chromogeen agarmedium evalueren voor de detectie van Vibrio parahaemolyticus met hogere gevoeligheid en specificiteit dan conventionele methoden. Dit verbetert voedselveiligheidsmonitoring.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken M. Channey, E. Chau, en K. Tomas voor hun hulp aan het project. Project leveringen werden gedeeltelijk gefinancierd door de California Polytechnic State University.

1. Media en het kweken van bacteriestammen LET OP: Gebruik aseptische technieken in alle experimenten. Gebruik steriele materialen. Steriliseren alle containers, instrumenten en reagentia voor gebruik. Autoclaaf alle afvalstoffen voorafgaand aan verwijdering, omdat ze biologisch gevaarlijk worden beschouwd. Autoclaaf temperatuur en tijd combinatie ≥121 ° C x ≥15 min voor elk van de volgende procedures. <ol><li> Om ~ 1-L tryptische soja-agar (TSA), eerste voeg 1 L gedeïoniseerd water in een 2-L Erlenmeyer kolf met een magnetische roerstaaf. Gebruik een kolf die ten minste twee maal groter is dan het volume. Voeg 30 g tryptische soja bouillon poeder en 20 g agar korrels in de kolf. LET OP: Gebruik 2% agar in plaats van 1,5% tot zwermende van een aantal Vibrio spp beperken. <ol><li> Meng goed door het inschakelen van de roerder. Onder roeren, zet de warmte aan het mengsel koken. Verwijder de kolf uit de kachel zodra het mengsel begint te koken. Losjes dekken the kolf met een aluminiumfolie. Tape de folie om het vast te zetten aan de kolf vóór autoclaaf. </li><li> Om tryptische soja bouillon (TSB) te maken, laat de agar van het recept in stap 1.1. LET OP: Het gebruik van mei flessen in plaats van Erlenmeyer. </li><li> Om tryptische soja-agar gesupplementeerd met 2% natriumchloride of NaCl (TSA), voeg 20 g NaCl in het mengsel vóór het roeren en verwarmen. Om tryptische soja bouillon aangevuld met 2% NaCl (TSBS) te maken, laat de agar, voeg 20 g NaCl in het mengsel voorafgaand aan het roeren en verwarmen. </li></ol></li><li> Om de hersenen het hart infusie (BHI) agar te maken, op te schorten 37 g BHI poeder en 15 g agar korrels in 1 liter gezuiverd water. Heat met frequente agitatie om het poeder op te lossen. Autoclaaf. Laat de agar om BHI bouillon te maken. </li><li> Om TCBS agar te maken, op te schorten 89 g van het TCBS poeder in 1 liter gezuiverd water. Heat met frequente agitatie en kook gedurende 1 minuut om volledig op te lossen het poeder. Niet in een autoclaaf. </li><li> Voor alle agar media, koelen van de hete agar naar 45-50 ° C in een waterbad. Schik lege Petri platen in stapels van 5-6 platen. Vanaf de bodem van de stapel, giet het gesmolten agar in elk Petri plaat halfvol bereiken. Sluit de Petri plaat deksel na het gieten. Laat de agar te stollen door te laten de platen zitten bij kamertemperatuur. <ol><li> Gebruik de agarplaten de volgende dag of na 12 uur. Bewaar ongebruikte platen in de koelkast voor maximaal twee weken. Verwijder voor gebruik platen uit de koelkast en equilibreren bij kamertemperatuur gedurende ten minste 15 min. LET OP: One-liter agar maakt ~ 45 agarplaten. Laat de agarplaten voldoende drogen op de dag van bereiding en evenwicht ze op kamertemperatuur na koude opslag effectief de verspreiding van de kolonies. </li></ol></li><li> Verkrijgen chocolade en chromogene agarplaten en equilibreren bij kamertemperatuur vóór elk experiment. </li><li> Subcultuur alle 54 microbiële stammen weergegeven in tabel 1 elk paar days. <ol><li> Gebruik een steriele entnaald om culturen te brengen van een bevroren voorraad of een vorige partij om niet-selectieve media zoals BHI, TSB / TSA of chocolade agar. Grow halophilic Vibrio spp. op TSBS / TSA. </li><li> Om de zuiverheid van de kweek controleren, strook alle stammen in een patroon die het mogelijk maken voor waarneming van geïsoleerde kolonies. Gebruik bijvoorbeeld driefase strepen patroon een grote hoeveelheid bacteriën verdunnen tot kleinere hoeveelheid, hetgeen uiteindelijk geïsoleerde kolonies. </li></ol></li><li> Incubeer de platen omgekeerd bij 35-37 ° C gedurende maximaal 48 uur. Voor Campylobacter spp., Incubeer buizen of platen in een gesloten deksel pot met daarin een gas hoes om een ​​Microaërofiele omgeving te produceren. Observeer kolonie morfologie na incubatie. Zuivere culturen moet kolonies die vergelijkbaar koloniemorfologie vertonen verkregen. OPMERKING: Incubeer alle platen ondersteboven te voorkomen gecondenseerde waterdruppels gevormd aan de onderzijde van het deksel valt op de colOnies. </li></ol> 2. Soort Vaststelling door PCR <ol><li> Gedrag tlh -PCR om de identiteit van V. bevestigen parahaemolyticus stammen. Gebruik primers TLH -F (5 &#39;AAA GCG GAT TAT GCA GAA GCA CTG 3&#39;) en tlh -R (5 &#39;GCT ACT TTC CAT TAG TTT CTC TGC 3&#39;) om een 450-bp fragment van de thermolabiele hemolysine gen 20 amplificeren . <ol><li> Gebruik een steriele entnaald om een paar geïsoleerde kolonies van elk V. overdragen parahaemolyticus stam van TSA tot 5 ml TSBS. Incubeer bij 35-37 ° C gedurende 16-24 uur. </li><li> Centrifugeer kweken bij 14.000 xg gedurende 1 min. Verwijder supernatant en was de pellet tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Kook de suspensie gedurende 3 min cellysaat verkregen. LET OP: V. parahaemolyticus is gemakkelijk te worden gelyseerd. Daarom lysis reagens is niet vereist. Het is ook mogelijk een beetje kolonie rechtstreeks gebruikt als de template. </li><li> Voer PCR in een 25-ul reactie volume. Bereid een reactiemengsel dat een uiteindelijke concentratie van 1x PCR-buffer, 1,5 mM MgCl2, 100 uM van elk dNTP, 1 uM van elke primer, 1 U Taq-polymerase en 1 pl cellysaat. Na voorincubatie bij 94 ° C gedurende 5 min, run 35 amplificatie cycli van 94 ° C gedurende 30 sec, 58 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 60 sec 21. </li><li> Belasting aliquots van 5 pl amplicon in 1,5% agarosegels. Schakel de stroomtoevoer naar elektroforese starten. Visualiseren de aanwezigheid of afwezigheid van amplicons onder UV-belichting na ethidiumbromide kleuring. </li></ol></li></ol> 3. Groei op Selectief en Differential Media <ol><li> Twee tot vier dagen voor het experiment, streep bacteriële stammen weergegeven in Tabel 1 op niet-selectief medium (TSA, of chocolade BHI agar) voor colony isoleren. Incubeer de platen bij 35-37 ° C gedurende 48 uur. Controleer de zuiverheid van de kweken door het observeren kolonie morfologie na incubatie. Zuivere culturen moet kolonies die vergelijkbaar koloniemorfologie vertonen verkregen. </li><li> Transfer enkele geïsoleerde kolonies van Stap 3,1 tot 5 ml bouillon. Incubeer buizen bij 35-37 ° C gedurende 16-24 uur. OPMERKING: Gebruik de jonge kolonies, die minder dan vier dagen oud zijn, om &#39;s nachts culturen bereiden in alle experimenten. </li><li> Streak een lus vol van &#39;s nachts culturen op selectieve en differentiële media (TCBS en chromogene agar) voor kolonie isolement. Incubeer de platen bij 35-37 ° C gedurende maximaal 96 uur. </li><li> Noteer de globale groei van alle stammen van onderzoeken zowel de kweekdichtheid op de plaat en de afmeting van geïsoleerde kolonies. Noteer de kleur van kolonies onder omgevings- en / of UV-licht. Let op andere kenmerken van geïsoleerde kolonie zoals de verheffing, marge en vorm. </li></ol> 4. Recovery Assay <ol><li> Selecteer een representatieve deelverzameling V. parahaemolyticus stammen (n = 14) die verschillende serotypen en de oorsprong van isolatie omvatten <sup&gt; 22. Inoculeer jonge culturen van de platen in 5 ml TSBS. Incubeer de buizen bij 35-37 ° C gedurende 16-24 uur. </li><li> Voer een Standaardkiemgetal werkwijze volgens de overnachtcultures zoals hieronder beschreven. <ol><li> Vortex aan de &#39;s nachts culturen meng goed. Voeg een 10-voudig of 10 -1 verdunning door overdracht 100 pl van de kweek gedurende de nacht in een buis met 900 ui PBS. Vortex goed te mengen. </li><li> Gebruik een nieuwe pipet tip om 100 ul te brengen van de 10 -1 verdunning buis naar een andere buis met 900 ul PBS. Vortex goed te mengen. Dit vormt 10 -2 verdunning. Herhaal de werkwijze sequentieel 10 -7 verdunning te verkrijgen. </li><li> Met de 10 -4 tot 10 -7 verdunningsbuizen, plaat 100 ul elk op het chromogene, TCBS en TSA agarplaten. LET OP: De verdunningsfactor (DF) op de plaat wordt 10 -5 tot 10 -8, respectievelijk. </li><li> Verdeel de porties gelijkmatig over thij agar oppervlak. Opmerking: Het is goed om hetzelfde spreider per stam op hetzelfde medium, zolang het meest verdunde monster eerst verspreid (dwz van 10 tot -8 10 -5). Doe hetzelfde strooier voor verschillende media niet gebruiken. </li><li> Incubeer de platen bij 35-37 ° C gedurende maximaal 96 uur. Rekenen kolonies op de platen. Negeren platen waarop kolonies die te talrijk om te tellen (tntc) of minder dan 25. Bereken CFU / ml volgens de volgende zijn: <img alt="vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/54493/54493eq1.jpg" /> Waar N = het aantal cellen in de onverdunde buis, uitgedrukt in CFU / ml of CFU / g C = het totale aantal getelde kolonies op platen die 25-300 kolonies dragen n 1 = het nummer van de plaat (en) waar geteld kolonies zijn afkomstig uit de lagere df n2 = het aantal platen (en) waar kolonies geteld vanaf de volgende 10-voudige verdunning df = de onderste verdunningsfactor (dat wil zeggen, meer geconcentreerd verdunning) </li></ol></li><li> Vergelijk CFU / ml tussen verschillende media. Gebruik CFU / ml op TSA als 100%, het berekenen van de% terugwinning van V. parahaemolyticus geteeld op de chromogene en TCBS agar. </li></ol> 5. Mededinging Assay <ol><li> Kies een subset van stammen die verschillende kolonie morfologie op de chromogene en TCBS agar vertonen. LET OP: Op deze manier zal het mogelijk zijn om te tellen kolonies ontstaan uit V. Alleen parahaemolyticus, ondanks de aanwezigheid van andere soorten in het inoculum. <ol><li> Kies een V. parahaemolyticus stam die de verwachte turquoise en cyaan kolonies op TCBS en de chromogene agar oplevert, respectievelijk. </li><li> Kies een niet-V. parahaemolyticus en Vibrio niet die niet groeien op een van deze media, of verschillende koloniekleur. LET OP: Bijvoorbeeld, V. metschnikovii groeit zeer zwak on TCBS en niet groeien op het chromogene agar. Shigella sonnei groeit niet op TCBS maar levert magenta kolonies op de chromogene agar. </li></ol></li><li> Na de selectie van de stammen bovenstaande, voor te bereiden &#39;s nachts bouillon culturen met behulp van geïsoleerde kolonies gegroeid op niet-selectieve media. <ol><li> Maak &#39;s nachts culturen van V. parahaemolyticus en V. metschnikovii door de overdracht van enkele geïsoleerde kolonies van TSA tot 5 ml TSBS. Incubeer bij 35-37 ° C gedurende 16-24 uur. </li><li> Maak &#39;s nachts culturen van Shigella sonnei door de overdracht van enkele geïsoleerde kolonies van BHI agar tot 5 ml BHI bouillon. Incubeer bij 35-37 ° C gedurende 16-24 uur. </li></ol></li><li> Voor elke stam, het uitvoeren van een verdunningsreeks vergelijkbaar met Steps 4.2.1 en 4.2.2. Plaat geschikte verdunningen op BHI TSA of CFU / ml van de overnacht kweek vast te stellen volgens de vergelijking uit stap 4.2.5. OPMERKING: Typisch 100 gl van 10 tot 10 -5 -7 verdunningbuizen werkt voor de meeste culturen. Gebruik de CFU / ml waarden om een ​​back-het berekenen van de precieze hoeveelheid cellen die worden gebruikt in de volgende stap. De berekende CFU / ml waarden verkregen na incubatie, hoewel de volgende stappen uitgevoerd op dezelfde datum als Stap 5,3. </li><li> Met behulp van de &#39;s nachts culturen en verdunning buizen in de stappen 5.2 en 5.3, combinaties van verschillende hoeveelheden van een V. parahaemolyticus stam en een niet-V. parahaemolyticus soorten. Bijvoorbeeld, meng 500 pi van de 10 -5 verdunning tube V. parahaemolyticus met 500 ul van de &#39;s nachts culturen van V. metschnikovii. NB: Dit mengsel simuleert hoge microflora achtergrond. Om een lage microflora achtergrond simuleren, meng 500 pi elk van de 10 -5 verwatering tube van beide soorten. </li><li> Spread 100 pi van het mengsel elk op het chromogene, TCBS en TSA agarplaten. </li><li> Na incubatie bij 35-37 ° C gedurende maximaal 96 uur, tellen kolonies V. parahaemolyticus en de niet V. parahaemolyticus species op basis van hun verschil in groei en koloniemorfologie de chromogene en TCBS agar. OPMERKING: Indien bijvoorbeeld de niet V. parahaemolyticus soort groeit niet aan de chromogene en TCBS agar, alle kolonies zullen van V. zijn parahaemolyticus. Als de niet V. parahaemolyticus soort groeit op beide media, wordt alleen de turquoise kolonies op TCBS en cyaan kolonies op chromogene agar van V. zijn parahaemolyticus. De niet V. parahaemolyticus soorten al dan niet vertonen vergelijkbare kolonie morfologie V. parahaemolyticus op TSA. <ol><li> Als de niet V. parahaemolyticus soort groeit eveneens V. parahaemolyticus op deze niet-selectief medium, verdeel het kiemgetal door twee nummers voor het verkrijgen van V. parahaemolyticus alleen. Vergelijk de werkelijke kiemgetal met de verwachte telling afgeleid van stap 5.3. </li></ol></li></ol> 6. Effects van Oyster Homogenaten <ol><li> Weeg ≥50 g oester vlees van ≥12 weekdieren inclusief vlees en drank. <ol><li> Voeg gelijke hoeveelheid van PBS om de oester vlees en drank. Mengen van het mengsel bij hoge snelheid gedurende 90 seconden. Dit vormt 2 -1 verdund oester homogenaat. </li><li> Voeg 100 g 2 -1 verdund oester homogenaat tot 400 g PBS. Gebruik een schaal om het gewicht, niet volume te meten. Mengen van het mengsel bij hoge snelheid gedurende 1 minuut. Autoclaaf de oester homogenaat. LET OP: Dit zal de oester homogenaat gebruikt voor spiking zijn. </li></ol></li><li> Herhaal de Recovery test (Stap 4) in de aanwezigheid van oester homogenaat. <ol><li> Na de 500 g oester homogenaat afkoelt, voeg 100 ul van V. parahaemolyticus overnacht culturen gekweekt in TSBS aan. Bepaal het werkelijke bedrag van V. parahaemolyticus cellen in de entstof door het uitvoeren van de Standard Plate Count procedures in Stap 4.2. </li></ol></li><li> Repeet de competitie assay (Stap 5) in aanwezigheid van oester homogenaat. <ol><li> Na de 500 g oester homogenaat afkoelt, voeg 100 ul van elk van &#39;s nachts culturen van V. parahaemolyticus en niet- V. parahaemolyticus aan. Bepaal het werkelijke bedrag van de bacteriële cellen in de entstof door het uitvoeren van de Standard Plate Count procedures beschreven in stap 4.2 </li></ol></li><li> Meng de bacteriële cellen met oester homogenaat goed met behulp van een homogenisator. LET OP: Na het mengen van de oester homogenaat met het opzettelijk toegevoegde cellen heet spiked oester homogenaat. </li><li> Maak verdunningen van het verrijkte oester homogenaat 10 -1 tot 10 -3 verdunningsbuizen verkrijgen volgens de in stap 4.2.2 beschreven procedures. Spread 100 pi van elke verdunning op de chromogene, TCBS en TSA agar. Incubeer de platen bij 35-37 ° C gedurende maximaal 96 uur. </li><li> Vergelijk de werkelijke kiemgetal op chromogene en TCBS agar met de exwachte kiemgetal afgeleid uit stappen 6.2.1 en 6.3.1. OPMERKING: Indien bijvoorbeeld een buis van V. parahaemolyticus nachtkweek bevat 10 8 CFU / ml, een inoculum van 100 gl betekent dat 10 7 cellen worden toegevoegd aan de 500-g oester homogenaat, waarbij 5 x 10 4 cellen / g. Na verdunning en plating, de plaat met df = 10 -2 moet 500 kolonies opleveren; terwijl dat het hebben van df = 10 -3 moet 50 kolonies opleveren. Dit zijn de verwachte kolonietellingen. </li></ol>

<ol><li>Yeung, P. S., Boor, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology%2C+pathogenesis%2C+and+prevention+of+foodborne+Vibrio+parahaemolyticus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Foodborne+Pathog.+Dis%22%5BJournal%5D)">Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections.</a> Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).</li>
<li>Yeung, P. S. M., Boor, K. J. Epidemiology, molecular biology, and detection of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYeung%2C+PSM+%22Foodborne+and+Waterborne+Bacterial+pathogens%3A+Epidemiology%2C+Evolution+and+Molecular+Biology%22">Foodborne and Waterborne Bacterial pathogens: Epidemiology, Evolution and Molecular Biology</a>. Faruque, S. M. , Caister Academic Press. 153-184 (2012).</li>
<li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+Signs%3A+Incidence+and+Trends+of+Infection+with+Pathogens+Transmitted+Commonly+Through+Food+-+Foodborne+Diseases+Active+Surveillance+Network%2C+10+U.S.+Sites%2C+1996-2010%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Report%22%5BJournal%5D)">Vital Signs: Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food - Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 1996-2010.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 10, 1996-2010 (2011).</li>
<li>Centers for Disease Control and Prevention. Summary of human Vibrio cases reported to CDC, 2008. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591">https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591</a> (2008).</li>
<li>Scallan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foodborne+illness+acquired+in+the+United+States+-+major+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Foodborne illness acquired in the United States - major pathogens.</a> Emerg. Infect. Dis. 17 (1), 7-15 (2011).</li>
<li>Baross, J., Liston, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+Vibrio+parahaemolyticus+and+related+hemolytic+vibrios+in+marine+environments+of+Washington+State%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and related hemolytic vibrios in marine environments of Washington State.</a> Appl. Microbiol. 20 (2), 179-186 (1970).</li>
<li>Baross, J., Liston, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Vibrio+parahaemolyticus+from+the+Northwest+Pacific%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of Vibrio parahaemolyticus from the Northwest Pacific.</a> Nature. 217 (5135), 1263-1264 (1968).</li>
<li>Kueh, C. S., Chan, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+in+bivalve+shellfish+with+special+reference+to+the+oyster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Bacteria in bivalve shellfish with special reference to the oyster.</a> J. Appl. Bacteriol. 59 (1), 41-47 (1985).</li>
<li>Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Bad+Bug+Book%2C+Foodborne+Pathogenic+Microorganisms+and+Natural+Toxins%22">Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins</a>. , Second Edition, (2012).</li>
<li>Qadri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+and+inflammatory+immune+responses+in+patients+infected+with+strains+of+Vibrio+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Adaptive and inflammatory immune responses in patients infected with strains of Vibrio parahaemolyticus.</a> J. Infect. Dis. 187 (7), 1085-1096 (2003).</li>
<li>Food and Drug Administration. Quantitative risk assessment on the public health impact of Vibrio parahaemolyticus in raw oysters. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/ResearchAreas/RiskAssessmentSafetyAssessment/ucm050421.htm">http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/ResearchAreas/RiskAssessmentSafetyAssessment/ucm050421.htm</a> (2005).</li>
<li>Food and Drug Administration. Bacteriological analytical manual online. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070830.htm">http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070830.htm</a> (2004).</li>
<li>MacFaddin, J. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMacFaddin%2C+JF+%22Media+for+isolation-cultivation-identification-maintenance+of+medical+bacteria%22">Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria</a>. 1, Williams & Wilkins. Baltimore, Md. (1985).</li>
<li>Bottone, E. J., Robin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+parahaemolyticus%3A+suspicion+of+presence+based+on+aberrant+biochemical+and+morphological+features%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vibrio parahaemolyticus: suspicion of presence based on aberrant biochemical and morphological features.</a> J. Clin. Microbiol. 8 (6), 760-763 (1978).</li>
<li>Lotz, M. J., Tamplin, M. L., Rodrick, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiosulfate-citrate-bile+salts-sucrose+agar+and+its+selectivity+for+clinical+and+marine+vibrio+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Clin.+Lab.+Sci%22%5BJournal%5D)">Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar and its selectivity for clinical and marine vibrio organisms.</a> Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (1), 45-48 (1983).</li>
<li>Hara-Kudo, Y., Nishina, T., Nakagawa, H., Konuma, H., Hasegawa, J., Kumagai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+detection+of+Vibrio+parahaemolyticus+in+seafood%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67 (12), 5819-5823 (2001).</li>
<li>Eddabra, R., Piemont, Y., Scheftel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+new+chromogenic+medium%2C+chromID+Vibrio%2C+for+the+isolation+and+presumptive+identification+of+Vibrio+choleare+and+Vibrio+parahaemolyticus+from+human+clinical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a new chromogenic medium, chromID Vibrio, for the isolation and presumptive identification of Vibrio choleare and Vibrio parahaemolyticus from human clinical specimens.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30 (6), 733-737 (2011).</li>
<li>Kodaka, H., Teramura, H., Mizuochi, S., Saito, M., Matsuoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Compact+Dry+VP+method+for+screening+raw+seafood+for+total+Vibrio+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food.+Prot%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Compact Dry VP method for screening raw seafood for total Vibrio parahaemolyticus.</a> J. Food. Prot. 72 (1), 169-173 (2009).</li>
<li>Su, Y. C., Duan, J., Wu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectivity+and+specificity+of+a+chromogenic+medium+for+detecting+Vibrio+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticus.</a> J. Food Prot. 68 (7), 1454-1456 (2005).</li>
<li>Bej, A. K., Patterson, D. P., Brasher, C. W., Vickery, M. C., Jones, D. D., Kaysner, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+total+and+hemolysin-producing+Vibrio+parahaemolyticus+in+shellfish+using+multiplex+PCR+amplification+of+tl%2C+tdh+and+trh%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh.</a> J. Microbiol. Methods. 36 (3), 215-225 (1999).</li>
<li>Yeung, P. S. M., DePaola, A., Kaysner, C. A., Boor, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PCR+assay+for+specific+detection+of+the+pandemic+Vibrio+parahaemolyticus+O3%3AK6+clone+from+shellfish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Sci%22%5BJournal%5D)">A PCR assay for specific detection of the pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone from shellfish.</a> J. Food Sci. 68 (4), 1459-1466 (2003).</li>
<li>Yeung, P. S. M., Hayes, M. C., DePaola, A., Kaysner, C. A., Kornstein, L., Boor, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+phenotypic%2C+molecular%2C+and+virulence+characterization+of+Vibrio+parahaemolyticus+O3%3AK6+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative phenotypic, molecular, and virulence characterization of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 isolates.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68 (6), 2901-2909 (2002).</li>
<li>Duan, J., Su, Y. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+chromogenic+medium+with+thiosulfate-citrate-bile+salts-sucrose+agar+for+detecting+Vibrio+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparison of a chromogenic medium with thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar for detecting Vibrio parahaemolyticus.</a> J. Food Sci. 70, M125-M128 (2005).</li>
<li>Pinto, A. D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+thiosulphate-citrate-bile+salt+sucrose+%28TCBS%29+agar+and+CHROMagar+Vibrio+for+isolating+Vibrio+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus.</a> Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).</li>
<li>Canizalez-Roman, A., Flores-Villaseñor, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Leòn-Sicairos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+a+chromogenic+agar+medium-PCR+protocol+with+a+conventional+method+for+isolation+of+Vibrio+parahaemolyticus+strains+from+environmental+and+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples.</a> Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).</li>
<li>Kriem, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+Vibrio+spp.+in+raw+shrimps+%28Parapenaeus+longirostris%29+and+performance+of+a+chromogenic+medium+for+the+isolation+of+Vibrio+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains.</a> Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).</li>
<li>Food Drug Administration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+guidance+on+reporting+results+from+studies+evaluating+diagnostic+tests%5BTitle%5D)+AND+%22http%3A%2F%2Fwww.fda.gov%2FRegulatoryInformation%2FGuidances%2Fucm071148.htm%22%5BJournal%5D)">Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests.</a> http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).</li>
<li>Burd, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+laboratory-developed+molecular+assays+for+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases.</a> Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).</li>
<li>World Organisation for Animal Health. Principles and methods of validation of diagnostic assays for infectious diseases. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/1.01.05_VALIDATION.pdf">http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/1.01.05_VALIDATION.pdf</a> (2013).</li>
</ol>

Sommige media werden genereus verstrekt door Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA. Thorsen voerde dit onderzoek uit terwijl hij een student was aan de California Polytechnic State University. Hij is momenteel een werknemer van Hardy Diagnostics.

Dit onderzoek richt zich op de ontwikkeling en evaluatie van de cultuur media. Conventioneel TCBS is het selectief en differentieel medium voor de isolatie en het detecteren V. parahaemolyticus, V. cholerae en V. vulnificus 12. Echter zijn beperkingen gerapporteerd voor dit medium, zoals het onvermogen om onderscheid V. cholerae uit andere Vibrio. Sucrose en pH-indicator zijn de differentiatie agenten van TCBS. Aldus zuurproductie sucrose fermentor veroorzaakt kleurverander...

Als lid van het genus Vibrio, V. parahaemolyticus is een Gram-negatieve, niet-sporen-vormende, gebogen, staafvormige bacterie. Vertoont hoge motiliteit in zowel vloeibare en halfvaste omgevingen. De meeste V. parahaemolyticus stammen zijn niet-pathogeen voor mensen, maar de pathogene subtypen veroorzaakt epidemieën en pandemieën, waardoor deze soort wordt beschouwd als een belangrijke voedselpathogeen in veel landen 1,2. De incidentie van Vibrio infectie in de VS heeft een stijgende trend sinds 2000 3. Onder Vibrio spp., V. parahaemolyticus is de meest frequent gemelde soorten veroorzaken ziekten in de VS 4,5. Andere klinisch relevante soorten zijn V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, etc. Een klein percentage van de ziekte wordt veroorzaakt door meerdere soorten tegelijk. V. parahaemolyticus is een natuurlijke inhabitant van zeewater en dus op grote schaal verspreid in mariene wateren over de hele wereld met inbegrip van de estuaria. De soort werd ontdekt in 1950 na een uitbraak van voedselvergiftiging in Japan. In de VS werd de soort voor het eerst geïsoleerd in zeewater, sedimenten en schelpdieren in de Puget Sound regio 6,7. Filtervoeders in mariene habitats, zoals tweekleppige schelpdieren, kan haven V. parahaemolyticus als onderdeel van hun natuurlijke flora 8. Als zodanig V. parahaemolyticus infecties bij de mens zijn vaak gekoppeld aan de consumptie van besmette vis, vooral rauw of onvoldoende verhit schelpdieren. Een minder gebruikelijke route van binnenkomst optreedt wanneer open wond wordt blootgesteld aan zeewater, waardoor huidinfectie. De meeste V. parahaemolyticus spanningen veroorzaken geen ziekte bij de mens, maar toch bepaalde subtypen herbergen virulentie factoren, zoals thermostabiel direct hemolysine (TDH) zijn pathogeen. De meest voorkomende symptomen van voedselvergiftiging V. parahaemolyticus infectiediarree en buikpijn, gevolgd door misselijkheid, braken, en koorts. Hoofdpijn en koude rillingen zijn ook gemeld. De mediane incubatietijd is 15 uur, maar kan tot 96 uur na consumptie van voldoende hoeveelheid pathogene stammen 9. De ziekte duurt twee tot drie dagen. De gastro symptomen veroorzaakt door V. parahaemolyticus grotendeels zelfbeperkend en daarom speciale behandeling niet nodig. Milde gevallen van gastro-enteritis kunnen worden behandeld door orale rehydratie. Ernstigere ziekten kunnen worden behandeld met antibiotica zoals tetracycline en ciprofloxacine 10. Sterftecijfer ongeveer 2% voor gastro gevallen, maar kan oplopen tot 29% voor die septicemie of sepsis ontwikkelen. Elke persoon die vis consumeert of heeft open wond blootgesteld aan zeewater is het risico van V. parahaemolyticus infectie. De ernstigere vorm van ziekten, levensbedreigende septikemie, komt vaker voor bij een subpopulatie met onderliggende medische conditions 11, die alcoholisme, leverziekte, diabetes, nierziekte, maligniteit en andere omstandigheden die leiden tot een verzwakte immuunrespons omvatten. Met name deze groep van individuen is ook op een hoger risico voor het oplopen van ernstige ziekten veroorzaakt door V. vulnificus, die kan worden gevonden in vergelijkbaar met V. natuurlijke habitats parahaemolyticus. V. parahaemolyticus wordt routinematig geïsoleerd met behulp van thiosulfaat-citraat-galzouten-sucrose (TCBS) agar als een selectieve en differentiële medium. Verrijking in alkalisch peptonwater kan isolatie voorafgaan op TCBS agar. Vermoedelijke kolonies op TCBS worden verder getest in een reeks van biochemische tests en / of moleculaire assays gericht op de aanwezigheid van soortspecifieke genen. PCR-gebaseerde werkwijzen worden vaak gebruikt om de identiteit van V. bevestigen parahaemolyticus door het versterken van de thermolabiele hemolysin gen, TLH 12. Ongeacht de lOICE van bevestigingsmethoden, is het belangrijk om een effectief medium te isoleren en te differentiëren V. hebben parahaemolyticus van andere mariene vibrio&#39;s in de eerste plaats. TCBS is routinematig gebruikt om soorten differentiëren binnen de genus Vibrio naar vermogen om sucrose 12 gisten. Positieve fermentatie gepaard gaat met een kleurverandering van de pH-indicator broomthymolblauw. V. parahaemolyticus kolonies zijn vrij onderscheidend op TCBS, tentoonstellen blauw naar groen kleur. Dit kan echter niet gemakkelijk onderscheiden medium V. alginolyticus en V. cholerae. sucrose fermenteren Proteus soorten kunnen gele kolonies die lijkt V. produceren cholerae of V. alginolyticus 13. Bij de eerste isolatie op TCBS, V. parahaemolyticus kan ook worden ten onrechte aangemerkt als Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides en Pseudomonas spp 14. Stammen met vertraagde sucrose fermentatie kan worden verward met andere sucrose nonfermenting Vibrio 13, die onder meer V. parahaemolyticus. TCBS bleek ongevoelig tegen Escherichia coli, Pseudomonas putrefaciens, onder anderen. Verscheidene andere soorten op groen naar grijs kolonies die mogelijk worden verward met V. parahaemolyticus of V. vulnificus 15. Dientengevolge is het wenselijk om alternatieve kweekmedia ontwikkelen betere gevoeligheid en specificiteit richting detecteren en isoleren V. parahaemolyticus en andere nauw verwante soorten. Verschillende media alternatieven zijn recent ontwikkeld. Naast het opnemen van selectiemiddelen meeste nemen chromogene substraten soorten onderscheiden op basis van hun differentiële enzymatische activiteiten. Bijvoorbeeld zijn indoxyl-β-glucoside en indoxyl-β-galactoside gebruikt als chromogene substraten V. differentiëren parahaemolyticus kolonies (die blauw-groen weergegeven) van die van V. cholerae (paars) vanwege hun differentiële vermogen om β-glucosidase en β-galactosidase 16 te produceren. Verschillende formuleringen van chromogene agar ontwikkeld door verschillende groepen onderzocht en gerapporteerd vergelijkbaar of beter dan TCBS 17,18,19 te voeren. Een voordeel van het gebruik van een chromogeen medium is dat het kleuren van het omringende medium minimaal is waardoor de isolatie van bepaalde kolonies vergemakkelijkt. In dit onderzoek onderzochten we de mogelijkheid van een nieuw geformuleerde chromogeen medium voor detecteren en isoleren V. cholerae, V. parahaemolyticus en V. vulnificus; met een speciale focus op het vermogen om onderscheid te maken V. parahaemolyticus van andere soorten.

<table><tbody><tr><td>Reagens/Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-15-4</td><td>mag andere merken gebruiken</td></tr><tr><td>Autoclaaf</td><td>Elk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BHI poeder</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0418-17-7</td><td>mag andere merken gebruiken</td></tr><tr><td>Blender</td><td>Elk</td><td></td><td>om oester vlees te mengen</td></tr><tr><td>CampyGen gasgenerator</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>CN035A</td><td>om een microaerofiele atmosfeer te bieden; mag andere merken gebruiken</td></tr><tr><td>Chocolate agar platen</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>E14</td><td>mag andere merken gebruiken</td></tr><tr><td>Gebruikelijke PCR reagentia (dNTP's, MgCl2, Taq Polymerase)</td><td>Elk</td><td></td><td>of gebruik PCR kralen (Fisher Sci 46-001-014)</td></tr><tr><td>Kweekbuisjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S50712</td><td>mag andere merken gebruiken</td></tr><tr><td>Eppendorf buisjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S348903</td><td>mag andere merken gebruiken</td></tr><tr><td>Gel doc</td><td>Elk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HardyChrom Vibrio agar platen</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>G319</td><td>Deze studie evalueert dit medium</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Elk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inoculating loops</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-606</td><td>10 microliter-grootte werd gebruikt in deze studie</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td>mag andere merken gebruiken</td></tr><tr><td>Oesters</td><td>Elk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>R23701</td><td>mag andere merken gebruiken</td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>mag andere merken gebruiken</td></tr><tr><td>Pipet en tips</td><td>Elk</td><td></td><td>Gesteriliseerde tips</td></tr><tr><td>Primers voor tlh</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schaal</td><td>Elk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spreader</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-11</td><td>Kralen kunnen in plaats daarvan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Stomacher blender</td><td>Stomacher</td><td>400</td><td>Steekproeven werden gehomogeniseerd bij 200 rpm gedurende 30 sec. Andere homogenisator kan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Steriele filterzakken voor blenders</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-5</td><td></td></tr><tr><td>TCBS poeder</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>265020</td><td>Deze studie evalueert dit medium</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Elk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TSB poeder</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0370-07-5</td><td>mag andere merken gebruiken</td></tr><tr><td>UV-bezichtigingskast</td><td>Elk</td><td></td><td>Zend langgolf UV-licht uit</td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Elk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bronnen</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Bacteriesoorten en stammen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aeromonas hydrophila</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Candida albicans</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteus mirabilis</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Salmonella Choleraesuis</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shigella boydii</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shigella flexneri</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shigella sonnei</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibrio alginolyticus</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V. cholerae (serotypes omvatten O139, O1, niet O1, El Tor biovars)</td><td>FDA, ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V. damsela</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V. fisheri</td><td>Omgeving</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V. fluvialis</td><td>CDC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V. furnissii</td><td>CDC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V. hollisae</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V. metschnikovii</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V. mimicus</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V. parahaemolyticus (serotypes omvatten O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc.)</td><td>ATCC, FDA, CDC, Omgeving</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V. proteolyticus</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V. vulnificus</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van een meer gevoelige en specifieke chromogenic agar medium voor de detectie van<em&gt; vibrio parahaemolyticus</em&gt; en andere<em&gt; vibrio</em&gt; species

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Voedselinfecties in de Verenigde Staten, veroorzaakt door Vibrio soorten hebben laten zien een stijgende trend. In het genus Vibrio, V. parahaemolyticus is verantwoordelijk voor het merendeel van Vibrio geassocieerde infecties. Aldus nauwkeurige differentiatie bij Vibrio spp. en detectie van V. parahaemolyticus is van cruciaal belang voor de veiligheid van onze voedselvoorziening te waarborgen. Hoewel moleculaire technieken worden steeds vaker worden kweek afhankelijk methoden nog routinematig en ze worden beschouwd standaardwerkwijzen onder bepaalde omstandigheden. Daarom werd een nieuwe chromogene agar medium getest met als doel het bieden van een betere werkwijze voor isolatie en differentiatie van klinisch relevante Vibrio spp. Het protocol vergeleken de sensitiviteit, specificiteit en detectielimiet voor de detectie van V. parahaemolyticus tussen de nieuwe chromogene medium en een conventioneel medium. Diverse V. parahaemolyticus stammen (n = 22) rede presentatie van diverse serotypes en de bron van oorsprong werden gebruikt. Zij werden eerder geïdentificeerd door de Food and Drug Administration (FDA) en de Centers for Disease Control and Prevention (CDC), en door TLH -PCR in ons laboratorium verder geverifieerd. In ten minste vier afzonderlijke onderzoeken werden deze stammen geënt op de chromogene agar en thiosulfaat-citraat-galzouten sucrose (TCBS) agar, is de aanbevolen medium voor het kweken van deze soort, gevolgd door incubatie bij 35-37 ° C gedurende 24 -96 uur. Drie V. parahaemolyticus stammen (13,6%) niet optimaal groeien op TCBS, toch tentoongesteld groene koloniën als er groei. Twee stammen (9,1%) niet de verwachte cyaan kolonies opleveren op het chromogene agar. Niet- V. parahaemolyticus stammen (n = 32) werden ook getest om de specificiteit van het chromogene agar te bepalen. Onder deze stammen, 31 niet groeien of tentoongesteld andere kolonie morfologie. De gemiddelde herstel van de V. parahaemolyticus op de chromogenic agar was ~ 96,4% betrokken op tryptische soja-agar gesupplementeerd met 2% NaCl. Concluderend, de nieuwe chromogene agar is een effectief medium te detecteren V. parahaemolyticus en het te onderscheiden van andere vibrio.

In deze studie werden 54 microbiële stammen samengesteld die 22 -stammen in de V. parahaemolyticus species, 19 andere Vibrio en 13 niet Vibrio soorten (Tabel 1). De meeste V. parahaemolyticus stammen werden ofwel ontvangen van de FDA, CDC of andere openbare gezondheidszorg afdelingen. Zij vertegenwoordigen verschillende serotypes en isolatie bronnen. Deze stammen werden eerder geïdentificeerd door de regelgevende instanties. We bevesti...

Detectie en isolatie van klinisch relevante Vibrio-soorten vereisen selectieve en differentiële kweekmedia. Deze studie evalueerde het vermogen van een nieuw chromogeen medium om V. parahaemolyticus en andere verwante soorten te detecteren en identificeren. Het nieuwe medium bleek betere gevoeligheid en specificiteit te hebben dan het conventionele medium.

Ontwikkeling van een meer gevoelige en specifieke Chromogenic Agar Medium voor de detectie van<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; En andere<em&gt; Vibrio</em&gt; Species

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

Het algemene doel van deze procedure is om de sensitiviteit en specificiteit van een nieuw chromogeen medium te evalueren voor het vermogen om Vibrio parahaemolyticus te detecteren en te isoleren in vergelijking met conventionele media. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de voedingsmiddelen- en milieumicrobiologie, zoals wat de prevalentie is van Vibrio-soorten in voedingsmiddelen en oogstomgevingen? Het belangrijkste voordeel van onze procedure is dat er veel bacteriële isolaten kunnen worden gebruikt, ook in de aanwezigheid van een voedselmatrix.Autoclaveer alle agarmedia voordat de bacteriën worden gekweekt. Koel de agar vervolgens af tot 45 tot 50 °C in een waterbad. Wanneer de agar klaar is, worden lege petrischalen in stapels van vijf tot zes schalen geplaatst.Giet vervolgens, beginnend bij de onderkant van de stapel, de gesmolten agar in elke plaat tot deze ongeveer halfvol is, en plaats de deksels na het gieten terug. Laat de agar gedurende ten minste 12 uur bij kamertemperatuur stollen. Om de microbiële stamculturen op te zetten, gebruikt u een steriele inoculatielus zodra de agar gereed is om de culturen over te brengen naar de juiste niet-selectieve agarplaten, waarbij de bacteriën in een patroon worden uitgezaaid dat de observatie van geïsoleerde koloniën mogelijk maakt.Wanneer alle kolonies zijn geuitgeplaat, worden de culturen ondersteboven geïncubeerd bij 35 tot 37 graden Celsius gedurende maximaal 48 uur, behalve voor Campylobacter-soorten, die geïncubeerd moeten worden in een pot met gesloten deksel waarin een gaszakje is geplaatst om een microaerofiele omgeving te creëren. Observeer de kolonimorfologie aan het einde van de incubatie. Pure culturen moeten kolonies opleveren die een vergelijkbare kolonimorfologie vertonen.Om de kolonies van belang op selectieve en differentiële media uit te kweken, brengt u enkele geïsoleerde kolonies over naar vijf milliliters van het juiste bouillonmedium en incubeert u de culturen opnieuw bij 35 tot 37 °C gedurende 16 tot 24 uur. Strijk de volgende dag een lusvolle van de overnight-culturen uit op ten minste één Thiosulfate-Citrate-Bile-Salts-Sucrose- (TCBS) agarplaat en ten minste één chromogene agarplaat, met een incubatietijd van maximaal 96 uur bij 35 tot 37 °C. Beoordeel aan het einde van de incubatie zowel de cultuurdichtheid op de plaat als de grootte van de geïsoleerde kolonies om de algemene groei van de stammen te bepalen, waarbij u de kleur van de kolonies onder omgevingslicht of UV-licht registreert, naar gelang van de toepassing, en eventuele andere belangrijke kenmerken van de kolonies noteert.Om een herstelassay uit te voeren, inoculeert u jonge culturen van Vibrio parahaemolyticus in vijf milliliter tryptic soy broth, aangevuld met twee procent natriumchloride, of TSBS, en plaatst u de buisjes gedurende 16 tot 24 uur bij 35 tot 37 °C. Vortex de overnight-culturen de volgende dag en maak verdunningen van de bacteriën in PBS van 1 × 10⁻¹ tot 1 × 10⁻⁷. Plaat 100 µL van elke verdunning tussen 1 × 10⁻⁴ en 1 × 10⁻⁷ gelijkmatig uit over individuele chromogene, TCBS- en tryptic soy agar aangevuld met twee procent natriumchloride agar (TSAS) platen.Incubeer alle platen bij 35 tot 37 °C gedurende maximaal 96 uur. Tel vervolgens de koloniën en negeer de platen met te veel koloniën om te kunnen tellen of platen met minder dan 25 koloniën. Selecteer voor het uitvoeren van een competitie-assay een V.parahaemolyticus-stam die de verwachte turquoise koloniën op TCBS en cyaan koloniën op chromogene agar produceert, en een niet-V.Parahaemolytius-soorten die op geen van beide media groeien of een andere koloniekleur vertonen. Draag enkele geïsoleerde V.Parahaemolyticus- en V.Metschnikovii-kolonies over van een TSAS-agarplaat naar vijf milliliter TSBS voor een incubatie van 16 tot 24 uur bij 35 tot 37 graden Celsius. Draag enkele geïsoleerde Shigella sonnei-kolonies over van Brain Heart Infusion (BHI) agar naar vijf milliliter BHI-bouillon voor 16 tot 24 uur bij 35 tot 37 graden Celsius.Voer de volgende dag een seriële verdunning uit voor elke stam en zaai de verdunningen uit op niet-selectieve agarplaten om de colony-forming units per milliliter van de overnight-culturen te bepalen. Gebruik vervolgens de overnight-culturen en verdunningsbuisjes om verschillende volumes van een V.Parahaemolyticus-stam en een niet-V. Parahaemolyticus-soort te mengen en verspreid 100 µL van het bacteriële mengsel over individuele chromogene, TCBS- en TSAS-agarplaten.Na maximaal 96 uur bij 35 tot 37 graden Celsius worden de kolonies geteld op basis van verschillen in groei en morfologie op de chromogene platen en de TCBS-platen. Om de effecten van oesterhomogenaten op de bacteriële groei op selectieve en differentiële media te beoordelen, weegt u eerst ten minste 50 gram oestervlees van ten minste 12 weekdieren, inclusief het vlees en het vocht. Voeg vervolgens een gelijke massa PBS toe aan het oesterweefsel en meng het mengsel op hoge snelheid gedurende 90 seconden.Voeg vervolgens 100 gram van het verdunde oesterhomogenaat toe aan 400 gram PBS en meng het mengsel gedurende één minuut op hoge snelheid. Autoclaveer daarna het homogenaat. Voeg na afkoeling 100 µL van elke overnight V.Parahaemolyticus en non-V toe.Voeg de Parahaemolyticus-cultuur toe aan het oestermengsel en gebruik een homogenisator om de bacteriële cellen met het oesterhomogenaat te mengen. Maak verdunningen van 1 × 10⁻¹ tot 1 × 10⁻³ van het gespikede oesterhomogenaat in PBS zoals gedemonstreerd, en strijk 100 µL van elke verdunning uit op individuele chromogene, TCBS- en TSAS-platen. Vergelijk na 96 uur bij 35 tot 37 °C de werkelijke kolonieaantallen op de chromogene en TCBS-agars met de verwachte kolonieaantallen afgeleid van de standaardplaatcount die is uitgevoerd op de overnight-culturen.Om de groei en koloniemorfologie van de in deze studie gebruikte stammen te bepalen, werden de bacteriën gekweekt op selectieve en differentiële media. TCBS is het conventionele medium dat wordt gebruikt voor de isolatie van enkele Vibrio-soorten, waaronder turquoise V.Parahaemolyticus en gele V.Cholerae. Het gebruik van chromogeen medium om klinisch relevante Vibrio-soorten uit voedsel- en milieu monsters te selecteren, resulteert in de vorming van cyaan V.Parahaemolyticus en magenta V.Cholerae.Kolonies van V.Parahaemolyticus die zijn gegroeid op chromogene agarplaten in aanwezigheid van oesterhomogenaat worden in vergelijkbare aantallen waargenomen als op niet-selectieve media. Dit suggereert dat de detectielimiet van het chromogene medium vergelijkbaar is met die van niet-selectieve media, zelfs in de aanwezigheid van een voedselmatrix. Ook worden de groei en het herstel van V.Parahaemolyticus niet beïnvloed door de aanwezigheid van een niet-V. Parahaemolyticus-soort; een essentiële eigenschap voor differentiële en selectieve media, aangezien milieusamples diverse Vibrio-soorten in hoge aantallen bevatten, vooral na een verrijkingsprocedure.Verder blijkt uit de vergelijking van TCBS en chromogene agars via thermolabiele hemolysine-PCR een hogere sensitiviteit en specificiteit voor de chromogene agar, wat wijst op een betere algehele prestatie van dit differentiële en selectieve medium voor het detecteren en identificeren van V.Parahaemolyticus. Eenmaal beheerst kan de gehele procedure, inclusief de test- en incubatietijden van ongeveer 50 stammen, binnen 30 dagen worden voltooid mits correct uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alle culturen nauwkeurig te labelen en te allen tijde aseptische technieken toe te passen.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals kolonie-PCR, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals: draagt dit specifieke isolaat een virulentiegen? Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van voedselveiligheid en volksgezondheid om de detectie van Vibrio-soorten in schaaldieren en de estuariumomgeving te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u een standaardplaat telling uitvoert en hoe u de sensitiviteit, specificiteit en detectielimiet van een groeimedium evalueert.Vergeet niet dat werken met pathogenen en heet medium extreem gevaarlijk kan zijn; neem daarom altijd voorzorgsmaatregelen bij het uitvoeren van deze procedure, zoals het dragen van beschermende kleding, het afdekken van open wonden en het gescheiden houden van biologisch gevaarlijk afval.

development-more-sensitive-specific-chromogenic-agar-medium-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We hebben onlangs melding gemaakt van een nieuwe benadering voor het genereren van fluorogene DNAzyme probes die kan worden toegepast op het opzetten van een eenvoudige, "mix-and-lezen" TL-test voor bacteriële detectie. Deze speciale DNA probes katalyseren de splitsing van een chromofoor gemodificeerde DNA-RNA chimère substraat in aanwezigheid van ruwe extracellulaire mengsel (CEM) door een bepaald bacterie, waardoor vertaling bacteriële detectie in fluorescentiesignaal generatie. In dit...

Detectie van bacteriën met behulp van fluorogene DNAzymes

Source: Heering, J., et al. Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the induction of swarmer cell differentiation in Vibrio parahaemolyticus using a specially prepared agar medium. By manipulating environmental cues such as iron depletion, calcium supplementation, and surface contact, the bacteria are stimulated to transition from their swimmer form into elongated swarmer cells...

Induction of Differentiation of Vibrio parahaemolyticus into Swarmer Cells

Source: Heering, J., et al., Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the preparation of swarmer cells from a Vibrio parahaemolyticus colony for fluorescence imaging. The bacteria are genetically engineered to express a fluorophore-tagged protein that localizes unipolarly in swimmer cells and bipolarly in elongated swarmer cells, allowing for their visual differentiation. An...

Preparation of Vibrio parahaemolyticus Swarmer Cells for Imaging

Source: Yeung, M., et al. Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates a culture-based method for identifying Vibrio species, highlighting chromogenic agar as a more accurate alternative to the commonly used thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose or TCBS agar. Chromogenic agar provides superior differentiation of Vibrio strains by detecting species-specific...

A New Chromogenic Medium for Rapid Detection of Vibrio Species

Source: Brumfield, K. D., et al., Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the Voges-Proskauer (VP) test to differentiate among three biotypes of Vibrio cholerae: classical, wild-type El Tor, and El Tor variant. Each culture is inoculated into a glucose-containing medium, incubated, and treated with α-naphthol and potassium hydroxide to detect the presence of acetoin. A...

Voges-Proskauer Assay for Differentiating Biotypes of Vibrio cholerae

Een protocol dat geïntegreerde concentratie, verrijking en eindpuntkleurmeting voor de detectie van door voedsel overgedragen ziekteverwekkers in grote volumes landbouwwater presenteert, wordt hier gepresenteerd. Het water wordt gefilterd door middel van Modified Moore Swabs (MMS), verrijkt met selectieve of niet-selectieve media, en de detectie wordt uitgevoerd met behulp van op papier gebaseerde analytische apparaten (µPAD) ingebed met bacteriële-indicatieve kleurmetingssubstraten.

Colorimetrische Papier-gebaseerde detectie van<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. En<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Van grote volumes of Agricultural Water

Dit manuscript beschrijft de juiste Vibrio cholerae onderhoudstechnieken naast een reeks biochemische analyses, collectief gebruikt voor snelle en betrouwbare differentiatie tussen klinische en milieuvriendelijke V. Cholerae biotypen in een laboratorium omgeving.

Laboratoriumtechnieken die gebruikt worden om biotypes van te houden en te onderscheiden<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Klinische en milieu-isolaten

Dit protocol maakt het mogelijk om de celcellen van een enkele cel te onderscheiden van de differentieel onderscheidende Vibrio parahaemolyticus zwemmer en zwermcellen. De methode produceert een populatie van zwermcellen die gemakkelijk beschikbaar zijn voor enkelvoudige celanalyse en behandelt de bereiding van celculturen, inductie van zwarmerdifferentiatie, monsterbereiding en beeldanalyse.

Inductie van Cellulaire Differentiatie en Single Cell Imaging van<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Zwemmer en zwermcellen

Een protocol voor de ontwikkeling van een elektrochemische DNA biosensor bestaat uit een polylactic acid-gestabiliseerde, gouden nanodeeltjes gemodificeerde, gezeefdrukt koolstof elektrode voor het detecteren van Vibrio parahaemolyticus wordt gepresenteerd.

Ontwikkeling van een elektrochemische DNA Biosensor te detecteren een Foodborne Pathogen

Hier introduceren we het principe, de structuur en de instructie van het intelligente high-throughput antimicrobiële gevoeligheidstest-/faagscreeningsysteem. De toepassing ervan wordt geïllustreerd aan de hand van Salmonella geïsoleerd uit pluimvee in Shandong, China, als voorbeeld. De Lar-index wordt berekend en de betekenis ervan bij het evalueren van antimicrobiële resistentie wordt uitgebreid besproken.

Toepassing van het intelligente high-throughput antimicrobiële gevoeligheidstest-/faagscreeningsysteem en Lar Index van antimicrobiële resistentie

Leer een nieuw chromogeen agarmedium evalueren voor de detectie van Vibrio parahaemolyticus met hogere gevoeligheid en specificiteit dan conventionele methoden. Dit verbetert voedselveiligheidsmonitoring.

Ontwikkeling van een meer gevoelige en specifieke Chromogenic Agar Medium voor de detectie van Vibrio parahaemolyticus En andere Vibrio Species (Video) | JoVE Journal

Ontwikkeling van een meer gevoelige en specifieke Chromogenic Agar Medium voor de detectie van

Meer video's verkennen